Escherichia coli ve Klebsiella pneumoniae KLĠNĠK ĠZOLATLARINDA PLAZMĠD ARACILI AmpC BETA- LAKTAMAZ TESPĠTĠ

Transkript

1 TÜRKĠYE CUMHURĠYETĠ ANKARA ÜNĠVERSĠTESĠ SAĞLIK BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ Escherichia coli ve Klebsiella pneumoniae KLĠNĠK ĠZOLATLARINDA PLAZMĠD ARACILI AmpC BETA- LAKTAMAZ TESPĠTĠ Serpil COġKUN FARMASÖTĠK MĠKROBĠYOLOJĠ ANABĠLĠM DALI DOKTORA TEZĠ DANIġMAN Prof. Dr. Nurten ALTANLAR 2011 ANKARA

2 ii

3 iii ĠÇĠNDEKĠLER Kabul ve Onay Ġçindekiler Önsöz Simgeler ve Kısaltmalar ġekiller Çizelgeler ii iii v vii viii ix 1. GĠRĠġ 1.1. Beta-Laktam Antibiyotikler Beta-Laktam Antibiyotiklerin Etki Mekanizması Beta-Laktam Antibiyotiklere KarĢı OluĢan Direnç mekanizması PBP lerde OluĢan DeğiĢikliğe Bağlı Direnç Permeabiliteye Bağlı GeliĢen Direnç DıĢ Membran Porin DeğiĢimine Bağlı Direnç Aktif Pompa (efluks) Sistemlerine Dayalı Direnç Beta-Laktamazlar ve Etki Mekanizmaları Beta-Laktamazların Sınıflandırılması AmpC Tipi Beta-Laktamazlar Kromozomal AmpC Beta-Laktamazlar Kromozomal AmpC Beta-Laktamazların Ġndüksiyon Mekanizması Kromozomal AmpC Beta-laktamaz Üreten Bakterilerde Beta-Laktam MĠK Değerleri Plazmid Aracılı AmpC Beta-Laktamazlar Plazmid Aracılı AmpC Beta-Laktamazların Ġsimlendirilmesi Plazmid Aracılı AmpC Beta-Laktamazların Genetik Özellikleri Plazmid Aracılı AmpC Beta-Laktamazların Duyarlılık Paterni AmpC beta-laktamazların Laboratuvar Tanısı 38

4 iv 2. GEREÇ VE YÖNTEM 2.1.Gereç Sarf Malzemeleri Kimyasal Madde ve Malzemeler , Araçlar Kullanılan Ayıraç ve Disklerin Hazırlanması Bakteri izolatları Bakterilerin Ġdentifikasyonu Duyarlılık Testleri BA-CA ile AmpC ve GSBL Tespiti AmpC Disk Testi ve Modifiye Üç Boyutlu Test Multipleks PCR ile AmpC Varlığının Saptanması Spot Ġnokulasyon Testi Üç Boyutlu Test Ġndüklenebilir AmpC Beta-Laktamaz Tespiti BULGULAR Disk Diffuzyon Test Bulguları Sefoksitin Dirençli Ġzolatlarda Disk Diffuzyon Test Bulguları AmpC Pozitif Ġzolatlarda Disk Diffuzyon Test Bulguları BA-CA ile AmpC ve GSBL Test Bulguları AmpC Disk Testi ve Modifiye Üç Boyutlu Test Bulguları Moleküler Test Sonuçları Spot Ġnokulasyon Test Bulguları Ġndüklenebilir Beta Laktamaz Bulguları Üç Boyutlu Test Bulguları 81 4.TARTIġMA SONUÇ VE ÖNERĠLER 116 ÖZET 119 SUMMARY 120 KAYNAKLAR 121 ÖZGEÇMĠġ 130

5 v ÖNSÖZ Hastanelerde sefalosporinlerin bilinçsizce kullanılması sonucunda son zamanlarda kromozomal AmpC enzimlerin plazmid kökenli türleri ortaya çıkmaya baģlamıģtır. Plazmidler aracılığı ile hastanelerde salgınlara neden olabilen AmpC beta-laktamaz üreten izolatlarla infekte olan hastaların büyük bir kısmı geniģ spektrumlu sefalosporinlerle tedavi gören hastalardır. Organ transplantasyonu geçirenlerde, uzun süre yoğun bakım ünitesinde kalanlarda, lösemi, kanser gibi bağıģıklık sistemi baskılanmıģ hastalarda plazmid aracılı AmpC beta-laktamaz taģıyan izolatlarla infeksiyona yakalanma riski daha fazladır. GeniĢ Spektrumlu Beta-Laktamaz(GSBL) sentezleyen mikroorganizmalarda olduğu gibi AmpC beta-laktamaz sentezleyen mikroorganizmalar, antibiyogramda sefalosporinlere duyarlı bulunsa bile bu antibiyotiklerin kullanıldığı durumlarda klinik baģarısızlık görülebilmektedir. Ġndüklenebilir plazmid aracılı AmpC türlerinin de ortaya çıkması ile birlikte GSBL enzimlerden daha tehlikeli boyutlara ulaģan olgular ortaya çıkmıģtır. Klinik tedavi sırasında geliģen AmpC beta-laktamaza bağlı dirençli mutantların seçilmesi tedavi maliyetini de arttırmaktadır. GSBL lar Clinical Laboratory Standards Institute nün ( CLSI) önerileri doğrultusunda laboratuvarlarda rutin olarak tespit edilebilmektedir. Ancak CLSI nin AmpC beta-laktamazlar için henüz yayınlanmıģ bir önerisi bulunmamaktadır. Bu nedenle laboratuvarlarda AmpC beta-laktamaz tespiti önemli problem olmaya devam etmektedir. ÇalıĢmamızda AmpC enzim araģtırması için bugüne kadar kullanılmıģ fenotipik yöntemleri kıyaslamak amacıyla boronik asit-klavulonat (BA-CA) inhibisyon testi, üç boyutlu test (3BT), modifiye üç boyutlu test (M3BT), spot inokulasyon test, TRĠS-EDTA lı AmpC disk testi, indüklenebilir beta-laktamaz (ĠBL) tayini için disk antagonizm test (DAT) ve genotipik olarak multipleks PCR ile AmpC enzim tayini yapıldı.

6 vi AmpC üreten bakterilerin çoğu aynı zamanda GSBL da üretmektedirler. Fenotipik duyarlılık testlerine göre GSBL üreten mikroorganizmaları plazmid aracılı AmpC enzim üreten mikroorganizmalardan ayırdetmek zordur. Bu ayırım sürveyans, epidemiyolojik ve hastane infeksiyonlarını kontrol altına almak açısından önemlidir. GSBL ve AmpC enzimleri fazla sentezlendiklerinde birbirlerini maskeledikleri için antibiyogramda yanlıģ yoruma neden olabilirler. Bu çalıģmada beta-laktam antibiyotiklere dirençli izolatlarda CLSI nin önermiģ olduğu doğrulama testinde kullanılan CA ihtiva eden disklere BA ilave edilerek eģzamanlı olarak GSBL ve AmpC beta-laktamaz tayini yapıldı. Bu tezin gerçekleģmesinde emeği geçen Ankara Üniversitesi Farmasötik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı öğretim üyesi DanıĢman hocam Prof. Dr. Nurten Altanlar, Gazi Üniversitesi Farmasötik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı öğretim üyesi Prof. Dr. Ufuk Abbasoğlu, Ankara Üniversitesi Farmasötik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı öğretim üyesi Prof. Dr. Sulhiye Yıldız, Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Biyoteknoloji Bölüm BaĢkanı Prof. Dr. Mustafa Akçelik, Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü araģtırma görevlileri, Hacettepe Üniversitesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Öğretim üyesi Profesör Burçin ġener, Yüksek Ġhtisas Hastanesi Mikrobiyoloji Bölümünden Doç. Dr. Nihal Karabiber, Ankara Numune AraĢtırma ve Eğitim Hastanesi Klinik Mikrobiyoloji Bölümü Mikrobiyoloji Uzmanı Dr. Kamer KoldaĢ ve Laboratuar çalıģanları,, Eczacı Eda Aydın, Veteriner Fakültesi Gıda Hijyeni ve Teknoloji Anabilim Dalı AraĢtırma görevlisi Erhan Keyvan, Veteriner Fakültesi Fizyoloji Anabilim Dalı Doktora öğrencisi Nilay CoĢkun, Veteriner Fakültesi Biyostatistik Anabilim Dalı BaĢkanı Doç. Dr. Safa Gürcan, Bioanaliz firması, Ankara Numune AraĢtırma ve Eğitim Hastanesi BaĢhekim Muavini Dr. Semih Güvendi ve eģime katkılarından dolayı teģekkür ederim.

7 vii Simgeler ve Kısaltmalar CLSI : Clinical Laboratory Standards Ġnstitute NCCLS: National Comittee for Clinical Laboratory Standards EDTA: Etilendiamintetraasetik Asit DMSO: Dimetilsulfoksit GSBL: GeniĢlemiĢ Spektrumlu Beta-Laktamaz (Extended-Spectrum Beta-Lactamase) MBL: Metallo Beta-Laktamaz KPC: K. pneumonae karbapenemazı MĠK: Minimum Ġnhibitör Konsantrasyon BA: Benzeneboronik Asit APB: 3-aminofenilboronik asit CAM: Cefoxitin Agar Medium DAT: Disk Antagonizm Test ĠBL: Ġndüklenebilir Beta-Laktamaz 3BT: Üç Boyutlu Test M3BT: Modifiye Üç Boyutlu Test MHA Müller Hinton Agar EMB: Eozin Metilen Blue Agar CAZ: Seftazidim CTX:Sefotaksim FEP: Sefepim CTT: Sefotetan AMC:Amoksisilin-klavulonat CPD: Sefpodoksim SXT: Sulfametaksazol-trimetoprim ĠMĠ: Ġmipenem CA: Klavulonik asit YBÜ: Yoğun Bakım Ünitesi

8 viii ġekiller ġekil 1.1. Beta-laktam antibiyotiklerin moleküler yapısı 6 ġekil 1.2. Peptidoglikan alt üniteleri 9 ġekil 1.3. Gram pozitif ve Gram negatif bakterilerde hücre duvar yapısı 14 ġekil 1.4. Serin beta-laktamazların etki mekanizması 16 ġekil 1.5.Beta-laktamazların protein yapısı 24 ġekil 3.1. Boronik asitle inhibisyon testi 67 ġekil 3.2. AmpC pozitif izolatlarda GSBL tayini 68 ġekil 3.3. AmpC disk testi ve modifiye üç boyutlu test 70 ġekil 3.4. AmpC disk testi ve Modifiye üç boyutlu test (halka Ģekli) 71 ġekil 3.5. den ġekil.10 a kadar. Multipleks PCR sonuçları 76 ġekil Spot inokulasyon test 79 ġekil ĠBL pozitif izolat 81 ġekil Üç boyutlu test 82

9 ix Çizelgeler Çizelge 1.1. Beta laktamaz grupları ve genel özellikleri 17 Çizelge 1.2. Kromozomal AmpC beta-laktamaz üreten bakterilerde bazal, ĠBL ve mutantlarda gözlenen MĠK değerleri 32 Çizelge 1.3. Kromozomal AmpC beta-laktamaz üreten bakterilerde BL ve mutantlarda gözlenen MĠK değerleri 33 Çizelge 2.1. CLSI 2008 e göre disk difüzyon testinin değerlendirilmesi. 50 Çizelge 2.2. Amplifikasyonda kullanılan primer dizileri 54 Çizelge 2.3. PCR da kullanılan ayıraçlar 55 Çizelge 3.1. Sefoksitin dirençli izolatların türlere ve geldiği yere göre dağılımları 58 Çizelge 3.2. Sefoksitin dirençli izolatların izole edildikleri materyallere göre dağılımları 58 Çizelge 3.3. Sefoksitin dirençli izolatların türlere göre GSBL prevalansı 59 Çizelge 3.4. Sefoksitin dirençli suģların disk difüzyon sonuçları 59 Çizelge 3.5. AmpC pozitif suģların izole edildikleri materyallere göre dağılımları 60 Çizelge 3.6. AmpC pozitif izolatların türlere göre GSBL prevalansı 60 Çizelge 3.7. ANEAH daki izolatlarda antibiyotik direnci 62 Çizelge 3.8. YĠH deki izolatlarda antibiyotik direnci 63 Çizelge 3.9. GSBL+AmpC, GSBL ve AmpC pozitif izolatlardaki antibiyotik direnç 64 Çizelge BA inhibisyon testinde kullanılan antibiyotiklerin karģılaģtırılması ve PCR sonuçları 69 Çizelge Sefoksitin dirençli BA testi pozitif izolatlarda Tris-EDTA lı AmpC disk ve PCR M3BT sonuçları 72 Çizelge BA testi pozitif, PCR-AmpC negatif izolatlarda Tris-EDTA lı AmpC disk test sonuçları 73 Çizelge BA testi ve PCR-AmpC pozitif izolatlarda Tris-EDTA lı AmpC disk testi ve M3BT sonuçları 73 Çizelge AmpC pozitif izolatların türlere ve geldiği yere göre dağılımları 74

10 x Çizelge Sefoksitin dirençli izolatların türlere ve geldiği yere göre AmpC dağılımları 75 Çizelge BA inhibisyon testi pozitif olan sefoksitin dirençli izolatlarda AmpC prevalansı 75 Çizelge Sefoksitin dirençli BA pozitif izolatlarda PCR sonuçları 78 Çizelge 3.18.PCR-AmpC pozitif izolatlarda spot test sonuçları 80 Çizelge ANEAH de PCR-AmpC pozitif izolatlarda indirekt ve direkt yöntem sonuçları 83 Çizelge YĠH de PCR-AmpC pozitif bulunan izolatlarda indirekt yöntem ile direkt yöntem sonuçları 84

11 1 1.GĠRĠġ 1.1. Beta-Laktam Antibiyotikler Beta-laktam antibiyotikler; penisilinler, sefalosporinler, karbapenemler, monobaktamlar ve beta-laktamaz inhibitörleri olmak üzere 5 grupta toplanmıģtır. Penisilinler: Kimyasal olarak tiazolidin halkasına beta-laktam halkasının eklenmesi ile oluģan 6-aminopenisilanik asit nukleusu içerirler. Doğal penisilinler betalaktamaz üretmeyen Gram pozitif kok ve basiller, anaeroblar, Neisseria spp., Haemophilus spp. Treponema spp.ve Leptospira spp. gibi spiroketlere etkilidir. Semisentetik penisilinler, metisiline duyarlı stafilokok ve streptokok infeksiyonlarında kullanılır. Aminopenisilinler, Listeria ve Haemophilus türlerine, Salmonella spp., Shigella spp., ve Proteus mirabilis e etkilidirler. Karboksipenisilin ve üreidopenisilinler, antipseudomonal etkileri vardır (Saran ve Karahan, 2010). Doğal penisilinler: Semisentetik penisilinler Geniş spektrumlu penisilinler: penisiling (parenteral) metisilin Aminopenisilinler: ampisilin penisilin V nafsilin amoksisilin bakampisilin (oral penisilin) kloksasilin Karboksipenisilinler: dikloksasilin karbenisilin, tikarsilin oksasilin Üreidopenisilinler: azlosilin flukloksasilin mezlosilin piperasilin Sefalosporinler: Bir beta-laktam halkası ile dihidrotiazin halkasının birleģmesinden oluģmuģ 7-aminosefalosporanik asit içerirler. Birinci kuģak sefalosporinler (dar spektrumlu sefalosporinler); Gram pozitif bakterilere karģı iyi, Gram negatif bakterilere karģı orta derecede etkilidirler.

12 2 Penisiline duyarlı ve dirençli Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes ve diğer aerobik ve anaerobik streptokoklara etkilidirler. Metisiline dirençli S. aureus, Staphylococcus epidermidis ve enterokoklara etkisiz, pek çok enterik bakteriye etkilidirler. Pseudomonas türlerine karģı etkileri yoktur. Bacterioides fragilis hariç diğer anaerob bakterilere etkilidirler. Ġkinci kuģak sefalosporinler (geniģletilmiģ spektrumlu sefalosporinler); Pseudomonas türlerine etkisizdirler. Bu jenerasyonda bulunan sefamisinler (sefoksitin, sefotetan) anaeroblara daha fazla etkilidir (Çolak, 1999). Diğer sefalosporinlere göre geniģlemiģ spektrumlu beta-laktamazlardan (GSBL) daha az etkilenirler. AmpC türü beta-laktamazlar sefamisinleri de hidroliz eder. Bu nedenle sefamisin duyarlılığı bakterinin ürettiği beta-laktamaz türünün AmpC mi yoksa GSBL mi olduğunu ayırdetmekte kullanılır. GSBL pozitif mikroorganizmalarla oluģan ciddi enfeksiyonlarda sefamisinlerin kullanımı ile ilgili yeterli klinik çalıģma yoktur. Az sayıda bildirilmiģ olgu raporlarına göre, 2 hastada klinik yetersizlik görülürken, katetere bağlı K. pneumoniae bakteriyemisi olan bir olguda sefamisin kullanımı ile klinik cevap alındığı bildirilmiģtir. Sefamisinlerin yoğun kullanımına bağlı olarak porin dirençli K. pneumoniae suģlarının seleksiyonu olabileceği düģünülmektedir. Mevcut bilgiler ıģığında GSBL üreten suģlar sefoksitine invitro olarak duyarlı bulunsa bile tedavide birinci seçenek olarak kullanılmaları önerilmemektedir. Sefamisinlerden sefoksitin ülkemizde yakın zamana kadar kullanımda iken artık kullanımda değildir (Esen, 2008). Üçüncü kuģak sefalosporinler (geniģ spektrumlu sefalosporinler); Birinci kuģak sefalosporinlere göre Gram pozitif koklara daha az, ikinci kuģak sefalosporinlere göre enterik bakterilere ve pseudomonas a daha fazla etkilidir. Bu artmıģ etkinlik hücre duvarını geçebilmelerine bağlanmaktadır. Üçüncü kuģak sefalosporinlerden seftazidim ve sefaperazon P. aeruginosa ya daha fazla etkilidir (Çolak, 1999). Seftazidim dıģındaki sefalosporinlerin, TEM-6 veya TEM-12 tipi GSBL üreten suģlarla infekte hastalarda etkili olduğu gözlenmiģse de rutin pratikte laboratuvar

13 3 testleri ile GSBL nin tipini tayin etmek mümkün olmadığı için, sefalosporinler GSBL üreten bakteri infeksiyonlarının tedavisinde kullanılmamalıdır (Esen, 2008). Dördüncü kuģak sefalosporinler; Bu grupta, sefepim ve sefpirom bulunmaktadır (Saran ve Karahan, 2010), sefepim, özellikle SHV türü bir çok GSBL ye invitro olarak etkili olmasına rağmen bakteri inokulumu arttırıldığında sefepim duyarlılığında azalma görülebilir. TEM ve SHV türü GSBL varlığında inokulum miktarı 10 5 ten 10 7 ye çıkarıldığında bu antibiyotiklere karģı direnç tespit edilir. Bazı CTX-M ve OXA türü beta-laktamaz üreten izolatlar düģük inokuluma rağmen sefepime dirençlidirler. Randomize kontrollü, GSBL üreten suģların etken olduğu nozokomiyal pnömoni ile ilgili bir çalıģmada, imipenem verilen hastalarda klinik baģarı % 100 iken, sefepim verilen hastalarda baģarı oranı % 69 olarak belirtilmiģtir (Esen, 2008). 1.kuşak sefalosporinler; 2.kuşak sefalosporinler; 3.kuşak sefalosporinler; 4.kuşak sefalosporinler sefadroksil sefazolin Sefaklor sefiksim Sefepim sefaleksin sefamandol sefoperazon sefpirom sefaloridin sefonisid sefotaksim sefalotin seforanid seftizoksim sefapirin sefpirozil seftriakson sefradin sefuroksim sefpodoksim lorakarbef sefditoren sefotetan seftibuten sefmetazol sefdinir sefoksitin moksalaktam Sefepim AmpC grubu beta-laktamazlardan 3. kuģak sefalosporinler kadar etkilenmez. Ancak, Enterobacter türlerinde özellikle E. cloacae de bu enzimle birlikte GSBL üretimi de sık olduğundan tedavide tercih edilmemesi gerekir (Esen, 2008).

14 4 Beta-laktamaz inhibitörleri : Klavulonat, sulbaktam ve tazobaktam. Bunlar tek baģlarına zayıf antibakteriyel etkili olup penisilin ve sefalosporinlerle kombine halde kullanıldığında sinerjik etki gösterirler. Tazobaktam PBP1(Penisilin bağlayan protein) ve PBP2 ye bağlanarak etki gösterir (Çolak, 1999). GSBL üreten mikroorganizmalarla üriner sistem enfeksiyonu olan hastaların çoğunda piperasilin-tazobaktamın kullanılmasıyla baģarı elde edilmiģtir. Mikroorganizmalarda yüksek oranda beta-laktamaz yapımı, diğer beta-laktamazların, özellikle inhibitör dirençli (IRT) beta-laktamazların veya dıģ membran porin defektinin birlikte olması gibi durumlarda beta-laktamaz inhibitörlü antibiyotikler yetersiz kalmaktadır. Tazobaktam CTX-M türü GSBL leri klavulonik aside göre 10 kat daha fazla inhibe eder. Beta-laktam/beta-laktamaz inhibitörlerinin bu enzimi üreten etkenlerle oluģmuģ enfeksiyonlarda kullanıldığı randomize kontrollu çalıģmalar olmadığı için GSBL üreten suģlarla oluģan ciddi enfeksiyonlarda betalaktam/beta-laktamaz inhibitörleri kullanılmamalı, eğer kullanılacaksa MĠK değerleri gözönünde bulundurulmalıdır. AmpC türü enzim üreten bakterilerin tedavisinde beta-laktamaz inhibitörlerinin yeri yoktur (Esen, 2008). Monobaktamlar; Beta-laktam halkasından oluģurlar. Monosiklik yapıda olup en bilinen antibiyotiği aztreonamdır. Gram negatif aerobik bakteriler üzerinde etkilidir, PBP3 e bağlanarak etki gösterir. Gram pozitif bakterilerin ve anaerob bakterilerin PBP lerine bağlanamadığı için bu bakterilere etkisizdir. Karbapenemler; imipenem, meropenem, doripenem, ertapenem. Yapıları penisilin ve sefalosporinlerden farklıdır. Beta-laktam halkasında sülfür ve oksijen atomları yerine hidroksietil yan zinciri bulunur. Gram pozitif ve Gram negatif bakterilerdeki PBP1 ve PBP2 ye bağlanarak hücrenin lizisine neden olurlar. GeniĢ spektrumlu antibiyotiklerdir. Metisilin dirençli stafilokoklar ile Enterococcus faecium hariç tüm bakteriler üzerinde etkilidir (Çolak, 1999). Ġmipenem ve meropenemin hem GSBL hem AmpC beta-laktamazlar üzerinde etkili olduğu gösterilmiģtir. Tigesiklin, colistin ve ertapenemin de bu enzimler üzerinde etkili olduğu ancak yeteri kadar klinik çalıģma bulunmadığı bildirilmiģtir (Yang ve Guiglielmo, 2007).

15 5 Ġmipenem pompa sistemlerinden en az etkilenen karbapenemdir (Gülay, 2005a). Ġmipenem direnci ya sadece porin kaybına bağlı olarak geliģir ya da AmpC sentezi ile birlikte porin kaybı olduğu zaman görülür (Walter-Rasmussen ve Hoiby, 2002). Karbapenemlerin yaygın kullanımı sonucu dıģ membran porin değiģikliğine bağlı direnç sıklığı K. pneumoniae, Acinetobacter spp., Stenotrophomonas maltophlia ve Pseudomonas spp. de görülebilmektedir (Esen, 2008). Meropenemin imipenem gibi indükleyici olmaması, PBP3 e affinitesinin daha fazla oluģu, hem D2 porininden hem nonspesifik porinlerden geçebilmesi gibi avantajları vardır (Livermore, 1991;Tomc ve ark., 1995). Ġmipenem, Gram pozitif koklara, meropenem Gram negatif basillere karģı daha etkilidir. Doripenem, meropenem ile benzer etki spektrumuna sahiptir ancak anti-stafilokokal ve anti-pseudomonal etkinliği diğer karbapenemlerden daha fazladır. Glikopeptidler: Bu grupta, büyük polar moleküller olan vankomisin ve teikoplanin yer alır. Gram negatif bakterilerin hücre duvarına penetre olamadıkları için etki spektrumları aerob ve anaerob Gram pozitif bakterilerle sınırlıdır (Saran ve Karahan, 2010). Beta-laktam antibiyotiklerden; benzilpenisilin, sefotaksim, aztreonam, meropenem, imipenem, ertapenem, doripenem, klinikte kullanılan beta-laktamaz inhibitörlerinden; klavulonik asit, sulbaktam, tazobaktam ile araģtırma aģamasındaki beta-laktamaz inhibitörlerinden; Syn2190, Ro , monobaktam türevi, BAL 30072; ATMO penisilin, BRL42715, penem 1, penem 2, AM 112, LK 157, Ro , SA2-13, LN-1-255, DVR-II-41S, meta-karboksifenil chiral sefalotin TSA, NXL104, O-ariloksikarbonil hidroksamat, sulfonamid, N-benzol ß-sultam, merkaptokarboksilat inhibitör, piridin-2,4- dikarboksilik asit, LK-159,062, J111,225, SB238569, 2,2-(S,S)-disubstituted süksinik asit, N-arilsulfonil hidrazon, BcII tiyol inhibitörü, C6 merkaptofenil penisillinat ġekil.1.1 de gösterilmiģtir (Draws ve Bonomo, 2010).

16 ġekil 1.1.Beta-laktam antibiyotiklerin moleküler yapısı 1-7, Klinikte kullanılan beta-laktamaz inhibitörleri: 8-10 AraĢtırma aģamasındaki beta-laktamaz inhibitörü monobaktam türevleri : 11-14, Penisilin türevi beta-laktamaz inhibitörü: 15, Penemler : Penem sulfonları : 21-24, Boronik asit analoğu :25, Non beta-laktam yapısındaki beta-laktamaz inhibitörleri: (Draws ve Bonomo, 2010) 6

17 ġekil 1.1.Devam. Beta-laktam antibiyotiklerin moleküler yapısı 1-7, Klinikte kullanılan beta-laktamaz inhibitörleri: 8-10, AraĢtırma aģamasındaki beta-laktamaz inhibitörü monobaktam türevleri : 11-14, Penisilin türevi beta-laktamaz inhibitörü: 15, Penemler : Penem sulfonları : 21-24, Boronik asit analoğu :25, Non beta-laktam yapısındaki beta-laktamaz inhibitörleri: (Draws ve Bonomo, 2010) 7

18 8 1.2.Beta-Laktam Antibiyotiklerin Etki Mekanizması E. coli ve K. pneumoniae enfeksiyonlarının tedavisinde, ilk seçenek beta-laktam grubu antibiyotiklerdir. Bu antibiyotikler, bakteride hücre duvar yapımını engellemektedirler (Livermore, 1995). Bakterilerin hücre duvarında bulunan peptidoglikan tabakası 3 bölümden meydana gelmiģtir. Birinci bölüm, polisakkarit yapısında bir iskelet olup, N-asetil glukozamin (NAG) ve N-asetil muramik asit (NAMA) diye bilinen iki aminoģekerin alternatif olarak yeraldığı iplikçikler. Ġkinci bölüm, NAMA e bağlı D ve L aminoasitlerden oluģan tetrapeptid zincir. (sitoplazmada pentapeptid olarak sentezlenir, sonra tetrapeptide döner.) (ġekil.1.2) Üçüncü bölüm, bir tetrapeptid zincirinin 4. aminoasidinin (alanin) karboksil grubu ile komģu NAMA teki tetrapeptidin 3. aminoasidinin NH2 grubu arasındaki çapraz bağlardan oluģmuģtur. Bu tetrapeptidin; 1. amino asidi; L-alanin 2. amino asidi; D glutamik asit 3. amino asidi ise en değiģken bölge olup Gram negatif bakterilerde diaminopimelik asit yapısındadır. 4. amino asid daima D-alanindir (Mutlu ve Öğünç, 1999).

19 9 ġekil Peptidoglikan alt üniteleri (Gülay, 2003) Bakterilerde iki grup PBP belirlenmiģtir. Birincisi, yüksek molekül ağırlıklı PBP ler (transpeptidaz ve transglikolizas), ikincisi düģük molekül ağırlıklı PBP lerdir (DDkarboksipeptidazlar) (Yorgancıgil, 1999). PBP ler serin amino asidi içeren aktif bölgeleri ile NAM pentapeptid zincirinin sonundaki D-alanil-D-alanine bağlanabildikleri gibi steroik yapı benzerliğinden dolayı beta-laktamlara bağlanabilmektedirler Geri dönüģümsüz bu bağlanma sonucunda enzim bir baģka NAMA e bağlı pentapeptid ile peptid bağı oluģturamıyacağından çapraz peptid bağlarının sentezi ve böylece kafes Ģeklindeki hücre duvarının oluģumu durdurulmuģ olur. Bakteri hücre duvar yapımı yavaģlayınca

20 10 otolizinler tarafından peptidoglikan tabaka lizise uğrar (Dwars ve Bonomo, 2010; Yorgancıgil, 1999) Beta-LaktamAntibiyotiklere KarĢı OluĢan Direnç Mekanizması Bakterilerde beta-laktam antibiyotiklere karģı oluģan direnç üç Ģekilde gerçekleģmektedir. PBP lerde oluģan değiģiklikler Permeabiliteye bağlı direnç Beta-laktamaz enzimlerine bağlı direnç PBP lerde OluĢan DeğiĢikliğe Bağlı Direnç Yüksek molekül ağırlıklı PBP deki değiģikliğe bağlı oluģan penisilin direnci Gram pozitif bakterilerde Gram negatif bakterilerden daha fazladır (Gülay, 2005a). S. aureus da gözlenen metisilin direnci klinikte son derece önem taģımaktadır, çünkü metisiline dirençli S. aureus aynı zamanda sefalosporinler ve karbapenemlerde dahil tüm beta-laktam antibiyotiklere karģı direnç göstermektedir. S. aureus daki bu metisilin direnci orijini henüz tanımlanamamıģ bir DNA nın elde edilmesine bağlıdır. Pnomokoklarda penisilin direnci tamamen PBP ile iliģkilidir. Bunlarda beta-laktamaz saptanamamıģtır. Buna bağlı olarak, penisilinlere dirençli pnomokoklar sıklıkla sefalosporinlere karģı da çapraz direnç geliģtirmektedirler (Yorgancıgil, 1999). Bu bakterilerde gözlenen mutasyonlar basit nokta mutasyonlarının birikimi ile değil, kommensal florada bulunan yakın türlerden transformasyon ile genlerin alınması ve homolog rekombinasyonla mozaik gen oluģumunun bir sonucudur (Gülay, 2005a). ABD ve Arjantin de stafilokoklardaki penisilinazları kodlayan plazmidler E. faecalis de de görülmüģtür (Livermore, 1995). ABD ve Arjantin de bulunan E. faecium a ise ülkemizde henüz rastlanmamıģtır (Gür, 2002). Bu bakteri beta-laktam antibiyotiklere karģı affinitesi düģük olan PBP5 üretimini arttırarak direnç gösterir, beta-laktamaz sentezlemez (Livermore, 1995). E. faecium da gösterilen en son mekanizma ise DD-transpeptidazlar yerine LD-transpeptidazın üretimidir. Bu enzim tamamen yeni çapraz bağlantılar oluģturduğu için bu suģlar tüm beta-laktamlara

21 11 dirençlidirler (Gülay 2005a). Penisilinaz üreten Gram pozitif bakteriler amoksisilin, ampisilin ve piperasiline dirençli, amoksisilin-klavulonat, piperasilin-tazobaktam ve karbapenemlere duyarlı iken E. faecium tüm beta-laktamlara dirençlidir (Livermore, 1995). Gram negatif bakterilerde, PBP ye bağlı direnç nadiren görülür. Haemophylus influenza ve Neisseria spp. gibi Gram negatif bakterilerde ise beta-laktamazlara bağlı beta-laktam direncinin yanısıra PBP değiģimine bağlı direnç de görülebilmektedir (Antignac ve ark., 2001). Özellikle N. menengitidis te pnomokoklardakine benzer Ģekilde mozaik PBP lere bağlı direnç sıktır. Mozaik gen dizileri N. menengitidis e normal üst solunum yolları florasındaki penisiline dirençli Neisseria spp. den geçmektedir. PBP değiģimine bağlı direnç, Shigella dysanteriae, Helicobacter pylori, B. fragilis ve Veionella spp. de bildirilmiģtir (Gülay, 2005a). Beta-laktamaz üretmeyen P. aeruginosa suģlarındaki penisilin direnci düģük affiniteli PBP lerin üretimi ile oluģmaktadır (Yorgancıgil, 1999) Permeabiliteye Bağlı GeliĢen Direnç - DıĢ membran porin değiģimine bağlı direnç - Aktif pompa sistemine bağlı direnç olmak üzere iki Ģekilde görülür DıĢ Membran Porin DeğiĢimine Bağlı Direnç; Porin kaybının tek baģına yüksek düzey beta-laktam direncine yol açması nadirdir. Genellikle dirençli suģlarda porin kaybının yanısıra aktif pompa sistemleri veya aģırı beta-laktamaz üretimi gibi ikinci bir mekanizmanın daha yer aldığı gözlenmektedir (Livermore, 1991;Tomc ve ark., 1995). Gram pozitif bakterilerde bulunan peptidoglikan tabaka geniģ aralıkları nedeniyle antibiyotiklerin bakteri hücresine giriģine engel oluģturmamaktadır. Oysa, Gram negatif bakterilerin dıģ zarı ortamdan alınacak moleküller için yarı geçirgen bir engel oluģturmaktadır. Küçük hidrofilik moleküller dıģ zardan ancak içi su dolu

22 12 kanalcıklar olan porinler aracılığı ile geçebilir. Bu nedenle porin proteinlerindeki değiģiklik veya özel porinlerin kaybı hidrofilik moleküllerin giriģini engellemektedir. Gram negatif bakterilerde özel bir beta-laktama karģı geçirgenliğin az olması doğal bir özellik olmasına karģın geçirgenliğin sonradan, antimikrobiyal tedavi sırasında azalması porin proteinlerinde bir değiģim meydana geldiğini göstermektedir. Örneğin; E. coli deki OmpC ve OmpF porinlerinin kaybı beta-laktam MĠK değerlerinde 8-16 kat artıģa neden olmaktadır P. aeruginosa ve diğer nonfermentatif basillerde dıģ membran geçirgenliği E. coli ye göre kez daha azdır (Gülay,2005a). P.aeruginosa nın dıģ zarında bulunan OprF porinlerinden molekül ağırlığı olan beta-laktamlar geçmektedir. Ancak bu porinlerin % 99,6 ı beta-laktamların geçemeyeceği kadar küçük kanallardır. P.aeruginosa da bulunan D2 adlı dıģ membran porini karbapenemler için özel bir porindir, bunun kaybı imipenemle tedavi sırasında oluģur ve bakteri karbapenemlere karģı dirençli hale gelirken diğer beta-laktamlara duyarlı kalmaktadır. Bu durum Enterobacteriaceae lerde çok nadir görülen bir durumdur. D2 porini bazik amino asitlerin taģınmasında kullanılan dıģ membran proteini olup aynı zamanda imipenemin % 95 inin bu yolla difüze olduğu kanaldır ( Tomc ve ark., 1995). Porin kaybında, hem aktif pompa sistemleri hem de beta-laktamazlar dıģ membrandan yavaģ geçen substratları üzerinde daha kolay etki gösterirler. Örneğin; sefoksitin dirençli E. coli suģlarının çoğunda, bu direncin OmpF kaybı ile AmpC tipi kromozomal enzimlerin aģırı üretiminin sinerjik etkilerinden kaynaklandığı belirlenmiģtir. Aynı Ģekilde K. pneumoniae suģlarında sınıf A beta-laktamazların varlığı OmpK35 in kaybı ile birlikte gitmektedir (Gülay, 2005a). K. pneumoniae deki OmpK36 ve OmpK35 porini E. coli deki OmpC ve OmpF porinlerinin eģdeğeridir (Hernandez-Alles ve ark., 1999).

23 Aktif Pompa (efluks) Sistemlerine Dayalı Direnç Bu sistem üç elemanlı pompa sistemleri olarak da adlandırılmaktadır. Sitoplazmik iç zar üzerindeki pompa proteini, periplazmik aralıkta bulunan membran füzyon proteini aracılığı ile dıģ membrandaki bir kanal sistemi ile iliģkilidir (Gülay, 2005a). Porin değiģikliğinde olduğu gibi yüksek düzey beta-laktam direnci, aktif pompa sisteminin dıģ membran porin değiģikliği ve/veya AmpC beta-laktamaz üretimi gibi ikinci bir mekanizma ile birleģtiği durumlarda görülmektedir. Hatta bu sistemlerin ortak regülatörlerce kontrol edildiğini gösteren örnekler mevcuttur. Örneğin; P. aeruginosa suģlarında MexA-Mex-B regulasyonundaki mutasyon OprD ekspresyonunda azalma ile gitmekte ve penisilin ve sefalosporinlerin yanısıra imipenem, kinolon, kloramfenikol ve tetrasiklin direncine neden olmaktadır (Dwars ve Bonomo, 2010). P. aeruginosa ve E. coli de RND sistemleri ile yapılan çalıģmalarda Mex ve Acr sistemlerinin hem biyositleri (triklosan gibi) hem de klinik tedavi açısından önemli antibiyotiklerden kinolonları atabildiği gösterilmiģtir (Chuanchuen ve ark., 2001) Beta-Laktamazlar ve Etki Mekanizmaları Beta-laktamazlar Gram pozitif bakterilerde hücre duvarı dıģında faaliyet gösterirler. Gram negatif bakterilerde ise periplazmik aralıkta yer alırlar (ġekil 1.3.) (Barlow ve Hall, 2002). Gram pozitif bakterilerde direnç geni taģıyan plazmidlerin bakteriden bakteriye aktarılması transdüksiyon yoluyla yani bir bakteriyofaj aracılığı ile olmaktadır ve direnç genlerini taģıyan plazmidler stafilokoklarda bir plazmitte bir direnç geni olacak Ģekilde bulunurlar. Buna karģılık, Gram negatif bakterilerde direnç genlerinin her biri ayrı ayrı plazmidler üzerinde bulunabileceği gibi tümü birleģik halde tek bir plazmid üzerinde sıralanmıģ olarak bulunabilmektedir.

24 14 ġekil 1.3. Gram pozitif ve Gram negatif bakterilerde hücre duvar yapısı ( ppt den uyarlanmıģtır.) Gram negatif bakterilerde bu plazmidlerin konjugasyon yolu ile aynı veya farklı tür Gram negatif bakterilere aktarılmasını yöneten R plazmidleri de sitoplazmada bulunabilir ve buradan tek ya da birleģik direnç plazmidlerinin konjugasyon yolu ile aktarılmasını yönetirler. Böylece aynı anda bir çok ilaçlara karģı direnç kazanılma ve R faktörünü taģıma özelliği de bir arada aktarılmıģ olur (Bilgehan, 1981; Hanson ve ark., 1999). YirmibeĢ yıl boyunca Gram negatif basillerde bulunan beta-laktamazlar birkaç çeģit ile sınırlı kalmıģ, ancak 1980 li yıllarda beta-laktamazlara dayanıklı geniģlemiģ spektrumlu sefalosporinlerin geliģtirilmesinden kısa bir süre sonra beta-laktamazların sayı ve çeģidinde ani bir artıģ gözlenmiģtir (Gür, 2005a). Bugüne kadar 850 den fazla beta-laktamaz tanımlanmıģtır (Dwars ve Bonomo, 2010). Benzil penisilinin ilk kullanıma girdiği zamanlarda S. aureus ta ve koagülaz negatif izolatlarda % 5 oranında bulunan penisilinaz enzimi plazmidler aracılığı ile % e kadar çıkmıģtır (Livermore, 1995). Gram negatif bakterilerde en yaygın olarak bulunan beta-laktamazlar TEM ve SHV tipi beta-laktamazlardır. Transpozonlarla kromozomdan plazmidlere transfer olan bu enzimlerden TEM-1 beta-laktamazı ilk kez 1965 te enterobakterilerde görülmüģtür.

25 15 Aynı enzim 1969 da Pseudomonas ta, 1973 te V. chloreae da, 1974 te Haemophilus ve Neisseria spp. de saptanmıģtır li yıllarda sefalosporinlerin yaygın kullanımı ile GSBL lar ortaya çıkmaya baģlamıģtır (Livermore, 1995; Barlow ve Hall, 2002). GeniĢ spektrumlu beta-laktamlara direnç gösteren ilk GSBL türü SHV tipi enzim türevi olup, Almanya da 1983 yılında tespit edilmiģtir. GSBL ye bağlı ilk salgın 1985 yılında Fransa da ortaya çıkmıģtır (Coudron ve ark., 1997). GSBL lar ilk ortaya çıkan TEM-1, TEM-2 ve SHV-1 adlı beta-laktamazlardan türemiģlerdir. GSBL ın substratları TEM-1, TEM-2 ve SHV-1 den daha geniģ olup tüm penisilinleri, sefalosporinleri ve aztreonamı hidroliz etmektedirler (Thomson, 2001). AmpC beta-laktamazlara bağlı dirençlilik ilk kez Enterobacter cloacae, Citrobacter freundii, Serratia marcescens ve Pseudomonas aeruginosa daki AmpC enzimlerinin aģırı üretimi Ģeklinde görülmüģtür. Bu enzim sefamisinlere, oksiiminosefalosporinlere ve monobaktamlara karģı aktiftir (Phillipon ve ark., 2002). Beta-Laktamazların Etki Mekanizması: Beta-laktamazlar penisilinleri, sefalosporinleri ve benzeri beta-laktamları hidrolize eden amid, amidin ve benzeri karbon azot bağlarını parçalayan enzimlerdir. Substratları olan antibiyotiklerle kompleks bir ara ürün oluģturarak antibiyotiklere karģı direnç geliģimine neden olmaktadırlar (Livermore, 1995). Sınıf A beta-laktamazlarla sınıf C beta-laktamazlar karģılaģtırıldığında Sınıf C nin aktif bölgesi daha geniģtir. Bu nedenle büyük yan zincirleri olan oksiiminosefalosporinleri bağlayabilirler. Bu bağlanma sonucu oluģan açil-enzim türevi su molekülünce kolayca ayrılabilmektedir (ġekil 1.4.). Bu konudaki bir ayrıcalık karbapenemlerdir. Sınıf C beta-laktamazlar imipenem ile bağlandığında, 6 alfa pozisyondaki büyük hidroksietil yan zinciri, açil-enzim türevinin elektrofilik açil merkezini hidrolitik saldırıdan korunacak Ģekilde kaydırmaktadır. Bunun sonucunda enzim açil türevinden ayrılamamakta ve inhibe olmaktadır (Gülay, 2005b).

26 16 ġekil 1.4. Serin beta-laktamazların etki mekanizması (Livermore,1995). PBP ler de beta-laktamlarla serin ester oluģturmak için reaksiyona girer ancak, betalaktamazların oluģturduğu gibi sabit esterler oluģturamadıkları için beta-laktamları kolayca hidroliz edemezler. Bir yandan beta-laktamaz inhbitörleri beta-laktamlarla sabit esterler oluģtururken bir yandan PBP ler çabucak deaçillenir ve böylece zayıf beta-laktamaz aktiviteleri membran geçirgenliği yeteri kadar azalmıģsa bakteri hücresini lizisten korumuģ olur (Livermore, 1995) Beta-Laktamazların Sınıflandırılması 1970 yılında Jack ve Richmond tarafından önerilen, 1973 tarihinde Richmond ve Sykes tarafından geniģletilen sınıflandırmaya göre, beta-laktamazlar hidrolitik spektrumlarına, duyarlı oldukları inhibitörlere, kromozom veya plazmid tarafından kodlanmalarına göre sınıflandırılmakta idi. Bush-Jacoby-Mederios sınıflamasında beta-laktamazlar tercih ettikleri substratlara ve klavulonatla inhibisyonlarına göre

27 17 1 den 4 e kadar sınıflandırılmıģlardır (Bush ve ark., 1995). Beta-laktamazları kodlayan genlerdeki nokta mutasyonlar substrat özgüllüğünü ve inhibitörlere duyarlılığı büyük ölçüde değiģtirdiği için fenotipik sınıflandırma yetersiz kalmıģtır. Bunun üzerine 1980 yılında Ambler beta-laktamazları enzimlerin nükleotid dizilerine göre A dan D ye kadar olmak üzere 4 sınıfa ayırmıģtır. (Çizelge 1.1.) Buna göre, Sınıf A, Sınıf C ve Sınıf D aktif bölgelerinde serin amino asit taģıyan betalaktamazlardır. Sınıf B enzimleri, aktive olmak için çinkoya bağlı tiyol grupları gerektiren metalloenzimlerdir (Livermore, 1995).(ġekil 1.5) Çizelge 1.1. Beta laktamaz grupları ve genel özellikleri (Bush ve ark., 1995). Beta-laktamaz grubu Moleküler sınıf Tercih edilen substrat CA ile inhibisyon (Bush-Jacoby-Mederios) (Ambler) 1 C Sefalosporinler - 2a A Penisilinler + 2b A Penisilinler Sefalosporinler + 2be A Penisilinler, dar ve geniģ spektrumlu sefalosporinler, monobaktamlar + 2br A Penisilinler +/- 2c A Penisilin, karbenisilin - 2d D Penisilin, kloksasilin +/- 2e A Sefalosporinler + 2f A Karbapenem, penisilin + 3 B Karbapenem, beta-laktam ların çoğu - 4 ND* Penisilin - ND*: BelirlenmemiĢ Grup 1 (Sınıf C): Bunların çoğu indüklenebilen kromozomal AmpC betalaktamazları kapsamaktadır. Ġzoelektrik noktaları bazik olan enzimlerdir. Klavulonik asitle inhibe olmazlar, kloksasilin ve aztreonam bu enzimler için potansiyel inhibitörlerdir. AmpC beta-laktamazlar karbapeneme etkisiz, sefepim ve sefpiroma daha az etkilidir (Philippon ve ark., 2002; Bush, 1989a).

28 18 Bu enzimler beta-laktamaz inhibitör kombinasyonları (ampisilin-sulbaktam, amoksisilin-klavulonat, piperasilin-tazobaktam) ve 7-alfa-metoksi-sefalosporinlerin (sefoksitin, sefotetan) kullanıma girmesi ile ortaya çıkmıģtır ve tıpkı kromozomal partnerleri gibi GSBL den daha geniģ bir etki spektrumuna sahiptirler. Penisilinler içinde sadece amdinopenisilin ve temosiline duyarlıdırlar. Ancak, oksiiminosefalosporin (seftazidim, seftriakson, sefotaksim, sefuroksim, seftizoksim) ile 7-alfa-metoksi-sefalosporinlere (sefoksitin, sefotetan, sefmetazol ve moksalaktam) dirençlidirler MOX-1 hariç plazmid aracılı AmpC beta-laktamazlar GSBL lerin aksine beta-laktamaz inhibitörlerine de dirençlidirler (Philippon ve ark., 2002). Grup 2 (Sınıf A ve Sınıf D):. Bu beta-laktamazlar penisilinleri, sefalosporinleri, karbenisilini, karbapenemleri ve monobaktamları hidroliz etmelerine göre a-f olmak üzere 6 alt gruba ayrılmaktadırlar. 2a: Bu alt grupta penisilini sefalosporinlerden daha hızlı hidroliz eden, fakat klavulonik aside duyarlı enzimler bulunmaktadır, kloksasilin bu enzimler üzerinde etkili bir inhibitör değildir (Bush, 1989a). Bu grup içinde Bacillus türlerinin kromozomal beta-laktamazları da bulunmaktadır. Gram pozitif anaerobik bakterilerden Clostridium türlerinin sentezlediği enzimler de çoğunlukla kromozomal penisilinazlardır (Gür, 2005a). Gram pozitif bakterilere ait penisilinazların çoğu bu grupta yer almaktadır. Bu gruptaki enzimler benzilpenisilin, aminopenisilin ve karboksipenisilinlere karģı aktif, amoksisilin-klavulonat, piperasilin-tazobaktam ve karbapenemlere ise duyarlıdırlar. Buna ilaveten isoksazolil penisilinler, nafsilin ve metisilin bu enzimlere karģı dayanıklıdır (Livermore, 1995). 2b: Klavulonatla inhibisyonları aztreonam ve kloksasiline nazaran daha fazladır (Bush, 1989a). TEM-1, TEM-2 ve SHV-1 enzimleri ile H. influenzae de saptanan ROB-1 enzimi de bu grupta bulunmaktadır (Bush ve ark., 1995). H. influenzae da ROB-1 dıģında TEM-1 enzimleri de bulunabilmektedir. ROB-1 enzimi TEM-1 e göre ampisilin ve amoksisiline daha duyarlıdır.

29 19 H. influenzae ve Neisseria türlerinde TEM enzimleri ampisilin ve benzilpenisiline enterobakterilere nazaran daha düģük düzeyde direnç gösterir. Çünkü, bu bakterilerin dıģ membranı daha geçirgen ve beta-laktamaz üretimi daha düģük düzeydedir. H. influenzae daki beta-laktam direnci beta-laktamaz varlığına, PBP değiģimine veya dıģ membran geçirgenliğine bağlı intrensk dirence bağlı olabilir (Livermore, 1995). TEM-1 enzimi E. coli lerin % dan, diğer enterik bakterilerin % inden izole edilmiģtir. P. aeruginosa da ise nadir bulunmaktadır. TEM-1 enzimi özellikle E. coli suģlarında ampisilin, karboksipenisilin ve amoksisilin direncine neden olan mekanizmalar arasında en sık görülenidir (Gür, 2005a). 2be: GSBL leri içeren gruptur. Bu enzimler, oksiiminosefalosporinler (seftazidim, sefotaksim, seftriakson gibi geniģletilmiģ spektrumlu sefalosporinler) ve monobaktamların yaygın kullanımına bağlı olarak TEM-1, TEM-2 ve SHV-1 gibi ana enzimlerden 1-4 amino asit değiģikliği ile oluģan enzimlerdir (Livermore, 1991). Sefoksitin, sefotetan gibi sefamisinlere, klavulonik asit gibi beta-laktamaz inhibitörlerine ve karbapenemlere duyarlıdırlar. TEM-52 ve TEM-88 enzimleri hariç GSBL ler sefamisinlere karģı aktivite göstermemektedir. TEM türü GSBL sayısı 130 u, SHV türü GSBL sayısı 50 yi geçmiģtir. TEM, SHV ve OXA enzimleri ve aminoasit değiģikliği adresinde verilmektedir. TEM tipi GSBL ler : GSBL fenotipi gösteren ilk TEM türevi enzim TEM-3 olup 1987 yılında bildirilmiģtir. SHV tipi GSBL ler;bu enzimler en sık K. pneumoniae de bulunmaktadır. GSBL fenotipi gösteren SHV türlerinin çoğunda karakteristik değiģiklik 238. pozisyonda glisin yerine serin içermesidir. Ülkemizde SHV-5 ve SHV-12 en sık bulunan SHV tipleridir (Gür, 2005b). OXA tipi GSBL ler: Bu enzimler daha çok P. aeruginosa da bulunan GSBL leri içermektedir. OXA-1 den OXA-10 a kadar olanları dar spektrumlu olup oksasilin ve kloksasilini hidroliz ederler (Livermore, 1995).

30 20 GeniĢlemiĢ spektrumlu OXA enzimlerinden ilki OXA-11 enzimidir ve Hacettepe Üniversitesi Hastanesi nde yatan bir hastadan izole edilen P. aeruginosa suģlarında tanımlanmıģtır. OXA-14, OXA-15, OXA-16, OXA-17 de Türkiye de izole edilen P. aeruginosa suģlarında tanımlanmıģtır (Gür, 2005b). OXA-15 enzimi OXA-2 den, diğerleri ise OXA-10 dan türev alan enzimlerdir. OXA-11, OXA-14, OXA-15 ve OXA-16 seftazidim direncine yol açarken OXA-17 sefotaksim, OXA-31 enzimi ise sefepime direnç oluģturmaktadır, buna karģın seftazidime duyarlıdır. Daha önce OXA -12 olarak adlandırılan OXA-13 sefalosporinaz olmaktan çok penisilinaz aktivitesi göstermekle birlikte aztreonamın yanı sıra sefotaksim ve seftazidimi hidrolize etmektedir (Mugnier ve ark.,1998). OXA-23 ve OXA-24 ise karbapenemaz aktivitesi göstermektedir; bunlar GSBL değildir Bu enzimleri bulunduran suģlarda florokinolon ve aminoglikozid direnci de yüksek oranda görülmektedir (Gür, 2005b). Hacettepe Üniversitesi Hastanesinde yatan iki hastada imipenem tedavisinden sonra Klebsiella ve E. coli izolatlarında tespit edilen OXA-48 Türkiye den bildirilen ilk karbapenemaz enzimidir (Gülmez ve ark., 2008). Bu grupta bulunan PSE-2 (OXA-10) ve tüm OXA beta laktamazların diğer GSBL lerden farklı olarak 100 mm NaCI ile inhibe oldukları bildirilmiģtir (Bush, 1989b). CTX-M tipi GSBL ler: CTX-M olarak tanımlanan bu grup beta-laktamazlar substrat olarak sefotaksimi tercih etmektedir. Seftazidimi bir miktar hidroliz etmekle beraber klinikte dirence yol açacak kadar değildir. Klyuvera ascorbata nın kromozomal AmpC beta-laktamazından köken almıģtır. Bu enzimlerin önemli özelliği tazobaktamın inhibitör etkisinin diğer inhibitörlere göre daha fazla olmasıdır. Bu gruptaki enzimler içinde CTX-M-14, CTX-M-2 ve CTX-M-3 en yaygın olanıdır. CTX-M tipi GSBL ler hem insanlardan hem de sağlıklı hayvanlardan izole edilmiģtir, SHV ve TEM enzimlerinden farklı olarak Vibrio cholerae, tifo dıģı Salmonella ve Shigella spp. gibi toplum kökenli infeksiyon etkenlerinden de izole edilmeleridir (Gür, 2005b). Ülkemizde 2004 Haziran-2005 Ocak arasında 6 farklı merkezden toplanan 1145 hastane izolatında E test ile GSBL bakıldıktan sonra dizi analizi yapılıģtır. Bu

31 21 çalıģmada en sık görülen GSBL tipleri sırasıyla; CTX-M (% 71.4), TEM (% 49.4), SHV (% 46.7) dir. CTX-M-15 kan kültürlerinde % 69.4 ile en yüksek sıklıkta görülürken bunu % 28.6 ile CTX-M-3, % 2 ile CTX-M-1 takip etmektedir (Gür ve ark., 2008). 2br: 1997 yılından itibaren amoksisilin/klavulonik asitten etkilenmeyen E. coli izolatları ortaya çıkmıģtır. TEM-50 ve TEM-68 dıģındaki türler hariç tüm IRT ler (inhibitörlere resistan TEM) GSBL aktivitesi göstermezler (Bradford, 2001). Bu enzimler önceleri IRT olarak isimlendirilmiģ, ancak daha sonra köken aldıkları TEM veya SHV ye göre sıralamaya gidilmiģtir. Örneğin; IRT-1: TEM-31, IRT-2: TEM-30, IRT-14: TEM-45 olarak yeniden numaralandırılmıģtır (Bush ve ark., 1995). Günümüzde IRT enzimlerin sayısı 22 civarındadır. Bunlar klavulonik asit ve sulbaktam ile bunların klinik kullanımda olan kombinasyonlarına dirençli olduğu halde tazobaktam, piperasilin-tazobaktam kombinasyonuna duyarlıdır (Gür, 2005b). 2c: Bunlar 2b den farklı olarak benzilpenisiline ilave olarak karbenisilini hidroliz etmektedirler. Klavulonik asitle inhibe olurlar (Bush, 1989b). P. aeruginosa da saptanan PSE-1, PSE-3, PSE-4 beta -laktamazları, Aeromonas hydrophilia nın AER-1 enzimi, Moraxella. catarrhalis in BRO-1 ve BRO-2 enzimleri, V. cholerae nin SAR-1 enzimi, P. aeruginosa da saptanan CARB-3, CARB-4 ile Acinetobacter deki CARB-5 de bu gruptadır (Bush ve ark., 1995). Kloksasilin ve aztreonama etkisizdirler. PSE-2 kloksasilini daha hızlı hidroliz ettiği için 2d grubuna alınmıģtır (Bush, 1989b). 2d: Bu grupta bulunan enzimler kloksasilini benzilpenisilinden daha hızlı hidroliz ederler. Klavulonatla inhibe olurlar sadece OXA-2 ve OXA-32 tazobaktamla inhibe olmakta klavulonat ve sulbaktamla inhibe olmamaktadır (Dwars ve Bonomo, 2010). OXA-4 hariç diğer OXA tipi beta-laktamazlar bu gruba dahil edilmiģlerdir, sefaloridin ve sefalotini penisilin kadar iyi hidroliz ederler. OXA-4 kloksasilinle inhibe olmamaktadır (Bush, 1989b). Grup 2 nin diğer alt gruplarında bulunan tüm enzimler, moleküler sınıf A da yer alırken, sadece 2d deki beta-laktamazlar

32 22 moleküler sınıf D de yer almaktadır. Bu alt gruptaki enzimler yukarıda OXA tipi GSBL ler baģlığı altında ayrıntılı olarak anlatılmıģtır. 2e: Bu grupta yer alan beta-laktamazlar grup 1 gibi indüklenebilen sefalosporinaz olmalarına rağmen monobaktam ve klavulonik asitle inhibe olurlar. Proteus vulgaris in indüklenebilir kromozomal sefalosporinazı, Bacillus fragilis in CepA, E. coli nin FEC-1, S. maltophilia nın L2, Yersinia enterocolitica nın BIaI enzimleri bu gruptandır (Bush ve ark., 1995). Bu grup enzimlerin çinko içerdiği rapor edilmiģse de boronik asitle inhibe olmaları serin amino asit içerdiklerini göstermektedir (Bush, 1989b). 2f: Bunlar karbapenemleri hidroliz eden, ancak metalloenzim olmayan serin betalaktamazları içermektedir. Bu gruptaki karbapenemazlar kromozoma integre olan transfer olamayan insersiyon elementler tarafından kodlanırlar. E. cloacae nin IMI-1 ve NMC-A enzimi ile S. marcescens in SME-1 enzimi bu gruptadır (Bush ve ark., 1995). Bunlar Grup 3 teki metalloenzimlerden (MBL) farklı olarak imipeneme meropenemden daha fazla dirençli, aztreonama direnç oluģturmalarına karģın diğer sefalosporinlere direnç oluģturmamaları ve klavulonik asitle inhibe olmalarıdır. Grup 3 teki karbapenemazlar ise imipenem ve meropeneme eģit derecede dirençlidir (Livermore, 1997). K. pneumonae de saptanan karbapenemaz (KPC) bu gruba dahildir (Yiğit ve ark., 2001). Grup 3: Bu grup, moleküler sınıf B de yer alan ve aktif bölgelerinde çinko içerdikleri için metallo-beta-laktamaz (MBL) denilen enzimlerden oluģmuģtur. Monobaktamlar dıģında karbapenemler dahil tüm beta-laktamları hidroliz edebilirler. Klavulonik asit veya tazobaktam gibi beta laktamaz inhibitörleri ile inhibe olmaz, ancak EDTA ile inhibe olurlar (Bush, 1989b). Bu enzimler a, b, c olmak üzere 3 alt gruba ayrılırlar. 3a: S. maltophilia nın kromozomal L1 enzimi, Bacillus fragilis in (CcrA) kromozomal beta-laktamazları bu gruptadır. Bu enzimler penisilin, karbapenem ve

33 23 bazı sefalosporinlere etkilidir. S. maltophilia nın L-1 ve L-2 diye adlandırılan ve aynı mekanizma ile indüklenebilen 2 tip beta-laktamazı vardır. L-1 enzimi aktif bölgesinde çinko içeren MBL sınıfında bulunmaktadır, sefsulodin ve aztreonam hariç diğer beta-laktam ve karbapenemlere dirençli beta-laktamazdır. L-2 beta-laktamazı klavulonatla inhibe olan enzimlerin bulunduğu Bush grup 2e de yer almaktadır. L2 sefalosporinazı L1 enziminin etkilemediği antibiyotikleri (sefsulodin ve aztreonam gibi) hidroliz eder (Livermore, 1995). 3b: Gerçek karbapenemaz olarak adlandırılırlar. Çünkü, grup 3a enzimlerin aksine penisilin ve sefalosporin üzerinde hiç hidrolitik aktiviteleri yoktur. Bu da onların zor belirlenmesine neden olur. Bu enzimler Aeromonas hydrophilia da bulunmaktadır. 3c: Legionella gormanii nin beta-laktamazı bu gruptadır. Bu enzim geniģlemiģ spektrumlu MBL enzimi olup 3a ve 3b deki gruplardan daha geniģ etki spektrumuna sahiptir ve çoğu sefalosporinleri hidroliz edebilir. MBL ler sıklıkla etki spektrumlarını geniģletecek bir diğer enzimle birlikte üretilirler. Örneğin, alt grup 3b genellikle diğer alt grub 2b deki penisilinazlarla birliktedir. S. maltophilia da L1 ile birlikte GSBL niteliği taģıyan L2 üretilmektedir. Böylelikle S. maltophilia suģları normalde MBL lerin etki etmediği aztreonama da direnç göstermektedir. Ġlk plazmidik MBL olan IMP-1 adlı karbapenemaz 1991 de Japonya da bir Pseudomonas suģundan izole edilmiģtir. ĠMP-1-18, VIM-1-13, SPM-1, GIM-1 adlı karbapenemazları kodlayan genler plazmid veya integronlarda bulunmuģtur. Bu enzimler aztreonam dıģındaki tüm beta laktamları hidroliz ederler (Sarı, 2005). MBL lar imipenem-edta veya seftazidim-merkaptopropiyonik asitle yapılan çift disk sinerji testi ile diğer beta-laktamazlardan ayırdedilebilmektedirler (Yong ve ark., 2002). Grup 4: Bu grup klavulonik asit ile inhibe olmayan küçük bir penisilinazlar grubundan oluģmaktadır. Burkholderia cepacia nın penisilinazı, Bacillus fragilis, Campylobacter jejuni den izole edilen enzimler, Clostridium butyricum un indüklenebilen kromozomal enzimi, E. coli nin plazmid kontrolundaki SAR-2 betalaktamazı bu grupta olup henüz molekül yapısı belirlenmemiģtir (Sarı, 2005).

34 24 ġekil 1.5.Beta-laktamazların protein yapısı :Sınıf A, C ve D deki beta-laktamazların serin ihtiva eden aktif kısımları sarı renkte, Sınıf B de Zn iyonları iki nokta Ģeklinde gösterilmiģtir (Dwars ve Bonomo, 2010) AmpC Tipi Beta-Laktamazlar AmpC beta-laktamazlar, kodlanma Ģekillerine göre, plazmidik AmpC betalaktamazlar ve kromozomal AmpC beta-laktamazlar olmak üzere ikiye ayrılırlar Kromozomal AmpC Beta-Laktamazlar Kromozomal AmpC beta-laktamazlar antibiyotik çağından önce bakterilerin kendilerini diğer bakteri ve fungusların sentezlediği beta-laktamlara karģı korumak amacıyla ortaya çıkan bir mekanizma olarak mevcut idi. Antibiyotiklerin yoğun Ģekilde kullanımı bu özelliğin seleksiyonuna neden olmuģtur (Livermore, 1995). Kromozomal AmpC beta-laktamazlar, Enterobacteriaceae ailesinden C. freundii, Enterobacter cloacae, Enterobacter asburiae, Enterobacter aerogenes, E. coli, Hafnia alvei, Morganella morganii, Providencia retgerii, Providencia stuartii, Serratia marcescens, Yersinia enterocolitica ile nonenterik Gram negatif bakterilerden P. aeruginosa, Acinetobacter baumanii, Aeromonas sobria,

35 25 Aeromonas hydrophila, Ochrobactrum antropi bakterilerinde bulunmaktadır (Walter-Rasmussen ve Hoiby, 2002). E. coli de ampr geni olmadığı için AmpC enzim sentezi düģük düzeydedir. Ancak mutasyon veya plazmid aracılığı ile AmpC sentezinde artıģ gözlenir (Nasim, 2004). E. coli de düģük düzeyde (bazal) sentezlenen yapısal enzimler, ampisilin ve dar spektrumlu sefalosporinlere karģı direnç oluģturmayacak kadar düģük düzeydedir. Bununla birlikte, E. coli lerin % 2 inde AmpC enzimi çok miktarda sentezlenmekte ve karbapenem, temosilin ve mesilinam hariç tüm beta-laktamlara karģı dirençli hale gelmektedir (Bush ve ark., 1995). Bu bakterilerde ampr geni olmadığı için ampc geni diğerlerinde olduğu gibi indüklenerek değil, büyüme hızına bağlı attenuasyon mekanizması tarafından düģük düzeyde sentezlenmektedir (Philippon ve ark., 2002). E. coli deki promotorun üst bölgesinde oluģan mutasyon AmpC ekspresyonunu 8-18 misli arttırmaktadır (Nelson ve Elisha, 1999). Hiçbir E. coli izolatında tek bir genetik mutasyonla 21 mislinden fazla AmpC üretilememektedir (Olsson ve ark., 1983), bu bakterilerde ancak iki farklı mutasyon sonucunda aģırı düzeyde enzim sentezlenirken Enterobacter spp. de ampd genindeki tek bir mutasyon aģırı düzeyde AmpC betalaktamaz sentezine neden olmaktadır (Livermore, 1995). Shigella flexneri ve S. dysanteriae nin ampc geninde büyük bir delesyon bölgesi bulunduğu için ya eksprese olmamakta ya da çok az eksprese edilmektedir (Maurelli ve ark., 1998). Salmonella enterica genetik haritalarında bir ampc lokusu bulunmakla birlikte, serotip Typhimurium ve Paratyphi B'nin tüm genom analizi sonucunda ampc geninin varlığı gösterilememiģtir (Philippon ve ark., 2002). Neden olarak, salmonellaların hücre içinde yaģamlarını sürdürdükleri için bu genden tasarruf ettikleri savunulmaktadır (Morosini ve ark., 2000). Kromozomal AmpC beta-laktamaz indüksiyonu sonucunda, aminopenisilinlere, beta laktamaz inhibitörlerine ve birinci kuģak sefalosporinlere direnç; karboksi ve

36 26 üreidopenisilinler, üçüncü kuģak sefalosporinler, aztreonam, sefepim, sefpirom ve karbapenemlere duyarlılık görülür. Aslında bu patern o türün doğal beta-laktam direnç fenotipini göstermektedir. Üçüncü kuģak sefalosporinler ancak, çok miktarda indüklenebilir beta-laktamaz (ĠBL) üretildiğinde etkilenir. Ġndüksiyon geçici bir fenomendir ve sefoksitin gibi çok güçlü indükleyici ile üçüncü kuģak sefalosporin birarada kullanılmadığı sürece, klinik bir sonucu yoktur. Bu tip beta-laktamazları üreten türlerde esas sorun, bakteri topluluğunda indüksiyona gerek kalmaksızın yüksek oranda beta-laktamaz üreten dereprese mutantların bulunmasıdır (Gülay, 2005b). Birinci kuģak sefalosporinler ile ampisilin ve amoksisilin gibi penisilinler, kromozomal ampc geni bulunduran bakterileri indükler, ancak kendileri de betalaktamazla inhibe oldukları için invitro olarak dirençli görüldüğünden klinik olarak bir sorun yaratmazlar (Livermore ve Brown, 2001). Ġkinci ve 3. kuģak sefalosporinler ile aztreonam ve üreidopenisilinler, bu tip betalaktamazlar için zayıf indükleyici olmalarına karģın, üretilen enzime duyarlıdırlar. Dolayısıyla, bu tip ajanlar tedavide tek baģına kullanıldıklarında indüklenebilen bakterilerin çoğu ölürken minimal inhibitör konsantrasyon (MĠK) değerleri, duyarlı bakterilere kıyasla yüksek olan dereprese mutantlar 10-5 sıklıkta seçilmektedir. AĢırı AmpC üreten mutantların seleksiyonu infeksiyon bölgesindeki bakteri yoğunluğuna ve kullanılan ilacın düzeyine göre değiģmektedir. Örneğin, Enterobacter bakteriyemilerinde 3. kuģak sefalosporinlerin kullanılması durumunda bu mutantların seleksiyona uğrama riskinin % 20, Enterobacter pnomonilerinde ise daha yüksek olduğu bildirilmiģtir. Aminoglikozidlerle birlikte tedavi uygulanması seleksiyonu düģürmez, fakat hastaya klinik açıdan fayda sağlamaktadır. Öte yandan üriner enfeksiyonlarda mutantların seleksiyon riski düģüktür. Çünkü, kullanılan geniģ spektrumlu beta-laktamların mesanede ulaģtığı MĠK değeri mutantların MĠK değerini aģmaktadır (Livermore, 1995). Bu nedenle üriner enfeksiyonlar dıģında tüm

37 27 Enterobacter spp., C. freundii, Serratia spp., Providencia spp. ve M. morganii ye bağlı enfeksiyonlarda 3. kuģak sefalosporinlerin dirençli olarak rapor edilmesi tavsiye edilmektedir. Klinik mikrobiyoloji laboratuvarında, bakterilerin tür düzeyinde tanımlanması bu nedenle büyük önem taģımaktadır. Kromozomal indüklenebilir ampc geni taģıyan Enterobacteriaceae lerin aksine P.aeruginosa alternatif ilaçlardan karbapenem ve florokinolonlara karģı da direnç geliģtirebilmektedir. P. vulgaris ile C. diversus ta sınıf A da bulunan kromozomal indüklenebilen beta-laktamazları diğerlerinin aksine klavulonatla inhibe olmakta ve bu bakterilerin dereprese mutantları herhangi bir klinik probleme neden olmamaktadır (Livermore ve Brown, 2001) Kromozomal AmpC Beta-Laktamazların Ġndüksiyon Mekanizması Ġndüksiyon mekanizmasında, indüksiyonu baskılayan enzimi kodlayan ampd, indüksiyon sinyali için permeaz iģlevi gören transmembranik proteini kodlayan ampg, transkripsiyonel düzenleyiciyi kodlayan ampr ve ampc genleriyle peptidoglikan yıkım ürünleri yer almaktadır. AmpC beta-laktamazı ampr, ampd ve ampc genlerinin kontrolunda üretilmektedir (Kuga ve ark., 2000) Yani ampc geni AmpG, AmpD ve AmpR proteinleri ile sefoksitin veya imipenem gibi indükleyici ajanların etkisiyle indüklenmektedir ( Reisbig ve ark., 2003). ampd ve ampg genleri kromozomal AmpC beta-laktamaz içermeyen bakteriler de dahil olmak üzere tüm Enterobacteriacea lerde bulundukları için bu genlerin asıl fonksiyonlarının bakteri hücre duvar bileģenlerinin dönüģümünü sağlamak olduğu düģünülmektedir. ampc ve ampr genleri sadece indüklenebilir beta-laktamaz yapan Enterobacteriacea lerde bulunmaktadır (Maurelli ve ark., 1998). AmpR proteni hem baskılayıcı hem aktivatör olabilmektedir. Normalde AmpR proteini ampc ile ampr genleri arasında bulunur ve AmpR bir peptidoglikan öncülü olan UDP-N-asetilmuramik asit-pentapeptid (UDP-Mur-Nac-pentapeptid) ile bağlı olduğunda baskılayıcı olarak görev yapar, ampc geninin transkripsiyonunu aktive edemez. Ancak ortamda hücre duvarının yıkım ürünü olan anhidro-mur-nactripeptid veya anhidro- Mur-Nac-pentapeptid yüksek oranlarda bulunduğunda

38 28 AmpR, UDP-Mur-Nac-pentapeptitten ayrılarak ampc transkripsiyonunu aktive eder, ampc transkripsiyonundaki artıģ, beta-laktam antibiyotiğinin etkisi ile meydana gelmektedir (Girlich ve ark., 2000a). Beta-laktamaz indükleyici sinyali olarak iģlev gören peptidoglikan yıkım ürünleri hücreye AmpG aracılığı ile girer (Gülay, 2005b). AmpG periplazmik muropeptid olan ad pentapeptidi (disakkarit pentapeptid) beta-laktamaz indüksiyonu için sitoplazmik sinyal molekülü olan am-pentapeptide (monosakkarit pentapeptid) dönüģtürmektedir (Reisbig ve ark., 2003).. AmpR proteini indükleyici yokken beta-laktamaz sentezini baskılar, en çok 2,5 misline kadar çıkabilir. Oysa indükleyici varken kat artıģ görülür (Kuga ve ark., 2000). Plazmid aracılı AmpC beta-laktamazlarda ampr yokluğunda AmpC sentezi 2,5-5,8 misline kadar çıkabilirken kromozomal ampc geni olanlarda AmpC ekspresyonu ampr yokluğunda misline kadar çıkabilmektedir (Reisbig ve ark., 2003). Yıkım ürünleri normalde muropeptidlerin dönüģümünü sağlayan bir enzim olan AmpD nin (N-asetil-anhidromuramil-L-alanin amidaz) kapasitesini aģarsa stoplazmada birikerek indükleyici etki gösterir ve beta-laktamaz sentezi baģlar. Betalaktamaz salınımı ancak indükleyici sinyal sürdükçe, yani ortamda antibiyotik bulundukça devam eder. Ġndükleyici ajan ortadan kalkınca AmpC ekspresyonu normale döner (Gülay, 2005b). AmpD proteini bir amidaz enzimi olup, yeni peptidoglikan yapımında kullanılmak üzere sitoplazmik 1,6 anhmurnac-tripeptidi (1,6 anhidro N-asetilmuramiltripeptid) meso-dap a (L-ala-D-glu-meso-diaminopimelik asit) çevirir (Kuga ve ark., 2000). ampd mutantlarında AmpD proteini yapılamamakta ve stoplazmada sürekli olarak anhidro-mur-nac tripeptid birikmektedir. Kromozomal AmpC beta-laktamazların sürekli olarak yüksek düzeyde üretilmesi en sık ampd genindeki mutasyondan kaynaklanmaktadır, beta-laktam yokluğunda bile aģırı miktarda AmpC enzimi sentezlenir (Girlich ve ark., 2000a; Reisbig ve ark., 2003).

39 29 Ġmipenem ve sefoksitin gibi kuvvetli indükleyiciler esansiyel PBP lerin ( PBP 1a, PBP 1b, PBP 2 ve 3) yanısıra düģük molekül ağırlıklı PBP olan DDkarboksipeptidazlara (PBP 4, 5, 6a, 6b ve 7) da bağlanarak peptidoglikandan yüksek miktarda N-Ac-Glc-anhidro-Mur-Nac-tripeptid (N-asetil glukozaminil-1,6-anhidro- N-asetilmuramil-L-alanil-D-glutamil-meso-diaminopimelik asit), N-Ac-Glc-anhidro- Mur-Nac-tetrapeptid (N-asetil glukozaminil-1,6-anhidro-n-asetil muramil-l-alanil- D-glutamil-meso-diamino pimelik asit-d-alanin) ve özellikle N-Ac-Glc-anhidro- Mur-Nac-pentapeptid (N-asetil glukozaminil-1,6-anhidro-n-asetil muramil -Lalanil- D- glutamil- meso- diaminopmelik asit-d-alanil-d-alanin) salınımına ve periplazmik aralıkta birikmesine neden olmaktadırlar. En önemli degradasyon ürünü olan am pentapeptid stoplazmadan geçerek AmpR yi ampc represörü durumundan ampc aktivatör durumuna geçiren en önemli sinyal molekülüdür. Bu iģlemi represor molekül olan UDP- Nac Mur - pentapeptidi (üridindifosfat - N-asetilmuramil - L - alanil - D -glutamil-meso-diaminopmelik asit-d-alanil-d - alanin) AmpR den uzaklaģtırmakla gerçekleģtirmektedir (Pfeıfle ve ark., 2000) Kromozomal AmpC Beta-Laktamaz Üreten Bakterilerde Beta-Laktam MĠK Değerleri Dereprese mutantlar disk difüzyon testinde dirençli görüldüğünden teģhiste sorun oluģturmazlar, asıl sorun 3. kuģak sefalosporinlere duyarlı görülen kromozomal indüklenebilir ampc geni taģıyan bakterilerde görülür (Livermore ve Brown, 2001). Dereprese mutantlar seçildiği anda hastane mikroflorasında birikmeğe baģlarlar. Yunanistan da 12 hastanede yapılan çalıģmada, E. cloacae izolatlarının % ında dereprese mutantlar görülmüģtür, Avrupa ve ABD deki hastanelerde mutant oranı E. cloacae ve C. freundii için % arasında iken M. morganii ve Serratia spp. de bu oran daha düģük bulunmuģtur (Livermore, 1995). Dirençli mutantların seçilmesi kullanılan antibiyotik, inokulum yoğunluğu ve bakteri suģuna göre değiģmektedir. Örneğin, mutantların seçilmesi Serratia suģlarında Enterobacter suģlarına kıyasla daha az orandadır ve bu bakterilerin seftazidim MĠK değerleri daha düģüktür. Çizelge 1.2. de görüldüğü gibi E. cloacae mutantlarının

40 30 sefotaksim ve seftazidim MĠK değerleri 256 ve 64 mg/l iken Serratia spp. mutantlarında MĠK değerleri sırasıyla 8 ve 1 mg/l olarak bulunmuģtur. Dolayısıyle her bakteri ve her antibiyotik aynı risk düzeyini taģımamaktadır (Gülay, 2005b). Serratia, Providencia ve Morganella nın dereprese mutantlarının MĠK değerleri E. cloacae ve C. freundii nin dereprese mutantlarının MĠK değerinden 10 misli daha düģük düzeydedir. Diğer bir ayrıcalık, sefoksitin Serratia, Providencia ve Morganella nın enzimlerine karģı stabil olup ĠBL ve mutantlara orta derecede etkili (MĠK: 1-16 mg/l) iken E. cloacae ve C. freundii ye karģı labil ve kuvvetli indükleyicidir, ancak ĠBL ve dereprese mutantlara etkisizdir (MĠK: >256 mg/l). (Çizelge.1.2.) (Livermore, 1995). Beta-laktam ajanlar indükleyici etkilerine ve üretilen beta-laktamazlara duyarlılıklarına göre 4 gruba ayrılırlar. 1-Ġndükleyici ve dayanıksız olanlar; Aminopenisilinler, 1. kuģak sefalosporinler, sefoksitin, sefotetan ve klavulonik asit 2-Ġndükleyici ve dayanıklı olanlar; Ġmipenem. Geçirgenlikte azalma gibi baģka direnç mekanizması eklenmedikçe etkisini sürdürür. 3-Zayıf indükleyici olan ve dayanıklılığı sınırlı olanlar; Üçüncü kuģak sefalosporinler, karboksipenisilinler, üreidopenisilinler ve aztreonam. Beraberlerinde kuvvetli indükleyici olmadığı durumlarda ĠBL (+) türlere etkilidir. 4- Ġndükleyici olmayan ve göreceli olarak dayanıklı olanlar; Sefepim ve sefpirom. ĠBL (+) türlere etkilidir, ancak imipenem kadar dayanıklı olmadıklarından çok miktarda enzim üretimi halinde aktiviteleri etkilenir (Gülay, 2005b). P. vulgaris ve C. diversus un beta-laktamazları Bush grup 2e veya Ambler sınıf A da bulunan ve sefuroksimaz olarak adlandırılan kromozomal enzimlerdir. Bu bakterilerin enzimleri K. oxytoca nın K1 enzimine benzerlik gösterirler, penisilin, sefuroksim, seftriakson ve sefotaksime dirençli iken seftazidim, sefamisin ve karbapenemlere duyarlıdırlar. K1 enzimin aksine aztreonama etkileri azdır ve indüklenebilirler. Ampisilin, amoksisilin ve dar spektrumlu sefalosporinler bu bakteriler için kuvvetli indükleyici fakat labil ilaçlardır. Bu yüzden indüklenebilen

41 31 türlerde ve mutantlarda ampisilin, amoksisilin ve dar spektrumlu sefalosporinlerin MĠK değerleri yüksektir. Üreidopenisilin, karboksipenisilin, sefotaksim ve seftriakson mutantlarda etkisiz olmasına rağmen zayıf indükleyici olduklarından tedavide ĠBL lere karģı kullanılabilir. Enterobacter spp. ve C. freundii nin mutantları karbapenem ve temosilin dıģındaki tüm beta-laktamlara karģı dirençli iken P. vulgaris ve C. diversus un mutantları karbapenem ve temosilinin yanısıra seftazidim, aztreonam, sefamisin, sulbaktam, klavulonat ve tazobaktama da duyarlıdırlar. P. vulgaris ve C. diversus daha az dirençli olduklarından tedavi sırasında mutantların seçilmesi de daha nadirdir. P.aeruginosa da derepresyon kısmidir, 10-7 sıklıkta oluģur. Bu durumda indüklenmemiģ enzim seviyesi indüklenen enzimden daha fazladır. P.aeruginosa da tam dereprese mutantların oluģma sıklığı 10-9 dur.. Enterobacter spp. de ise indüksiyon tamdır ve mutantların oluģma sıklığı dir. P. aeruginosa da total veya kısmi dereprese mutantların seçimi geniģ spektrumlu beta-laktamların yanısıra üreidopenisilin gibi labil ve zayıf indükleyicilerin tedavide kullanılması ile geliģir. Enterobacter spp. de ise mutantların seçiminde sadece sefalosporinler etkin olmasına rağmen P. aeruginosa da tam veya kısmi mutantların seleksiyonu kistik fibrozizli hastalar hariç diğer hastalıklarda Enterobacter spp. ve C. freundii den daha az sıklıkta oluģur (Livermore, 1995). GSBL varlığında P. aeruginosa da seftazidime yüksek düzeyde direnç gözlendiği halde kromozomal AmpC beta-laktamazın aģırı üretiminde, porin değiģikliğinde veya efluksa bağlı dirençte ise seftazidime düģük düzeyde direnç gözlenmektedir. Bu nedenle P.aeruginosa da yapılan ĠBL testinde seftazidim yerine sefotaksim kullanılması önerilmektedir (Livermore ve Brown, 2001). Karbapenemler indükleyici olsalar da yüksek düzeyde enzim üreten mutantlar ve ĠBL üzerinde eģit ölçüde aktiftirler ve gerek invitro gerekse invivo olarak mutant seleksiyonuna neden olmamaktadır (Livermore, 1995).

42 32 Çizelge 1.2. Kromozomal AmpC beta laktamaz üreten bakterilerde bazal, ĠBL ve mutantlarda gözlenen MĠK değerleri (Livermore, 1995). E. coli Bazal E. coli Yüksek düzeyde E. cloacae E. Cloacae E. cloacae ĠBL Bazal Yüksek düzeyde C. freundii C. Freundii C. freundii ĠBL Bazal Yüksek AM düzeyde TĠC TĠM PĠP PTZ TEM CLT CPZ 0, ,25 0, ,25 0,25 32 CXM CTX 0,03 4 0,12 0, ,06 0,03 32 CAZ 0,06 4 0,25 0, ,25 0,5 32 CEP 0,03 0,12 0,12 0,12 2 0,03 0,06 0,5 FOX MOX 0, ,06 0, ,3 0,06 8 AZT 0,03 2 0,06 0, ,015 0,015 8 ĠMĠ 0,12 0,12 0,25 0,25 0,25 0,25 0,12 0,25 MEM 0,03 0,03 0,06 0,015 0,06 0,03 0,03 0,03

43 33 Çizelge 1.3. Kromozomal AmpC beta laktamaz bulunduran bakterilerde ĠBL ve mutantlarda gözlenen MĠK değerleri (Livermore, 1995). M. morganii ĠBL M. Morganii Yüksek düzeyde S. marcescens ĠBL S marcescens Yüksek düzeyde P. vulgaris AM ĠBL P. Vulgaris Yüksek düzeyde TĠC TĠM PĠP 0, PTZ 0, TEM CLT >2.048 >2.048 >2.048 > CPZ CFX CTX 0, ,25 8 0,06 2 CAZ 0,06 8 0,25 1 0,06 0,25 FEP 0,03 0,03 0,12 0,25 0,12 1 FOX MOX 0,12 0,12 0,5 4 0,12 0,12 AZT 0,06 0,12 0,06 2 0,25 2 ĠMĠ 2 2 0,25 0, MEM 0,03 0,03 0,03 0,03 0,03 0,06 AM: ampisilin, amoksisilin, TĠC: tikarsilin, TĠM: tikarsilin-klavulonat, PĠP: piperasilin, PTZ: piperasilintazobaktam, TEM:temosilin, CLT: sefalotin, CPZ: sefazolin, CFX: sefuroksim, CTX: sefotaksim, CAZ: seftazidim, CFP:sefpirom, FEP:sefepim, FOX: sefoksitin, MOX: moksalaktam, AZT: aztreonam, ĠMĠ: imipenem, MEM:meropenem

44 34 C. freundii ve Enterobacter spp. nin mutant ve ĠBL dıģındaki fenotipleri ; tıpkı E. coli de olduğu gibi bazal seviyede AmpC üretebilmekte ve tüm beta-laktamlara duyarlı kalabilmektedir. E. cloacae ve E. aerogenes in mutantları majör porinden yoksun oldukları için AmpC enzim varlığı impermabilite ile birleģtiğinde diğer geniģ spektrumlu betalaktamların yanı sıra sefepim, sefpirom, temosilin ve karbapenemlere karģı da dirençli hale gelmektedirler, ancak bu tür durumlara klinikte çok nadir rastlanmaktadır. Seleksiyon riskinden kurtulmak için tedavide karbapenem, temosilin veya kinolon grubu antibiyotikler verilmeli veya tür düzeyinde tanımlama yapılamıyorsa C. freundii ve Enterobacter den Ģüpheleniliyorsa indüksiyon testi (Disk antagonizm testi) uygulanması önerilmekte ancak, bu testin sefoksitine orta derecede duyarlı olan M. morganii, Providencia spp., Serratia spp. de geçersiz olduğu bildirilmiģtir (Livermore, 1995) Plazmid Aracılı AmpC Beta-Laktamazlar AmpC beta-laktamaz genlerinin plazmid üzerindeki varlığı ilk defa Papanicolaou ve arkadaģları (1990) tarafından K. pneumoniae suģlarında MIR-1 beta-laktamazın gösterilmesiyle kanıtlanmıģtır. Bauernfeind ve arkadaģları (1996a) tarafından 1990 yılında Yunanistan da bir K. pneumoniae izolatında CMY-2 adlı AmpC beta-laktamazı tespit edildi. CMY-2 hem coğrafik olarak en geniģ alana yayılan hem de prevalansı en yüksek olan bir enzimdir. CMY-2 enzimi bugüne kadar Arjantin, Fransa, Almanya, Yunanistan, Hindistan, Pakistan, Tayvan, Türkiye Ġngiltere ve A.B.D. den bildirilmiģtir (Bauernfeind ve ark., 1996a). GSBL üreten mikroorganizmalarda olduğu gibi AmpC üreten mikroorganizmalarla da nozokomiyal enfeksiyonlar görülmüģtür. Örneğin, aynı hastanede yatan 11 hastada MIR-1 (Papanicolaou ve ark.,1990) 17 hastada ACT-1 (Bradford ve ark.,1997) ile oluģan nozokomiyal enfeksiyonlar gibi.

45 Plazmid Aracılı AmpC Beta-Laktamazların Ġsimlendirilmesi AmpC tipi enzimler yol açtıkları direnç fenotipine göre (sefamisinler-cmy; sefoksitin-fox; moksalaktam-mox; latamoksef-lat), enzim tipine göre (AmpC type-act; Ambler Class C-ACC), enzimin bulunduğu yere göre (Miriam Hastanesi- MIR-1, Suudi Arabistan daki Dhahra Hastanesi-DHA-1) veya hasta adına göre (Bilal-BIL-1) isimlendirilmiģlerdir (Walter-Rasmussen ve Hoiby, 2002). Bu enzimlerin pek çoğu nükleotid dizisine göre yeni bir beta-laktamaz olarak adlandırılmıģ olmasına rağmen, nükleotid ve aminoasit dizilerinin tekrar incelenmesi sonucunda; CMY-2, BIL-1 ve LAT-2 nin; LAT-1 ve LAT-4 ün; ayrıca CMY-6 ve LAT-3 ün birbirleriyle aynı enzimler olduğu anlaģılmıģtır (Barlow ve Hall, 2002) Plazmid Aracılı AmpC Beta-Laktamazların Genetik Özellikleri Tüm Enterobacteriaceae üyeleri pampc nin orijini değildir, örneğin bügüne kadar Enterobacter aerogenes, Serratia marcescens, ve indol pozitif Proteus ve E. coli nin kromozomal ampc genleri hiçbir plazmid üzerinde tespit edilememiģtir (Perez- Perez ve Hanson, 2002). Moleküler sınıf A, B ve D enzimleri integron ve transpozonlara gen kasedi içinde integre olmuģlardır. Fakat sınıf C enzimleri ise gen kasetleri oluģturmazlar, integronlara bağlı olarak bulunurlar. Örneğin; CMY-1, CMY-8, CMY-9, CMY-10, CMY-11, FOX-4, MOX-1, DHA-1 genleri. Bu enzimler, gen kasetlerinin karakteristik özelliği olan 59 bazlık elementten yoksundurlar. CMY-3, CMY-4, CMY-5 genleri ise insersiyon elementlerine bitiģik olarak bulunmuģtur (Walter- Rasmussen ve Hoiby., 2001). Kromozomal ampc genlerinin evrimi TEM beta-laktamazların aksine antibiyotik baskısı olmadan gerçekleģebilmektedir. Antibiyotik çağından önceki kromozomal AmpC enziminin direnç düzeyi ile antibiyotik çağından sonra izole edilen plazmid aracılı AmpC enzimlerinin direnç düzeyi aynı bulunmuģtur (Barlow ve Hall, 2002).

46 36 pampc enzimlerindeki amino asit değiģikliği her zaman fenotipik değiģikliğe yol açmamaktadır, örneğin ilk defa 1989 da Seul de saptanan CMY-1 adlı plazmidik AmpC enzimi halen aynı bölgedeki bazı suģlardan izole edilmekte ve aynı direnç fenotipi göstermektedir. Bu bölgede 1995 te saptanan CMY-1 enzimle aralarında bir amino asit değiģikliği olduğu halde sadece seftazidim MĠK değerinde artıģ gözlenmiģtir (Bauernfeind ve ark., 1998). Aynı Ģey kromozomal AmpC beta-laktamazlar için de geçerlidir. Örneğin E. cloacae nin 208. ve 210. pozisyonlardaki 3 aminoasidin duplikasyonu seftazidim ve sefuroksime karģı aktivitesini arttırmaktadır (Nukaga ve ark., 1995) veya 318. pozisyondaki aminoasit değiģikliği veya 289. ve 294. pozisyonlar arasındaki 6 aminoasidin delesyonu sefepim ve sefpiroma doğru aktivite artıģı Ģeklinde kendini göstermiģtir (Phillipon ve ark., 2002; Bauernfeind ve ark., 1998). pampc enzimlerinin çoğu indüklenmedikleri halde DHA-1, DHA-2 ve ACT-1 plazmidik AmpC tipi beta-laktamazlar indüklenebilen enzimlerdir. Ancak, plazmidik MIR-1 tipi AmpC beta-laktamazı indüklenme ile ilgili tüm genlere sahip olmasına rağmen indüklenmemektedir (Phillipon ve ark., 2002) Plazmid Aracılı AmpC Beta-Laktamazların Duyarlılık Patterni Bakterilerde kromozomal genetik değiģikliğe bağlı dirençlilik % civarında oluģurken ekstra kromozomal (transpozon, plazmid, integron, IS gibi) genetik değiģikliğe bağlı dirençlilik % 80 dolaylarında oluģmaktadır (Coculescu, 2009). Gram negatif bakterilerde porin kaybına bağlı beta-laktam direnci genellikle insersiyon elementlerinin porin genlerine integre olmasıyla oluģmaktadır (Hernandez-Alles ve ark.,1999). AmpC enzim varlığında oksi-iminosefalosporinler içinde seftazidimin MĠK değeri sefotaksimden, sefamisinler içinde ise sefoksitinin MĠK değeri sefotetandan daha yüksek bulunmaktadır. Sefepim ve sefpiromun MĠK değeri çok az etkilenmektedir, fakat inokulum miktarı 10 5 ten 10 7 çıkarıldığında MĠK değeri yükselmektedir.

47 37 Ġmipenemin MĠK değeri ise değiģmemektedir. AmpC enzimi porin değiģikliği ile birlikte olduğunda imipenemin MĠK değeri meropenemin MĠK değerinden daha yüksek çıkmaktadır (Philippon ve ark., 2002). CMY-1 enziminin sefotaksim MĠK değeri FOX-1 in sefotaksim MĠK değerinden daha yüksek olup sırasıyla 128 µg/ml ve 4 µg/ml iken, seftazidim MĠK değerleri ise aksine 4 ve 8 µg/ml dir (Thomson, 2001). CMY-1 ve MOX-1 adlı AmpC tipi enzimlerin sefotaksim MĠK değerleri seftazidimin MĠK değerinden daha yüksek bulunmuģtur. Diğer plazmidik AmpC beta-laktamazlarda ise bu antibiyotiklerin MĠK değerleri ya eģit olmakta ya da seftazidimin MĠK değeri sefotaksimden daha yüksek çıkmaktadır. CMY-8 ile CMY-9 enzimleri arasında tek aminoasit farkı olmasına rağmen hidrolitik aktiviteleri farklıdır. CMY-8 sefaloridini CMY-9 dan daha fazla hidroliz ederken, CMY-9 seftazidimi CMY-8 den daha fazla hidroliz etmektedir (Doi ve ark.,2002). Ayrıca CMY-1 enziminin sulbaktamla inhibisyonu klavulonat ve tazobaktama nazaran daha fazladır (Bauernfeind ve ark., 1996b). Bradford ve arkadaģları (1997) tarafından yapılan çalıģmada, ACT-1 adlı AmpC enzim sentezleyen K. pneumoniae suģlarında 42 kda majör outer membran protein yokluğu, Stapleton ve arkadaģları (1999) tarafından yapılan çalıģmada ise, CMY-4 adlı AmpC enzimi bulunduran E. coli suģlarında 38 kda outer membran protein yokluğu aģırı miktarda sentezlenen AmpC enzim varlığı ile birleģtiğinde karbapeneme karģı direnç gözlenmiģtir. SHV-1 tipi enzim bulunduran K. pneumoniae de 40 kda dıģ membran porin yokluğu sefoksitin direncine, SHV-5 bulunduran K. pneumoniae de kda dıģ membran porin yokluğu sefotaksim ve sefoksitin direncine, TEM-2 bulunduran izolatlarda 41 kda yokluğu sefaperazon-sulbaktam direncine neden olurken bu porinlerin yokluğu adı geçen beta-laktamazlarla birlikte iken sadece sefoksitin direnci gösterdikleri halde imipenem direncine neden olmamaktadır (Bradford ve ark., 1997).

48 38 Bauernfeind ve arkadaģları (1999) tarafından ilk kez K. pneumoniae de tanımlanan ACC-1 enziminin 11. pozisyonunda bulunan amino asit sefamisinleri hidrolize eden diğer AmpC beta-laktamazlardaki aminoasitten farklıdır. Bu nedenle ACC-1 enzimi diğer AmpC beta-laktamazların aksine sefamisinlere duyarlıdır AmpC Beta-laktamazların Laboratuvar Tanısı Tarama testleri 1-GeniĢ spektrumlu beta-laktam antibiyotiklere ve sefoksitine karģı azalmıģ duyarlılık, oldukça duyarlı olmakla birlikte nonspesifiktir. Çünkü, bu kriterler E. coli de kromozomal AmpC nin aģırı üretilmesi veya membran geçirgenliğinin azalması durumunda da görülebilmektedir (Doi ve Paterson, 2007). 2-Beta-laktamaz inhibitörlerine direnç, AmpC enzim varlığında görüldüğü gibi betalaktamaz inhibitörlerine dirençli TEM (IRT) beta-laktamazların varlığında veya çok fazla miktarda üretilen GSBL, TEM-1, SHV-1 enzimleri, MBL ve sınıf D deki bazı OXA tip enzim varlığında da görülebilmektedir. 3-Sefepime ve sefpiroma duyarlılık, AmpC enzimleri GSBL ile birlikte ise gözden kaçabildiği için sensitivitesi ve spesifitesi oldukça düģüktür(doi ve Paterson, 2007). 4-Beta-laktamazlarda tarama testi ile ilgili olarak Jacoby ve arkadaģlarının (2006) kullandıkları beta-laktam antibiyotikler içinde sefpodoksimin en az negatif sonuç verdiği gözlenmiģtir. 5-Nonfermentatif Gram negatif bakterilerde sefoksitine karģı efluks veya porin kaybı gibi nedenlerden ötürü direnç geliģtiği için bu bakterilerde AmpC enzimi yönünden sefoksitin tarama testi faydasızdır (Doi ve Paterson, 2007). AmpC beta-laktamazların tayininde doğrulama testleri olarak kullanılan indirekt yöntemler; 3BT, Tris-EDTA lı AmpC disk testi, sefoksitin agar besiyerinde üretme (CAM) ve Modifiye Hodge testidir. Bu testler porin kaybına

49 39 bağlı sefoksitin direncini AmpC beta-laktamaza bağlı sefoksitin direncinden ayırdedebilen ve sefoksitin direnci esasına dayanılarak yapılan testlerdir (Black ve ark., 2004). CAM yöntemi; sefoksitin ihtiva eden agarda açılan kuyucuklara 3BT de olduğu gibi enzim ekstraktının doldurulması ile gerçekleģtirilen bir testtir. 3BT ile aynı sensitivite ve spesifiteye sahip olduğu belirtilmekle beraber santrifüj gerektiren ve yoğun emek isteyen bir yöntem olduğu bildirilmiģtir ( Nasim ve ark., 2004). Modifiye Hodge Testi 3BT nin modifiye edilmiģ Ģeklidir. Ancak bazı tip AmpC enzim varlığında (CMY-10) sensitivitesi yüksek iken bazılarında (DHA-1) sensitivitesinin düģük olduğu belirtilmiģtir (Lee ve ark.,2005). Tris-EDTA lı AmpC disk testi: Tris-EDTA kullanılarak bakteri hücre geçirgenliğinin arttırılması ve bakterideki beta-laktamaz salınımının kolaylaģtırılması esas alınmaktadır. GSBL ile birlikte bulunmasının sonuç üzerinde etkili olmadığı ancak, sefoksitin ve karbapenemleri hidroliz edebilen (KPC-2 gibi) nadir bulunan AmpC dıģı beta-laktamaz varlığının yanlıģ pozitifliğe neden olabileceği bildirilmiģtir ( Black, 2005a). AmpC enzim tayininde doğrulama testleri olarak önerilen inhibitör temelli direkt yöntemler; Boronik asit (BA)ile yapılan inhibisyon disk testi (Coudron, 2005; Yagi ve ark., 2005; Brenwald ve ark., 2005), LN-2-128, Ro ile inhibisyon disk testi (Black ve ark.,2004), Syn2190 ile inhibisyon disk testi Black ve arkadaģları (2005b), Piperasilin ve piperasilin-tazobaktam diskleri ile yapılan inhibisyon disk testi (Taneja ve ark.,2008), Kloksasilin Çift Disk Sinerji (Mirelis ve ark., 2006), Ġzoelektrik odaklama (ĠEO) (Ak, 2008;Jacoby, 2009) ve immunolojik olarak ELĠZA ile immunglobulin araģtırması (bununla ilgili çalıģmalar araģtırma safhasındadır) (Doi ve Paterson, 2007). Moleküler yöntemler; Multipleks PCR (Perez-Perez ve Hanson, 2002), oligoprimerlerle yapılan dizi analizleri, PCR bazlı multipleks asimetrik mikroarray

50 40 yöntemi (Jacoby, 2009), Pulsed field gel electrophoresis (PFGE) (Pai ve ark., 2004; Wang ve ark., 2004; Winokur ve ark., 2000). Kloksasilin Çift Disk Sinerji Testi; Müller Hinton (MH) agarda CLSI nin önerilerine göre 500 µg kloksasilin ihtiva eden diskten merkezden merkeze 2,5 cm mesafede olacak Ģekilde seftazidim (30 µg) ve sefotaksim (30 µg) diskleri yerleģtirilerek yapılan bu testte sefalosporinlerden herhangi birinin kloksasiline doğru görülen zon geniģlemesi AmpC varlığı olarak değerlendirilmektedir. E. coli için özgüllüğünün % 10,3 olduğunu rapor edilmiģtir (Mirelis ve ark., 2006). E testle AmpC enzim tespiti, sefotetan veya sefoksitin ile kloksasilin emdirilmiģ sefotetan veya sefoksitin kombine disklerle yapılmaktadır. Bir çalıģmada 500 izolatla yapılan E testinde sensitivitesinin % 88 - % 93 olduğu bildirilmiģtir (Jacoby, 2009). Ro ile LN beta-laktamaz inhibitörleri, hem sınıf A (TEM ve SHV), hem sınıf C enzim inhibitörleridirler. Seftazidim (30µg), sefotaksim (30µg), sefpodoksim (10µg), sefotetan (30µg) ve sefoksitin (30µg) diskleriyle bu betalaktam antibiyotiklerle kombine Ro (20 µg) ve LN nin (20 µg) kullanıldığı çift disk sinerji testinde inhibisyon zon farkının >4 mm olması AmpC pozitif olarak değerlendirilmiģtir. Ancak bu testin AmpC tespitinde sefotetan- LN ile sefotetan-ro nin en iyi sonucu verdiği, sefamisin dıģı sefalosporinlerle spesifitesinin düģtüğü görülmüģtür (Black ve ark., 2004). Syn2190 ile inhibisyon testi : Bir monobaktam türevi olan Syn2190 AmpC üzerinde etkili, GSBL üzerinde ise önemsenmeyecek düzeyde etkili bir inhibitördür. Yukardaki çalıģmanın aynısı Syn 2190 (150µg ) inhibitörü ile karģılaģtırmalı olarak yapıldığında, Syn 2190 (150 µg) nin LN (20 µg) ile Ro den (20 µg) daha geniģ spektrumdaki bakterilerde AmpC beta-laktamaz tespit edebildiği ve sefotetan/syn 2190 kombinasyonunun LN ile Ro ye oranla tekrarlanabilirliğinin daha yüksek olduğu bildirilmiģtir (Black ve arkadaģları (2005b).

51 41 Piperasilin-tazobaktam ile çift disk sinerji testi, bazı AmpC tipi enzimler tazobaktama duyarlı bulunduğu için (Babini ve ark., 1998) piperasilin ve piperasilintazobaktam kombine diskleri ile yapılan sinerji testinde piperasilinin piperasilin/tazobaktama göre zon çapının >5 mm olmasının AmpC taramasında geçerli olduğu önerilmektedir. Bu testle pozitif çıkan izolatların 3BT ve TRĠS-EDTA disk testiyle pozitif sonuç verdiği gösterilmiģtir (Taneja ve ark.,2008). BA ile inhibisyon testi:beta-laktam dıģı inhibitörler içinde en çok çalıģılan molekül olan BA nın AmpC beta-laktamaz inhibitörü olduğu ilk kez Beesley ve arkadaģları (1983) tarafından tespit edilmiģtir. Ġzolektrik Odaklama Metodu (ĠEO); tespit edilen beta-laktamazın izoelektrik noktasının (pi) belirlenmesi için uygulanan bir iģlemdir. Plazmid aracılı betalaktamazların pi değeri 6,4 ile 9,4 arasında değiģmektedir. Ancak bu aralıkta bazı GSBL türü enzimler bulunabileceğinden, tespit edilen bantların kloksasilin ile inhibe olarak kaybolduğunun gösterilmesi gerekir. Kromozomal AmpC enzimlerin pi değeri >8 büyük olduğu halde plazmid aracılı AmpC enzimlerin pi değeri (pi:6,7-7,2) daha düģüktür (Jacoby, 2009). Rutin laboratuarların kullanımı için zahmetli test olup deneyimli kiģilere ihtiyaç duyulduğundan ancak referans laboratuarlarında uygulanabilmektedir Bu yöntemde; bakterilerdeki enzimler sonikasyon ile ekstrakte edilmektedir. ġöyle ki; Ġncelenecek bakterinin kanlı agardaki 24 saatlik kültüründen birkaç koloni alınarak 10 ml triptikaz soy buyyon içerisine inokule edilmektedir. 35 ºC de 24 saat inkubasyondan sonra 4000 rpm de 10 dakika santrifüj edilmekte ve üstteki sıvı döküldükten sonra üzerine tampon eklenmektedir, daha sonra soğutmalı santrifüjde rpm de 15 dakika santrifüj edilip bu iģlem 3 kez tekrar edilir. Yıkama sonunda süpernatan dökülerek çökelti üzerine tekrar 500 µl tampon eklenerek 3 kez sonikasyon iģlemi uygulanır ve enzimlerin korunması için aralarda buz ile soğutma iģlemi uygulanır. Sonikasyon sonrasında rpm de +4ºC de 60 dakika santrifüj iģlemi uygulandıktan sonra üstteki sıvıdan 50 µl alınarak nitrosefin çözeltisi (500µg/ml) eklendikten sonra renk değiģimi gözlenir. Rengi sarıdan kırmızıya dönen enzim ekstraktlarına poliakrilamid jel üzerinde elektroforez iģlemi uygulanır. Her

52 42 elektroforez iģlemi sırasında izoelektrik noktası bilinen beta-laktamaz enzimi pozitif kontrol olarak kullanılmaktadır. Elektroforez sonlandığında, enzim bantlarını görünür hale getirmek için, jel üzerine nitrosefin çözeltisi yayılarak ortaya çıkan pembe bantlar milimetrik kağıda aktarılmakta ve milimetrik hesaplama ile izoelektrik noktaları hesaplanmaktadır (Eroğlu ve ark., 2007). Konjugasyon deneyleri: AmpC tipi enzim genlerinin konjugatif olup olmadığını göstermek için konjugasyon veya transformasyon deneylerinin yapılması gerekmektedir ki bu testler sadece referans laboratuarlarında yapılabilmektedir (Doi ve Paterson, 2007). ġöyleki; Konjugasyon deneyinde kullanılmak üzere alıcı olarak rifampisin dirençli E. coli, verici olarak hastadan izole edilen suģ kullanılır. Her iki suģun yoğun suspansiyonundan (109 Cfu/ml) Müller Hinton buyyona ekim yapılıp 35 C de 18 saat bekledikten sonra bu süre sonunda verici suģun inhibisyonu için 64 µg/ml nalidiksik asit, alıcı suģun inhibisyonu için de 64 µg/ml sefoksitin eklenen MacConcey agara buyyondan ekim yapılıp bir gece inkubasyondan sonra transkonjugantlar elde edilmektedir. Bunların sefoksitin MĠK değerlerine bakıldığında sefoksitin direncinin alıcı hücreye aktarıldığı gösterilmiģtir (Bauernfeind ve ark., 1996a).

53 43 2. GEREÇ VE YÖNTEM 2.1.GEREÇ Sarf Malzemeleri Ependrof, 1, 5 ml lik (Greiner, Almanya) Sarı pipet ucu (Eppendrof, Almanya) Santrifüj tüpü 15 ml lik (Greiner, Almanya) Kimyasal Madde ve Malzemeler Besiyerleri Eosin metilen blue (Oxoid) Blood agar base (Oxoid) Müller hinton agar (Difco) Müller hinton buyyon(difco) Kligler iron agar (Difco) Cristensen üre agar (Difco) Simmons sitrat agar (Difco) Antibiyotik diskleri: Sefoksitin antibiyotik diski (30 µg) (Bioanaliz) Sefotaksim antibiyotik diski (30 µg) (Bioanaliz) Seftazidim antibiyotik diski (30 µg) (Bioanaliz) Sefepim antibiyotik diski (30 µg) (Bioanaliz) Sefotaksim-klavulonat antibiyotik diski (30 /10 µg) (Bioanaliz) Seftazidim-klavulonat antibiyotik diski (30 /10 µg) (Bioanaliz) Amoksisilin/klavulonat antibiyotik diski (20/10 µg) (Bioanaliz) Ampisilin/sulbaktam antibiyotik diski (10/10 µg) (Bioanaliz)

54 44 Piperasilin/tazobaktam (antibiyotik diski 100/10 µg) (Bioanaliz) Tikarsilin/klavulonat antibiyotik diski (75/10 µg) (Bioanaliz) Sefaperazon/sulbaktam antibiyotik diski (75/10 µg) (Bioanaliz) Trimetoprim/sulfametaksazol antibiyotik diski (5 µg) (Bioanaliz) Gentamisin antibiyotik diski (10 µg) (Bioanaliz) Siprofloksasilin antibiyotik diski (5 µg) (Bioanaliz) Ġmipenem antibiyotik diski (10 µg) (Bioanaliz) Araçlar IĢık mikroskobu (Nikon, Japonya) Etüv (Heraeus, Almanya) Santrifüj aleti (Herolab, Almanya) Otomatik pipet (Genex, Finlandiya) Derin dondurucu (Nuaire, Japonya) Kullanılan Ayıraçların ve Disklerin Hazırlanması Clark-Lubs besiyeri; Polipepton Glikoz K2HPO4 Distile su 7 gr 5 gr 5 gr 1000 ml Ġndol besiyeri; Polipeptid NaCl Distile su 2 gr 0,5 gr 100 ml Gram boyasının hazırlanıģı; a-kristal moru eriyiği: Kristal viole 1 gr

55 45 Fenik asit kristali 2 gr % 96 lık etil alkol 10 ml Distile su 100 ml b- Lugol eriyiği: Ġyot kristalleri Potasyum iyodür Distile su c- % 96 etil alkol 1 gr 2 gr 300 ml d- Sulu fuksin eriyiği: Karbol fuksin Distile su 2 ml 18 ml Ġndol ayıracı; Kovacs ayıracı : Ġsoamil alkol p-dimetilaminobenzaldehit HCl 150 ml 2 gr 40 ml Metil kırmızısı ayıracı; Metil red Etil alkol Distile su 0,050 gr 150 ml 100 ml Voges Proskauer ayıraçları; a-alfa naftol Etil alkol b-potasyum hidroksit Distile su 5 gr 100 ml 10 gr 100 ml.

56 46 Klavulonik asid solusyonunun hazırlanması, (Bioanaliz firması tarafından hazırlandı.) Bunun için % 41,14 oranında clavulonic acid anhydre içeren potassieum clulo./avicel blend. kullanıldı mg da 411 mg CA içerir, gereken ml.de 10 µg.dır ml için 10 µg gerekir ise 100 ml için ne gerekir:x = 100 mg çıkar mg var ise 100 mg X = mg gerekir. 100 ml suda eritilerek süzüldü. Kullanılıncaya kadar -20ºC de muhafaza edildi. Disklerdeki son konsantrasyon 10 µg olacak Ģekilde bu çözeltiden 10 µl miktarda alınarak sefoksitin, sefoksitin-boronik asit, seftazidim-boronik asit ve sefotaksim-boronik asit ve içeren disklere test yapıldığı zaman damlatıldı. Kullanılan Disklerin Hazırlanması a-beta-laktam antibiyotikle kombine 3-aminofenilboronik asit (APB)ihtiva eden disklerin hazırlanması 3-aminofenilboronik asit monohidrat(sigma-aldrich, Almanya) 120 mg DMSO (dimetilsulfoksit) : 3 ml Distile su: 3 ml Disklerdeki son konsantrasyon 400 µg olacak Ģekilde bu çözeltiden 20 µl alınarak seftazidim, sefotaksim, sefoksitin, sefotaksim-klavulonat, seftazidim-klavulonat içeren disklere emdirildi. Disklerin kuruması için oda ısısında 30 dakika bekletildi ve kullanılıncaya kadar kapalı kaplar içerisinde +4C de saklandı(yagi ve ark., 2005). b-beta-laktam antibiyotikle kombine benzeneboronik asid (fenilboronik asit) ihtiva eden disklerin hazırlanması Benzeneboronik asid (Merck): 120 mg DMSO (dimetilsulfoksit) : 3 ml Distile su: 3 ml ilave edildi.

57 47 Disklerdeki son konsantrasyon 400 µg olacak Ģekilde bu çözeltiden 20 µl alınarak seftazidim, sefotaksim, sefoksitin, sefotaksim-klavulonat, seftazidim-klavulonat içeren disklere emdirildi. Disklerin kuruması için oda ısısında 30 dakika bekletildi ve kullanılıncaya kadar kapalı kaplar içerisinde +4C de saklandı (Coudron, 2005). c-trġs-edta lı AmpC disklerinin hazırlanması 100 mm TRĠS-EDTA lı HCl solusyonu (Sigma-Fluka, Almanya) 3 ml Steril distile su 3ml sonra blank (antibiyotik emdirilmemiģ boģ disk) disklere 20 Ģer µl miktarda damlatılarak emdirildi. Kuruması için 30 dk bekledikten sonra buzdolabında +4ºC de kullanılıncaya bekletildi Bakteri Ġzolatları Mart Kasım 2009 tarihleri arasında Ankara Eğitim ve AraĢtırma Hastanesi ve Yüksek Ġhtisas Hastanesinden toplanan sefoksitin dirençli 96 izolatın 70 i E. coli, 26 sı K. pneumoniae olup bu izolatlar plazmid aracılı AmpC beta-laktamaz ve GSBL varlığı yönünden araģtırıldı. ACC-1 tipi AmpC beta-laktamazın sefoksitine duyarlı oluģu gözönüne alınarak, Ankara Eğitim ve AraĢtırma Hastanesinden toplanan sefoksitine duyarlı, seftazidime ve amoksisilin-klavulonata dirençli 130 E. coli ve K. pneumoniae izolatı daha çalıģmaya dahil edildi. Toplam olarak 220 (sefoksitin dirençli: 96, sefoksitin duyarlı :130) izolat çalıģıldı Bakterilerin Ġdentifikasyonu: ÇalıĢmaya alınan bakterilerin tanımlanmasında klasik yöntemler kullanıldı. AĢağıda tanımlanan bu yöntemlerle identifiye edilemeyen bakterilerin tanımı VĠTEK 2 sistem GN REF (Biomerieux-France ) ile yapıldı.

58 48 Gram boyama: 1-Bakteriler saf kültür halinde elde edildikten sonra lam üzerinde alkolle tespit edilen preparatın üzerine kristal viole eriyiği döküldü. Bir dakika sonra preparat eğilerek boya uzaklaģtırıldı. 2-Üzerine Lugol eriyiği döküldü Bir dakika sonra tutulduktan sonra uzaklaģtırıldı. 3-Preparatın üzerine etil alkol döküldü, alkol boyasız akıncaya kadar renksizleģtirme iģlemine devam edildi, sonra praparat su ile yıkandı. 4- Sulu fuksin ile 15 saniye boyandıktan sonra yıkandı ve immersiyonla incelendi. Gram negatif basil oldukları tespit edildi. Laktoz, glukoz fermentasyonu, H 2 S ve gaz oluģumu: SuĢların bu özellikleri Kligler Iron Agarda araģtırıldı. Bakteri ekilmiģ KIA besiyerini kırmızıdan sarı renge dönüģtüren (asit oluģturan), gaz kabarcıkları oluģturan, H 2 S oluģturmayan izolatlara oksidaz deneyi yapıldı. Oksidaz aktivitesi Ayıraç olarak distile su içindeki % 1 tetrametil p-fenilendiamin HCl eriyiği kullanıldı. Mor renk oluģturanlar pozitif olarak değerlendirildi. Oksidaz aktiviteleri negatif çıkan bakterilere ĠMVĠC (indol, metil red, Voges Proskauer ve sitratı kullanma) deneyi uygulandı. ĠMVĠC testi: a-ġndol testi: Ġndol besiyerindeki kültür süspansiyonun üzerine damlatılan Kovacs ayıracıyla kırmızı renk oluģturanlar E. coli, renk oluģturmayanlar Klebsiella spp. olarak değerlendirildi. b-metil red testi : Clark-Lubs besiyerinde üremiģ olan kültür süspansiyonun üzerine damlatılan metil kırmızısı ayıracı ile kırmızı renk oluģturanlar E. coli, renk oluģturmayanlar Klebsiella spp.olarak değerlendirildi.

59 49 c-voges Proskauer testi: Clark-Lubs besiyerindeki kültür süspansiyonun üzerine 0,6 ml alfa naftol ve 0,2 ml KOH ayıracından damlattıktan sonra kırmızı renk oluģturanlar Klebsiella spp., renk oluģturmayanlar E. coli olarak değerlendirildi. d-simmons sitrat agarda üreme: Bu besiyerini yeģilden prusya mavisine dönüģtüren bakteriler Klebsiella spp., besiyerinde üremeyen yani sitratı karbon kaynağı olarak kullanamayan bakteriler E. coli olarak değerlendirildi. Üre testi:cristensen üre agarın rengini pembeye dönüģtüren izolatlar Klebsiella spp., üreaz enzimi olmayan ve üre agarın rengini değiģtirmeyen izolatlar E. coli olarak değerlendirildi. Böylece EMB besiyerinde morumsu, mukoid koloni oluģturan kapsüllü, hareketsiz bakteriler K. pneumoniae, EMB de madeni parlaklık veren mor-siyah renkte koloni oluģturan, hareketi oldukça yavaģ olan bakteriler E. coli olarak değerlendirildi (Bilgehan, 1992) Duyarlılık Testleri Tanımlanan bakterilerin antibiyotik duyarlılıkları CLSI nin (veya NCCLS 2008) önerileri doğrultusunda Kirby-Bauer disk diffuzyon yöntemi ile Müller Hinton Agarda (MHA) yapıldı. Ġzolatların antibiyotik duyarlılık testi için 0,5 McFarland yoğunluğundaki bakteri suspansiyonu hazırlandıktan sonra 2 adet 130 mm lik MHA plaklarına inokule edildi. Plaklar kurumadan aģağıdaki antibiyotik diskleri yerleģtirildi ve 35º C de bir gece inkubasyondan sonra zon çapları ölçülerek değerlendirildi. Zon çapları Çizelge 2.1. de gösterilmiģ ve belirtilen değerin altında bulunanlar dirençli olarak kabul edildi.

60 50 Çizelge 2.1. CLSI 2008 e göre disk diffuzyon testinin değerlendirilmesi Antibiyotik adı Zon çapı GN (10 µg) gentamisin 12 mm AMC (20/10 µg) amoksisilin/klavulonat.. 13 mm SAM (10/10 µg) ampisilin/sulbaktam mm PTZ (100/10 µg) piperasilin/tazobaktam.. 17 mm TĠM (75/10 µg) tikarsilin/klavulonat 14 mm CES (75/10 µg) sefaperazon/sulbaktam 15 mm FOX (30 µg) sefoksitin 14 mm CAZ (30 µg) seftazidim... <14 mm..<22 mm (GSBL tarama testi) CTX(30 µg) sefotaksim....<14 mm..<27 mm (GSBL tarama testi) CRO (30 µg) seftriakson.<13 mm <25 mm (GSBL tarama testi) FEP (30 µg) sefepim <14 mm SXT (5 µg) trimetoprim/sulfametaksazol 10 mm CĠP (5 µg) siprofloksasin. 15 mm ĠMP (10 µg) imipenem. 13 mm Bu test yapılırken plaklara aynı zamanda GSBL tespiti için sefotaksim- klavulonat (30/10 µg) ve seftazidim-klavulonat (30/10 µg) kombine diskleri yerleģtirilerek zon çapları ölçüldü. Tek baģına seftazidim (30 µg) veya sefotaksim (30 µg) zon çaplarıyla kombine disklerin zon çapları arasında 5 mm fark görülmesi GSBL açısından pozitif olarak değerlendirildi (CLSI. 2008). Bu testte sefoksitin (30 µg) zon çapı <18 mm olan GSBL pozitif ve/veya GSBL negatif izolatlar ilerideki çalıģmalar için ayrıldı. Ayrıca sefoksitin duyarlı ACC-1 tipi AmpC enzim araģtırması için seftazidim (30 µg) ve amoksisilin-klavulonata (20/10 µg) dirençli izolatlar ayrıldı. Ankara Eğitim ve AraĢtırma Hastanesinden toplanan 176 izolat (sefoksitin dirençli 46 izolat ile sefoksitin duyarlı 130 izolat) ile Yüksek Ġhtisas Hastanesinden toplanan 50 adet sefoksitin dirençli izolat % 6 gliserin içeren ependrof tüplerine alınarak ilerideki çalıģmalar için -20ºC de muhafaza edildi BA-CA ile AmpC ve GSBL Tespiti Duyarlılık testi ile birlikte yapılan ilk GSBL testinde GSBL negatif bulunan izolatlara, AmpC ye bağlı yanlıģ GSBL negatifliğini veya GSBL ye bağlı yanlıģ

61 51 AmpC negatifliğini ortadan kaldırmak için Song ve arkadaģları (2007b) ile Coudron un (2005) kullandıkları yöntem uygulandı. Bunun için önce izolatların 0,5 McFarland yoğunluğundaki bakteri suspansiyonu hazırlanıp MHA plaklarına inokule edildi. Plaklar kurumadan besiyerine yukarıda hazırladığımız Ģekilde boronik asit emdirilmiģ 9 ar adet antibiyotik diski yerleģtirildi. Sonra sefoksitin+boronik asit, seftazidim+boronik asit, sefotaksim+boronik asit ve sefoksitin disklerine 10 µl miktarda klavulonik asit damlatılarak 10 µg klavulonat eklenmiģ oldu. MHA da yerleģtirilen disklerin içeriği aģağıda olduğu gibidir. 1-sefoksitin (30 µg) + boronik asit (400 µg) 2-sefoksitin(30 µg) + klavulonat (10 µg) 3-sefoksitin(30 µg) + boronik asid (400 µg) + klavulonat (10 µg) 4-seftazidim (30 µg) + boronik asit (400 µg) 5-seftazidim (30 µg) + klavulonat (10 µg) 6-seftazidim(30 µg) + boronik asit(400 µg) + klavulonat (10 µg) 7-sefotaksim(30 µg) + boronik asit(400 µg) 8-sefotaksim (30 µg) + klavulonat(10 µg) 9-sefotaksim (30 µg) + boronik asit (400 µg) + klavulonat (10 µg) Bu plaklara sefoksitin dirençli GSBL olabileceği göz önünde bulundurularak sefoksitin + boronik asid diski de yerleģtirildi. Bu durumda sefoksitin + boronik asit + klavulonat zonunun sefoksitin+boronik asit zonundan çıkarılarak GSBL varlığı araģtırıldı. Plaklar 35º C de bir gece bekletildikten sonra inhibisyon zon çapları birbirinden çıkarılarak AmpC ve GSBL varlığı yönünden değerlendirildi. ġöyleki, sefalosporin + klavulonik asit + boronik asit diski etrafındaki inhibisyon zon çapının, sefalosporin + klavulonik asit diski etrafındaki inhibisyon zon çapından 5 mm olması durumunda, test edilen izolatta fenotipik olarak plazmid aracılı AmpC beta-laktamaz olduğu kabul edildi. Bu izolatlarda GSBL araģtırmak için sefalosporin + boronik asit + klavulonik asit diski etrafındaki inhibisyon zon çapının, sefalosporin + BA diski etrafındaki

62 52 inhibisyon çapından 5 mm olması durumunda, test edilen izolatta fenotipik olarak plazmid aracılı GSBL olduğu kabul edildi. Duyarlılık testi ile birlikte yapılan ilk GSBL testinde GSBL pozitif bulunan izolatlarda sadece AmpC beta-laktamaz araģtırması yapıldı. Bu izolatlar için MHA agara yerleģtirilen diskler ve içerikleri Ģunlardır: 1-sefoksitin + klavulonat 2-sefoksitin + boronik asid + klavulonat 3-seftazidim + klavulonat 4-seftazidim + boronik asit + klavulonat, 5-sefotaksim + klavulonat 6-sefotaksim + boronik asit + klavulonat APB ile inhibisyon testi negatif bulunan izolatlara benzeneboronik asit ile inhibisyon testi uygulandı AmpC Disk Testi ve Modifiye 3 Boyutlu Test (M3BT) Coudron (2005) tarafından enzim ekstraktı yerine 5 McFarland bulanıklığında hazırlanan yoğun bakteri süspansiyonu agar yüzeyinde açılan yarıklara doldurulurken çalıģmamızda yoğun bakteri süspansiyonu blank (antibiyotik emdirilmemiģ boģ disk) disklere damlatılarak modifiye edildi. Modifiye 3 boyutlu test (M3BT) olarak adlandırdığımız bu yöntem Black ve arkadaģlarının (2005a) uyguladığı AmpC disk testi ile aynı plakta eģzamanlı olarak uygulandı. BA testi pozitif çıkan sefoksitin dirençli izolatlara AmpC disk testi ile M3BT i uygulandı. Bu yöntemde antibiyotiklere duyarlı bir E.coli klinik izolatı, eküvyon ile 9 cm lik MHA yüzeyine yayıldı ve her plağa üçer adet sefoksitin (30 µg) diski yerleģtirildi. Böylece 3 hastaya tek bir plakta iki farklı yöntemle bakılmıģ oldu. Her bir sefoksitin diskinin iki tarafına bitiģik olarak ikiģer adet disk yerleģtirildi. Daha önceden hazırladığımız Tris-EDTA emdirilmiģ disklere 20 Ģer µl SF damlatıldı. Sonra plakta üreyen bakteri kolonilerinden birkaç tane alınarak bu disklerin yüzeyine sürüldü. Diğer blank disk üzerine ise 5 McFarland bulanıklığında hazırlanmıģ yoğun bakteri

63 53 süspansiyonundan 20 µl damlatıldı. Bir gece 35 C de inkübe edildikten sonra disklerin çevresinde halka Ģeklinde görülen üreme veya sefoksitinin inhibisyon zonunu kestiği noktada üremenin artarak inhibisyon zonunda meydana getirdiği bozulma (distorsiyon) AmpC beta-laktamaz açısından pozitif olarak değerlendirildi. Disklerin etrafında üremenin görülmemesi AmpC negatif olarak değerlendirildi Multipleks PCR la AmpC Varlığının AraĢtırılması Plazmid kökenli AmpC varlığının genotipik olarak saptanması için Perez-Perez ve Hanson un (2002) uyguladığı multipleks polimeraz zincir reaksiyonu uygulandı. BA testi pozitif çıkan izolatlarda, CIT, EBC, DHA, FOX, MOX ve ACC primerleri kullanılarak toplam altı AmpC ailesi PCR la araģtırılmiģtır (Çizelge 2.2.). DNA eksraksiyonu: Kanlı agarda üretilmiģ olan izolattan tek koloni alınarak 5 ml triptik soy buyyona inokule edildi. 37ºC de 20 saat inkube edildikten sonra, buradan 1,5 ml alınarak rpm de 10 dk santrifüj edildi. Üst sıvı atılarak 500 µl steril distile su ilave edildi. Hücrelerin parçalanarak DNA nın ortaya çıkarılabilmesi için kaynatma yöntemi kullanıldı. Kaynatma iģlemi 95ºC de 10 dakika gerçekleģtirildikten sonra, hücresel artıkların uzaklaģtırılması için rpm de 10 dakika santrifüj edildi. Santrifüj sonrasında üst sıvı alınarak DNA amplifikasyonu yapılmak üzere -20ºC de saklandı. Amplifikasyon: PCR karıģımı toplam reaksiyon hacmi 50 µl olacak Ģekilde aģağıdaki gibi hazırlandı. PCR amplifikasyonunda kullanılan primer ve ayıraçlar Çizelge 2.2 ve Çizelge 2.3 te listelenmiģtir.

64 54 Çizelge 2.2. Amplifikasyonda Kullanılan Primer Dizileri (Perez-Perez ve Hanson, 2002) Hedefler Primer 5-3 baz dizisi Amplikon büyüklüğü bp MOX-1, MOX-2, MOXMF GCT GCT CAA GGA GCA CAG GAT 520 CMY-1,CMY-8 ile MOXMR CAC ATT GAC ATA GGT GTG GTG C CMY-11 arası LAT-1 ile LAT-4 arası CITMF TGG CCA GAA CTG ACA GGC AAA 462 CMY-2 ile CMY-7 CITMR TTT CTC CTG AAC GTG GCT GGC arası, BIL-1 DHA-1, DHA-2 DHAMF AAC TTT CAC AGG TGT GCT GGG T 405 DHAMR CCG TAC GCA TAC TGG CTT TGC ACC-1 ACCMF AAC AGC CTC AGC AGC CGG TTA 346 ACCMR TTC GCC GCA ATC ATC CCT AGC MIR-1, ACT-1 EBCMF TCG GTA AAG CCG ATG TTG CGG 302 EBCMR CTT CCA CTG CGG CTG CCA GTT FOX-1 FOX-5b FOXMF AAC ATG GGG TAT CAG GGA GAT G 190 arası FOXMR CAA AGC GCG TAA CCG GAT TGG

65 55 Çizelge 2.3. PCR da kullanılan ayıraçlar PCR karıģım içeriği Son hacim Son konsantrasyon 10X PCR tamponu * 10 µl 1 X MgCl2 (25 mm) 4 µl 2 mm dntp** 1 µl 0,2 mm Primer F *** 1 µl 0,5 µm Primer R *** 1 µl 0,5 µm Taq DNA polimeraz (5 U/ µl) 0.25 µl 1,25 U DNA kalıbı 3 µl Distile su 20,75 µl Toplam 50 µl *Promega : 5X PCR buffer (ph 8.5): (Ġçerisinde bulunan sarı boya, % 1 lik agaroz jelde 50 bp den küçük DNA fragmentleri ile, mavi boya ise 3-5 kb DNA fragmentleri ile aynı hızda göç etmektedir.) **dntp: MOXMF, MOXMR, CITMF, CITMR, DHAMF, DHAMR, ACCMF, ACCMR, EBCMF, EBCMR, FOXMF, FOXMR ***Fermentas dntp set : Her bir dntp nin konsantrasyonu (datp, dctp, dgtp ve dttp) 10 mm dir. Herbirinden 10 ar µl alınarak toplam hacim 100 µl olacak Ģekilde 60 µl distile su ile sulandırıldı. PCR programı: Thermocycler da uygulanan 94ºC de 3 dakikalık ilk denatürasyondan sonra 25 döngü olacak Ģekilde aģağıdaki iģlemler gerçekleģtirildi: 94ºC de 30 saniye denatürasyon 64ºC de 30 saniye primerlerin yapıģması 72ºC de 1 dakika ekstensiyon Son siklustan sonra 72 ºC de 7 dakika daha final ektensiyon uygulandı. % 2 agaroz içeren jel 1X TAE (Tris-asetat EDTA) ile hazırlandı. PCR ürünleri 1XTAE tampon içerisinde 90 V ta 2 saat yürütüldü, 10 µg/ml etidyum bromür ile boyandıktan sonra UV transilluminatöründe görüntülendi. Her bir primer için oluģan bandlar kaydedildi.

66 Spot Ġnokulasyon Testi PCR la AmpC pozitif bulunan izolatlara spot inokulasyon yöntemi uygulandı (Shahid ve ark., 2004). Bunun için 9 mm çapındaki MHA plaklarına tüm antibiyotiklere duyarlı bir E.coli klinik izolatı ekildikten sonra, her plağa 3 er adet sefoksitin (30 µg) diski yerleģtirildi. Her bir diskin 4 tarafına 4 farklı hastaya (bir plakta 12 hasta izolatı) ait klinik izolattan bir öze dolusu bakteri kolonisi nokta Ģeklinde ekildikten sonra bir gece 35 C de inkübe edildi. Sefoksitin diskinin 4-5 mm yakınına ekilen bu izolatların sefoksitin zonunu kestiği noktada üremenin artarak inhibisyon zonunda meydana getirdikleri bozulma AmpC beta-laktamaz açısından pozitif olarak değerlendirildi. Ekim yerinde sadece nokta tarzında görülen üreme Ģüpheli olarak değerlendirildi. 2.9.Üç Boyutlu Test (3BT) Coudron ve arkadaģlarının (2000) uyguladıkları yöntemle yapıldı. Buna göre; AmpC beta-laktamaz varlığı araģtırılacak bakterinin, kanlı agardaki 24 saatlik kültüründen triptik soy buyyon içerisinde 0,5 McFarland bulanıklığında süspansiyonu hazırlandı. Bu süspansiyondan 50 µl alınarak 12 ml triptik soy buyyon içerisine inokule edildi ve 35 C de 4 saat inkübe edildi. Ġnkübasyon süresi sonunda hücreler santrifüj iģlemi ile konsantre edilip üstteki sıvı döküldü. BeĢ kez dondurulup çözülerek enzim ekstraktı elde edildi. CLSI nin standart disk difüzyon önerileri doğrultusunda MH buyyonda 0.5 McFarland bulanıklığında hazırlanmıģ olan duyarlı E.coli suģu, eküvyon ile 9 cm lik MHA yüzeyine yayıldı ve 30 µg lık sefoksitin diski bu plağın ortasına yerleģtirildi. Daha sonra steril bir bistüri yardımıyla sefoksitin diskine 5 mm uzaklığından baģlanarak plağın kenarına doğru ıģınsal tarzda oluklar oluģturuldu. Daha önce dondurulup çözülerek hazırlanmıģ olan enzim ekstraktından µl lik miktar, oluktan taģmayacak Ģekilde merkezden kenara doğru damlatılıp 35 C de bir gece inkübe edildi. Testin sonucu değerlendirilirken, oluğun sefoksitin etrafındaki inhibisyon zonunu kestiği noktada üremenin artarak inhibisyon zonunda meydana getirdiği bozulma, üç

67 57 boyutlu test için pozitif olarak kabul edildi ve AmpC beta-laktamaz varlığına iģaret edildi. Bu yöntem uygulamasının güçlüğü nedeniyle sadece AmpC disk testi ile GSBL testi negatif bulunan suģlara uygulandı. Bu yöntemde, GSBL pozitifliği, yanlıģ pozitif sonuca yol açtığı için suģların GSBL negatif olanları özellikle seçildi Disk Antagonizm Testi (DAT) ile Ġndüklenebilir AmpC Beta-Laktamaz Tespiti PCR pozitif bulunan izolatlara ĠBL testi uygulandı. Bunun için MHA plağa araģtırılacak bakterinin 0,5 McFarland bulanıklığında hazırlanan süspansiyonu ekildikten sonra plağın ortasına indükleyici antibiyotik olarak sefoksitin (30 µg) diski yerleģtirildi. Sefoksitin diskine 2 cm uzaklığa seftazidim (30 µg) diski yerleģtirildi. Bir gece 35º C de inkübasyondan sonra seftazidimin sefoksitine bakan yüzünde düzleģme olması ĠBL varlığı açısından pozitif olarak değerlendirildi (Barnaud ve ark., 1998; Arora ve Bal, 2005).

68 58 3. BULGULAR 3.1. Disk Diffuzyon Test Bulguları Sefoksitin Dirençli Ġzolatlarda Disk Diffuzyon Test Bulguları Sefoksitin dirençli 96 izolatın 70 i (% 72,9) E. coli, 26 ı (% 27,1) K. pneumoniae izolatıdır. E. coli izolatlarının 42 i Yüksek Ġhtisas Hastanesinden, 28 i Ankara AraĢtırma ve Eğitim Hastanesinden toplanmıģtır. K. pneumoniae izolatlarının 18 i Ankara AraĢtırma ve Eğitim Hastanesinden, 8 i Yüksek Ġhtisas Hastanesinden toplanmıģtır. Bu izolatların türlere ve geldiği yere göre dağılımları Çizelge 3.1. de özetlenmiģtir. Çizelge 3.1. Sefoksitin dirençli izolatların türlere ve geldiği yere göre dağılımları Bakteri adı ANEAH YĠH Toplam E. coli 28/46 (% 60,8) 42/50 (% 84) 70/96 (% 72,9) K. pneumoniae 18/46 ( % 39,1) 8/50 (% 16) 26/96 (% 27,1) Toplam 46/96 (% 47,9) 50/96 (% 52,1) 96 (% 100) ANEAH:Ankara AraĢtırma ve Eğitim Hastanesi, YĠH:Yüksek Ġhtisas Hastanesi Sefoksitin dirençli suģların 71 i (% 73,9) idrar 10 u (% 10,4) yara, 7 i (% 7,3) mayii, 2 i (% 2,1) trakeal aspirat, 2 i (% 2,1) abse, 3 ü ( 3,1) kan, 1 i (% 1,0) balgam örneklerine aittir. Sefoksitin dirençli suģların izole edildikleri materyallere göre dağılımları Çizelge 3.2. de özetlenmiģtir. Çizelge 3.2. Sefoksitin dirençli izolatların izole edildikleri materyallere göre dağılımları Materyal N % Ġdrar 71 73,9 Yara 10 10,4 Mayii 7 7,3 Trakeal aspirat 2 2,1 Abse 2 2,1 Kan 3 3,1 Balgam 1 1,0 Toplam ,0

69 59 Sefoksitin dirençli 70 E. coli izolatının 42 inde (% 60), 26 K. pneumoniae izolatının 10 unda (% 38,5) GSBL pozitif olarak bulunmuģtur. Toplam olarak sefoksitin dirençli 96 izolatın 52 inde (% 54,1) GSBL pozitif olarak bulunmuģtur. Sefoksitin dirençli izolatların türlere göre GSBL prevalansı Çizelge de gösterilmiģtir Çizelge 3.3. Sefoksitin dirençli izolatların türlere göre GSBL prevalansı Bakteri adı GSBL(+) n % GSBL (-) n % E. coli 42/70 (% 60) 28/70 ( % 40) K. pneumoniae 10/26 (% 38,5) 16/26 (% 61,5) Toplam: 96 52/96 (% 54,1) 44/96 (% 45,8) Disk difüzyon testinde sefoksitin dirençli izolatlar arasında amoksisilin-klavulonata, sefotaksime, seftazidime, siprofloksasiline, sulfametaksazol-trimetoprime, gentamisine, piperasilin-tazobaktama ve imipeneme dirençli suģ sayısı sırasıyla 84 (% 87,5), 68 (% 70,8), 58 (% 60,4), 47 (% 48,9), 41 (% 42,7), 31 (% 32,3), 23 (% 23,9) ve 1 (% 1,04) olarak görülmüģtür. Sefoksitin dirençli suģların disk difüzyon sonuçları Çizelge 3.4. de özetlenmiģtir. Çizelge 3.4. Sefoksitin dirençli suģların disk difüzyon sonuçları PTZ AMC GN SXT CĠP ĠMĠ CAZ CTX n (%) n (%) N (%) n (%) n (%) n(%) n (%) n (%) Toplam (23,9) (87,5) (32,3) (42,7) (48,9) (1,04) (60,4) (70,8) AMC: Amoksisilin / klavulonik asit, PTZ: Piperasilin / tazobaktam, CAZ: seftazidim, CTX: sefotaksim, SXT: Sulfometaksazol / trimetoprim, CĠP: Siprofloksasilin, GN: Gentamisin, ĠMĠ: Ġmipenem AmpC Pozitif Ġzolatlarda Disk Difüzyon Test Bulguları PCR la AmpC pozitif çıkan 43 izolatın 33 ü (% 76,7) E. coli, 10 u (% 24,3) K. pneumoniae dir. PCR la pampc beta-laktamaz tespit edilen 43 izolatın 27 i idrar, 16 sı idrar dıģı (2 kan, 5 yara, 2 trakeal aspirat, 1 balgam, 4 mayii) örneğidir (Çizelge 3.5).

70 60 Çizelge 3.5. AmpC pozitif suģların izole edildikleri materyallere göre dağılımları Materyal N % Ġdrar 27 62,7 Yara 5 11,7 Mayii 4 9,4 Trakeal aspirat 2 4,6 Abse 2 4,6 Kan 2 4,6 Balgam 1 0,2 Toplam ,0 PCR la AmpC pozitif bulunan 33 E. coli izolatının 20 inde (% 60,6), 10 K. pneumoniae izolatının 5 inde (% 50) olmak üzere toplam 43 AmpC beta-laktamaz üreten izolatın 25 inde (% 58,1) GSBL + AmpC enzimi birlikte saptanmıģtır. AmpC pozitif izolatların türlere göre GSBL prevalansı Çizelge 3.6. da özetlenmiģtir. Çizelge 3.6. AmpC pozitif izolatların türlere göre GSBL prevalansı GSBL (+) GSBL (-) E. coli 20/33 (% 60,6) 13/33 (% 39,4) K. pneumoniae 5/10 (% 50 ) 5/10 (% 50 ) Toplam 25/43 (% 58,1) 18/43 (%41,8)) PCR-AmpC pozitif 43 izolatın antibiyotik direncine bakıldığında 43 ünde (% 100) sefoksitine, 43 ünde (% 100) amoksisilin-klavulonata, 29 unda (% 67,4) seftazidime, 26 ında (% 60,4) sefotaksime, 22 inde (% 51,2) siprofloksasiline, 21 inde (% 48,8) sefepime, 20 inde (% 46,5) sulfametaksazol-trimetoprime, 17 inde (% 39,5) piperasilin-tazobaktama, 12 inde (% 30) gentamisine direnç gözlendi. Hiçbirinde imipenem direnci görülmemiģtir.

71 61 Ankara AraĢtırma ve Eğitim Hastanesinden izole edilen PCR-AmpC pozitif izolatlar arasında en fazla dirençli suģ sayısı 11 ile (% 52,4) seftazidim ve sefotaksime karģı görülürken bunu 9 ile (% 42,9) piperasilin tazobaktam, 8 ile (% 38,1) sefepim, 7 ile (% 33,3) siprofloksasilin, 5 ile (% 23,8) sulfametaksazol-trimetoprim ve 3 ile ( % 14,3 ) gentamisin izlemektedir (Çizelge 3.7). Yüksek Ġhtisas Hastanesinden izole edilen PCR-AmpC pozitif izolatlar arasında en fazla dirençli suģ sayısı 18 ile ( % 81,9) seftazidime karģı görülürken bunu 15 ile (% 68,2) sefotaksim, siprofloksasilin ve piperasilin - tazobaktam, 13 ile (% 59,1) sulfametaksazol-trimetoprim ve sefepim, 10 ile (% 45,5) ile gentamisin izlemektedir.

72 62 Çizelge ANEAH deki izolatlarda antibiyotik direnci Hasta No K.pneumonie 13 K.pneumonie B5 K.pneumonie O3 K.pneumonie 45 K.pneumonie V8 Kpneumoniae 16 K.pneumonie 21 K.pneumonie V3 FOX AMC PTZ CAZ CTX CĠP SXT GN ĠMĠ FEP R R S S R S S S S R R R S R R S S S S S R R S R R R R R S R R R S S S S S S S S R R S S S S S S S S R R R S S S R S S S R R S R S R R S S S R R S S S S S S S S E.coli 23 R R S S S S S S S S E.coli K4 R R S S R S S S S R E.coli T4 R R S S R S S S S S E.coli H8 R R S R R R R S S R E.coli R7* R R S R S S S S S S E.coli O R R R R R R R S S R E.coli 53 R R S R R S S S S R E.coli O5 R R S R R R R R S R E.coli P6 R R S R S R S S S S E.coli O4 R R S R S S S S S S E.coli E3 R R S R R S S S S R E.coli K9 R R S S R R R R S S E.coli P8 R R S S S S S S S S AMC: Amoksisilin / klavulonik asit, PTZ: Piperasilin/tazobaktam, sefepim (FEP), seftazidim (CAZ) FOX: Sefoksitin, SXT: Sulfometaksazol/trimetoprim, CĠP: Siprofloksasilin, GN: Gentamisin, ĠMĠ: Ġmipenem

73 63 Çizelge 3.8.YĠH deki izolatlarda antibiyotik direnci Hasta FOX AMC PTZ CAZ CTX CĠP SXT GN ĠMĠ FEP No K.pneumonie R R R R R S S S S R Ö K. R R R R S R R R S S pneumoniae M E.coli 34 R R S R S R S S S S E.coli D* R R S R S R R S S S E.coli ġ R R R R R S S R S S E.coli f R R R R R R R R S R E.coli 33 R R R R R R R S S R E.coli 36 R R R R R S S R S R E.coli S R R R R R R R R S R E.coli II R R S S S R R S S S E.coli R R R S R R R R S S R E.coli 4 R R S R R R R S S R E.coli S R R R R R S S S S S E.coli 37 R R S R R R R R S R E.coli Ö R R R S S S S S S S E.coli Ü R R R R R R R S S R E.coli P R R R R R R R R S R E.coli O R R R S S S R S S S E.coli R R R R S S R S S S S E.coli 39 R R R R R R R R S R E.coli 35 R R S R R S S R S R E.coli Y R R R R R R S R S R AMC: Amoksisilin / klavulonik asit, PTZ: Piperasilin/tazobaktam, sefepim (FEP), seftazidim (CAZ) FOX: Sefoksitin, SXT: Sulfometaksazol/trimetoprim, CĠP: Siprofloksasilin, GN: Gentamisin, ĠMĠ: Ġmipenem Sefoksitin dirençli 96 izolatın 18 inde sadece AmpC, 25 inde GSBL+AmpC, 27 inde sadece GSBL, 26 ında hiçbiri görülmemiģtir. Sadece PCR-AmpC pozitif çıkan 18 izolat arasında en fazla dirençli suģ sayısı 18 ile (% 100) amoksisilin-klavulonata karģı bulunurken bunu 8 ile (% 44,4)

74 64 siprofloksasilin, 6 ile (% 33,3) piperasilin-tazobaktam, 4 ile (% 22,2) trimetoprimsulfametaksazol, 3 ile (% 16,6)) gentamisin izlemektedir. GSBL+AmpC enzimini bir arada bulunduran 25 izolat arasında en fazla dirençli suģ sayısı 25 ile (% 100) amoksisilin-klavulonata karģı bulunurken bunu 16 ile (% 64) trimetoprim-sulfametaksazol, 14 ile (% 56) siprofloksasilin, 11 ile (% 44) gentamisin, 10 ile (% 40) piperasilin-tazobaktam izlemektedir. Sadece GSBL pozitif çıkan 27 izolat arasında en fazla dirençli suģ sayısı 25 ile (% 92,6) siprofloksasiline karģı bulunurken bunu 23 ile (% 85) amoksisilin-klavulonat 21 ile (% 77,7) trimetoprim-sulfametaksazol, 17 ile (% 63) gentamisin, 7 ile (% 26) piperasilin-tazobaktam izlemektedir (Çizelge 3.9). Çizelge 3.9. GSBL+AmpC, GSBL ve AmpC pozitif izolatlardaki antibiyotik direnci AB adı AmpC AmpC+GSBL GSBL CĠP % 44,4 % 56 % 92,6 SXT % 22,2 % 64 % 77,7 GN % 16,6 % 44 % 63 PTZ % 33,3 % 40 % 26 AMC % 100 % 100 % 85 Toplam AB: Antibiyotik, PTZ: Piperasilin/tazobaktam, SXT: Sulfometaksazol/trimetoprim, CĠP: Siprofloksasilin, GN: Gentamisin, Ġstatistik Beta-laktamaz üreten izolatların yöntemine göre değerlendirildi. beta-laktam dıģı antibiyotik dirençleri Ki kare Sadece AmpC pozitif izolatlardaki siprofloksasilin direnci sadece GSBL pozitif izolatlardakinden daha düģük oranda bulunmuģtur. Siprofloksasilin direnci yönünden bu izolatlar arasında anlamlı fark görüldü (p< 0,01). Sadece AmpC pozitif izolatlardaki siprofloksasilin direnci AmpC+GSBL pozitif izolatlardakinden daha düģük oranda bulunmuģtur. Ancak siprofloksasilin direnci yönünden bu iki grup arasında anlamlı fark görülmedi (p>0.05).

75 65 AmpC+GSBL üreten izolatlardaki siprofloksasilin direnci sadece GSBL pozitif olan izolatlardan daha düģük oranda bulunmuģtur. Bu iki grup arasında siprofloksasilin direnci yönünden anlamlı fark görüldü (p<0,01). Sadece AmpC pozitif izolatlardaki SXT direnci sadece GSBL pozitif izolatlardan daha düģük oranda bulunmuģtur. Bu iki grup arasında SXT direnci yönünden anlamlı fark görüldü (p< 0,001). Sadece AmpC pozitif izolatlardaki SXT direnci AmpC+GSBL pozitif izolatlardan daha düģük oranda bulunmuģtur. Bu iki grup arasında SXT direnci yönünden anlamlı fark görüldü (p< 0,01). AmpC+GSBL pozitif izolatlardaki SXT direnci sadece GSBL pozitif izolatlardan daha düģük oranda bulunmuģtur. Ancak bu iki grup arasında SXT direnci yönünden anlamlı fark görülmedi (p>0.05). Sadece AmpC pozitif izolatlardaki GN direnci AmpC+GSBL pozitif izolatlardan daha düģük oranda bulunmuģtur. Ancak bu iki grup arasında GN direnci yönünden anlamlı fark görülmedi (p> 0,05). Sadece AmpC pozitif izolatlardaki GN direnci sadece GSBL pozitif izolatlardan daha düģük oranda bulunmuģtur. Bu iki grup arasında GN direnci yönünden anlamlı fark görüldü. (p< 0,01). AmpC+GSBL pozitif izolatlardaki GN direnci sadece GSBL pozitif izolatlardan daha düģük oranda bulunmuģtur. Ancak bu iki grup arasında GN direnci yönünden anlamlı fark görülmedi (p> 0,05).

76 BA-CA ile AmpC ve GSBL Test Bulguları APB-CA ile yapılan inhibisyon test ile sefoksitin dirençli 96 izolatın 50 inde (% 52,1) AmpC pozitif olarak bulundu. APB ile negatif bulunan sefoksitin dirençli suģlar benzeneboronik ile tekrarlandıktan sonra 3 (E.coli E3, K. pneumoniae 16 ve E. coli R) izolatta daha AmpC pozitif sonuç alınmıģtır. Böylece toplam olarak 96 izolatın 53 ünde (% 55,2) BA-CA inhibisyon testi ile AmpC pozitif olarak tespit edilmiģtir (ġekil.3.1). BA-CA inhibisyon testi ile AmpC pozitif bulunan 53 (K. pneumoniae: 15, E.coli : 38 ) izolatın 43 ü (% 81,1) PCR la AmpC pozitif olarak bulundu. ACC tipi AmpC enzim yönünden CAZ-BA-CA ve CTX-CA-BA testine alınan 130 izolatın 17 inde (% 13) BA-CA testi (benzeneboronik asit) ile AmpC pozitif olarak bulundu. Hepsi GSBL pozitif olan bu izolatların 3 ü K. pneumoniae, 14 ü E.coli izolatıdır. Ancak, hiçbirinde PCR la ACC-1 tipi AmpC enzim saptanamadı. Sefoksitin direnci görülen 26 K. pneumoniae izolatının 15 inde (% 57,6) BA-CA inhibisyon testi ile AmpC pozitif bulundu. Bu izolatların 10 unda (% 66,6) PCR la AmpC tespit edildi. Sefoksitin direnci görülen 70 E.coli izolatın 38 inde (% 53,5) BA inhibisyon testi ile AmpC pozitif bulundu. Bu izolatların 33 ünde (% 86,8) PCR la AmpC tespit edildi. AmpC+GSBL pozitif 25 izolatın 14 ünde (% 56) FOX-BA-CA ile, 17 inde (% 68) CTX-BA-CA ile, 9 unda (% 36) CAZ-BA-CA ile AmpC pozitif sonuç alındı. AmpC pozitif GSBL negatif 18 izolatın 15 inde (% 83,3) FOX-BA ile AmpC pozitif sonuç alındı (Çizelge 3.10).

77 67 CAZ-CA-BA CTX-CA-BA CAZ-CA CTX-CA FOX-CA ġekil 3.1. Boronik asitle inhibisyon testi GSBL kombine disk testinde GSBL negatif bulunan suģlara, AmpC ye bağlı GSBL negatifliğini ortadan kaldırmak için ġekil 3.2. de görüldüğü gibi CAZ-CA ve CTX- CA disklerine BA ilave edildi. Hem GSBL hem de AmpC pozitif olan izolatlarda CAZ ve CAZ-CA disklerinin inhibisyon zonları arasında 1-2 mm lik fark oluģurken seftazidim ile seftazidim/klavulonat disklerinin üzerine 400 µg/ml BA ihtiva eden diskler yerleģtirildikten sonra 20 µl SF ilave edildiğinde bu diskler arasındaki zon farkı 5 mm den daha büyük olmuģtur.

78 68 ġekil 3.2. AmpC pozitif izolatlarda GSBL tayini Dört klinik izolat; CLSI ın önerdiği GSBL doğrulama yöntemi ile negatif sonuç verdiği halde BA eklendikten sonra GSBL pozitif olarak bulunmuģtur. Bunlardan ikisi ( E. coli R7, E. coli D suģları) CAZ-BA ile CAZ-BA-CA zon farkı >5 mm olduğu için GSBL pozitif olarak değerlendirildi. Diğer ikisi ise (K. pneumoniae B5, K. pneumoniae16) FOX-BA ile FOX-BA-CA arasındaki zon farkı >5 mm nin üzerinde çıktığı için GSBL pozitif olarak değerlendirildi.

79 69 Çizelge BA inhibisyon testinde kullanılan sefalosporinlerin karģılaģtırılması ve PCR sonuçları Hasta no BA PCR Hasta no BA testi PCR inhibisyon testi K. pneumoniae CAZ-BA-CA, negatif E.coli O4 FOX-BA-CA + U1 FOX-BA-CA CAZ-BA-CA E.coli 23 FOX-BA-CA + E.coli D* CAZ-BA-CA, + FOX-BA-CA K.pneumoniae FOX-BA-CA + K. pneumoniae CAZ-BA-CA - V8 17 FOX-BA-CA E.coli K4 CTX-BA-CA + E.coli f CTX-BA-CA + E.coli 34 CAZ-BA-CA, + E.coli K9 CAZ-BA-CA, + FOX-BA-CA FOX-BA-CA E.coli ġ FOX-BA-CA + K.pneumoniae CAZ-BA-CA + M K. pneumoniae FOX-BA-CA + E.coli 33 CTX-BA-CA + V3 E.coli T4 CTX-BA-CA, + K. pneumoniae CAZ-BA-CA Negatif FOX-BA-CA 20 E.coli M7 CTX-BA-CA, negatif E.coli K FOX-BA-CA Negatif FOX-BA-CA E.coli H8 CTX-BA-CA + K.pneumoniae CTX-BA-CA + O3 FOX-BA-CA E.coli II CAZ-BA-CA, + E.coli P8 FOX-BA-CA + CTX-BA-CA E.coli R CTX-BA-CA + K. pneumoniae FOX-BA-CA, + 21 CAZ-BA-CA K.pneumoniae FOX-BA-CA negatif K. pneumoniae ** FOX-BA-CA E.coli R7* CAZ-BA-CA + K. pneumoniae FOX-BA-CA + 13 E.coli h CTX-BA-CA, negatif E.coli 37 CTX-BA-CA, + CAZ-BA-CA, FOX-BA-CA E.coli O CTX-BA-CA + E.coli Ö CTX-BA-CA, + FOX-BA-CA CAZ-BA-CA FOX-BA-CA E.coli 36 CTX-BA-CA + E.coli 53 CTX-BA-CA + E.coli S FOX-BA-CA CTX-BA-CA, CAZ-BA-CA, + K. pneumoniae Ö FOX-BA-CA CTX-BA-CA, FOX-BA-CA E.coli 4 CAZ-BA-CA + K. pneumoniae + B5* FOX-BA-CA E.coli O FOX-BA-CA + E.coli E3 CTX-BA-CA, + FOX-BA-CA E.coli S CAZ-BA-CA + E.coli R FOX-BA-CA + E.coli P E.coli Ü K. pneumoniae 45 E.coli O5 CAZ-BA,CA, CTX-BA-CA + K. pneumoniae 11 FOX-BA-CA Negatif CTX-BA-CA, + E.coli 39 CAZ-BA-CA, + CAZ-BA-CA, CTX-BA-CA, FOX-BA-CA FOX-BA-CA FOX-BA-CA + E.coli 1 CTX-BA-CA Negatif CAZ-BA-CA, FOX-BA-CA + E.coli 35 CAZ-BA-CA, CTX-BA-CA E.coli P6 FOX-BA-CA, + K.pneumoniae FOX-BA-CA CAZ-BA-CA, 14 CTX-BA-CA Toplam:53 E.coli Y CAZ-BA-CA, CTX-BA-CA, FOX-BA-CA + + Negatif * R7, D, B5 ve 16 nolu suģlar CTX/CTX-CA ile CAZ/ CAZ-CA ile GSBL (-) çıktığı halde BA eklenmesi ile zon farkı >5mm den fazla olduğu için GSBL (+) olarak değerlendirildi. +

80 AmpC Disk Testi ile Modifiye Üç Boyutlu Test Bulguları AmpC disk testi; BA-CA testi AmpC pozitif bulunan 50 izolatın 33 ünde (% 66) pozitif bulundu ve 15 izolatın sefoksitinin inhibisyon zonunda distorsiyon veya disk çevresinde halka Ģeklinde üreme görülmediği için negatif olarak değerlendirildi. (ġekil 3.3 ve ġekil 3.4). M3BT ile BA-CA testi AmpC pozitif bulunan 50 izolatın 34 ünde (% 68) pozitif sonuç alındı. Sadece bir izolatta (K. pneumoniae 16) AmpC disk testi negatif bulunduğu halde M3BT ile pozitif sonuç elde edildi. Hem AmpC disk testi hem de BA-CA testi AmpC pozitif olan 33 izolatın 27 inde (% 81,8) PCR la AmpC pozitif bulundu. Hem M3BT hem de BA-CA testi ile AmpC pozitif olan 34 izolatın 28 inde (% 82,3) PCR la AmpC pozitif bulundu. M3BT ve AmpC disk testi negatif izolatlar M3BT ve AmpC disk testi pozitif distorsiyon ġekil 3.3. AmpC disk testi ve modifiye üç boyutlu test

81 71 M3BT ve AmpC disk testi pozitif izolat(halka Ģekli) M3BT ve AmpC disk testi negatif izolat ġekil 3.4. AmpC disk testi ve modifiye üç boyutlu test (halka Ģekli) BA-Ca testi AmpC pozitif olan, 3 ü E. coli, 1 i K.pneumoniae olmak üzere toplam 4 izolatta AmpC disk testi, M3BT ve PCR-AmpC negatif bulundu. BA-CA testi ve Tris-EDTA lı AmpC disk testi AmpC pozitif bulunan 1 i E. coli, 5 i K.pneumoniae olmak üzere toplam 6 izolatta PCR-AmpC negatif bulundu. BA inhibisyon testi pozitif olan, 3 ü K. pneumoniae 10 u E. coli olmak üzere 13 izolatta AmpC disk testi ve M3BT negatif olduğu halde PCR-AmpC pozitif bulundu. PCR-AmpC pozitif 40 izolatın 27 i (% 67,5) AmpC disk testi ile 28 i (% 70) M3BT pozitif sonuç verdi. PCR ve BA testi referans test olarak değerlendirildiğinde Tris- EDTA lı AmpC disk testinin sensitivitesi % 67,5, spesifitesi % 60 iken M3BT nin sensitivitesi % 70, spesifitesi % 60 olarak bulundu. BA testi pozitif izolatlarda yapılan AmpC disk testi, M3BT sonuçları Çizelge 3.11, Çizelge 3.12., Çizelge de özetlenmiģtir.

82 72 Çizelge Sefoksitin dirençli BA testi pozitif izolatlarda Tris-EDTA lı AmpC disk ve M3BT sonuçları Hastanın geldiği yer YĠH TRĠS- EDTA AmpC M3BT Hastanın geldiği yer ANEAH TRĠS- EDTA AmpC E.coli E.coli E.coli ġ + + E.coli O4 - - E.coli II - - E.coli K9 + + E.coli R + + E.coli P8 + + E.coli E.coli E.coli S - - E.coli E3 E.coli E.coli O5 + + E.coli O - - E.coli P6 + + E.coli S + + E.coli R7 + + M3BT E.coli P - - E.coli O - - E.coli Ü + + E.coli T4 + + E.coli E.coli H8 + + E.coli Y + + E.coli K4 + + E.coli K.pneumoniae V8 E.coli D - - K.pneumoniae V3 E.coli f - - K.pneumoniae 45 E.coli R K.pneumoniae O3 E.coli K.pneumoniae 21 E.coli K.pneumoniae 16 E.coli Ö + + K.pneumoniae 13 K. pneumoniae - - K.pneumoniae Ö B5 K.pneumoniae - - M Toplam:

83 73 Çizelge BA testi pozitif, PCR-AmpC negatif izolatlarda Tris-EDTA lı AmpC disk test sonuçları BA testi pozitif AmpC disk test PCR negatif GSBL 3MBT izolatlar K. pneumoniae U1 K. pneumoniae K. pneumoniae K. pneumoniae K. pneumoniae K. pneumoniae E.coli M E.coli h E.coli E.coli K Çizelge BA testi ve PCR-AmpC pozitif izolatlarda Tris-EDTA lı AmpC disk testi ve M3BT sonuçları BAtesti pozitif AmpCdisk testi PCR-AmpC GSBL 3MBT suģlar negatif suģlar pozitif suģlar E.coli E.coli II E.coli O E.coli S E.coli O E.coli P E.coli O E.coli D E.coli f E.coli K. pneumoniae M K. pneumoniae Ö K. pneumoniae

84 Moleküler Test Bulguları Ankara AraĢtırma ve Eğitim Hastanesinden toplanan sefoksitin dirençli 46 izolatın 28 i (% 60,8) E.coli, 18 i (% 39,1) K. pneumoniae dir. PCR-AmpC beta-laktamaz pozitif 21 izolatın 13 ü (% 61,9) E.coli, 8 i (% 38,1) K. pneumoniae dir. Yüksek Ġhtisas Hastanesinden 3 ay boyunca toplanan sefoksitin dirençli 50 izolatın 42 i (% 84) E. coli, 8 i (% 16) K. pneumoniae dir. PCR-AmpC beta-laktamaz pozitif 22 izolatın 20 i (% 90,1) E. coli, 2 i (% 9,1) K. pneumoniae dir. Toplam olarak Yüksek Ġhtisas Hastanesi ve Ankara AraĢtırma ve Eğitim Hastanesinden toplanan sefoksitin dirençli 96 klinik izolatın 26 ı (% 27,1) K. pneumoniae, 70 i (% 72,9) E. coli dir. AmpC pozitif izolatların türlere ve geldiği yere göre dağılımları Çizelge de özetlenmiģtir. Çizelge AmpC pozitif izolatların türlere ve geldiği yere göre dağılımları ANEAH AmpC (+) YĠ AmpC (+) Toplam AmpC (+) E. coli 13/21(% 61,9) 20/22 (% 90,1) 33/43(% 76,7) K. pneumoniae 8/21(% 38,1) 2/22 (% 9,1) 10/43 (% 25,3) Toplam 21/46 (% 45,6) 22/50 (% 44) 43/96 (% 44,7) Sefoksitin dirençli 70 E. coli izolatının 33 ünde (% 47,1) ve sefoksitin dirençli 26 K. pneumoniae izolatının 10 unda (% 38,4) olmak üzere toplam olarak 96 izolatın 43 ünde (% 44,7 ) PCR la AmpC pozitifliği saptandı. Sefoksitin dirençli 96 izolatın 27 inde (% 28,1) sadece GSBL, 18 inde (% 18,8) sadece AmpC, 25 inde (% 26 ) AmpC+ GSBL, 26 ında (% 27,1) hiçbiri görülmedi.

85 75 BA inhibisyon testi ile AmpC pozitif çıkan 53 izolatın 25 inde (% 47,1) GSBL+AmpC pozitifliği, 5 inde ( % 9,4) sadece GSBL pozitifliği, 18 inde (% 33,9) sadece AmpC pozitifliği, 5 inde ( % 11,3) ise hiçbiri görülmedi. Sefoksitin dirençli izolatların türlere ve geldiği yere göre AmpC dağılımları Çizelge 3.15 de, BA inhibisyon testi pozitif olan sefoksitin dirençli izolatlarda AmpC prevalansı Çizelge da, özetlenmiģtir. Çizelge Sefoksitin dirençli izolatların türlere ve geldiği yere göre AmpC dağılımları Geldiği yer E. coli FOX:R E. coli AmpC(+) K.pneumoniae FOX:R K.pneumoniae AmpC(+) ANEAH 28/70 (% 40) 13/28 (% 46,4) 18/26 (% 69,2) 8/18 (% 44,4) YĠ 42/70 (% 60) 20/42 (% 47,6) 8/26 (% 30,7) 2/8 (% 25) Toplam: 96 70/96 (% 72,9) 33/70 (% 47,1) 26/96 (% 27,1) 10/26 (% 38,4) Çizelge BA inhibisyon testi pozitif olan sefoksitin dirençli izolatlarda AmpC prevalansı Geldiği yer E. coli BA(+)/FOX:R E. coli PCR(+)/BA(+) K. pneumoniae BA(+)/FOX:R K. pneumoniae PCR(+)/BA(+) ANEAH+YĠH 38/70 (% 53,5) 33/38 (% 86,8) 15/26 (% 57,6) 10/15 (% 66,6)

86 76 ġekil 3.5. EBC primeri ile PCR sonuçları: Soldan sağa K4(-), 13(+), Negatif kontrol, V8(+), 45(+), 21(-), 53 (-), V3(+), 23(-), S(-), Ö(-), ġ (-), O(-), 37(-), P (-), 34(-), Ö (+), 16(+) CIT primeri ile PCR sonuçları: Soldan sağa 53 (+),O (++), B5(+) ve Ö (+). ġekil 3.6. Soldan itibaren altıncı kuyuda MOX primeri ile yapılan PCR da 4 no lu suģta ampc beta-laktamaza ait band saptandı. ġekil 3.7. CIT primeri ile PCR sonuçları: Soldan itibaren f(+), O4 (+++++), D(+), 14 (-), 37 (+), O (+), 1 (-), e (-), 4 (++), P6 (+), S (+), P (+++), h (-), 39 (+++), T4(+), Ü (+++), M7 (-), V3 (-), 36 (+), S (+), H8 (+), R7 (++).

87 77 ġekil 3.9. CIT- PCR sonuçları:soldan itibaren K (-), M ((+), 16 (-), 21 (+), 17 (-). ġekil 3.9. CIT primeri ile PCR sonuçları: Soldan itibaren K4 (+), ġ (+), 34 (+), R ((++), 10 (-), V8 (- ), U1 (-), 23 (+), O5 (++), II (++), 45 (-), Ö (+), 33 (++), 13 (-), Negatif kontrol, P8 (+), O3 (+), 35 (++), Y (+++), 20 (-),11 (-), K9 (+). ġekil EBC-PCR sonucu: Soldan altıncı kuyucukta pozitif kontrol suģ, sağdan ikinci kuyucukta K. pneumoniae 45 nolu pozitif suģ

88 78 Çizelge Sefoksitin dirençli, BA pozitif izolatlarda PCR sonuçları Hastanın geldiği yer YĠH PCR CIT PCR MOX PCR EBC Hastanın geldiği yer ANEAH E.coli 34 + E.coli PCR CIT PCR EBC E.coli ġ + E.coli O E.coli II ++* E.coli K9 + E.coli R ++ E.coli P8 + E.coli 36 + E.coli 53 + E.coli S + E.coli E3 + E.coli E.coli O5 ++ E.coli O + E.coli P6 + (kalın) E.coli S + E.coli R7 ++ (kalın) E.coli P +++ E.coli O ++ E.coli Ü +++** (kalın) E.coli T4 +++ (kalın) E.coli E.coli H8 + (kalın) E.coli Y +++ E.coli K4 + E.coli K.pneumoniae V8 E.coli D + K.pneumoniae V3 E.coli f + K.pneumoniae 45 E.coli R ++ K.pneumoniae O3 E.coli K.pneumoniae 21 E.coli 37 + K.pneumoniae 16 E.coli Ö + K.pneumoniae 13 K. pneumoniae + + K.pneumoniae Ö B5 K.pneumoniae + M Toplam:43 * Jeldeki band sayısı ** kalın band ve homolog band sayısı Yüksek Ġhtisas Hastanesinde saptanan 22 AmpC pozitif izolatın 20 inde (% 91); CIT grubu AmpC, 1 inde (% 4,5); CIT+MOX grubu AmpC, 1 inde (% 4,5); CIT+EBC grubu AmpC görüldü. Ankara AraĢtırma ve Eğitim Hastanesinde saptanan 21 AmpC pozitif izolatın 16 ında (% 76,2); CIT grubu AmpC, 5 inde (% 23,8); EBC grubu AmpC tespit edildi. Toplam olarak bakıldığında, Yüksek Ġhtisas Hastanesi ve Ankara AraĢtırma

89 79 ve Eğitim Hastanesinde tespit edilen PCR-AmpC pozitif 43 izolatın 36 inda (% 83,7) CIT grubu, 5 inde(% 11,6) EBC grubu, 1 inde (% 2,35) CIT+EBC, 1 inde (% 2,35) CIT+MOX grubu tespit edildi (Çizelge.3.17), (ġekil 3.5 den ġekil 3.10 a kadar) Spot Ġnokulasyon Test Bulguları Spot inokulasyon deneyinde sadece bir izolatta (E. coli H8) sefoksitin diskinin 4-5 mm yakınına öze ile nokta ekim yapıldığı zaman sefoksitinin inhibisyon zonunda bozulma görüldüğü halde diğer PCR-AmpC pozitif suģlarda sadece ekim alanında üreme tespit edilmiģ olup inhibisyon zonunda bozulma saptanmadı. Bu izolatın CIT grubu AmpC tipi beta-laktamazla birlikte GSBL ürettiği ve jel elektroforezde kalın band oluģturan PCR-AmpC pozitif 5 izolattan biri olduğu gözlendi. (ġekil. 3.11), (Çizelge 3.18). ġekil Spot inokulasyon testi

90 80 Çizelge PCR-AmpC pozitif çıkan izolatlarda spot test sonuçları Geldiği yer YĠH PCRA mpc Spot test Geldiği yer ANEAH PCR AmpC Spot test E.coli 34 + ġüpheli E.coli 23 + ġüpheli E.coli ġ + ġüpheli E.coli O4 + ġüpheli E.coli II + ġüpheli E.coli K9 + ġüpheli E.coli R + ġüpheli E.coli P8 + ġüpheli E.coli 36 + ġüpheli E.coli 53 + ġüpheli E.coli S + ġüpheli E.coli E3 + ġüpheli E.coli 4 + ġüpheli E.coli O5 + ġüpheli E.coli O + ġüpheli E.coli P6 + Kalın E.coli S + ġüpheli E.coli R7 + Kalın ġüpheli ġüpheli E.coli P + ġüpheli E.coli O + ġüpheli E.coli Ü + Kalın ġüpheli E.coli T4 + Kalın E.coli 35 + ġüpheli E.coli H8 + Kalın ġüpheli Pozitif E.coli Y + ġüpheli E.coli K4 + ġüpheli E.coli 39 + ġüpheli K.pneumoniae V8 E.coli D + ġüpheli K.pneumoniae V3 E.coli f + ġüpheli K. pneumoniae 45 E.coli R + ġüpheli K.pneumoniae O3 E.coli 33 + ġüpheli K.pneumoniae 21 E.coli 37 + ġüpheli K.pneumoniae 16 E.coli Ö + ġüpheli K. pneumoniae 13 K.pneumonie + ġüpheli K. pneumoniae Ö B5 K.pneumonie + ġüpheli M Toplam:43 + ġüpheli + ġüpheli + ġüpheli + ġüpheli + ġüpheli + ġüpheli + ġüpheli + ġüpheli 3.6. Ġndüklenebilir Beta-Laktamaz Bulguları PCR-AmpC pozitif 43 izolattan sadece 1 (Klebsiella pneumoniae 45) izolatta seftazidim ile ĠBL varlığı fenotipik olarak tespit edildi (ġekil.1). Dört izolatta ise FOX-BA ya göre FOX-CA inibisyon zonunda daralma görüldüğü için ĠBL pozitif

91 81 olarak değerlendirildi. Toplam olarak 5 izolatta ĠBL pozitifliği görüldüğü halde dördünde CIT grubu AmpC enzimi saptanırken 1 inde EBC grubu AmpC enzimi saptandı (ġekil 3.12). seftazidim sefoksitin ġekil 3.12 ĠBL pozitif test 3.7.Üç Boyutlu Test Bulguları CLSI nin önerdiği GSBL doğrulama testine göre GSBL negatif çıkan 4 izolata (R7, 04, II, M ) uygulandı. Bu izolatlardan birinde BA+CA ile GSBL pozitif bulunmuģtur. ġekil 3.5. te görüldüğü gibi 3BT ile PCR la AmpC pozitif izolatların ikisi (E. coli R7 ve Klebsiella pneumoniae M) pozitif çıkarken diğer ikisi negatif olarak bulunmuģtur. PCR-AmpC pozitif izolatlardan biri plakta açılan yarıkların içine doldurulurken diğer pozitif suģ blank disk üzerine enzim eksraktı damlatılarak sonuçlar karģılaģtırıldı. Ancak yarık içine doldurulan yöntemin daha iyi sonuç verdiği fakat uygulamanın diğer yönteme göre daha zor olduğu görülmüģtür (ġekil 3.13).

92 82 negatif pozitif negatif pozitif ġekil 3.13.Üç boyutlu test Ankara AraĢtırma ve Eğitim Hastanesi ve Yüksek Ġhtisas Hastanesi PCR-AmpC pozitif izolatların Tris-EDTA lı AmpC disk, M3BT, spot inokulasyon, BA-CA testi, 3BT, DAT ve GSBL sonuçları Çizelge ve Çizelge.20 de özetlenmiģtir.