EKSFOLİYE SÜT VE GÖMÜLÜ ÜÇÜNCÜ BÜYÜK AZI DİŞLERİNDEN İZOLE EDİLEN KÖK HÜCRELERİN KÜLTİVASYONU VE KARAKTERİZASYONU

TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ EKSFOLİYE SÜT VE GÖMÜLÜ ÜÇÜNCÜ BÜYÜK AZI DİŞLERİNDEN İZOLE EDİLEN KÖK HÜCRELERİN KÜLTİVASYONU VE KARAKTERİZASYONU Banu KÜRKÇÜ PEDODONTİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. Serap ÇETİNER 2010- ANKARA

i TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ EKSFOLİYE SÜT VE GÖMÜLÜ ÜÇÜNCÜ BÜYÜK AZI DİŞLERİNDEN İZOLE EDİLEN KÖK HÜCRELERİN KÜLTİVASYONU VE KARAKTERİZASYONU Banu KÜRKÇÜ PEDODONTİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof. Dr. Serap ÇETİNER Bu tez, TÜBİTAK SBAG-3603 (107S076) Proje numarası ile desteklenmiştir. 2010- ANKARA

ii

iii İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay ii İçindekiler iii Önsöz vii Simgeler ve Kısaltmalar viii Şekiller xiii Çizelgeler xiv 1. GİRİŞ 1 1.1. Doku Mühendisliği 1 1.2. Kök Hücre 3 1.2.1. Kök Hücre Sınıflandırılması 4 1.2.1.1. Farklı Tip Hücreye Dönüşebilme Kapasitelerine Göre Kök Hücre Sınıflandırması 4 1.2.1.1.1. Totipotent Kök Hücreler 5 1.2.1.1.2. Pluripotent Kök Hücreler 5 1.2.1.1.3. Multipotent kök Hücreler 6 1.2.1.1.4. Unipotent Kök Hücreler 7 1.2.1.2. Kökenlerine Göre Kök Hücre Sınıflandırması 7 1.2.1.2.1. Embriyonik Kök Hücreler 7 1.2.1.2.2. Erişkin Kök Hücreler (Dokuya özel kök hücreler) 8 1.2.2. Dental Dokulardan İzole Edilen Kök Hücreler 9 1.2.2.1. Daimi Diş Pulpası Kök Hücreleri (DPSC) 10 1.2.2.2. Düşme Zamanı Gelmiş Süt Dişi Pulpası Kök Hücreleri (SHED) 11 1.2.2.3. Apikal Papilla Kök Hücreleri (SCAP) 13 1.2.2.4. Periodontal Ligament Kök Hücreleri (PDLSC) 14 1.2.2.5. Dental Folikül Öncü Hücreleri (DFPC) 15 1.2.3. Dental Dokulardan İzole Edilen Kök Hücreler ile İlgili Çalışmalar 15 1.3. Pulpa 22 1.3.1. Süt Dişi ve Daimi Diş Pulpası Arasındaki Farklılıklar 23 1.3.2. Kök Rezorpsiyonu ile Süt Dişi Pulpasında Meydana Gelen Farklılıklar 23 1.4. Vital Pulpa Tedavileri 26 1.4.1. İndirekt Pulpa Kapaklaması 26 1.4.2. Direkt Pulpa Kapaklaması 27

iv 1.4.3. Amputasyon 28 1.4.4. Vital Pulpa Tedavilerinde Kullanılan Biyolojik Materyaller 28 1.4.4.1. Kemik Morfojenik Proteinleri (BMP) 28 1.4.4.1.1. BMP lerin Kimyasal Yapısı ve Sınıflandırılması 30 1.4.4.1.2. BMP-2 ve BMP-7 nin Vital Pulpa Tedavilerinde Kullanımına ait Çalışmalar 32 1.5. PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) 35 1.5.1. PCR Bileşenleri 36 1.5.1.1. Primerler 36 1.5.1.2. Kalıp DNA 37 1.5.1.3. Deoksinükleotid Bazlar 37 1.5.1.4. DNA Polimeraz 37 1.5.1.5. PCR Tampon (Buffer) 38 1.5.1.6. Isı Döngüleyici (Thermal Cycler) 38 1.5.2. PCR Çeşitleri 38 1.5.2.1. RT-PCR (Revers Transkripsiyon Polimerize Zincir Reaksiyonu) 39 1.5.2.1.1. Primerler 39 1.5.2.1.1.1. Poli (T) Primer 39 1.5.2.1.1.2. Random Primerler 40 1.5.2.1.1.3. Spesifik Primerler 40 1.5.2.1.2. Deoksinükleotid Trifosfatlar (dntps) 41 1.5.2.1.3. Enzimler 41 1.5.2.1.3.1. AVM Revers Transkriptaz 41 1.5.2.1.3.2. M-MLV Revers Transkriptaz 42 1.5.2.1.3.3. Tth DNA Polimeraz 42 1.5.2.2. Revers Transkripsiyonun Avantajları 42 1.5.2.3. Revers Transkripsiyonun Dezavantajları 43 1.6. Kalsiyum Saptanması için Kullanılan Hücre Boyama Yöntemleri 43 1.6.1. Von Kossa Gümüş Nitrat Boyama Tekniği 43 1.6.2. Alizarin Red S 44 1.7. Kemik Metabolizmasının Biyokimyasal Belirteçleri 44 1.7.1. Alkalen Fosfataz 45 1.7.2. Prokollajen Tip I Propeptidler 45 1.7.3. Osteokalsin (OC) 45

v 1.8. Amaç 46 2. GEREÇ VE YÖNTEM 48 2.1. Etik Kurul Onayı 48 2.2. Primer Kök Hücre İzolasyonu 48 2.2.1. İnsan Daimi Dişinden Kök Hücre İzolasyonu 49 2.2.2. Eksfoliasyon Zamanı Gelmiş İnsan Süt Dişinden Kök Hücre İzolasyonu 50 2.3. Kök Hücrelerin İdamesi ve Subkültürü 52 2.4. Kök Hücrelerin rhbmp-2 ve rhbmp-7 Kullanılarak Farklılaştırılması 53 2.4.1. DPSC lerin rhbmp-2 ve rhbmp-7 ile Farklılaştırılması 53 2.4.2. SHED lerin rhbmp-2 ve rhbmp-7 ile Farklılaştırılması 53 2.5. Hücrelerin Biyolojik Özellikleri ve Hücre Yapısının Belirlenmesi 53 2.5.1. Alizarin Red S Boyaması 54 2.5.2. Hematoksilen Eosin Boyaması 54 2.6. Reverse Transkripsiyon PCR 55 2.6.1. Total RNA İzolasyonu 55 2.6.2. cdna Sentezi 55 2.6.3. PCR 56 3. BULGULAR 58 3.1. Primer Kök Hücre İzolasyonu ve Hücrelerin Yapıları 58 3.2. Kök Hücrelerin rhbmp-2 ve rhbmp-7 Kullanılarak Farklılaştırılması 60 3.3. Hücrelerin Biyolojik Özellikleri 60 3.3.1. Hücre Sayısı 60 3.3.2. Hücre Çapı 62 3.4. RT-PCR 64 3.4.1. DPSC için OC ve GAPDH Ekspresyonları 64 3.4.2. SHED için OC ve GAPDH Ekspresyonları 65 3.5. Hücre Boyaması 66 3.5.1. Alizarin Red S Boyaması 66 3.5.2. Hematoksilen Eozin Boyaması 67 4. TARTIŞMA 69 5. SONUÇ VE ÖNERİLER 81 ÖZET 83 SUMMARY 84

vi KAYNAKLAR 85 ÖZGEÇMİŞ 101

vii ÖNSÖZ Eksfoliye Süt ve Gömülü Üçüncü Büyük Azı Dişlerinden İzole Edilen Kök Hücrelerin Kültivasyonu ve Karakterizasyonu isimli tez çalışmamda fizyolojik düşme zamanı gelmiş süt dişlerinden ve gömülü üçüncü büyük azı dişlerinden kök hücre izolasyonu yapılmış, elde edilen kök hücrelerin uzun süreli kültivasyonunu takiben rhbmp-2 ve rhbmp-7 kullanılarak yapılan indüksiyon RT-PCR ile semikantitatif olarak değerlendirilmiştir. Hem doktora eğitimim, hem de özel hayatımda her türlü desteğini her zaman hissettiğim, yetişmemde büyük emeği geçen, tez çalışmamı yönlendiren çok sevdiğim tez danışmanım Prof. Dr. Serap ÇETİNER e, Tezimin başlangıcından bitimine kadar bilgilerini esirgemeyen ve önerileri ile destek olan tez izleme komitesindeki değerli hocam Prof. Dr. Hayriye SÖNMEZ e, Tezimin kurulum aşamasında ve deneylerimin her basamağında her türlü yardımı esirgemeyen, tez izleme komitesindeki çok değerli hocam Prof. Dr. Aykut ÖZKUL a Deneylerimin her basamağında bana yardım eden, desteği ve verdiği fikirlerle tezimde büyük emeği olan Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi Viroloji Anabilim Dalı Öğretim Üyeleri nden sevgili hocam Doç. Dr. M. Taner KARAOĞLU na ve tüm Viroloji Kürsüsü ne, Tezimin gerçekleşmesi için gerekli tüm maddi desteği sağlayan TÜBİTAK a bağlı Sağlık Bilimleri Araştırma Grubu na, Histolojik boyamalar sırasında yardımlarını esirgemeyen Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji ve Embriyoloji Anabilim Dalı Öğretim Üyeleri nden Prof. Dr. Petek KORKUSUZ a, Elde edilen verilerin istatistiksel değerlendirilmesindeki yardımlarından dolayı Gazi Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi İstatistik Bölümü Araştırma Görevlileri nden sevgili arkadaşım Esra AKDENİZ DURAN a, Doktora programım süresince bana verdikleri eğitim ve ilgileri nedeniyle Ankara Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi Pedodonti Anabilim Dalı Öğretim Üyeleri ne, Başta Dt. Zerhan KIZILELMA ÇELİKTEN ve Dt. Levent DEMİRİZ olmak üzere tüm asistan arkadaşlarıma ve diş çekimleri sırasında yardımını esirgemeyen Ankara Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi Ağız Diş Çene Hastalıkları ve Cerrahisi Anabilim Dalı Araştırma Görevlilerinden Dt. Özkan ÖZGÜL e Hayat boyu her zaman yanımda olan, benimle üzülüp benimle sevinen, aldığım her kararda arkamda olan ve beni ayakta tutan biricik aileme, gece gündüz tüm sıkıntılarımı paylaşan, yardım etmek için elinden geleni yapan canım eşim İbrahim KÜRKÇÜ ye tüm kalbimle teşekkür ederim.

viii SİMGELER ve KISALTMALAR µl Mikrolitre µm Mikromerte µm Mikromolar A Adenine ALP Alkaline phosphatase AMV Avian myeloblastosis virus BALP Bone alkaline phosphatase Bç Baz çifti BGP Bone gla protein BMP Bone Morphogenetic Proteins BMP-1 Bone Morphogenetic Protein 1 BMP-10 Bone Morphogenetic Protein 10 BMP-11 Bone Morphogenetic Protein 11 BMP-12 Bone Morphogenetic Protein12 BMP-13 Bone Morphogenetic Protein 13 BMP-14 Bone Morphogenetic Protein 14 BMP-15 Bone Morphogenetic Protein 15 BMP-16 Bone Morphogenetic Protein 16 BMP-2 Bone Morphogenetic Protein 2 BMP-2A Bone Morphogenetic Protein 2A BMP-2B Bone Morphogenetic Protein 2B BMP-3 Bone Morphogenetic Protein 3 BMP-3B Bone Morphogenetic Protein 3B BMP-4 Bone Morphogenetic Protein 4 BMP-5 Bone Morphogenetic Protein 5 BMP-6 Bone Morphogenetic Protein 6 BMP-7 Bone Morphogenetic Protein 7 BMP-8 Bone Morphogenetic Protein 8 BMP-8B Bone Morphogenetic Protein 8B BMP-9 Bone Morphogenetic Protein 9

ix C Cytosine Ca Kalsiyum Ca(OH) 2 Kalsiyum hidroksitin kimyasal formülü CaO Kalsiyum oksitin kimyasal formülü CD34 Cluster of differentiation 34 CD45 Cluster of differentiation 45 CDMP-1 Cartilage derived morphogenetic protein 1 CDMP-2 Cartilage derived morphogenetic protein 2 CDMP-3 Cartilage derived morphogenetic protein 3 cdna Complementary deoxyribonucleic acid c-kit C-kit receptor cm 2 Santimetrekare CO 2 Karbon dioksitin kimyasal formülü datp Deoxyadenosine triphosphate dctp Deoxycitosine triphosphate DFPC Dental follicle precursor cells dgtp Deoxyguanosine triphosphate DMEM Dulbecco s Modified Eagle s Medium DMP-1 Dentin Matrix Protein DNA Deoxyribonucleic acid dntp Deoxynucleotide Triphosphate DOP-PCR Degenerate oligonucleotide primer polymerase chain reaction DPSC Dental pulp stem cells DSPP Dentin sialophosphoprotein dttp Deoxythymidine triphosphate ECM Extra cellular matrix EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid FDA Food and Drug Administration FDS Fetal dana serumu FGF Fibroblast Growth Factors G Guanine GAG Glycosaminoglycan

x GAPDH Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase GC Guanine Cytosine GDF-10 Growth differentiation factor 10 GDF-11 Growth differentiation factor 11 GDF-2 Growth differentiation factor 2 GDF-5 Growth differentiation factor 5 GDF-6 Growth differentiation factor 6 GDF-7 Growth differentiation factor 7 GER Granular endoplasmic reticulum Gla Gamma carboxyglutamic acid Hhs Hedgehong Proteins hop-1 Human osteogenic protein 1 ICM Inner cell mass IDPSC Immature dental pulp stem cells IGF Insulin like growth factor IL-1 İnterlökin 1 IL-6 İnterlökin 6 IM Intra muscular ITS Insulin- transferin- sodium selenite media supplement kda Kilodalton MEPE Matrix Extracellular Phosphoglycoprotein Mg Magnezyum mg Miligram MgCl 2 Magnezyum klorür ün kimyasal formülü MHC Major histocompatibility complex Ml Mililitre mm Milimetre mm Milimolar M-MLV Moloney murine leukemia virus MnCl 2 Manganez klorür ün kimyasal formülü mrna Messenger ribonucleic acid MUC-18 Melanoma cell adhesion molecule 18

xi Na Sodyum Na 2 O Sodyum oksit NaOCl Sodyum hipoklorit ng Nanogram NH 4 OH Amonyum hidroksit in kimyasal formülü OC Osteokalsin ºC Degree celcius OP-1 Osteogenic proein 1 OP-2 Osteogenic protein 2 P 2 O 5 Fosfor pentoksit in kimyasal formülü PBS Phosphate buffered saline PCR Polymerase chain reaction PDGF Platelet derived growth factor PDLSC Periodontal ligament stem cells PGE 1 Prostaglandin E 1 PGF 2α Prostaglandin F 2α ph Power of hydrogen PICP Procollagen Type I Carboxyl-Terminal Propeptide PINP Procollagen Type I Amino-Terminal Propeptide PLGA poly(lactic-co-glycolic acid) pmol Pikomol RACE-PCR Rapid Amplification of cdna Ends Polymerase Chain Reaction rhbmp-2 Recombinant human bone morphogenetic protein 2 rhbmp-4 Recombinant human bone morphogenetic protein 2 rhbmp-7 Recombinant human bone morphogenetic protein 2 rhop-1 Recombinant human osteogenic protein 1 RNA Ribonucleic acid rpm Revolutions per minute RT Reverse transcription RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction SCAP Stem cells from apical papilla SCNT Somatic cell nuclear transfer

xii SHED Stem cells from exfoliated deciduous teeth SiO 2 Silisyum Oksit in kimyasal formülü T Thymine T7 7. gün T14 14. gün T21 21. gün TGF-β Transforming growth factor beta TGF-β 1 Transforming growth factor beta 1 Tm Melting temperature TNF Tumor necrosis factors U Unit ml mililitre UV Ultra viyole VCAM-1 Vascular cell adhesion molecule 1 VEGF Vascular endothelial growth factor Vgr-1 Vetegal protein -1 related gene Wnts Wingless- and- int related proteins α- SM actin Alpha smooth muscle actin β-actin Beta actin

xiii ŞEKİLLER Şekil 1.1. Pluripotent kök hücreler 6 Şekil 1.2. Multipotent kök hücreler 6 Şekil 2.1. Tip I Kollajenaz 49 Şekil 2.2. Dispaz 49 Şekil 2.3. Vertikal yiv açılan süt dişi 51 Şekil 3.1. Düşme zamanı gelmiş süt dişi kronunda kalan pulpa dokusu 58 Şekil 3.2. 48 saatlik kültivasyon sonrası DPSC görüntüsü (40X) 59 Şekil 3.3. 1 haftalık kültivasyon sonrası DPSC görüntüsü (40X) 59 Şekil 3.4. 48 saatlik kültivasyon sonrası SHED görüntüsü (40X) 59 Şekil 3.5. 1 haftalık kültivasyon sonrası SHED görüntüsü (40X) 59 Şekil 3.6. Primer SHED populasyonu (40X) (a, iğsi hücre) 60 Şekil 3.7. Primer DPSC populasyonu (40X) (a,iğsi hücre; b, yuvarlak hücre) 60 Şekil 3.8. DPSC lere ait OC ve GAPDH ekspresyonları 64 Şekil 3.9. SHED lere ait OC ve GAPDH ekspresyonları 65 Şekil 3.10a. DPSC T21 Kontrol (40X) 67 Şekil 3.10b. DPSC T21 rhbmp-2 (40X) 67 Şekil 3.10c. DPSC T21 rhbmp-7 (40X) 67 Şekil 3.11a. SHED T21 Kontrol (40X) 67 Şekil 3.11b. SHED T21 rhbmp-2 (40X) 67 Şekil 3.11c. SHED T21 rhbmp-7 (40X) 67 Şekil 3.12a. DPSC T21 Kontrol (40X) 68 Şekil 3.12b. DPSC T21 rhbmp-2 (40X) 68 Şekil 3.12c. DPSC T21 rhbmp-7 (40X) 68 Şekil 3.13a. SHED T21 Kontrol (40X) 68 Şekil 3.13b. SHED T21 rhbmp-2 (40X) 68 Şekil 3.13c. SHED T21 rhbmp-7 (40X) 68

xiv ÇİZELGELER Çizelge 1.1. BMP Ailesi 32 Çizelge 2.1. DPSC izolasyonu için kullanılan enzim kokteylinin 49 (kollajenaz/dispaz) bileşimi. Çizelge 2.2. DPSC lerin çoğalması ve idamesinde kullanılan vasat 50 bileşimi Çizelge 2.3. SHED izolasyonu için kullanılan enzim kokteylinin 51 (kollajenaz/dispaz) bileş imi Çizelge 2.4. SHED lerin çoğalması ve idamesinde kullanılan vasat 52 bileşimi Çizelge 2.5. RT reaksiyonu için kullanılan Karışım I ve II bileşimleri 56 Çizelge 2.6. PCR reaksiyon karışımları 57 Çizelge 2.7. OC ve GAPDH gen bölgelerinin çoğaltılması için kullanılan primer dizinleri, elde edilecek ürün büyüklükleri ve 57 bağlanma ısıları Çizelge 3.1. DPSC hücre sayısının protein çeşidine göre zaman içindeki tanımlayıcı istatistiksel değerleri 61 Çizelge 3.2. SHED hücre sayısının protein çeşidine göre zaman içindeki tanımlayıcı istatistiksel değerleri 61 Çizelge 3.3. DPSC hücre çapının protein çeşidine göre zaman içindeki tanımlayıcı istatistiksel değerleri 62 Çizelge 3.4. SHED hücre çapının protein çeşidine göre zaman içindeki tanımlayıcı istatistiksel değerleri 63 Çizelge 3.5. DPSC için 1 µg PCR ürünündeki OC ve GAPDH ekspresyon miktarı 65 Çizelge 3.6. SHED için 1 µg PCR ürünündeki OC ve GAPDH ekspresyon miktarı 66

1 1.GİRİŞ 1.1. Doku Mühendisliği Biyoloji, mühendislik ve tıp ilkelerini birleştirerek, doğumsal deformiteler, hastalıklar ya da travma sonucu kaybedilen dokuların tamiri için fonksiyonel greftlerin yaratılmasına olanak tanıyan doku mühendisliğinin asıl amacı, normal doku fonksiyonunun sağlanmasıdır (Radisic ve ark., 2006; Saber, 2009). Doku mühendisliğinin bir dalı olan kraniofasiyal doku mühendisliğinde, konjenital anomaliler, travma ya da hastalıklar sebebiyle kaybedilen dental, oral ve kraniofasiyal dokuların onarılması ya da yeniden oluşturulması hedeflenmektedir (Mao ve ark.,2006). Vücudun diğer bölümlerinden farklı olarak ağız boşluğu, doku mühendisleri için rahat inceleme ve ulaşım kolaylığı gibi açık avantajlar sunmaktadır (Nakashima ve Reddi, 2003). Kraniyofasiyal kompleksin rejeneratif tedavi potansiyelinin anlaşılabilmesi için üç anahtar elementin kesişmesi gerekmektedir. Bunlar; a) Cevap veren kök hücreler, b) Uyarı için sinyal moleküller, c) Hücre dışı matriks için yapı (doku) iskelesidir (Nakashima ve Reddi, 2003; Nakashima, 2005; Hargreaves ve ark.,2008; Saber, 2009). Diş ve periodonsiyumun oluşumunu başlatmak için tüm bu elemanların birleşip gelişimsel olarak birbirini takip ederek örnek oluşumu başlatmaları gerekmektedir. Kraniyofasiyal dokuların rejenerasyonunda aynı zamanda, embriyonik gelişim ve morfojenez mekanizmalarının bir kısmının yeniden tekrarlanması beklenmektedir. (Nakashima ve Reddi, 2003). Morfojenler, epitelyal-mezenşimal etkileşim sırasında morfojenezi kontrol eden hücre dışı salgılanan sinyal moleküllerdir. Bu amaçla evrim sürecinde korunmuş dört protein ailesi görev yapmaktadır. Bu protein aileleri; Kemik Morfojenik Proteinleri (BMPs), Fibroblast Büyüme Faktörleri (FGFs), Hedgehong Proteinler (Hhs),

2 Wingless- and- int related Proteinler (Wnts) dir. Dental epitel ile mezenşim gelişimi sırasında BMP ler ve FGF ler mezenşimin proliferasyonunu kontrol eden genlerin ekspresyonunu arttırırlar (Nakashima ve Reddi, 2003). Diş ve periodonsiyum ile ilgili doku mühendisliği çalışmalarında hücre dışı matriksin yapı iskeleleri ile desteklenmesini gerektirmektedir (Nakashima ve Reddi, 2003). Yapı iskelesi olarak kullanılacak materyalin en önemli görevi, konak hücrelere ya da transplante edilecek hücrelere geçici olarak destek görevi görerek dokunun işlevini yerine getirmesine yardım etmektir (Yoon ve Fisher, 2007). Periodontal ve kraniofasiyal dokuların rejenerasyonunda doğal ve sentetik biyomimetik olmak üzere iki çeşit yapı iskelesi kullanılmaktadır. Doğal yapı iskeleleri olarak kalsifiye donmuş kurutulmuş kemik, dekalsifiye donmuş kurutulmuş kemik, sığır mineral matriksi, sığırdan elde edilmiş hidroksiapatit kullanılırken, sentetik biyomimetik yapı iskelesi olarak hidroksiapatit (dense, porous, rezorbe olabilen), trikalsiyum fosfat, sert doku replasman polimerleri, biyoaktif camlar (SiO 2, CaO, Na 2 O, P 2 O 5 ), mercandan elde edilmiş kalsiyum karbonat, kollajen, PLGA: poli(laktik-ko-glikolik asit), metil selüloz, kitosan ve mine matriks deriveleri kullanılmaktadır (Anusaksathien ve ark., 2006). Doku mühendisliği tasarımı düzenekler, biyolojik biyomateryal kombinasyonları olup, dokunun bazı kısımlarının biyomateryal ile birleşerek organ ve dokunun fonksiyonlarında küçük değişiklikler yapmaktadır. Bu değişiklik yapılırken de düzeneklerin doğru ve eksiksiz olarak çalışarak konak doku ile olan uyumunun sağlanması gerekmektedir. Bunun için de, hedef dokunun uygun fonksiyonu ve hücresel fenotipik ekspresyonlarının kaybedilmeden tamiri, düzeneğin fonksiyonunu değiştirecek ya da durduracak yabancı cisim reaksiyonlarının önlenmesi, düzeneğin fonksiyonlarında aksamalara sebep olacak skar ya da kapsül oluşumunun engellenmesi, doku mühendisliği tasarımı düzeneklerin beklenen fonksiyonunu bozacak ya da doku parçasının tamamen yok olmasına sebep olacak immün cevabın engellenmesi gerekmektedir (Anderson, 2007).

3 Doku mühendislerinin, restoratif diş hekimliği uygulamalarında yapmak istedikleri çürük lezyonlarının remineralizasyonu, diş çürüğünü durdurucu ya da geri çevirmeye merkezli etkili tedavilerin sağlanmasıdır. (Murray ve ark., 2002). Çürük, pulpitis ve apikal periodontitis, sağlık harcamalarını arttırmakta ve buna bağlı olarak da ekonomik verimliliği azaltmaktadır. Bunlar erken diş kayıplarına neden olurken aynı zamanda da yaşam kalitesini azaltmaktadır. Kök hücreler kullanılarak yapılan vital pulpa tedavilerindeki ilerlemeler sayesinde tüm pulpanın uzaklaştırılmadan dentin-pulpa kompleksinin rejenerasyonunda ilerleme sağlanması hedeflenmektedir (Nakashima ve Akamine, 2005). 1.2. Kök Hücre Kök hücreler, kendini yenileyebilme yani bölünebilme ve aynı zamanda yeni kök hücreler oluşturabilme özelliğine sahip ve değişik türlere farklılaşma gösteren klonojenik hücreler olarak tanımlanmaktadır (Fuchs ve Serge, 2000; NIH, 2001a; Blau ve ark., 2001; Bishop ve ark., 2002; Gronthos ve ark., 2002; Fortier, 2005; Rimondini ve Mele, 2009). Kök hücreler, hücre membranı, sitoplazması, bölünebilme, kendini eşleyebilme ve tüm hücresel işlevleri yerine getirebilme gibi özellikleriyle diğer hücrelere benzerlik gösterirler (Viegas, 2003), ancak kaynakları ne olursa olsun tüm kök hücreler sahip oldukları üç temel özellikle normal hücrelerden ayrılırlar (Kelly, 2007; NIH, 2009a). Kök hücreler özelleşmemiştir: Kök hücrelerin belli başlı özelliklerinden birisi özelleşmiş fonksiyonları gerçekleştiren, dokuya özel yapılara sahip olmamalarıdır. Kök hücre komşu hücreler ile birlikte vücuda kan pompalayamaz (kalp kası hücreleri gibi), kan dolaşımında oksijen moleküllerini taşıyamaz (alyuvarlar gibi), ve vücudun hareket etmesi ya da konuşmasına olanak sağlayan diğer hücreleri uyaran elektrokimyasal sinyaller gönderemez (sinir hücreleri gibi). Ancak özelleşmemiş kök hücreler kalp kası hücreleri, kan hücreleri ya da sinir hücreleri gibi özelleşmiş hücrelere dönüşebilirler. (Kelly, 2007; NIH, 2009a)

4 Kök hücrelerin yaşamları boyunca bölünme ve kendilerini yenileme yetenekleri vardır: Kendilerini çoğaltma yetenekleri olmayan kas, kan ya da sinir hücrelerinin aksine kök hücreler birçok kere kendi benzerlerini yapabilme özelliğine sahiptirler. Kendi benzerlerini yapabilme özelliğine sahip olan bu hücreler kendilerini eşleyerek çoğalmaktadırlar. Özetle kök hücreler prolifere olabilirler. (Kelly, 2007; NIH, 2009a) Kök hücreler özelleşmiş hücrelere dönüşebilirler: Kök hücrelerin, özelleşmiş hücrelere dönüşmesi farklılaşma olarak adlandırılmaktadır. Kök hücre farklılaşmasını içsel ve dışsal sinyaller tetiklemektedir. İçsel sinyaller, hücrelerin genleri ile kontrol edilirken, dışsal sinyaller komşu hücrelerden salgılanan kimyasallar, komşu hücrelerle fiziksel temas ve mikro çevredeki büyüme faktörleridir (Kelly, 2007; NIH, 2009a). 1.2.1. Kök Hücre Sınıflandırılması Kök hücreler gelişim sırasında çok yönlü olarak farklı tip hücreye dönüşebilme kapasitelerine ve kökenlerine göre iki şekilde sınıflandırılmaktadır (Kelly, 2007; Can, 2008; NIH, 2009a). 1.2.1.1. Farklı Tip Hücreye Dönüşebilme Kapasitelerine Göre Kök Hücre Sınıflandırması NIH (2001a) ve Kelly (2007), gelişim sırasındaki dönüşüm potansiyellerine göre hücreleri Totipotent, Pluripotent ve Unipotent, Fortier (2005), Totipotent, Pluripotent ve Multipotent, Alison ve ark (2002) ve Can (2008) ise, hücreleri gelişim sırasında, çok yönlü olarak farklı tip hücreye dönüşebilme kapasitelerine göre Totipotent, Pluripotent, Multipotent ve Unipotent olarak sınıflandırmıştır.

5 1.2.1.1.1. Totipotent Kök Hücreler Kök hücreler birden fazla hücre tipine farklılaşabilirler. Bunun en iyi örneği döllenmiş yumurta hücresi ya da zigottan itibaren görülmektedir. Vücuttaki tüm hücrelere dönüşebilecek potansiyele sahip bu ilk embriyonel hücreye totipotent hücre denmektedir. Bu hücreler sınırsız farlılaşma ve farklı yönlere gidebilme yeteneğine sahip kök hücrelerdir. Erken embriyonel dönemde 4 hücreden 8 hücreye kadar olan tüm blastomerler totipotenttir. Bu evrede bölünen hücre grubu birbirinden ayrılırsa, genetik olarak birbirleriyle aynı embriyolar oluşmakta ve tek yumurta ikizleri meydana gelmektedir (NIH, 2001a; Alison ve ark., 2002; Fortier, 2005; Kelly, 2007; Can, 2008; Rimondini ve Mele, 2009). 1.2.1.1.2. Pluripotent Kök Hücreler Döllenmenin yaklaşık 5. gününde bu hücreler blastokist denilen içi boşluklu hücre topluluklarına dönüşürler. Blastokistin dış kısmında kalan hücre grubu plasenta ve göbek kordonunu oluştururken, 50 hücreden meydana gelen iç hücre kitlesindeki (Inner Cell Mass- ICM) hücreler endoderm, ektoderm ve mezodermden köken alan çok farklı hücre çeşidine farklılaşabilirler. Bu özelliğe sahip hücrelere pluripotent hücreler denir (Şekil 1.1). İnsan embriyonel kök hücreleri blastokistin iç hücre kitlesinden elde edilirler ve pluripotenttirler. Bu hücreler çoğu embriyonik hücre tiplerini oluşturabilseler de gelişimin tamamlanması için gereken tüm dokuları oluşturma özelliğinde değildirler (NIH, 2001a; Alison ve ark., 2002; Rao, 2004; Fortier, 2005; Kelly, 2007; Can, 2008). İnsan vücudunda bulunan ve gerektiğinde herhangi bir hücre türüne dönüşebilme özelliğine sahip olan pluripotent kök hücre kaynaklarından biri embriyonik germ hücreleridir. 5-10 haftalık fetüsün testis ya da overlerinde oluşan pluripotent kök hücreler bu amaçla toplanıp kök hücre kaynağı olarak kullanılmaktadır (NIH 2001a; Kelly, 2007).

6 Pluripotent kök hücre kaynaklarından bir diğeri de tüp bebek merkezlerinde döllenmiş ve araştırma amacıylaa bağışlanmış yumurtalardan gelişen embriyolardır. Bu hücreler laboratuarda kültürr ortamındaa farklılaşmadan çoğaltılır, dondurularak saklanır ve başka laboratuarlara araştırma amacıyla gönderilirler (Görkey ve ark.,2009) Somatik hücre çekirdek nakli (SCNT), pluripotent hücre elde etmek için bir diğer yoldur. Çekirdek transplantasyonu da denilen bu prosedürde, hastanın somatik hücre çekirdeği, çekirdeği çıkartılmışş yumurta hücresi içine konduktan sonra yumurta bölünmesi için aktive edilmektedir. Birkaç hücre bölünmesindenn sonra elde edilen blastokistten birbirinin kopyası,, hastaya genetik olarak tamamen uyan ve böylece reddedilme riski bulunmayan pluripotent kök hücreler üretilmektedir (Görkey ve ark., 2009; Rimondini ve Mele, 2009). Şekil 1.11 Pluripotent kök hücreler http://www.kokhucredernegi.org.tr/tur/kok_hucre/embriyo.htm Şekil 1.2 Multipotent kök hücreler http://www.kokhucredernegi.org.tr/ r/tur/kok_hucre/eriskin.htm 1.2.1.1.3. Multipotent Kök Hücreler Gelişimin ilerleyen dönemlerind de (fetal hayat), hücreler biraz daha özel görevlere sahip olurlar ve erişkin tip kökk hücrelere dönüşürlerr (Şekil 1.2). Multipotent kök hücreler, izole edildikleri dokunun özelliklerini koruyarak bir ya da daha fazla farklı hücre tipine farklılaşan hücrelerdir (Alison ve ark., 2002; Rao, 2004; Bongsoo ve ark., 2008; Can, 2008).

7 1.2.1.1.4. Unipotent Kök Hücreler Farklılaşmanın en son basamağında tek bir hücre türüne farklılaşma fonksiyonuna sahip hücrelerdir (NIH, 2001a; Alison ve ark., 2002; Kelly, 2007; Can, 2008). 1.2.1.2. Kökenlerine Göre Kök Hücre Sınıflandırması Kök hücreler kökenlerine göre embriyonik kök hücreler ve erişkin kök hücreler (dokuya özgü kök hücreler) olarak sınıflandırılmaktadır (NIH, 2001a; Kelly, 2007; Can, 2008; Rimondini ve Mele, 2009) 1.2.1.2.1. Embriyonik Kök Hücreler Embriyonik kök hücreler, gelişmekte olan blastokistin iç tabaka hücrelerinden türeyen, kendi kendini yenileyebilen, farklılaşma göstermeden sınırsız sayıda simetrik bölünme eğilimi gösteren, pluripotent ve teorik olarak ölümsüz hücrelerdir (Jiang ve ark., 2002; Panno, 2005; NIH, 2009b). Blastokist evresinde embriyo henüz rahim duvarına yapışmamış olup içi sıvı ile dolu bir yumak şeklindedir. Bu yumağın dış kısmında kalan hücreler plasentayı oluştururken iç kısmında kalan hücreler ise embriyonik tabakaları oluşturmaktadır (NIH, 2001b). Embriyonik kök hücrelerin ayırıcı özellikleri: Blastokistin iç tabaka hücrelerinden türemektedir. Farklılaşma göstermeden sınırsız sayıda simetrik bölünme eğilimi göstermektedir. Stabil, tam sayıda, normal içerikli kromozoma sahip olup bunu devam ettirmektedir. Pluripotent embriyonik kök hücreler, embriyodaki primer germ tabakalarından (endoderm, ektoderm, mezoderm) türeyen farklılaşmış hücre gruplarını oluşturmaktadır. Gelişim sırasında tüm fetal dokuları birleştirme eğilimi göstermektedir.

8 Germ serisini kolonize etme, yumurta ve sperm hücreleri oluşturma eğilimindedir. Klonejeniktir, yani her bir embriyonik kök hücre genetik olarak birbirine tıpatıp benzeyen ve orijinal hücreyle aynı özelliklere sahip olan hücrelerin koloni ya da klon oluşturmasına olanak tanımaktadır. Proliferasyona ya da diferansiyasyona devam edebilmesi için indüklenebilmektedirler. Hücre döngüsünün G1 kontrol noktası yoktur. Embriyonik kök hücreler, hücre döngüsündeki çoğu zamanı DNA sentezledikleri S fazında geçirmektedir. Farklılaşmış somatik hücrelerin aksine embriyonik kök hücrelerde, DNA replikasyonunun başlaması için dışsal bir uyaran gerekmemektedir. X inaktivasyonu göstermemektedir. Dişi bir memelinin her bir somatik hücresinde, iki X kromozomundan bir tanesi sürekli olarak inaktif olmaktadır. Farklılaşmamış embriyonik kök hücrelerde X inaktivasyonu meydana gelmemektedir (NIH 2001b). 1.2.1.2.2. Erişkin Kök Hücreler (Dokuya Özel Kök Hücreler) Yakın zamana kadar bilim adamları erişkin organizmadaki tüm tamir olaylarının etkilenen doku tarafından yapıldığına inanmaktaydı. Ancak bu inanış son yıllarda klinik olarak birçok dokudan da kök hücre elde edilmesi ile biraz daha karmaşık bir hal almıştır (Panno, 2005). Loeffler ve Roeder (2002) bir dokuya özel kök hücreyi; Fonksiyonel olarak farklılaşmamış, Potansiyel olarak heterojen, Uygun bir çevreye yerleşme, çoğalma, çok sayıda farklılaşmış yeni hücreler oluşturma, kendini yenileme ve idame ettirme özelliği olan, Bir hasar oluştuğunda burada yeni bir doku oluşturabilme yeteneğine sahipken bu seçenekleri kullanma konusunda esneklik gösteren ve eski haline geri dönebilen hücreler olarak tanımlamışlardır.

9 Erişkin kök hücrelerin ayırıcı özellikleri: Kendilerine tıpatıp benzeyen kopyalarını yapabilme özelliğine sahiptir. Bu beceri hücrenin uzun yıllar boyunca kendi kendini yenileyebilme özelliği anlamına gelmektedir. Karakteristik morfolojik özellikleri ve özelleşmiş fonksiyonları bulunan olgun hücrelere dönüşebilme özelliklerine sahiptir. Bazı erişkin kök hücreler orijin aldığı dokudan farklı dokulara farklılaşabilme özelliğine sahiptir. Bu özellik yeniden şekillenme (plasticity) olarak adlandırılmaktadır. Erişkin kök hücreler nadir bulunmaktadır ve embriyonik kök hücrelerin aksine, erişkin kök hücrelerin olgun dokulardaki orijinleri bilinmemektedir. (NIH, 2001c). Erişkin kök hücreler; kemik iliği (Friedenstein ve Kuralesova, 1971), beyin (Gage ve ark.,1995), deri epiteli (Dunnwald ve ark., 2001;Toma ve ark., 2001; Toma ve ark., 2005), retina (Tropepe ve ark., 2000), böbrek (Bussolati ve ark., 2005; Gupta ve ark., 2006), kordon kanı (Lee ve ark., 2004; Laitinen ve Laine, 2007) periferik kan (Kuznetsov ve ark., 2001), iskelet kası (Mauro, 1961; Lu ve ark., 2009), karaciğer (Herrera ve ark., 2006), pankreas (Zulewski ve ark., 2001), sinir sistemi (Weiss ve ark., 1996; Uchida ve ark., 2000), kornea (Yokoo ve ark., 2008) ve dental dokulardan (Gronthos ve ark., 2000; Gronthos ve ark., 2002; Miura ve ark., 2003; Seo ve ark., 2004; Morsczeck ve ark., 2005; Sonoyama ve ark., 2006; Suchánek ve ark.,2007; Sonoyama ve ark., 2008; Suchánek ve ark., 2009) izole edilmiştir. 1.2.2. Dental Dokulardan İzole Edilen Kök Hücreler Oral dokuların travmatik ve patolojik yaralanmaların ardından olağanüstü rejenerasyon yeteneğine sahip olması bu dokularda büyük miktarda farklılaşma kapasitesine sahip hücrelerin olabileceğine dikkati çekmiş ve araştırmalar bu hücreleri izole etmeye yönelik olmuştur (Glick, 2009).

10 Dental ektomezenşimal kök hücreler, major farklılaşma potansiyelleri değerlendirildiğinde iki grupta incelenebilmektedir. Bunlardan ilk grup pulpa dokusu ile alakalı olup DPSC, SHED ve SCAP leri içerirken, diğer grup ise periodonsiyum ile alakalı olup PDLSC leri ve dental folikül kök hücrelerini içermektedir (Morsczeck ve ark., 2008). Tüm bu hücrelerden SHED dışındakiler daimi dişlerden elde edilmektedir (Saber, 2009). Dental dokular kemik dokusunda olduğu gibi sürekli yenilenme kapasitesine sahip olan dokular değildir ve bu durumdan yola çıkılarak da dental dokulardan izole edilen kök/öncü hücrelerin farklılaşma potansiyelinde kemik iliği kök hücrelerine göre bazı sınırlamaların olduğu düşünülmektedir. İzolasyonu ve karakterizasyonu yapılmış bu beş hücre türünün birbirleri arasındaki ilişki belirsizliğini hala korumaktadır (Huang ve ark.,2009). 1.2.2.1. Daimi Diş Pulpası Kök Hücreleri (DPSC) İlk olarak Gronthos ve ark. tarafından 2000 yılında tanımlanan ve gömülü üçüncü büyük azı dişlerinden izole edilen DPSC ler, kolay elde edilmesi sebebiyle araştırmacıların sıklıkla tercih ettiği kök hücre türlerinden biridir (Gronthos ve ark., 2000; Shi ve ark., 2001; Gronthos ve ark., 2002; Suchánek ve ark., 2007; Suchánek ve ark., 2009). Bu hücrelerin temel biyolojik özelliklerinin değerlendirildiği bir çalışmada hücrelerin ortalama canlılığının %96±3 olduğu, ortalama hücre çaplarının 12-18 µm arasında değiştiği belirtilmiştir (Suchánek ve ark., 2007). Genel olarak fibroblast benzeri görünümde olan DPSC lerin kendi kendini yenileme özelliği olan ve uygun ortamlarda kemik, kıkırdak, yağ doku, kas hücreleri, sinir hücresi gibi farklı tür hücrelere farklılaşma yeteneği olan hücreler olduğu saptanmıştır (Gronthos ve ark., 2000; Gronthos ve ark., 2002; Batouli ve ark., 2003; Laino ve ark., 2005; Zhang ve ark., 2006; d Aquino ve ark., 2007; Huang ve ark., 2009). Uygun ortamlarda mineralize doku oluşturmaları sebebiyle kemik rejenerasyonunda kullanılabilme potansiyelleri yüksektir (Wei ve ark., 2007; Luisi ve ark., 2007).

11 Kemik iliği kök hücreleri ile karşılaştırıldığında, aynı kültür ortamında DPSC lerin daha yüksek proliferasyon kapasitesine sahip olduğu bildirilmektedir (Gronthos ve ark., 2000; Shi ve ark., 2001). DPSC lerin immün sitokimyasal analizinde bu hücreler bilinen antijenlere karşı değerlendirilmiş ve protein ekspresyon şekilleri bakımından kemik iliği kök hücrelerine benzediği gösterilmiştir (Gronthos ve ark., 2000; Shi ve ark., 2005). Buna göre DPSC lerin, endotel (VCAM-1 ve MUC-18), düz kas (α-sm actin), kemik (alkalen fosfataz, tip1 kollajen, osteonektin, osteopontin, osteokalsin) ve fibroblastlar (tip III kollajen ve fibroblast büyüme faktörü 2) ile ilgili yüzey antijenlerine sahip olduğu belirlenirken bu antijenler tüm kültürde homojen olarak dağılım göstermemiştir. Hücrelerin farklı alt kültürlerinde de farklı yoğunlukta antijenler saptandığından DPSC populasyonunun heterojen karakterde olduğu belirtilmiştir (Gronthos ve ark., 2000; Shi ve ark., 2005). DPSC lerin immün sistemleri baskılanmış farelere transplantasyonu sonucunda dentin pulpa kompleksi benzeri bir yapı oluşturma kapasitesine sahip olduğu gözlenmiştir (Gronthos ve ark., 2000; Batouli ve ark., 2003; Shi ve Gronthos, 2003). DPSC ler ile yapılan çalışmalardan elde edilen veriler ışığında bu hücrelerin hızlı çoğalma kapasitesine sahip, multipotent stromal hücrelerdir. DPSC ler güvenle dondurularak saklanabilen, farklı yapı iskelelerine uyum sağlayabilen, uzun ömürlü, immünolojik olarak baskılanmış özellikler gösteren ve dentin benzeri mineralize dokular oluşturabilen hücreler olarak tanımlanmıştır (Gronthos ve ark.,2000; Gronthos ve ark., 2002; Yu ve ark., 2006; Zhang ve ark., 2006; Jo ve ark., 2007; Kitagawa ve ark., 2007; d Aquino ve ark., 2007; d Aquino ve ark., 2009). 1.2.2.2. Düşme Zamanı Gelmiş Süt Dişi Pulpası Kök Hücreleri (SHED) Süt dişinin yerini daimi dişe bırakma süreci, süt dişinin kökleri erirken daimi dişin sürmesini içeren dinamik bir olaydır (Rimondini ve Mele, 2009).

12 Fizyolojik düşme zamanı gelmiş süt dişlerinin pulpalarından kök hücre elde edilmesi ilk olarak 2003 yılında gerçekleştirilmiştir. Araştırıcılar, çalışma sonucunda kalan pulpa dokusundan kollajenaz/dispaz enzimatik reaksiyonu sonucunda 12-20 arasında koloni oluşturma yeteneğine ve güçlü proliferasyon kapasitesine sahip kök hücrelerin varlığından bahsetmişlerdir. Kemik iliği kök hücreleri ve DPSC ler ile karşılaştırıldığında, SHED lerde daha yüksek proliferasyon kapasitesi ve hücre sayısını iki katına çıkarma hızı saptanmıştır (Miura ve ark., 2003). SHED ler, düz kas (α-sm actin), kemik (alkalen fosfataz, tip1 kollajen, osteonektin, osteopontin, osteokalsin) ve fibroblastlar (tip III kollajen) ile ilgili yüzey antijenlerini farklı alt populasyonlarda farklı ekspresyon yoğunluklarda göstermişlerdir (Shi ve Gronthos, 2003; Shi ve ark., 2005). Bu sebeple SHED lerin multipotent kök hücre populasyonunu simgelediği ve daha heterojen karakterde, olgunlaşmamış hücre grubu olduğu düşünülmektedir (Miura ve ark., 2003; Huang ve ark., 2009). In vivo değerlendirilmede ise immün sistemleri baskılanmış farelere bu hücrelerin transplasyonu sonucunda DPSC lerin aksine SHED ler dentin pulpa kompleksi benzeri bir yapı oluşturmamışlardır (Miura ve ark., 2003). SHED ler İmmatür DPSC ler olarak da adlandırılmıştır (Kerkis ve ark., 2006). Hücrelerin osteojenik, adipojenik, kondrojenik ve miyojenik farklılaşması da çalışmalarla gösterilmiştir (Miura ve ark., 2003; Kerkis ve ark.,2006). Osteoindüktif potansiyelleri sayesinde SHED lerin kritik boyuttaki kafatası kubbesi defektlerini tedavi etmede kullanılmıştır. Bu çalışma sonucunda süt dişlerinin sadece daimi diş sürmesinde bir rehber olmadığı, aynı zamanda daimi diş sürmesi sırasında kemik oluşumunda da görev aldığı bulgulanmıştır (Seo ve ark., 2008). SHED lerin esas avantajı mineralize doku oluşturarak orofasiyal kemik rejenerasyonunda kullanılabilmesidir (Papaccio ve ark., 2006; Seo ve ark., 2008 ). SHED lerin doku mühendisliği alanında kullanımları, daha hızlı çoğalmaları, değişecek olan bir dokudan elde ediliyor olması ve ulaşım kolaylığı gibi faktörler göz önünde bulundurulduğunda DPSC lere göre daha avantajlıdır (Miura ve ark., 2003; Condeiro ve ark., 2008).

13 1.2.2.3. Apikal Papilla Kök Hücreleri (SCAP) Apikal papilla, gelişen daimi dişlerin kök ucunda bulunan yumuşak dokudur (Sonoyama ve ark., 2006; Sonoyama ve ark., 2008). Kök gelişimi tamamlanmamış insan dişleri gelişen bir organdır. Apikal pulpada proliferasyon ve farklılaşmayı da içine alan dinamik biyolojik reaksiyonlar meydana gelerek kök gelişimi tamamlanmaktadır. Bu yüzden kök gelişimini tamamlanmamış diş pulpasında kök hücrelerin varlığından bahsedilmiştir (Abe ve ark., 2007). Apikal papilla kök hücreleri Sonoyama ve ark., tarafından 2006 yılında tanımlanmıştır. Hücreler insan dişinin kök açıklığının dış kısmından izole edilmiştir. DPSC ler ve SHED lerde olduğu gibi SCAP ler de in vitro olarak uyarana göre osteojenik ya da adipojenik farklılaşma kapasitesinde olduğu bulunmuştur (Sonoyama ve ark., 2006; Abe ve ark., 2007; Ding ve ark., 2010). SCAP lerin uyarım olmadan da bazı nöral belirteçlere karşı pozitif sonuç verdiği, nöral stimülasyon yapıldığında ise yeni belireçlerin de ekspresyonlarının izlenmektedir (Abe ve ark., 2007). Dental pulpa ile apikal papilla arasındaki fark, apikal papillanın radiküler pulpanın öncüsü olmasıdır. Bu bakış açısından değerlendirildiğinde SCAP lerin koronal pulpada dentin oluşumundan sorumlu olan odontoblastlara farklılaşan kök hücrelere benzerlik göstermesi beklenmektedir. Apikal papilla pulpaya dönüştükten sonra SCAP lerin DPSC lere mi dönüştüğü yoksa farklı hücre tipi olarak hücre havuzunda mı bulunduğu daha netlik kazanmamıştır (Huang ve ark., 2009). SCAP lerin kök dentininin oluşumundan sorumlu olan primer odontoblastların kaynağı olduğu, DPSC lerin ise reperatif dentin üretmekten sorumlu olan odontoblastların yerlerini doldurmadan sorumlu hücreler olduğu düşünülmektedir. SCAP lerin gelişen dokudan izole edilmesi de bu hücrelerin potansiyelleri konusunda dikkati çekmektedir (Huang ve ark., 2009).

14 SCAP ler kullanıldığında DPSC lere göre daha yüksek kapasitede dentin rejenerasyonu sağlanmıştır. Bunun sebebi olarak da SCAP lerin embriyonik benzeri bir dokudan orijin almaları gösterilmiştir (Sonoyama ve ark., 2006; Ding ve ark., 2010). 1.2.2.4. Periodontal Ligament Kök Hücreleri (PDLSC) Periodontal ligament, sement ile alveol kemiğinin iç duvarı arasında sıkışmış ve dişi çeneler içinde destekleyen ve tutmaya yardım eden yumuşak bağ dokudur (Seo ve ark., 2004; Rimondini ve Mele, 2009). Süt dişi ve daimi diş pulpasından mezenşimal kök hücre izolasyon metodu kullanılarak ilk kez Seo ve arkadaşları tarafından 2004 yılında insan periodontal ligamentinde bulunan multipotent postnatal kök hücrelerin varlığından bahsedilmiştir. Periodontal ligament kök hücrelerinin farklı indüksiyon ortamlarında yağ ve kemik dokusuna farklılaşma potansiyelleri araştırılmış ve 3 haftalık adipojenik indüksiyon sonucunda Oil-red-O pozitif boyanma saptanmış, 4 haftalık osteo/odontojenik indüksiyondan sonra da Alizarin red pozitif boyanma saptanmıştır (Seo ve ark., 2004). Sonoyama ve ark. nın (2006) PDLSC leri immün sistemi baskılanmış farelere transplante ettikleri çalışmalarının sonuçlarından yola çıkarak PDLSC ler kullanılarak fonksiyonel periodonsiyumun başarıyla yapılabileceği vurgulanmıştır. PDLSC lerin kullanımının klinik potansiyeli, hücrelerin dondurularak saklanmış periodontal ligamentten izole edildikten sonra bile kök hücre karakteristiklerini korumaları, mezenşimal kök hücre yüzey belirteçlerini göstermeleri, multipotansiyel farklılaşma kapasiteleri sayesinde hazır mezenşimal kök hücre kaynağı olarak kullanılabilmeleri açısından önem kazanmıştır (Seo ve ark., 2005).

15 1.2.2.5. Dental Folikül Öncü Hücreleri (DFPC) Dental folikül, gelişen diş jerminin mine organı ve dental papillasının etrafını çevreleyen ektomezenşimal dokudur. Bu doku periodontal ligament, sement ve alveol kemiğini oluşturan öncü hücreleri içermektedir (Felthaus ve ark., 2010). Öncü hücreler ilk olarak Morsczeck ve ark. (2005) tarafından gömülü üçüncü büyük azı dişlerinin folüküllerinden izole edilmiştir. Hücrelerde farklılaşmamış hücrelere özgü yüzey antijenlerinden olan Notch-1 ve Nestin ekspresyonu izlenmiştir. Hücre morfolojisi fibroblast benzeri şekilde olup osteojenik yönde farklılaşması izlenmiştir. Dental folikül öncü hücreleri uygun ortamlarda yağ hücrelerine, kemik hücrelerine, sement hücrelerine ve sinir hücrelerine dönüşebilmektedir (Kemoun ve ark., 2007; Felthaus ve ark., 2010). 1.2.3. Dental Dokulardan İzole Edilen Kök Hücreler ile İlgili Çalışmalar Gronthos ve ark. (2000), insan daimi diş pulpa hücrelerinden kolonojenik, hızlı prolifere olabilme özelliğine sahip hücre populasyonu izole etmeyi başardıkları çalışmalarında elde ettikleri hücreler ile kök hücre karakteristikleri hakkında bilgi sahibi olunan kemik iliği stromal hücrelerini karşılaştırmışlardır. İnsan daimi dişi pulpasında koloni oluşturma yeteneğine sahip olan hücrelerin çoğalma hızı kemik iliği stromal hücrelerinden daha fazla bulunmuştur. Bu hücrelerin in vitro ortamdaki farklılaşma potansiyelleri de incelenmiş ve deksametazon ile 6 hafta boyunca sitimüle edilen hücrelerde odontoblast benzeri hücrelere dönüşme potansiyeline rastlanmıştır. Elde edilen hücrelerin immun sistemi baskılanmış farelere transplantasyonu sonucunda dentin-pulpa benzeri yapı oluştuğu gözlenmiştir. Miura ve ark. (2003), eksfoliyasyon zamanı gelmiş süt dişlerinin pulpalarında, yüksek proliferasyon özelliği olan, klonojenik sinir hücreleri, yağ hücreleri ve odontoblastları da içine alan çeşitli hücre türlerine dönüşebilme yeteneğine sahip hücreler izole etmişlerdir. Yaklaşık olarak her eksfoliye keser dişten elde edilen 12-

16 20 hücrenin koloni oluşturabilme kapasitesine sahip olduğunu göstermişlerdir. Bu çalışma süt dişinden kök hücre elde edildiği ilk çalışmadır. Elde edilen kök hücrelerin transjenik farelere in vivo transplantasyonu sonrasında bu hücrelerin kemik oluşumunu indüklediği, dentin oluşturduğu ve farenin beyninde sinir hücrelerine farklılaştığı saptanmıştır. Seo ve ark. (2004), 25 insan üçüncü büyük azı dişini kullandıkları çalışmalarında insan periodontal ligament kök hücrelerini izole etmişler ve immünositokimyasal boyamalar, RT-PCR, nerthern ve western blot analizlerini kullanarak hücrelerin kök hücre belirteçleri bakımından değerlendirmişlerdir. Çalışmaların sonuçlarından yola çıkarak periodontal ligament kök hücrelerinde mezenşimal kök hücre belirteçleri olan STRO-1 ve CD146/MUC18 izlenmiştir. Farklı kültivasyon ortamlarında hücrelerin sementoblast benzeri hücrelere, yağ hücrelerine ve kollajen üreten hücrelere farklılaştığı saptanmıştır. Hücrelerin immün sistemleri baskılanmış farelere transplantasyonu sonucunda PDLSC lerin sement/ periodontal ligament benzeri bir yapı oluşturduğu bulgulanırken bu hücrelerin periodontal doku tamirinde görev yaptığına değinilmiştir. Morsczeck ve ark. (2005), insan daimi üçüncü büyük azı dişi folikülünden öncü hücreleri izole ettikleri çalışmalarında, öncü hücrelerin gen ekspresyonlarını mezenşimal kök hücreler, periodontal ligament hücreleri ve osteoblastlar ile karşılaştırmışlardır. Uzun dönem deksametazon ile kültivasyonu sonucunda kompakt kalsifiye nodüller saptanmıştır. İmmün sistemi baskılanmış farelere transplantasyon sonucunda sement ve kemik oluşumu gözlenmeksizin ostekalsin ve kemik sialoproteini ekspresyonları izlenmiştir. Sonuç olarak araştırıcılar folikül öncü hücrelerinin diş sürmesinden önce ya da diş sürmesi sırasında periodonsiyum oluşumunda görev alan farklılaşmamış hücre topluluğu olduğuna değinmişlerdir. Laino ve ark. (2005), 30-35 yaşları arasındaki sağlıklı bireylerden elde ettikleri kök hücreleri kullandıkları çalışmalarında diğer çalışmalardan farklı olarak kök hücreler c-kit, CD34 ve CD45 ekspresyonlarına göre incelenmiş ve c-kit ve CD34 pozitif hücreler seçilerek çoğaltılmıştır. Seçilen hücrelerin koloni oluşturma kabiliyetleri yüksek, osteoblast öncü hücrelerine farklılaşabilen, kendini yenileme kabiliyetini

17 koruyan daha sonra osteoblatlara farklılaşarak canlı otolog fibröz kemik dokusu oluşturabilen hücreler olduğu bulunmuştur. Bu hücrelerin immün sistemi baskılanmış farelere transplantasyonu sonucunda osteosit içeren lamellar kemik oluşturduğu saptanmıştır. Laino ve ark. (2006a), 19-37 yaşları arasındaki hastalardan çekilmiş gömülü üçüncü büyük azı dişlerinden elde ettikleri kök hücreleri kullandıkları çalışmalarında, pulpanın yüksek miktarda kök hücre içerdiğini ve bu hücrelerin farklı tipte hücrelere farklılaşma kabiliyetinin olduğu en fazla da osteoblastlara farklılaşma yeteneğinin olduğunu saptamışlardır. Doku rejenerasyonundaki en önemli sorunlardan biri olan otolog kemik greftlerinin yerine geçebilecek hücre kaynağı olarak değerlendirilebileceğine değinmişlerdir. Kerkis ve ark. (2006), 5-7 yaş arası çocukların fizyolojik düşme zamanı gelmiş süt dişi pulpa hücrelerini yapıştırma tekniği kullanarak çoğalttıkları ve bu hücreleri immatür pulpa kök hücreleri (IDPSC) olarak adlandırdıkları çalışmalarında 25 hücre pasajlamasında hücrelerin karyotiplerini koruduklarını ve bazı embriyonik ve mezenşimal kök hücre belirteçlerinin ekspresyonlarının izlendiğini saptamışlardır. Hücrelerin farklı kültür vasatlarında düz kas, iskelet kası, nöron, kıkırdak ve kemik hücrelerine farklılaştığı ve bu hücrelerin immün sistemi baskılanmış farelere transplantasyon sonucunda organize dokuları oluşturmaları ile IDPSC lerin klinik kullanımları için uygun olabileceği ancak konu ile ilgili daha fazla çalışmalara ihtiyaçları olduğu araştırıcılar tarafından vurgulanmıştır. Papaccio ve ark. (2006), uzun süre dondurmanın pulpa kök hücrelerinin morfolojik yapısı, fonksiyonel özellikleri ve farklılaşma kapasiteleri üzerine etkilerini değerlendirdikleri çalışmaları için hücreleri 2 yıl dondurmuşlardır. Çalışma sonucunda çözülen hücrelerin morfolojik yapısı, fonksiyonel özellikleri ve farklılaşma kapasitelerinin değişmediği sonucuna varılmıştır. Osteojenik yönde farklılaştırılan hücrelerin in vivo transplantasyonu sonucunda üç boyutlu lameller kemik oluşturabilme kapasitesinde olduğu da saptanmıştır.

18 Zhang ve ark. (2006), DPSC leri 5 farklı kültür ortamında 5 farklı türde hücreye dönüştürmüşler ve sonuçlar morfolojik olarak, immün sitokimyasal boyamalar ve RT-PCR ile değerlendirilmiştir. Araştırıcılar, sıvı azotta dondurulduktan sonra çözülerek kullanılan pulpa kök hücrelerinin bile kök hücre kaynağı olarak kullanılabileceğini ileri sürmüşlerdir. Suchánek ve ark. (2007), DPSC leri ve SHED leri kemik iliği kök hücreleri ile karşılaştırdıkları çalışmalarında, DPSC ler ile kemik iliği kök hücrelerinin birbirine benzer biyolojik özelliklerinin olduğu ve kök hücre özelliklerinde de benzerlikler bulunduğunu belirtmişlerdir. Çalışmalarında DPSC kültürlerinde iki farklı kök hücre populasyonundan söz etmişler, bu hücrelere ait iki farklı morfolojinin bulunduğuna değinmişlerdir. Sonuçlarını değerlendirdiklerinde, yüksek farklılaşma ve proliferasyon kapasiteleri olan DPSC lerin kolaylıkla elde edilmeleri sebebiyle tedavi amacıyla kullanılabilecek kök hücre kaynağı olduğuna dikkati çekmişlerdir. Wei ve ark. (2007), DPSC lerin mineralizasyon kapasitesi ve odontoblast farklılaşmasına ait belirteçleri değerlendirmeyi amaçladıkları çalışmalarında DPSC leri odontojenik, adipojenik ve kondrojenik nesillere farklılaştığını, 21 günlük osteojenik indüksiyon sonucunda alkalen fosfataz aktivitesinde artış gözlendiği saptanmıştır. Real time RT-PCR ile OC, DSPP ve MEPE ekspresyonlarının zamana bağlı olarak indüksiyon ortamlarına göre arttığı saptanmıştır. Arthur ve ark. (2008), DPSC, SHED ve insan sünnet derisi fibroblastlarını kullandıkları çalışmalarında, uygun ortamlarda elde edilen kök hücrelerin aktif nöronlara farklılaşma kapasitelerini değerlendirmişlerdir. Sünnet derisi fibroblastlarının ve nöronal morfoloji sergileyerek sinir hücrelerine ait belirteçleri gen ve protein düzeyinde eksprese eden pulpa kök hücrelerinin in vivo tavuk embriyolarına transplantasyonu sonucunda DPSC lerin nöronal morfoloji sergilediği saptanırken sünnet derisi fibroblastları iğsi şekillerini korumuşlardır. Çalışmanın sonunda araştırıcılar DPSC lerin ve SHED lerin nörolojik hastalıklarda kök hücre kaynağı olarak kullanılabilirliğine değinmişlerdir.

19 Carinci ve ark., (2008), kollajenaz/ dispaz enzimatik reaksiyonu sonucunda elde ettikleri DPSC leri kullandıkları çalışmalarında bu hücrelerden farklılaşan osteoblastlar ile normal osteoblastların genetik yapılarını karşılaştırmışlardır. Araştırıcılar, DNA mikrodizi tekniği ile insan genomunun belirli bir bölümü ile 19200 gen kullanılarak iki hücre arasındaki genetik yapı farklılıklarını belirlemiştir. Buna göre, pulpa kök hücrelerinin farklılaşması sonucunda meydana gelen osteoblast hücrelerinde bazı genlerin ekspresyonlarında belirgin bir şekilde artış ya da azalma gözlenmiştir. Farklılık gösteren genlerin hücre farklılaşmasının, gelişimsel maturasyon, hücre adezyonu ve hücre iskeleti elemanlarının üretilmesi ile alakalı olduğu saptanmıştır. Araştırmacılar, bu farlılıkların farklılaşan osteoblastların olgunlaşma evreleri ile alakalı olabileceği görüşündedirler. Cordeiro ve ark. (2008), insan büyük azı dişi parçalarını SHED ler için biylojik yapı iskelesi olarak kullanmışlar ve immün sistemi baskılanmış farelere transplante ederek oluşan dokunun morfolojik karakterini belirlemişlerdir. 2 haftalık transplantasyonun sonunda oluşan dokunun yapısal ve hücresel olarak fizyolojik diş pulpasına çok benzediğini saptamışlardır. TEM ve immünohistokimyasal değerlendirmede ise SHED lerin odontoblast benzeri hücrelere ve endotel benzeri hücrelere farklılaştığı bulgulanmıştır. Çalışmanın sonucu olarak da SHED lerin pulpa doku mühendisliği çalışmaları için etkin bir kök hücre kaynağı olabileceği vurgulanmıştır. Zhang ve ark. (2008), izole ettikleri DPSC leri 4 değişik farklılaştırma vasatında 3 hafta boyunca inkübe ettikleri çalışmalarında hücrelerin fenotipleri ve belirli belirteçlerin ekspresyon miktarlarına RT-PCR ile bakılmıştır. İndüklenen hücrelerin in vivo transplanrasyonu sonucunda odontojenik, kas ve yağ hücrelerine farklılaştığı saptanmıştır. İndüksiyon yapılmayan DPSC lerde spondan olarak odontojenik ve yağ hücrelerine farklılaşma izlenmiştir. Histolojik incelemede ise sınırlı, olgun morfolojik farklılaşma izlenmiştir. Araştırıcılar, DPSC lerin doku mühendisliği çalışmalarında ve kök hücre bazlı tedavilerde kullanıma uygun olduğu ancak konu ile ilgili daha fazla çalışmanın yapılması gerekliliğini vurgulamışlardır. Casagrande ve ark. (2009) çalışmalarında SHED lerin odontoblastlara farklılaşmasını sağlamak için rhbmp-2 kullanmışlardır. In vitro olarak diş parçası/