Flow Sitometri ve Kullanım Alanları

Elektronik Mikrobiyoloji Dergisi TR (Eski adı: OrLab On-Line Mikrobiyoloji Dergisi) Yıl: 2008 Cilt: 06 Sayı: 2 Sayfa: 01-18 www.mikrobiyoloji.org/pdf/702080201.pdf Flow Sitometri ve Kullanım Alanları İsmail Karaboz 1, Esra Kayar 2, Suna Akar 3 01. Giriş Flow sitometri, hücre veya partiküllerin akmakta olan bir akışkanın içindeyken karakteristiklerinin ölçülmesidir. Akım sitometrisi ile bir süspansiyon halindeki hücre ya da partiküller, lazer ışığı ile aydınlatılmakta olan bir bölmeden geçirilir; hücrelerin ışığın önünden geçerken verdikleri sinyaller toplanarak analiz edilir. Oluşan sinyallerin kaynağı, hücrenin büyüklük, granülarite gibi fiziksel özellikleri olabildiği gibi; hücreye bağlanan çeşitli fluorokromlar da olabilir. Böylece hücre ya da partikülün immunfenotipi, DNA içeriği, enzim aktiviteleri, hücre membran potansiyeli, canlılığı gibi çeşitli özellikleri hakkında bilgi toplanabilir (1). Flow sitometrilerin fluorosen olmayanları tam kan hücresi sayımları için klinik laboratuarlarda kullanılır. Daha çok yönlü araştırmalar için fluorosen olanları kullanılır. Bunlara sitofluorometre denir. Flow sitometriler birçok biyolojik araştırma enstitüsünde ve tıp merkezlerinde bulunur. Bunlardan dünyada yaklaşık 7 bin tane vardır. Tıp merkezlerinde araştırmanın yanında tanı için de kullanılır. Ayrıca kanserli hücre tanısında ve AIDS hastalarının kanında CD4 lenfosit seviyesinin izlenmesinde de kullanılır (2). 02. Flow Sitometrinin Çalışma Prensibi Her bir hücre veya partikül lazer demetinin içinden geçerken saptırılan lazer ışığı ve hücreler tarafından yayınlanan fluorosen ışığı bir araya getirilip, optik filtreler ve aynalar tarafından farklı dalga boylarına göre ayrılarak, analog sinyallere dönüştürülürler. Bu sinyaller dijitalleştirilerek, histogramlar olarak ekrana aktarılır. Histogram, ölçülen parametrelerin frekans dağılımlarının görsel sunumudur (1). Ölçüm sırasında hücreler canlı veya sabit olmalıdır, ayrıca sıvı içinde hücreler tek tek askıda olmalıdır. Hücreleri içeren süspansiyon sürekli bir akışla lazer ışını içinden geçmelidir. Her bir hücre lazer ışığının bir kısmını saptırır ve aynı zamanda lazer tarafından uyarıldıklarından yani ekstra enerji yüklenmiş olduğundan, fluorosen ışığı yayarlar (2). 1 Prof. Dr., Ege Üniv., Fen Fakültesi, Biyoloji Blm., Temel ve Endüstriyel Mikrobiyoloji AbD, Bornova, İzmir. Yazışmalardan sorumlu yazarın E-posta adresi: ismail.karaboz@ege.edu.tr 2 Uzman Mikrobiyolog, Ege Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Dahili Tıp Bilimleri Bölümü, Gastroenteroloji Bilim Dalı, 35100 Bornova, İzmir 3 Uzman Mikrobiyolog 1

Sitometri her bir hücre için aynı anda birçok parametre ölçer: -Hücre çapı ile yaklaşık orantılı olarak düşük açıda ileri saçılma yoğunluğu -Hücre içindeki granül yapı sayısı ile yaklaşık orantılı olarak ortogonal (90 ) saçılma yoğunluğu -Birçok dalga boyundaki fluoresen yoğunluğu Fluorosen yoğunluğu her bir hücre için eş zamanlı olarak birçok farklı dalga boylarında ölçülür. Fluorosen propları hücrelerin spesifik bileşenlerinin sayılarını rapor etmek için kullanılır. Fluorosen antikorlar daha çok spesifik yüzey reseptörleri yoğunluklarının rapor edilmesinde kullanılır ve böylece geçiş genleri ifade eden hücreler de dahil olmak üzere farklılaşmış hücre tiplerinin alt populasyonları da belirlenir. Bunlar fluorosen hale getirilerek, virüslerin veya hormonların yüzey reseptörleri ile bağı ölçülebilir. Hücreler arası bileşenler ile toplam DNA/ hücre (hücre çevrimleri analizlerine izin verecek şekilde), yeni sentez edilmiş DNA, DNA veya mrna oluşturan özel nükleotid flamentoz aktin ve antikor elde edilebilecek herhangi bir yapıyı kapsayacak şekilde fluorosen proplar ile veriler toplanabilir (2). Flow sitometri aynı zamanda hücreler arası serbest kalsiyum, zar potansiyeli, ph veya serbest yağ asitlerindeki hızlı değişiklikleri de izleyebilir (2). Flow sitometriler; akışkanlar, lazer optikler, elektronik dedektörler, analog dijital çevrimciler ve bilgisayarları içerir. Optik kısım lazer ışığı yayar ve ışını birkaç hücre çapının oluşturduğu demet üzerine odaklar (2). 03. Flow Sitometri Uygulamaları için Yapılan Hazırlıklar 03.01. Hücre konsantrasyonunun belirlenmesi Flow sitometri ile analiz edilen hacimler çok küçük olduğu için, yaklaşık 10 3 /ml den az olanlar konsantre edilmelidir. Hazırlık sırasında; -Santrifüj -Teğetsel akış filtrasyonu -Polikarbonat zar filtreleri -Gravitasyon filtrelemesi (nükleopor) uygun işlemler olarak ön plana çıkar (3). 03.02. Kalibrasyon ve Önemi Çok yüksek doğruluk oranlarında (örneklerde bol hedef dışı partikül varsa), sitometriler, sinyalleri değerlendirirken, bazı hedef hücreleri kaçırabilirler. Araçların kalibrasyonu, kaçan hücrelerle ilgili doğrulamayı sağlar. Bu yüzden, örneklerin hücre konsantrasyonu da kalibre edilmiş olmalıdır (3). 2

03.03. Hücrenin optik özelliklerinin belirlenmesi İleri ışık saçılmaları hücre boyutu ile ilgili bilgiler verir. Fluorosen ile boya içeriği belirlenir. Parametrelerin her biri için hücre sinyalleri bölünerek, her bir populasyon için normalize edilebilir. Eğer logaritmik amplifikatör kullanılırsa, veriler genellikle bu normalizasyon yapılmadan önce lineerleştirilir (3). 03.04. Hücre gruplaması (Cell Sorting) ekil 1. Flow sitometri genel çalışma prensibi. Örnek cihaza konur, boyalı hücreler borudan tek tek akarak lazer ışınından geçirilir ve hücreler ışık saçılımı ile fluorosen verir ve yüklerine göre ayrılırlar. Bazı sitometrilerin hücrelerin tüplere konuşu sırasında agar plaklar üzerinde direkt gruplanması mikrobiyologlar için bir avantajdır. Farklı bakteri, maya ve fungus türleri için, farklı görüntüleme ve hücre gruplama stratejileri olmalıdır (3). Hücre gruplayıcılar Bazı akışkan sitometriler partikülleri fiziksel olarak gruplayabilir (3). -Damlacık Saptırma (Droplet deflection) gruplayıcıları: Damlacık içeren hücreye elektrik yüklenir. Örnek elektrikli alandan geçerken, yüklü damlacıklar toplama cihazına sapar. Bu gruplayıcılar hızlıdır.10.000 hücre/sn. de gruplanabilir (3). -Mekanik gruplayıcılar: Hücreler akışkandan geçerken toplanıp, yakalama tüplerinde biriktirilir. Yavaştır.100 hücre/sn. gruplanabilir. Ucuzdur. Düzeneklerin kurulması ve kullanılması kolaydır (3). 03.05. Örnek Ekstraksiyonu ve Hazırlanışı Flow sitometri serbest partiküllü tuzlu çözelti içerisinde serbestçe asılı duran hücre tiplerini analiz edebilir. Örnek türüne bağlı olarak birçok teknik uygulanabilir (4). 03.06. Etiketleme Flow sitometri, hücre yüzeyinde veya içindeki spesifik kimyasalların varlığına çok bağlıdır. Hücreler çok küçüktür ve doğal olarak güçlü fluorosen veren molekülleri yoktur. Bu yüzden hücreler etkili fluorosen yayan kimyasal boyalarla etiketlenir. 3

Hücreler hakkında spesifik bilgiler elde etmek için bu kimyasal boyalar yüzeydeki hücre moleküllerine veya hücre içine biyolojik olarak tutturulur (4). ekil 2. Yardımcı ve öldürücü T hücreleri lazer ışını etkisiyle fluorosen verebilmeleri için kimyasal boyalarla etiketlenirler. ekil 3. Örnek flow sitometri cihazındaki kılıf kısmının merkezine enjekte edilir, toplam örnek süspansiyonu kılıfın çapında azalır ve hücreler tek tek akmaya başlar. Bu şematik akım yeri, algılama bölgesindeki lazer ışını ile ilgilidir. 03.07. Tek sıra akışı Etiketlenmiş hücrelerin bulunduğu çözelti dar bir bölgeden akıtılır ve içindeki hücreler tek sıra akışı şeklinde geçmeye zorlanır. Bu durum dar, kılcal tüpler kullanılarak veya hidrodinamik odaklanma ile sağlanır (4). 03.08. Lazer Aydınlatması Lazer ışığı, akan örnek üzerinde hücreleri aydınlatmak üzere odaklanır. Hücrelere bağlı boya etiketler optik olarak uyarılır ve fluorosen yayar. Bir molekül hücrenin hızına ve odaklanan ışığın büyüklüğüne bağlı olarak farklı sayılarda yayınlanma yapar (4). 4

03.09. Fluoresenlerin Toplanması ve Aranması Üretilen fluoresen ışığı her yere yayılır. Bu ışınlar mümkün olduğunca çok miktarda bir yerde toplanır, saçılan lazer ışınları filtre edilir (4). 03.10. Veri Analizi ekil 4. Hücre süspansiyonun borudan akışı ve hücrelerin lazer ışınından geçerek küresel ve oval hücrelerin birbirinden ayrılması. Hızlı dedektörler ve sinyal oluşturan ekipmanların flow sitometri de kullanılması kritik önem taşır. İyi dizayn edilmiş ekipmanlarla dakikada 100 bin hücre analiz edilebilir (4). Flow sitometri, sucul mikrobiyal populasyonlarla ilgili yapılan çalışmalarda önemli bir araçtır. Flow sitometri teknolojisi, süspansiyondaki bireysel hücrelerin çoklu özelliklerinin eşzamanlı ölçümlerine izin verir (4). ekil 5. Bilgisayar programında verilerin ışık saçılımı ile verdiği histogram sonuçları. 5

Flow sitometri, memelilerin hücre sistemleri için geliştirilmesine rağmen, bireysel hücrelerin yapısal ve fonksiyonel özelliklerini belirtmekte ve değerlendirmedeki yetenekleri sebebiyle deniz mikrobiyal ekolojisi uygulamaları için de uygundur. 1980'lerin başlarından itibaren deniz mikrobiyal ekolojisindeki flow sitometri uygulamaları sürekli artış göstermiştir. Deniz mikrobiyal ekolojisinde pikoplanktonlar gibi çapı 2 µm'den az olan hücrelerin belirlenmesi ve sayımı için flow sitometri gereklidir. Okyanuslardaki besin zincirinin anlaşılmasında pikoplanktonların öneminin anlaşılması temel değişiklikler oluşturmuştur (5). Mikrobiyal populasyonların analizinde, özellikle çok düşük ve zayıf fluorosenli fotosentetik pikoplankton olan Prochlorococcus ların ayrıntılı analizi için flow sitometrinin optik özelliklerinin çok yüksek duyarlılıkta olması gerekir (5). Flow sitometri ile hücrelerin ileri saçılma ve fluorosen yoğunluğu ile pelajik bakteri populasyonları, hücre boyutları, DNA ve biyokütle dağılımları belirlenebilir. Yüksek çözünürlüklü flow sitometrinin akuatik bakterilerin dağılımı ve aktivitelerinin belirlenmesinde kullanımının: -Büyük örnek boyutlarına göre bireysel hücre parametrelerinde istatistiksel doğruluk (analiz başına 100'den 100 bin hücreye) -İstenenlere ve boyuta bağlı olarak, 5-30 dakikada populasyonların karakterize edilme hızı gibi avantajları vardır (6). 04. Flow Sitometri ile Bakteri Aranması ve Canlı-Ölü Ayrımı Mikrobiyolojik birçok uygulamada canlı, ölü ve toplam bakteri belirlenmesinin tam olarak belirlenmesi önemlidir (7). Geleneksel olarak, bakterilerdeki uygulanabilirlik kolonilerin katı gelişme ortamlarında oluşabilmesi ve sıvı besiyerinde hızla çoğalma ile aynı anlama gelir. Bu geleneksel kültür tabanlı testler fazla zaman alır ve yavaş gelişenler için uygun değildir. Başlangıçta ökaryotik hücrelere uygulanan flow sitometri, daha sonra bakterilerin uygulanabilirlik analizleri, metabolik safhalar ve antijenik işaretlenmelerine adapte edilmiştir. Flow sitometri özellikle bir örnekteki canlı bakterilerin sayımlarında kullanılır (7). 05. Mikrobiyologlar Açısından Flow Sitometri Mikrobiyologlar açısından flow sitometrik metodun en önemli özelliği, her bireysel hücre için veri toplanmasıdır. Bu durum, araştırmacının bir populasyon içindeki dağılım özelliğini veya özelliklerini ölçebilmesini sağlar (8). Mikrobiyal populasyonlardaki heterojenlik, birçok farklı kaynaklar sebebiyle oluşur. Genetik farklılıklar, mutasyon ve plazmid eksikliği sonucunda artış gösterir. Ayrıca heterojenlik, hücre çevrimindeki farklılıklara sebep olur. DNA içeriğini flow sitometrik ölçümü, heterojenitenin belirlenmesi ve anlaşılmasında, antibiyotiklerin ve diğer çevresel uyarıcıların etkilerinin anlaşılmasında önemlidir (8). 6

Son zamanlarda Withers ve Nordström flow sitometri kullanarak, E.coli 'de kromozom replikasyonunun hücre dışı faktörlerle düzenlendiğini göstermişlerdir. Heterojenitenin bir diğer sebebi de, farklı fizyolojik seviyelerdir. Agar plaklarında gelişen kolonilerin kenar ve ortasındaki hücreler farklı lokal çevrelere ve onların genetik regülasyonlarının etkisinde kalır ve bu durumun sonucunu heterojenite olarak yansıtırlar (8). Mikrobiyal kültürler bu yüzden alt populasyon serilerinden oluşur. Farklı hücresel hedeflerle leke karışımı kullanımını içeren çok parametreli flow sitometri, alt populasyonların tanımlanmasında kullanılabilir. Bu yaklaşım, doğru ölçüm şartları altında değişime uğramış olanları veya kontaminasyonları belirlemede kullanılır (8). 06. Giardia lamblia Varlığının Test Edilmesi ve Canlılığının Değerlendirilmesi için Flow Sitometri Optimizasyonu Giardia lamblia insanlarda diyareye yol açar. Bulaşma kaynağı su ve gıda ile yayılan bulaşmanın yanı sıra fekal ve oral yollarla olmaktadır. Sulara ve dışkılara uygulanan metotlar kist konsantrasyonuna bağlıdır, bu yüzden kist tespiti için zaman alan geleneksel mikroskobik inceleme yapılır. Daha iyi ayırt edebilmek antijen ile olabilir fakat kesin varlığı önceden bilinemez (9). Moleküler genetik çalışmalar rutin analizler için karışık ve zordur. Bu yüzden Giardia lamblia 'nın tespiti spesifik flow sitometrik protokolün optimizasyonu ile olabilir. Canlılık çalışmaları, bulaşma riskinin ve tedavi izleniminin değerlendirilmesi için ve aynı zamanda flow sitometrinin performansının ölçülmesi açısından önemlidir (9). Giardia lamblia kistlerinin derişimi fluorosen etiketli (FL) fare monoklonal antikor (Giardia-a-Glo, su bazlı) ardışık konsantrasyonları ile boyanır ve FACS Calibur cytometer FL1 (525 nm yeşil) (Becton Dickinson, Canada) ile analiz edilir (9). Boyanmış olan kistlerin (2.10 5, 1.10 2 kist/ml) seyreltmeleri istenen limitlerin belirlenmesi için flow sitometri ile analiz edilir. Çapraz reaksiyonlar kullanılan hem prokaryot (Escherichia coli, Staphylococus aureus) hem de ökaryot (Candida albicans, Cryptosporidium parvum ookistleri) mikroorganizmalar için araştırılır. Canlı ve ölü kistlerin süspansiyonları 5 µg/ml propidium iodid (Pl, sigma) ile boyanır, spesifik fluorosenli antikorla birleştirilir ve FL3 (670 nm kırmızı) ile analiz edilir (9). En uygun spesifik antikor konsantrasyonunun 1,5 µg/ml olduğu otofluoresenle histogramdan açıkça görülmüştür. Başlangıçta 2.10 2 kist/ml saptanmıştır. Bakteriler, funguslar veya parazitlerle çapraz bulaşma olmamıştır. Spesifik antikor ve propidium iodid, bu iki fluorosen prob kullanıldığı zaman canlı kistleri ölü olanlardan ayırmıştır (9). Sonuç olarak; flow sitometri Giardia lamblia 'nın varlığının tespiti ve canlılığının değerlendirilmesi açısından başarılı bir sonuç vermiştir (9). 7

07. Yüksek Hidrostatik Basınca Maruz Bırakılan Listeria monocytogenes 'in Fizyolojik Hasarlarının Flow Sitometri ile Analizi 07.01. Bakteriyal Kültürün Hazırlanması Listeria monocytogenes Scott A (CIP 103575) Pasteur enstitüsü koleksiyonundan elde edilmiştir. mikroorganizma -30 o C'de saklanmıştır (10). 07.02. Süspansiyon Ortamının Hazırlanması ve Yüksek Hidrostatik Basınç Muamelesi Basınçlı örnekler 9 ml sitrat tamponu içeren torbalarda 1 ml bakteriyal kültür dilüsyonundan oluşur (10). Her örnek steril mini stomaker torbasında bulunur. Torbalar kapatılıp yüksek hidrostatik basınca maruz bırakılır. Yüksek basınç seviyeleri basınçlanmış kullanılan suyun hidrostatik su çekimi ile üretilir. L.monocytogenes hücreleri 10 dakika 20 C' de 200 ile 400 MPa basınçta bırakılır. Ölen hücrelerin kontrolü için, aynı şekilde hazırlanmış örnekler 121 C' de 15 dakika otoklavlanır (10). 07.03.Flow Sitometri Her hücre süspansiyonundan 1 ml örnek boyanmadan önce santrifüje (12,000 g, 5 dk.) konur ve yaklaşık 10 6 hücre/ml elde edilir. Daha sonra tamponlanmış fosfatlı tuzlu su konur. Hücreler 10 µl propidium iodid (PI, 1mg/ml) veya 10 µl DiBac 4 (3)[bis- (1,3-dibutylbarbituric acid) trimethine oxonol, 10 µmol/lml ile muamele edilir. Flow sitometrik analizden önce, hücre süspansiyonları karanlıkta inkübasyona bırakılır (DiBAC 4 için 37 o C'de 15 dakika, propidium iodid için ise 4 o C'de 2 dakika). DiBAC 4 boyama kontrolü için, hücreler gramisidin (5 veya 50 µmol/l, 10 dakika ;Sigma) ile muamele edilir (3,10). FACScan flow sitometri (Becton Dickinson Immunocytochemistry Systems, San Jose,CA) tek hücreler için ışık saçma ve fluorosen şiddetinin ölçülmesi şeklinde çalışır. Örnekler lazer argon iyonu (488 nm) ile aydınlatılır ve 500-560 nm de cfda, DiBAC 4 (FL1 detektör), 650 nm de PI (FL3 detektör), ve ilerleyen ışık saçılımı aynı şekilde kaydedilir. Toplanmış olan veriler Lizis ІІ programıyla işleme tabi tutulur (10). 07.04. Membran Potansiyel Ölçümü Tetrafenilfosfonyum bromid membran potansiyel ölçümleri için radyoaktif prob olarak kullanılır. 3 H-TPP + (1.4 TBq mmol/l, etanolik çözelti) stok solüsyonundan 100µl örneğe 2 ml yoğun hücresel süspansiyon ilave edilir. Oluşan karışım oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edilir (10). Sonra örnekler 100 µmol/l perklorik asit ve 300 µl silikon yağı 508 V70 (d = 1.03) içeren tüplere tabakalar halinde konur. Daha sonra ise hücreler santrifüj (10,000.g) edilir. Radyoaktivite; hücreler ve yağın üstündeki süpernatantta ölçülür. Işık veren çift etiketlenmiş olan örnekler Betamatik sıvı ışık sayıcı ile sayılır (10). 8

07.05. Sonuçlar 400 MPa basınçta, 10 dakika ph 5.6'da muamele edilmiş olan hücrelerin bazı fizyolojik özellikleri canlı (bu faktörlere maruz bırakılmamış) veya ölü (sıcaklığa maruz bırakılmış) hücreler ile karşılaştırılarak kontrol edilmiştir (10). 07.06. Hücresel Morfoloji L. monocytogenes süspansiyon hücreleri muameleden (sitrat tamponunda 400 MPa, ve 20 o C' de 10 dakika) önce ve sonra gözlemlenmiştir. Ortalama hücresel bir boyut 0,7 µm uzunluğunda ve 0,4 µm çapında olarak ölçülmüştür. Bazı hücreler halen bölünmektedir. Muameleden önce, hücre yüzeyinin düzgün olduğu görülmüştür ( ekil 6). Basınç ile muameleden sonra, hücrelerin yüzeyinde tomurcuk şeklinde yara izleri olmuştur (10). ( ekil 7). ekil 6: Listeria monocytogenes 'in Scaning Elektron Mikroskobunda herhangi bir işlem uygulanmamış hali görülmektedir. ekil 7: Listeria monocytogenes 'te Yüksek Hidrostatik Basıncın Etkisi. Scaning Elektron Mikroskobunda sitrat tamponunda (ph 5.6), basınç uygulanmış (400 MPa, 10 dakika) hücrelerin son şekli görülmektedir. Tablo 1. Listeria monocytogenes İnaktivasyonunda Yüksek Hidrostatik Basınç Muamelesinin Etkileri Basınç muamelesi (MPa) Populasyonda azalma (log 10 CFU/ml) İşlem görmemiş Azalma yok 200 0,36 250 0,39 300 2,56 350 6,57 375 7,85 400 >9,19 20 o C'de 10 dakikada 200-400 MPa'lık basınçtan sonra, mikroorganizmaların yaşamını sürdürmesi PCA' da ölçülmüştür. 9

07.07. Membran Bütünlüğü Propidyum iodid (PI) membran bütünlüğünü belirlemek için çoğunlukla kullanılan bir boyadır. Bu boya mutajeniktir, yüklüdür ve membrandan hemen hemen geçemez. Boya sadece yaralanmış veya ölü hücrelerin hasara uğramış membranlarından girerek DNA veya RNA'nın içine girer ve kırmızı fluorosen verir (3). İşlem görmemiş hücrelerde düşük fluorosen şiddeti görülmesine karşın, sıcaklık muamelesi görmüş hücreler yüksek fluorosen vermektedir. Sonuçlar yüksek basınca maruz bırakılmış populasyonun küçük bir kısmının membran bütünlüğünü koruyabildiğini göstermiştir (10). 07.08. Membran Potansiyeli 07.08.01. Flow Sitometri DiBAC 4 gibi negatif yüklü oxonol boyalar sitoplazmik membran ve ekstraselüler ortam arasında potansiyel bağımlı dağılımlara uğrarlar. DiBAC 4 lipitçe zengin hücre içi bileşenleri bağlayarak depolarize olmuş hücrelerin içine girer. Boyanın fluoroseni akümülasyonla geliştirilir (10). DiBAC 4 boyasının etkisi ile membrandaki potansiyel değişiklikleri göstermek için bir depolarize edici ajan olan gramisidin kullanılır. Listeria hücreleri DiBAC 4 ile boyanmadan önce değişik gramisidin konsantrasyonlarına maruz kalırlar. Gramisidin membran depolarizasyonuna neden olur ve bu da hücre membranında DiBAC 4 ' ın birikmesine yol açar böylelikle de fluoresen şiddeti artar. 275, 325 ve 400 MPa'da yüksek basınç muamelesi görmüş hücreler DiBAC 4 ile boyanır ve flow sitometri ile analiz edilir. Muamelenin yoğunluğu ile artan bu populasyonların fluoreseni, hücre membranının yüksek basınç işleminden sonra depolarizasyona yol açar (10). 07.08.02. Radyoetiketleme Yöntemi Yüksek basınç muamelesi görmüş hücrelerin membran bütünlüğü, radyoaktif problar kullanılarak analitik bir yöntem ile ölçülür. Sitrat tamponunda işlem görmemiş hücrelerin membran bütünlüğü -86 ± 11 Mv'ye eş değer gelir. Uygulanan basınç artıkça membran bütünlüğündeki değerin azaldığı görülür. Bu sonuçlar flow sitometri ile elde edilen sonuçların, membran depolarizasyonunda yüksek basınç muamelesinin etkisini doğrulamaktadır (10). Tablo 2: Yüksek hidrostatik basınç muamelesi ile Listeria monocytogenes hücrelerinin membran bütünlüğünde meydana gelen değişikliklerin sonuçları Basınç muamelesi (MPa) Membran Bütünlüğü (mv) Muamele edilmemiş - 86 ± 11 275-41 ± 1 325-34 ± 8 400-5 ± 2 10

15 dakika gramisidin (5 veya 50 µmol/l) ile muamele edilmiş ve edilmemiş Listeria monocytogenes populasyonlarının DiBAC 4 ile boyanmasından sonra fluorosen şiddetleri kaydedilir. Yüksek basınca (275, 325 veya 400 MPa, 10 dakika) veya yüksek sıcaklığa (121 o C, 15 dakika) maruz bırakılmış L. monocytogenes populasyonlarının DiBAC 4 ile boyanmasından sonra fluorosen şiddetleri kaydedilir. 11

08. arapta Olabilecek Maya ve Bakterilerin Flow Sitometri ile Analizi 08.01. Strainler ve Kültür Koşulları Kullanılan organizmalar; 20 Saccharomyces straini (13 Saccharomyces cerevisiae ve 7 S. bayanus) ve 10 Oenococcus oeni dir. Bu organizmalar, Valpolicella şaraplarından elde edilmiştir (11). Maya kültürleri 28 o C' de 24 saatte YEPD ortamında (%1 Yeast Extract, %2 Pepton, %2 Dextroz) büyütülmüştür. O. oeni strainleri 30 o C'de ph 4,8'de 4-5 gün süreyle anaerobik koşullarda AGB (Asidik garpe broth) ortamında çoğaltılmıştır. araptaki maya ve malolaktik bakterilerin sayımı (CFU/ml) ayrı ayrı büyüme substratlarında paralelli uygun dilüsyonların 100 µl' sinde belirlenmiştir (11). 08.02. Hücrelerin Hazırlanması Steril ringer çözeltisinde maya ve malolaktik bakterilerin uygun ardışık seyreltmeleri 13000g'de 5 dakika santrifüjlenir. Hücreler fosfat tamponlu tuzlu suda (PBS; 8.0 g/l NaCl, 0.2 g/l KCl, 1.44 g/l NaH(PO 4 ), 0.24 g/l KH(PO 4 ) tekrar süspanse edilir, ph 7,4 veya malolaktik bakteriler için 1N HCl ile ph 4,7'ye ayarlanmıştır. Valpolicella A ve B şaraphanelerinden toplanmış örneklerin analizi içinde aynı işlem yapılmıştır (11). 08.03. Boyama İşlemleri Rhodamin 123(Rh 123, Sigma) son konsantrasyonu 5 µg/ml; Calsein asetoksi metil ester (Calcein-AM; Molecular Probes) 2 µm; 2',7'-bis (carboksietil).-5(6).- carboksiflorosein acetoksimetil ester (BCECF-AM; Sigma), 10 µm; Fluoroscein diasetat (FDA; Sigma) 0,01mg/l, gibi boyalar ile maya ve bakterilerin canlılıkları değerlendirilir. arap örnekleri flow sitometrik analizden önce, oda sıcaklığında 5 dakika boyanırken malolaktik bakteri hücreleri en az 15 dakika boyanır (11). Flow Sitometri Boyanmış olan örnekler 50 W cıva ark lambası ve bir florasein isotiosiyanat filtre seti ile Leica DMRB epifluorosen mikroskobunda incelenirler. Flow sitometrik denemeler 0,7 barlık basınçta, mayalar için 1,5 µl/dk., bakteriler için 3,0 µl/dk. akış oranı ile çalışan bir cihaz kullanılarak (BryteHS) (Bio-Rad) gerçekleştirilir. Maya ve malolaktik bakteriler birlikte analiz edildiğinde akış oranı 3,0 µl/dk. ve 0,7 barlık basınçtır. Cihazın kalibrasyonu 1,5 µl/dk akış oranında, 1,5 µm çapında Bio-Rad Standart Kalibrasyon Çubukları kullanılarak yapılır (11). Bryte- HS Flow Sitometride, aydınlatma yüksek basınçlı civa ksenon ark lambası 75 W ile sağlanır; cihaz iki ışık saçan dedektör ve FL1, 515 565 nm; FL2, 565 605 nm; ve FL3, > 605 nm. dalga boylarını yayan filtre bloklar hazırlanarak üç fluoresen dedektörden geçirilir. 12

Ölçümler için, 470-490 nm'lik sitümülasyon sağlayan, 510 nm 'de ışık yayan 520-560 nm'lik emisyon veren standart bir florosein isotiosyanat filtre blok düzeni kullanılır. Foton arttıran yükselteç hem ışık saçılımı hem de fluorosen için logaritmik düzende ayarlanır. Veriler Winbryte programında saklanır (11). 09. Flow Sitometri Kullanımı ile Fitoplankton Analizi Sıvı bir ortamda asılı otofluorosen partiküller olan fitoplanktonlar, flow sitometri ile analiz için çok uygundur. Bu teknik, bireysel hücrelerin hızlı izole edilmesi, sayılması ve ölçümü için kullanılabilir (12). Flow sitometri, belirli bir bölgede akan bireysel partikülleri test eder. Asılı partiküller, akan hücreler içerisinde partikül bulunmayan suda yüzen kılıfın ortasına doğru yönlendirilirler. Kılıf, incelenen örneği lazer demetinin içine doğru yönlendirir ve akmakta olan örneği herhangi bir anda ışın demetinin içerisinde sadece bir hücre olacak şekilde sıkıştırır. Her hücre demet içerisinden geçerken, saçılır ve ışık absorbe eder. Farklı açılarda saçılan ışık ölçülebilir ve absorbe edilen ışık, ayırıcı dedektörlerle ölçülebilen farklı renklerdeki fluorosenlar şeklinde yayınlanır. Bazı araçlar Coulter prensibi yardımı ile her bir hücrenin hacmini ölçebilir. Her bir hücre için, boyutların her sinyalinin korole edilmiş ölçümleri daha sonraki analizler için bilgisayara kaydedilir. Ayrıca bazı flow sitometriler partikülleri fiziksel olarak gruplayabilir (12). Flow sitometri ile optik ölçümler, siyanobakterler, proklorofitler, kokolitoforitler, pennat diatomlar ve kriptofitler gibi fitoplanktonları ve gruplarını tanımlamak ve saymak için kullanılan bilgileri kapsar (12). Ayrıca, her bir grup içerisindeki hücrelerin boyut ve pigment içeriği gibi karakteristikleri küçük ölçekte incelenebilir. Saçılan ışık sinyalleri, partikül boyu, şekli ve kırılma indeksi ile ilişkilidir. Otofluorosen sinyallerin büyüklüğü, varolan pigmentlerin türü ve niteliği ile ilgili bilgiler içerir. Bu belirli optik özelliklerin ölçülmesine ek olarak, fluorosen etiketlenmiş antikorlar ve molekül proplar kullanılarak, özel spesifik gruplar, DNA ve protein gibi moleküller işaretlenir, yağlar özel boyalarla görüntülenebilir (12). 10. Flow Sitometrinin Avantajları ve Dezavantajları 10.01. Flow Sitometrinin Avantajları Hız: Teknik hızlıdır, saniyede binlerce bireysel hücre test edecek kadar potansiyeli vardır. Duyarlılık: Hücrelerin fluoroseni manuel epifluorosen mikroskobu ile ölçülebilecek kadar parlak değildir. Flow sitometri ile bu hücreler belirlenip, ölçülebilir. Doğruluk: Tek tip mikro küreciklerin ışık saçılımı ve fluorosen ölçümleri için varyasyon sabiti (CV=standart sapma/ortalama); %1 gibi çok küçük değerde olur. 13

Gruplama: Flow sitometrinin en güçlü ve kendisine özgü avantajı, herhangi bir optik karakteristiğe veya bunların kombinasyonlarına bağlı olarak hücrelerin fiziksel olarak birbirlerinden ayırabilmesidir. Böylece daha ileri analizler yapabilmek için, spesifik hücrelerin saf örneklerini elde etmek mümkün olur (12). 10.02. Flow Sitometrinin Dezavantajları Sınırlı çözümleme: Flow sitometriler tipik olarak sadece ileri yapısal detayları değil de pik yapan veya entegre sinyalleri ölçebilir. Fitoplanktonları veya türlerini nadiren belirleyebilir. Oysa hücreler optik karakteristiklerine göre sınıflandırılır. Epiflurosen mikroskobu ve görüntü analizi gibi diğer metotlar bir plankton örneğinde, heterojenite ile ilgili çok daha büyük çözümleme imkanı sağlar. Küçük örnek boyutu: Birçok flow sitometri çok küçük hacimleri (<0.5 mm) analiz eder. Oysa, hücreler en az yaklaşık 10 3 /ml olarak bulunurlar. Bu yüzden prekonsantrasyon veya cihaz modifikasyonu olmadan doğru bir şekilde analiz edilemezler. Flow sitometriler çok doğru ölçümler yapabiliyor olmalarına rağmen, bu ölçümler kullanılan örneğin özelliğine göre kalibrasyonuna bağlıdır (12). 11. Flow Sitometri ile İlgili Yapılan Bazı Çalışmalar Winson ve Davey 2002 yılında, "Mikrobiyal Problemlerde Flow Sitometri Kullanımındaki Gecikme Sebepleri" ile ilgili bir çalışma yapmışlardır. Bu çalışma ile uygulama aralıkları, sınırları ve mikrobiyolojide flow sitometrinin kullanımı için yeni stratejiler geliştirmişlerdir (13). D'Haese ve Nelis'in 2002 yılında Belçika'da yaptıkları, "Gıda Mikrobiyolojisinde Tek Bakteri Hücresinin Hızlı Dedeksiyonu" adlı çalışmaya göre, katı fazlı sitometrinin, tek hücre seviyesindeki bakteriyi gelişme evresine ihtiyaç duymadan hızla saptayabilen özgün bir teknik olduğu belirtilmiştir. Çalışmada, örnek filtre edildikten sonra filtre membranının üzerinde kalan mikroorganizmalar fluorosenle etiketlendikten sonra lazerli cihazda otomatik olarak sayılmıştır (14). Stauber, Franklin ve Adams'ın 2002 yılında yaptıkları "Ekotoksisite Testinde Mikroalg Kullanılarak Flow Sitometri Uygulamaları" adlı çalışmada, sudaki kontaminasyonlar ve sedimentlerdeki deniz ve tatlı su alglerinin biyolojik tahlillerinin geliştirilmesinde flow sitometri uygulamaları incelenmiştir. Ekotoksikolojide flow sitometri uygulamaları tek hücreli alglerle aquatik ve sediment toksisitesi testlerinin çevre ile daha ilişkili olarak gelişmesini sağlar. Bu çalışmaya göre, düşük hücre yoğunluğunda çok parametreli çok örnekli testler uygulanabilir (15). Seo, Brackett ve Frank'in 1998 yılında yaptıkları "Kıyma, Elma suyu ve Sütte İmmüno-Magnetik Flow Sitometri kullanarak hızlı E. coli O157:H7 Aranması" adlı çalışmada, kullanılan örneklerde düşük konsantrasyonlardaki E. coli yi belirlemenin flow sitometri ve immüno-magnetik ayrışma ile mümkün olacağını göstermişlerdir(16). 14

Jimenez'in 2001 yılında yapmış olduğu "İlaçların Mikrobiyolojik Denetiminde Hızlı Metotlar" adlı çalışmasında, farmakoloji laboratuarlarında hızlı mikrobiyolojik metotların kullanımının, suyun, ürünlerin, hammaddelerin kalite kontrollerini geliştirdiğini ve imal edilen farmakolojik ürünlerin antimikrobiyal etkinliklerini arttırdığını belirlemiştir (17). Langsrud ve Sundheim 2000 yılında "Bakterilerin Hayatta Kalabilirliğine Hızlı Destek İçin Flow Sitometri" adlı bir çalışma yapmışlardır. Bu çalışmada, bakterilerin canlılığını test etmek için kullanılan geleneksel metotların çok zaman alıcı olduğunu belirtmişleridir. Ayrıca gıda endüstrisinde çok sayıda izolatın direnç seviyesini ölçmek için, daha iyi dezenfeksiyon uygulamaları geliştirmek için ve bakterilerin dezenfektanlarla karşılaştıktan sonra hayatta kalabilirliklerinin test edilmesi için basit ve hızlı metotlara ihtiyaç olduğu vurgulanmıştır. Bakterilerde Rodamin 123 birikiminin, bakterilerin hücre zarı potansiyeline bağlı olduğunu ve laboratuar organizmaları kullanılarak bakterilerin hayatta kalabilirliklerinin tahmin edilebileceği belirtilmiştir(18). Green ve arkadaşlarının 1994 yılında yaptıkları "Flow Sitometri ile Antifungal Aktivitenin Hızlı Belirlenmesi" adlı çalışmada, kullanılan ilaçlardan zarar görmüş fungal hücrelerdeki canlı boya birikiminin belirlenmesinde flow sitometri kullanımını kolaylaştıran hızlı denemeler geliştirilmiştir. Bu çalışmanın sonunda, farklı hareket modlarına göre bileşiklerin antifungal aktivitelerinin karşılaştırılması ve belirlenmesi için hızlı metotların sağlanmasının ve geliştirilmesinin flow sitometri ile gerçekleşebileceği belirtilmiştir (19) Meyers'in 2000 yılında yapmış olduğu "Aquatik Mikrobiyolojide Gelişmeler" adlı çalışmasında, son 40-50 yıl içinde deniz mikrobiyolojisinde çok önemli keşiflerin olduğu ve deniz gıdaları bileşenlerinde bakterilerin en önemli biyolojik kütle olduğu belirtilmiştir. Ayrıca bu keşiflerin, okyanus derinliklerinde olan ekosistemdeki kemosentez aktiviteleri, oligotrofik sularda hayatta kalma yöntemleri ve besin zincirlerinde mikroorganizmaların rollerinin, simbiyotik yaşamlarda besin ve enerji ilişkileri gibi olduğu vurgulanmıştır. Bunun yanında yapılan birçok çalışmanın, radyoizotoplar, immünofluoresen-epifluoresen analizleri ve flow sitometri gibi metodların bulunmasına destek olduğu belirtilmiştir (20). Vives-Rego, Lebaron ve Caron'un 2000 yılında yaptıkları "Aquatik Mikrobiyolojide Flow Sitometrinin Günümüzde ve Gelecekteki Uygulamaları" adlı çalışmada, flow sitometrinin aquatik ve çevresel mikrobiyolojide kullanılan çok değerli bir araç olduğu vurgulanmıştır. Ayrıca flow sitometrinin aquatik sistemlerin mikrobiyoloji çalışmalarında yüksek potansiyelli 3 özgün teknik özelliği sergilediği belirtilmiştir. Bunlar : -Verilerin elde edilmesi ve işlenmesinde artmakta olan hız, -Bazı sitometrilerin kapasitelerine göre sınıflandırılması. Bu sınıflandırma, spesifik popülasyonların transferine veya belirlenmiş bir pozisyonda tek bir hücrenin bile ileri fiziksel, kimyasal, biyolojik veya moleküler analizine imkan sağlamaktadır. -Yüksek hızda çok parametreli verilerin tam ve çok değişkenli veri analizleri. Bu çalışmaya göre, lazer saptıran sitometrilerin son zamanlardaki gelişmeleri sınıflandırılmıştır ve bunların, hücrelerde veya filtre ya da slaytlar üzerinde kalan hücrelerin ileri analizlerini sağladığı belirtilmiştir (21). 15

Chang, Rihana, Bahrman, Gruden, Anna, Khijniak,. Skerlos, Adriaens'in 2004 yılında yaptıkları "Metal İşi ile İlgili Akışkanlarda Mycobacteria 'nın Flow Sitometri ile Bulunması ve Ölçülmesi" adlı çalışmalarında spesifik olmayan nükleik asit boyaları kullanarak flow sitometri ile yarı sentetik metal işi ile ilgili akışkanlarda Mycobacterium parafortuitum 'un tespiti yapılmıştır. Sonuçlar flow sitometrinin kompleks akışkanlarda mikrobiyal yük tespitinde uygulanabilirliğini göstermiştir (22). Joachimsthal, Ivanov, Joo-Hwa ve Stephen Tay'ın 2002 yılında yaptıkları "Gemilerdeki Balast Suyundaki ve Deniz Örneklerindeki Mikroorganizmaların Flow Sitometri ile Sayımı" adlı çalışmalarında flow sitometrinin deniz suyu ve gemilerin balast suyu analizinde oldukça hızlı ve hassas bir yöntem olduğunu göstermişlerdir. Ayrıca flow sitometrinin sağlık riski oluşturan ölü ve canlı mikroorganizmaların bulunmasını sağladığını belirtmişlerdir (23). Kempf, Mandle, Schumacher, Schafer, Autenrieth'in 2004 yılında yaptıkları "İn İSitu Hibridizasyon ve Flow Sitometri de Fluorosen ile Kan Kültürlerindeki Patojenlerin Hızlı Tespiti ve tanımlanması" adlı çalışmalarında FISH ve flow sitometriyi bir arada kullanarak kan kültürlerinden direkt olarak patojenlerin (Gram-negatif çubuklar ve Candida spp.) tanımlamalarını yapmışlardır (24). Yapılan bazı son çalışmalar Barbosa, Costa-de-Oliveira, Rodrigues, Hanscheid, Shapiro ve Pina-Vaz ın 2007 yılında yaptıkları " Cryptosporidium parvum un Flow Sitometri ile Belirlenmesi " adlı çalışmalarında C. parvum un varlığının belirlenmesi için flow sitometrik protokolun optimisazyonunu yapmışlardır. R-fikoeritrin bağlı spesifik monoklonal antikor, uygun antikor konsantrasyonunu belirlemek için ölü oositler ile inkübe edilmiştir. En uygun antikor konsantrasyonu 3.0 mg/ml bulunmuştur. En düşük saptanabilir sayı 2 10 3 oosit/ml olduğu görülmüştür (25). Chih, Chia ve Pei, nin 2007 yılında "Hastane atık sularındaki mikroorganizmaların Flow Sitometri ile Analizi" adlı çalışmalarında hastane atık sularındaki mikroorganizmaların toplam sayısı ve canlılığının belirlenmesi için dört fluorosen veren boya kullanarak flow sitometri ile analiz yapmışlarıdır. Sonuçları epifluoresen mikroskobu ve kültür metotları ile karşılaştırmışlarıdır (26). Kaynaklar 1. Dunphy,C.H., 2004. Applications of Flow Cytometry and immunohistochemistry to Diagnostic Hematopathology.Arch. Pathol. Lab. Med. 128:9, 1004-1022. 2. Laane,E., Tani,E., Björklund,E., Elmberger,G., Everaus,H., Skoog,L., Porwit- MacDonald.A., 2005.Flow cytometric immunophenotyping including Bcl-2 detection on fine needle aspirates in the diagnosis of reactive lymphadenopathy and non-hodgkin's lymphoma. Cytometry Part B Clinical Cytometry 64B1, 34-42. 3. Ormerod, M., 2000, Flow Cytometry, A practical approach. Third Edition, Oxford University Press, Oxford, UK. 16

4. Jaroszeski, M.J., Heller, R., 1998, Flow Cytometry Protocols, Volume 91, Humana Press Inc, Totowa, Nj. 5. Campbell, L., Methods in Microbiology: Flow Cytometry, Department of Oceanography, Texas A&M University, Chapter12. 6. Button, D.K., Robertson, B.R., 1993, Use of High-Resolution Flow Cytometry to Determine The Activity and Distribution of Aquatic Bacteria, In: Kemp, P.F., Sherr, B.F., Sherr, E.B., Cole, J.J. (Eds.), Handbook of Methods in Aquatic Microbial Ecology. Lewis, Ann Arbor, MI, pp. 163 173. 7. BD Biosciences, 2002. Bacterial Detection and Live/Dead Discrimination by Flow cytometry, US Patent Nos.4, 4,883,867 and 4,957,870. 8. Winson, M.K., Davey, H.M., 2000, Flow Cytometric Analysis of Microorganisms, Methods, 21, 231-240. 9. Barbosa.J., Costa-de-Oliveira, S., Rodrigues, A.G., Pina-Vaz, C.,2008, Optimization of a Flow Cytometry Protocol for Detection and Viability Assessment of Giardia lamblia, Travel Med Infect Dis, 6:4, 239-239. 10. Ritz, M., Tholozan, J.L., Federighi, M., Pilet M.F.,2002, Physiological damages of Listeria monocytogenes treated by high hydrostatic pressure, International Journal of Food Microbiology 79, 47 53. 11. Malacrino, P., Zapparoli, G., Torriani, S., Dellaglio, F., Rapid detection of viable yeasts and bacteria in wine by flow cytometry, 2001, Journal of Microbiological Methods, 45:2, 127 134. 12. Olson, R.J., Zetter, E.R.,and Anderson, O.K. 2005. Discrimination of eukaryotic phytoplankton cell type from light scatter and autofluorescence properties measured by flow cytometry, Cytometry, 10, 636-693. 13. Davey, H.M.,Jones,A.,Shaw,A.J.Kell, D.B. 1999. Variable selection and multivariate methods for identification of microorganisms by flow cytometry, Cytometry Part B: Clinical Cytometry, 35:2, 162-168. 14. D'Haese, E., Nelis, H.J., 2002, Rapid Detection of Single Cell Bacteria as a novel Approach in Food Microbiology, Journal of AOAC International 85:4, 979-983. 15. Stauber, J.L., Franklin, N.M., Adams, M.S., 2002, Applications of Flow Cytometry to Ecotoxicity Testing Using Microalgae, Trend in Biotechnology, 20:4, 141-143. 16. Seo, K.H., Brackett, R.E.,Frank, J.F.,1998, Rapid dedection of E. coli O157:H7 Using Immuno-magnetic Flow cytometry in Ground Beef, Apple Juice and Milk, International Journal of Food Microbiology, 44:1-2, 115-123. 17. Jimenez, L., 2001, Rapid Methods for the Microbiological Surveillance of Pharmaceuticals, PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology, 55:5, 278-285. 18. Langsrud, S., Sundheim, G., 2000, Flow Cytometry for Rapid Assessment of Bacterical Viability, International Biodeterioration&Biodegradation, 36:3, 467-467. 19. Green, L., Peterson, B., Steimel, L.,Haeber, P., Current, W., 1994, Rapid Determination of Antifungal Activity by Flow Cytometry, Journal of Clinical Microbiology, 32:4, 1088-1091. 20. Meyers, S.P., 2000, Developments in Aquatic Microbiology, International Microbiology, 3, 203-211. 21. Vives-Rego, J., Lebaron, P., Nebe-von Caron, G. 2000. Current and Future Applications of Flow Cytometry in Aquatic Microbiology, FEMS Microbiology Reviews, 24:4, 425-448. 17

22. Chang, S.C., Rihana, A., Bahrman S., Gruden, C.L. Khijniak, A.I.,Skerlos, S.J., Adriaens. P. 2004. Flow Cytometric Detection and Quantification of Mycobacteria in Metalworking Fluids, International Biodeteriation &Biodegredation, 54:2-3, 105-112. 23. Joachimsthal, E.L., Ivanov, V., Tay, J.H., L.Tay, S.T. 2003. Flow cytometry and conventional enumeration of microorganisms in ships ballast water and marine samples, Marine Pollution Bulletin, 46:3, 308-313. 24. Kempf, V.A.J., Mandle, T., Schumacher, U., Schafer, A., Autenrieth, I.B., 2004. detection and identification of pathogens in blood cultures by fluorescence in situ hybridization and flow cytometry, International Journal of Medical Microbiology, 295:1, 47-55. 25. Joana M., Barbosa M., Costa-de-Oliveira,S., Rodrigues,A.G., Hanscheid,T., Shapiro,H., Pina-Vaz,C., 2007, A Flow Cytometric Protocol for Detection of Cryptosporidium spp., Cytometry Part A, 73A:1, 44-47. 26. Chih S. L., Chia,W. C., Pei S. C. 2007, Fluorochrome and flow cytometry to monitor microorganisms in treated hospital wastewater,journal of Environmental Science and Health, Part A, 42:2, 195-203. 18