GİRİŞ. Materyal ve Metod GİRİŞ. Orta Batı Anadolu da Subklinik Mastitisli İnek Sütlerinden İzole Edilmiş Staphylococcus aureus ların Genotiplendirmesi

Transkript

1 Orta atı Anadolu da Subklinik Mastitisli İnek Sütlerinden İzole Edilmiş Staphylococcus aureus ların Genotiplendirmesi Gülgün KANER, eytullah KENAR *, Kıymet GÜVEN Ege Üniversitesi, Fen ilimleri Enstitüsü, 00 İzmir, TÜRKİYE Afyon Kocatepe Üniversitesi, Veteriner Fakültesi, Microbiyoloji Anabilim Dalı, 000 Afyon, TÜRKİYE Anadolu Üniversitesi, Fen Fakültesi, iyoloji ölümü, 0 Eskişehir, TÜRKİYE Mastitis, bakteri, maya ve mantar enfeksiyonları sonucu ortaya çıkabilir ve dünya nın her yerinde süt ineklerinde görülür(,,, ). akteriler, meme içi enfeksiyonların en yaygın sebebi olup, bulunulan yerin konumu ve yönetim şekli ile ilgili olarak çeşitlilik gösterebilir. Staphylococcus aureus süt ineklerinde klinik ve subklinik mastitise neden olan major bir patojenidir (,, 0), ve prevalansı farklı ülkelerde % %0 oranındadır. S. aureus suşları akut, genellikle klinik ve kronik, sıklıkla subklinik mastitise neden olabilir. Mastitisin bu tipi genellikle kroniktir ve tüm sığır olgularının % 0'una kadar varmaktadır Süt üretiminde süt miktarında ve kalitede azalma, Maliyetli antibiyotik tedavilerinin uzaması ve erken sütten çıkma gibi önemli ekonomik problemler oluşturmaktadır Subklinik mastitise bağlı olarak süt üretimindeki azalma toplam kayıpların %00'ini oluşturabilir. [], []. [0] Orta atı Anadolu'daki çiftliklerde subklinik mastitisle ilişkili S. aureus suşlarının karakterizasyonu hakkında farklı yöntemlerin karşılaştırılmasına yönelik herhangi bir çalışma bulunmamaktadır. u çalışmanın amacı Orta atı Anadolu'da subklinik mastitisli inek sütlerinden izole edilen S. aureus suşlarının stafilokok enterotoksinlerini tespit etmek ve PFGE ve otomatik ribotiplendirme yöntemlerini kullanarak genetik profillerini belirlemektir. ildiğimize göre, Türkiye de subklinik mastitise neden olan S. aureus ların riboprofillerini ortaya çıkaran ilk çalışmadır. Farklı bölgelerdeki subklinik mastitlerinden izole edilen S. aureus ların fenotipik ve genotipik karakterizasyonu üzerine birçok çalışma yapılmış ve unlar koagülaz gen polimorfizmleripcr [], klasik enterotoksijenik özelliklerin belirlenmesi [], süperantijenik toksin genlerinin tespiti, antibiyotik direnç profillerinin karşılaştırılması çalışılmıştır. Ünal ve İstanbulluoğlu [] Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) kullanarak az sayıda S. areus'un klonal ilişkisini ortaya koymuşlar ve Kırıkkale'de süt çiftliklerinde bakteri klonları yaygın olarak saptanmıştır. [0]) Orta atı Anadolu'da farklı çiftlikteki laktasyondaki ineklere (CMT) uygulandı. Subklinik mastitis pozitif olan süt örneği, 000 yıllarında mikrobiyal değerlendirme için toplandı. S. aureus suşları Gram boyama, katalaz, tüp koagülaz, oksidaz, DNaz aktiviteleri, aird Parker Agar da üreme ve mannitolün fermantasyonu [] ve API Staph testi (iomerieux, Fransa) dahil olmak üzere standart biyokimyasal yöntemler kullanılarak tür düzeyinde tanımlandı.

2 TALE I. Characterisation of S. aureus isolates S. aureus olarak tanımlanan izolatlar enterotoksin üretimi ve genotiplendirme için otomatik ribotiplendirme ve PFGE ile değerlendirildi (Tablo ). Staphylococcal Enterotoksinlerin Değerlendirilmesi Suşlar, 0 ml tripton soya besiyeri (CM09, Oxoid) içinde saat boyunca aerobik ortamda C'de bekletildi. Santrifüjden sonra süpernatan, üretici firmanın önerdiği gibi Staphylococcal Enterotoxin Testi Reversed Passive Latex Agglutination () (TD900, Oxoid) tarafından SE'lerin varlığı ve test edildi Ribotiplendirme E E E E E E E E E E E E E E E E E C C G G G G G G G G G G G G G G G9 G C C C C C C C A A A A A A A A A A A A A A A A A A A C G G G G G G A D D D D D D D D D D D D D D D D S S S S S S S S S. aureus olarak tanımlanan suşlar daha sonra bir robotize cihazda Eco RI kullanılarak (Riboprinter Mikrobiyal Characterization System, Qualicon, DuPont, Wilmington, DE) ve otomatik ribotiplendirme ve Riboprinter Sistem Data Analizi ) Tanımlandı. Her numunenin işlenmesi için kullanılan prosedür üretici firma tarafından ayrıntılı olarak açıklanmıştır. Her suşun tanımlanması, Riboprinter 'in DuPont Tanımlama kitapçığından bir numune % 0. benzerlik ile eşleştiğinde elde edilmiştir. ir benzerlik dendrogramı, SPSS versiyon.0 kullanılarak pattern benzerliklerine dayalı olarak oluşturulmuştur. TALE II. Spread of pulsotypes in the farms Jeller, etidyum bromid ile boyandı, morötesi trans aydınlatıcı kullanılarak görselleştirildi ve fotoğraflandı. S. aureus suşları, fotografik görsel denetim ve bilgisayar analizi (SPSS versiyonu.0, SPSS Inc., Chicago, IL) kombinasyonu kullanılarak üretilen bantlama kalıpları karşılaştırılarak özdeş veya ilgili suş gruplarına yerleştirildi. benzerlik dendogramı oluşturuldu. PULSED FIELD GEL ELECTROPHORESIS (PFGE) ANALYSES Subklinik mastitisli ineklerden toplanan S. aureus izolatlarının genetik ilişkileri, Sma I işleminden sonra PFGE'den elde edilen DNA makrorestriction modelleriyle karşılaştırıldı. Suşların PFGE tiplendirilmesi, Vanderlinde [9] ve Hennekinne ve ark. [] göre yapıldı. Elektroforez, Şef Mapper e (iorad Laboratories, Hercules, CA) göre gerçekleştirildi. Farklı çiftlikten 'inde toplanan izolat hem klasik biyokimyasal testler hem de ribotiplendirme ile S. aureus olarak tanımlandı (Tablo I). STAPHYLOCOCCAL ENTEROTOKSİNLERİN TESPİTİ testi kullanılarak, S. aureus'un izolattan 'ü (% 9.) enterotoksin aktivitesi göstermedi; mastitis pozitif süt örneklerinden izole edilen sadece izolat (%.9) pozitif olarak kaydedildi. Üç izolat (0, ve ) SE sentezledi, ancak sadece bir izolat () SEC sentezledi (Tablo ). Enterotoksin profilleri ve izolatların pulsotipleri arasında korelasyon yoktu (Tablo I).

3 Ribotiplendirme u çalışma, hem klasik tanımlamanın doğrulanması hem de ribotiplendirme için S. aureus izolatına otomatik riboprinting uygulanmıştır. Toplam DNA'nın EcoRI ile sınırlandırılması, 0 kb boyutunda yaklaşık fragman elde etti. Suşlar arasında toplam sekiz bantlama örneği elde edildi (Şekil ). En yaygın ribotip, 0 izolat ile temsil edilen Ribotip 'tir (Tablo I). Ribotiplendirme enzerliğe dayanan bir dendogram elde edilmiştir. s ve % 9 benzerlik gösterdi, ancak tüm ribogruplar % 9 benzerlik gösteren bir grupta toplandı (Şekil ). Türkiye'de subklinik mastitis pozitif süt örneklerinden toplanan S. aureus izolatlarının değerlendirilmesi için otomatik ribotiplendirme ilk kez uygulanmıştır. Tüm çiftlikler, E, ve A çiftlikleri hariç, S. aureus'un farklı ribogrupları içeriyordu. Çiftlikler E, ve A'de yalnızca bir S. aureus ribogrubu bulunurken D ve D çiftlikleri aynı lezyonlu gruba sahiptir (Tablo I). farklı çiftlikten toplanan izolat PFGE ve E,,, A ve D çiftlikleri, sadece veya 'dan oluşan bir pulsotip içeriyordu; mastitisin kaynağının aynı S. aureus suşu olduğunu belirtmektedir. ununla birlikte, S. aureus'un mastitise neden olan farklı suşlarının göstergesi olarak diğer çiftlikler farklı pulsotiplerle temsil edilmektedir (Tablo II). Tüm örnekleri içeren bir dendogram, benzerlik seviyeleri temel alınarak oluşturulmuştur. ve pulsotipleri arasında yüksek düzeyde bir benzerlik gözlemlendi. İkinci derecede yüksek benzerlik derecesi, pulsotipler ve arasında gözlenmiştir (Şekil ). ŞEKİL. Çeşitli subklinik mastitis süt örneklerinden izole edilen S. aureus'un ribobitleri (ribogrup numaraları otomatik ribotiplendirme sistemi ile verilmiştir). PFGE ANALİZLERİ Test edilen izolatların tümü Pulsed Field Jel Elektroforez (PFGE) ile değerlendirildi. Genetik analizler, kb ila. kb aralığında ila farklı band arasında değişen 9 farklı PT'yi gösterdi (Şekil ). Pulsotip, izolat (% 9,), pulsotip, izolat (% ), pulsotip G izolat (%,), pulsotip G izolat (%,), pulsotip G, izolatlar (%,9). Diğer pulsotipler sadece bir izolat ile temsil edildi. TALO II. Çiftliklerde pulotiplerin dağılımları

4 ŞEKİL. Sma I PFGE analizi ile kurulan S. aureus suşlarının 9 pulsotip kalıbı temelinde oluşturulmuş dendogram. Pulsotip sayıları Tablo 'de verilmiştir. Subklinik mastitis artmış somatik hücre sayılarına (SCC) neden olur, ancak süt veya memede belirli bir değişiklik olmaz. u çalışmada, 'den yalnızca izolat, subklinik mastitin sebebi olarak S. aureus olarak tanımlandı ve diğer bakterilerin sorumlu olduğunu göstermektedir []. S. aureus sağım esnasında meme başından doğrudan süt kanalları ile loblara ulaşabilir [] ve sütte çoğalır ve gıda olarak tüketilmesi halinde gıda zehirlenmesine neden olan enterotoksin üretir []. Stafilokok enterotoksinleri (SE) ısıya dirençlidir ve kaynatılarak yok edilemezler. u organizma pastörizasyonla ölmesine rağmen, toksinin biyolojik etkisi kalır ve gıda zehirlenmesine neden olabilir []. Sığır subklinik mastitisinden klasik enterotoksin oluşturan S. aureus suşlarının nispeten yüksek bir yüzdesi, birçok yayında kaydedilmiştir [,, ]. oynukara ve ark. [], subklinik mastitisli ineklerden izole edilen Staphylococcus aureus suşlarının klasik enterotoksijenik özelliklerini 0 S. aureus suşuyla ilk kez araştırmışlardır. Ayrıca bu çalışma, Türkiye'de süt çiftliklerinde subklinik mastitis prevalansında S. aureus virulans faktörünün rolünü değerlendirmek için ribotiplendirme tekniğinin ilk uygulamasını göstermektedir. Sonuç olarak, SE üreten suşlar, Orta atı Anadolu'da subklinik mastitisli ineklerden toplanan süt örneklerinde toksinlerin çok düşük potansiyelini göstermektedir. Ayrıca, bu çalışmada enterotoksin üretimi, ribogroup ve pulsotip arasında anlamlı bir ilişki gözlenmemiştir. İzolatların biyofilm üretim kapasitesini içeren gelecek çalışmalar biyofilm oluşumu ve genotipleri olan enterotoksin genleri arasında olası bir korelasyonu açıklayabilir []. Yirmi yedi izolatın (%.) Revers Pasif Lateks Aglütinasyon testi (RPLA) ile enterotoksijenik olduğu ve bunların 'i (%.) Stafilokok enterotoksin A (SEA) için pozitifti, SE için (%.9) idi. oynukara ve ark. [], Çalışmalarında, sığır subklinik mastitisinden izole edilen S. aureus suşlarının çoğunun diğer SE'lere kıyasla SEA ürettiğini rapor etmiştir. u çalışmada SE suşlarının prevalansı S. aureus'un izolatında çok düşük (%.9), SE (%.9) ve SEC (%.0) idi. u çalışma, Orta atı Anadolu'da bulunan, farklı S. aureus ribotipi ve pulsotip prevalansı bulunan çiftlikten elde edilen izolat içermektedir. Reference. ISPING W., GUNTER A. Colour Atlas fort the Diagnosis of acterial Pathogens in Animals, Paul Parey Scientific Publishers erlin and Hamburg. Germany, 99,.. OYNUKARA., GULHAN T., ALISARLI M., GURTURK K., SOLMAZ H.: Classical enterotoxigenic characteristics of Staphylococcus aureus strains isolated from bovine subclinical mastitis in Van, Turkey. Int J Food Microbiol., 00,, 09.. RADLEY A.J., GREEN M.J.: Adaptation of Escherichia coli to the ovine Mammary Gland. J. Clin. Microbiol., 00, 9, 9.. RAMLEY A.J., DODD F.H.: Reviews of the progress of dairy science: mastitis controlprogress and prospects. J. Dairy Res., 9,,.. RUCE J.: Automated system rapidly identifies and characterises microorganisms in foods. Food Technol., 99, 0,.. COSTA E.O., MELVILLE P.A., RIEIRO A.R., WATANAE E.T., PAROLARI M.C.F.F.; Epidemiologic study of environmental sources in a Prototheca zopfii outbreak of bovine mastitis. Mycopathologia, 99,,.. DA SILVA E.R., DO CARMO L.S., DA SILVA N.: Detection of the enterotoxins A,, and C genes in Staphylococcus aureus from goat and bovine mastitis in razilian dairy herds. Vet Microbiol, 00, 0, DING T., YU Y.Y., SCHAFFNER D.W., CHEN S.G., YE X.Q.: to consumption risk assessment for Staphylococcus aureus and staphylococcal enterotoxins in fluid milk in China. Food Control., 0, 9,. 9. DINGES M.M., ORWIN P.M., SCHLIEVERT P.M.: Exotoxins of Staphylococcus aureus. Clin Microbiol Rev., 000,,. 0. GÜNAYDIN., ASLANTAŞ Ö., DEMIR C.: Detection of superantigenic toxin genes in Staphylococcus aureus strains from subclinical bovine mastitis. Trop Anim Health Prod., 0,,.. HALASA T., HUIJPS K., OSTERAS O., HOGEVEEN H.: Economic effects of bovine mastitis and mastitis management: A review. Vet Q., 00, 9,.. HEGDE R., ISLOOR,S., K. PRAHU, N., SHOME,.R., RATHNAMMA, D., SURYANARAYANA, V. V. S., YATIRAJ, S., PRASAD, C.R., KRISHNAVENI, N., SUNDARESHAN, S., AKHILA, D.S., GOMES, A.R., HEGDE, R.N.: Incidence of Subclinical Mastitis and Prevalence of Major Mastitis Pathogens in Organized s and Unorganized Sectors, Indian J Microbiol., 0,, 0.. HENNEKINNE J.A., KEOUANTON A., RISAOIS A., DE UYSER M.L.: Discrimination of Staphylococcus aureus biotypes by pulsedfield gel electrophoresis of DNA macrorestriction fragments. J Appl Microbiol., 00, 9, 9.. KARAHAN M., CETINKAYA.: Coagulase gene polymorphisim detected by PCR in Staphylococcus aureus isolated from subclinical bovine mastitis in Turkey. Vet J., 00,,.. KHORAMROOZ S.S., MANSOURI F., MARASHIFARD M., HOSSEINI S., CHENARESTANEOLIA F.A., GANAVEHEI., GHARIPOUR F., SHAHAZI A., MIRZAII M., DARANSAROKHALIL D.: Detection of biofilm related genes, classical enterotoxin genes and agr typing among Staphylococcus aureus isolated from bovine with subclinical mastitis in southwest of Iran. Microb Pathog., 0, 9,.. KUZMA K., MALINOWSKI E., LASSA H., KLOSSOWSKA A.: Detection of genes for enterotoxins and toxic shock syndrome toxinin Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis. ull Vet Inst Pulawy. 00,, 9.. MORETTI A., PASQUALI P., MENCARONI G., FIORETTI D.P.: Relationship etween Cell Counts in ovine Milk and the Presence of Mastitis Pathogens (Yeasts and acteria). J Vet Med., 99,,9.. MUTLUER.: Süt İnekçiliğinde Mastitis Sempozyumu, 00 Mayıs, urdur, Akdeniz Üniversitesi Veteriner Fakültesi Yayın Ünitesi, yayın no:, s:, NORMANNO T.G., LA SALANDRA G., DAMROSIO A., QUAGLIA N.C., CORRENTE M., PARISI A,. SANTAGADA G., FIRINU A., CRISETTI E., CELANO G.V.: Occurrence, characterization and antimicrobial resistance of enterotoxigenic Staphylococcus aureus isolated from meat and dairy products. Int J Food Microbiol., 00,, PHILPOT W.N., NICKERSON S.C.: Mastitis What is it? abson ros. Co., Publishing, Napervile, IL. 99,.. PIEPERS S.L., DE MEULEMEESTER L., DE KRUIF A., OPSOMER G., ARKEMA H.W., DE VLIEGHER S.: Prevalence and distributionof mastitis pathogens in subclinically infected dairy cows in Flanders, elgium. J Dairy Res., 00,,.. RALL V., VIEIRA F., RALL R., VIEITIS R., FERNANDES A., CANDEIAS J., CARDOSO J.P. ARAÚJO J.R.: PCR detection of staphylococcal enterotoxin genes in Staphylococcus aureus strains isolated from raw and pasteurized milk. Vet Microbiol., 00,, 0.. SAUNCUOĞLU N., ÇOAN Ö.: Mastitis Ekonomisi. Atatürk Üniversitesi Veteriner ilimleri Dergisi, 00,,.. SCHERRER D., CORTI S., MUEHLHERR J., ZWEIFEL C., STEPHAN R. Phenotypic and genotypic characteristics of Staphylococcus aureus isolates from raw bulk tank milk samples of goats and sheep. Vet Microbiol., 00, 0, 00.. SERRAINO A., ALERGHINI L., FONTANA M.C., ANNEMÜLLER C., LÄMMLER C., ROSMINI R.: Occurrence of enterotoxin genes and macrorestriction analysis of Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitis and bulktank milk samples in Italy. An epidemiological study. Ital. J. Anim. Sci., 00,,.. SWINKELS J.M., HOGEVEEN H., ZADOKS R.N.: A partial budget model to estimate economic benefits of lactational treatment of subclinical Staphylococcus aureus mastitis. J. Dairy Sci., 00,,.. TENHAGEN.A., KOSTER G., WALLMANN J. HEUWIESER W.: Prevalence of mastitis pathogens and their resistance against antimicrobial agents in dairy cows in randenburg, Germany. J. Dairy Sci., 00, 9,.. ÜNAL N., İSTANULLUOĞLU E.: İnsan ve sığır kökenli Staphylococcus aureus izolatlarının fenotipik ve genotipik özelliklerinin araştırılması. Ankara Üniv Veteriner Fakültesi Dergisi, 009,, VANDERLINDE P.., FEGAN N., MILLS L., DESMARCHELIER P.M.: Use of pulse field gel electrophoresis for the epidemiological characterisation of coagulase positive Staphylococcus isolated from meat workers and beef carcasses. Int J Food Microbiol., 999,,. 0. WAAGE S., SVILAND S., ODEGAARD S.A.: Identification of risk factors for clinical mastitis in dairy heifers. J. Dairy Sci., 99,,.

5