HLA LABORATUVARLARINDA ÇALIŞILAN TESTLERİN STANDARDİZASYONU. Prof. Dr. Belma DURUPINAR TİGED 2013

Transkript

1 HLA LABORATUVARLARINDA ÇALIŞILAN TESTLERİN STANDARDİZASYONU Prof. Dr. Belma DURUPINAR TİGED 2013

2 "yapmış olmak için yapmak"

3 Ya şansınız tutmazsa?

4

5 AMAÇ Kaliteli, hata riski düşük ve güvenilirliği yüksek sonuçlar elde ederek rapor etmek. Hatalı test sonuçlarının bildirilmesini en aza indirmek. Tüm sağlık hizmetlerinde olduğu gibi hedef sıfır hata olmalıdır

6 Laboratuvar Döngüsü HASTA Test Seçimi Raporun Gönderilmesi Örnek Alınması Raporun Yazılması Örneğin Transportu Testin Yorumlanması Lab. Kayıt ve Analiz

7 Standardizasyon (ISO) Standart (bir örneklik) İmalatta, anlayışta, ölçümde ve test işlemlerinde birlik ve beraberlik anlamına gelmektedir. Standardizasyon Belirli kurallar koyma ve kuralları uygulama işlemidir. Standardizasyon işlemi ile kalitenin alt sınırı tespit edilerek belirlenen düzeyin altında mal ve hizmet üretimine müsaade edilmemektedir.

8 Standardizasyon Kalitenin niteliklerini yerine getirmek amacıyla laboratuvar sonuçlarının izlenebilir ve karşılaştırılabilir olması için Laboratuvar diagnostik işlemlerinin (preanalitik, analitik ve postanalitik safhalar) standardize edilmesidir.

9 Nasıl? Geçerli, güvenilir cihaz ve malzemelerin kullanımı, Eğitimli, kendini sürekli geliştiren, motive kadro, Doğru alınmış ve tanımlanmış numuneler, Güvenli ve çalışmaya uygun bir ortam, Doğru sonuçları, doğru kayıt ve doğru, yorumlama ile sağlanır.

10 Neden gereklidir? HLA laboratuvarları; Solid organ nakillerinde greft rejeksiyonu, Kemik iliği ve kök hücre nakillerinde GVH reaksiyonu riskleri Alıcı ve vericilerin eşleştirilmelerinde, Alıcının nakil öncesi ve sonrası immünolojik durumunun saptanmasında önemli role sahiptirler.

11 Neden gereklidir? Testlerin yapılması, değerlendirilmesi ve yorumlanmasında sorunların en aza indirilmesi, Farklı laboratuarlarda elde edilen sonuçlar arasındaki uyumun sağlanması, Testlerin üstün kalite ve performansta sonuç vermelerine yol açan kuralların uygulanması, Laboratuvarların standardize edilmeleri önemlidir.

12 Neler standardize edilmelidir? Çalışanlar Kit ve cihazlar Testler Raporlar Laboratuvarların sağlık sistemine entegrasyonuyla ilgili yasal düzenlemeler

13 Temel ilkeler nelerdir? Testlerin Seçimi Doğruluk Kesinlik Duyarlılık Özgüllük Pozitif/negatif prediktif değerleri

14 HLA Tiplendirmesi HLA CDC PCR-SSO (low resolution) PCR-SSP (low resolution) PCR-SSP (high resolution) PCR-SBT (high resolution) A B C DR DQ DP B5 B27

15 Anti-HLA ve CDC Anti-HLA antikor tarama Anti-HLA antikor tarama 2 Anti-HLA antikor tanımlama 1 Anti-HLA antikor tanımlama 2 CDC ELISA Flow Sitometri Cross-match

16 Cihazın Değerlendirilmesi Performans Kesinlik ve doğruluk Test başına düşen maliyet Mekanik, elektrik ve kimyasal güvenliği Kullanım klavuzları Cihazın idame, bakım ve çalışma standartları Sonuçların karşılaştırılabilir olması Kullanım kolaylığı Cihaza ait yukarıda belirtilen tüm özellikler değerlendirilerek standart çalışma prosedürleri (SÇP) detaylı olarak yazılmalıdır.

17 Verilerin toplanması, analizi, işlenmesi, sunumu, saklanması Bilgisayar kaynaklı olması tercih edilir Kalite kontrolleri ve standardizasyonu önemlidir

18 Analiz öncesi, analiz ve analiz sonrası standardizasyon Testlerin yapıldığı ünitenin yapısı Örneklerin alınması, taşınması, saklanması Sonuçların raporlanması, uyumsuz sonuçlar Test prosedürleri, kalite kontrol Örneğin alımından sonuçların doktora ulaştırılmasına kadar geçen sürecin kontrolü

19 Kalite kontrolü ve kalite güvencesi

20 Kalite kontrolü ve kalite güvencesi Pre-analitik, analitik ve post-analitik bütün evreler için test kalitesini sağlamak Standart Çalışma Prosedürü (SÇP) hazırlamak Tüm testlerin standardizasyonunu yapmak Dış kalite kontrol mekanizmalarını kullanmak Sık denetime açık olmak Bağımsız ulusal/uluslararası bir kuruluş tarafından akredite edilmek

21 SÇP formatı örneği Kapak sayfası Başlık-Referans numarası-hazırlama tarihi-isimler Kapsamı Amacı-Testin temel prensibi-görev alan personelin nitelikleri Örnekle ilgili bilgiler Örnek kabul/red kriterleri Güvenlik ve korunma Yüksek riskli hastaların tanımı Cihazlar ve reaktiflerin özellikleri Kontroller, kalibrasyon Uygulanan testin etraflı tanımı Test sonuçlarının raporlanması Test sonuçlarının sınırları ve hata payları Kan örneklerinin saklanması ve atılması yöntemleri İlgili Literatür İmzalar

22 Standartlar Test seçimi Test uygulamaları Test sonuçlarının değerlendirilmesi Raporlama Kalite kontrol

23 Oluşturulacak politikalar en alt kademedeki personelden başlayarak, teknisyenler, teknik danışman, laboratuvar sorumlularına kadar herkesi kapsayacak şekilde bir fikir ve uygulama birlikteliği sağlayacaktır. Uygulama politikalarınız ve yöntemlerinizi yazılı hale getirmelisiniz.

24 Doğabilecek hata şekilleri ise; İstek hataları Örnek alımındaki hatalar Transport Test uygulama Değerlendirme Raporlama hataları

25 A-Z ye standardizasyon ve kontrol Analiz öncesi dönem Analiz dönemi Analiz sonrası dönem

26 Analiz öncesi dönem Multidisipliner bir uyum içerisinde çalışılmalıdır. Test istem formu gerektiği şekilde doldurulmalıdır Laboratuvarda uygulanan testlere yönelik örnek alma kılavuzları hazırlanmalı ve eğitim verilmelidir. Örnek alma yöntemleri Örnek miktarları Laboratuvara gönderme koşulları Saklama koşulları

27 Örnekler Örnek Saklama koşulları PCR-SSP Periferik kan DNA EDTA 5-10 ml <48 saat +4 C PCR-SSO Periferik kan DNA EDTA 5-10 ml <48 saat +4 C PCR-SBT Periferik kan DNA EDTA 5-10 ml <48 saat +4 C Multipleks PCR Periferik kan DNA EDTA 5-10 ml <48 saat +4 C CDC-HLA Periferik kan Lenfosit Li Heparin 8 ml <24 saat Oda ısısı CDC-PRA Periferik kan Serum Kuru tüp 5 ml <72 saat >72 saat +4 C C ELISA-PRA Periferik kan Serum Kuru tüp 5 ml <72 saat >72 saat +4 C C FISH Periferik kan Kemik iliği Lenfosit Li Heparin EDTA 10 ml 2 ml <24 saat Oda ısısı İLAÇ DÜZEYİ Periferik kan Kan EDTA 2 ml 1 hafta +4 C MLC Periferik kan Lenfosit Li Heparin 8 ml <24 saat Oda ısısı FCXM Periferik kan Lenfosit Serum Li Heparin Kuru tüp 8 ml 5 ml <24 saat Oda ısısı CDXM Periferik kan Lenfosit Serum Li Heparin Kuru tüp 8 ml 5 ml <24 saat Oda ısısı

28 Analiz dönemi Laboratuar prosedürleri klavuzu hazırlanmalıdır. Tekrar politikaları Prosedürlerin update edilmesi için politikalar Yeni prosedürlerin validasyonu Laboratuara gelen örneklerin kalitesini, uygulanabilirliğini değerlendirecek kabul/red kriterleri oluşturulmalı ve bundan kesinlikle taviz verilmemelidir. Laboratuar içi algoritmik uygulama standartları oluşturulmalı ve yazılı hale getirilmelidir. Tüm personelin bu kurallara uyması sağlanmalıdır.

29 Laboratuar prosedürleri klavuzu Personelin gerektiğinde danışabileceği, hastane şartlarına ve laboratuvarın kendi uygulama politikasına göre hazırlanmalıdır. Deneyimsiz ve işe yeni başlamış bir personelin anlayacağı dilde detaylı hazırlanmalı ve her çalışma alanında bir tane bulundurulmalıdır. Böylece tüm laboratuvar çalışanları arasında uygulama bütünlüğü sağlanmış olacaktır.

30 Analiz sonrası Sonuçların raporlanması Uyumsuz sonuçları raporlama politikaları Transplant Proğramı ve diğer ilgili taraflar ile ilişkiler Dış denetim Personel ile iletişim Yeterlilik testleri (iç/dış) Sonuçların gözden geçirilmesi

31 Laboratuvarın karar vermesi gereken durumlar ; Kullanılacak metod? Sonuçların raporlanması? Sonuçların klinik anlamı? Sonuçların doğruluğundan emin olma? Hangi standart? Kalite kontrol/ kalite güvenliği?

32 Hangi standart?

33 Standardizasyon kriterleri nelerdir? HLA Laboratuvarlarının uyguladıkları testlerin üstün kalite ve performansta sonuç vermelerine yol açan kurallar ASHI ve EFI liderliğinde USA ve Avrupa da uzun yıllardır uygulanmaktadır. ASHI veya EFI akreditasyonu için gerekli standartlar ve kriterlerden oluşmuştur.

34 HLA LABORATUVARINDA ÇALIŞILAN TESTLERİN STANDARDİZASYONU Standarts for Histocompatibility and Immunogenetics Testing Version 6.0, v6.1

35 Standarts for Histocompatibility and Immunogenetics Testing A - GENERAL POLICIES B - PERSONNEL QUALIFICATIONS C - QUALITY ASSURANCE D - HLA ALLELES AND ANTIGENS E - EROLOGICAL HLA CLASS I AND CLASS II TYPING F - ANTIBODY SCREENING AND CROSSMATCHING G - RENAL and/or PANCREAS TRANSPLANTATION H - OTHER ORGAN TRANSPLANTATION I - HAEMATOPOIETIC STEM CELL TRANSPLANTATION J HLA AND TRANSFUSION K - DISEASE ASSOCIATION L NUCLEIC ACID ANALYSIS M - FLOW CYTOMETRY N - ENZYME-LINKED IMMUNO SORBENT ASSAY (ELISA)

36 Standarts for Histocompatibility and Immunogenetics Testing Section E - HLA sınıf I/II Serolojik Tiplendirme Section F- Antikor Tarama ve Crossmatch Section G - Böbrek ve/veya Pankreas Transplantasyonu Section H - Diğer Organ Transplantasyonları Section I - Haematopoietic Stem Cell Transplantasyonu Section K - Hastalık İlişkileri Section L - Nükleik asit analizleri Section M - Flow Sitometri Section N - ELISA

37 HLA tiplendirme testleri Serolojik Tiplendirme Mikrolenfositotoksisite Moleküler Tiplendirme (PCR a dayalı testler) SSP,SSO,SSPC,SBT

38 Serolojik tiplendirme Kompleman Bağımlı Sitotoksisite Test sonuçlarının kaydedilmesi Her serum-hücre kombinasyonu için ölü hücre oranı belirtilmelidir. Değerlendirmede, sayısal (0,1,2,4,6,8) skorlar kullanılmalıdır.

39 Sonuçların değerlendirilmesi Ölü hücre % Skor Değerlendirme (-) Olası (-) Zayıf (+) (+) Kuvvetli (+)

40 Tiplendirme Sınıf I için, HLA A ve B Sınıf II için, HLA DR Kullanılan teknikler sınıf I ve II özgüllüğünü optimal saptamalıdır.

41 Kontroller Pozitif antikor kontrolü Sınıf I ve II antijenlerini eksprese eden lenfositlerle reaksiyon veren; en az bir Negatif kontrol serumu lökosit reaktif antikorları içermeyen; en az bir Kontrol serumlarının çalışmadığı durumlar tanımlanmalıdır. Pozitif kontrolün beklenen reaksiyonu vermemesi durumunda, kabul/red kriterleri bulunmalıdır. Validasyonu için, kontrol serumunun reaktivitesi ve min. hücre canlılığı tanımlanmalıdır.

42 Antijen saptanması Her HLA-A ve B antijeni Her ikisi de monospesifik ise, en az iki serum Multispesifik ise, en az üç çakışmayan serum Her HLA-Sınıf II antijeni Monospesifik ise, en az üç serum Multispesifik ise, en az beş farklı serum

43 Kompleman Önerilen sıcaklıkta saklanmalıdır. Her lot ve shipment için test edilmelidir. Test farklı dilusyonlar ile yapılmalıdır. En az bir dilüsyonun altında maksimum aktif olmalıdır. Her hedef hücre için ayrı ayrı test edilmelidir. Her yeni lot ve shipment için sitotoksisite test edilmelidir. Spesik HLA antikor varlığında sitotoksik HLA spesifik antikor yokluğunda sitotoksik değil

44 Moleküler tiplendirme SSP,SSOP,SBT, SSCP, heteroduplex, DGGE

45 Nükleik asit analizleri Genel laboratuar tasarımı Aletler Reaktifler Primerler Nükleik asit ekstraksiyonu Analiz* Elektroforez Analiz Kontaminasyon kontrolü*

46 Sequence Specific Primers (SSP) Sequence- Based Typing (SBT) Sequence Specific Oligonucleotide Probe (SSOP) hibridizasyon yöntemleri Kalite Kontrol Hibridizasyon Ekipman Yorumlama* Diğer yöntemler (SSCP, heteroduplex, DGGE)

47 Analiz Poz.ve neg. sonuçlar için kabul edilebilir sinyal yoğunluğu limitleri tanımlanmalıdır. Allel tayin yöntemi planlanmalıdır. Allel database dökümante edilmeli ve yılda en az bir kere güncellenmelidir. SSOP veya SSP için poz/neg. reaksiyonların yorumu veya allellerin tanımlanması manuel olarak yapılmışsa primer verilerin iki bağımsız yorumu sağlanmalıdır. Primer dataların yorumunda kullanılan HLA sekanslarının databaseleri dökümante edilmelidir.

48 Kontaminasyon kontrolü Laboratuardaki amplifikasyon ürünleri için izlenmelidir Rutin kontaminasyon testi Pre-amplifikasyon çalışma alanı Pre-amplifikasyon cihazı En az iki ayda bir yapılmalıdır En az rutin test kadar duyarlı bir test kullanılmalıdır Pozitif kontrolleri içermelidir Amplifiye edilmiş ürün saptanırsa; Kontaminasyonun nasıl önlendiği yazılmalıdır Kontaminasyonun önlendiğini kanıtlanmalıdır

49 Yorumlama Poz/neg sonuçlar için kabul edilir sinyal yoğunluğu limitleri tanımlanmalıdır. Testte set limitleri prob sinyalleri kabul edilmişse doğrulanmalı ve dökümante edilmelidir. Laboratuar, aynı lottaki primer ve probların tiplendirmelerin yorumundan ve validasyondan elde edilen verileri kullanmalıdır. Nonspesifik ve zayıf hibridizasyon sinyalleri tanımlanmalı ve dökümante edilmelidir.

50 SSP Her amplifikasyon reaksiyonu teknik başarısızlıkları tanımlayan kontroller içermelidir. Non spesifik veya internal kontrol bantları elde edildiğinde tiplendirmeyi kabul/red kriterleri belirlenmiş olmalıdır. Tanımlanmalı ve dökümante edilmelidir Non-spesifik ve zayıf amplifikasyonlar Prime-dimer oluşma eğilimi

51 SSOP Her probun özgüllüğü ve hedef dizi tanımlanmalıdır. Problar spesifisite ve sensitivitelerini koruyacak şekilde saklanmalıdır. Kalite kontrol Probların her lot ve shipment için kalite kontrol politikaları olmalıdır. Her probun spesifisite ve signal şiddeti tanımlanmalı ve izlenmelidir. Ticari kitlerde spesifikasyondan sapma valide ve dökümante edilmelidir. Her lot ve shipment en az bir DNA örneği ile paralel test edilmelidir.

52 Hibridizasyon Amplifikasyon hibridizasyondan önce jel elektroforezi ile izlenmelidir. Her test aşağıdakileri içermelidir: Amplifiye olmuş parçanın konserve bölgesine için poz. Kontrol Hibridizasyonu valide etmek ve basamakları saptamak için uygun kontroller DNA içermeyen neg. Kontrol Her işlemde bilinen tipte DNA

53 Diğer Yöntemler (SSCP, Heteroduplex, GGE) Validasyonları yapılmalıdır. Her örneğin tiplendirilmesinde kontroller kullanılmalıdır.

54 Antikor tarama ve crossmatch Kompleman Bağımlı Sitotoksisite (CDC) ELISA Flow sitometri (FC) Luminex

55 Serum Örnekler dondurulmuş olarak saklanmalıdır HLA antijenlerini saptayan optimal antikor konsantrasyonu sapatnmalı ve, dilüsyonlar dökümante edilmelidir. Her test, neg. kontrol olarak non-alloimmunize insan serumu içermelidir. Her test, yüksek derecede alloimmunize bireyden elde edilen pos. kontrol içermeli ve HLA antijenleri ile reaksiyonu dökümante edilmelidir Her yöntem için antikor uygun isotipte olmalıdır.

56 Teknikler HLA antijenlerine karşı antikorların saptanması için lab. İkisinden birini kullanmalıdır Komplemana bağlı sitotoksik teknik veya HLA antijenlerine karşı antikorları eşit veya daha yüksek duyarlıkta saptayan diğer bir teknik HLA sınıf II antikorlarını saptamak için, HLA sınıf I antikorlarından ayırt edebilen bir teknik

57 Diğer teknikler FC (bölüm M1, M2) ELISA (mikro-plate?)(bölüm N)* Fluoresan mikropartikül assay (bölüm M4)*

58 CDC ile antikor tarama Her çalışmada pozitif ve negatif kontrol kullanılmalıdır. Serum DTT ile muamele edilmişse IgG ve IgM pozitif kontroller kullanılmalıdır. CDC tekniğini kullanan laboratuar, kompleman için E5 standartlarını uygulamalıdır.

59 Paneller HLA antijen panelleri,yeterli sayıda verici hücresi içermelidir. Antikor varlığını veya tanımlamasını sağlayan yöntemler için, HLA sınıf I ve/veya sınıf II özgüllüğü tanımlanmalıdır.

60 Crossmatch HLA spesifik antikorların saptanması için crossmatch En az lymphocytotoxicity kadar duyarlı teknikler kullanılmalıdır Duyarlılığı artırmak için (inkübasyonun süresinin uzatılması, antiglobulin testi, B-hücre crossmatch ya da FC gibi) en az bir teknik dökümante edilmelidir. Kullanılan tarama sonuçları, en az rutin crossmatch tekniği kadar hassas olmalıdır.

61 Her serum sulandırılmamış ve çift çalışılmalıdır Ayrılmamış lenfositler veya T lenfositler ile çalışılmalıdır Tx proğramı için gerekli ise, B lenfositler ile çalışılmalıdır Poz. ve neg. kontroller mutlaka olmalıdır. Serum DTT ile muamele edilmişse IgG ve IgM kontrolleri olmalıdır. Kompleman için E5 standartı kullanılmalıdır. Gerekli olduğunda M ve N standartları izlenmelidir.

62 Fluoresan mikropartikül assay Hücre temelli testler Hücre ve bead temelli antikor tarama Anti-HLA antikorlarının veya antikor özgüllüğünün saptanmasında panel özellikleri daha önce tanımlanan şekildedir. Kontroller Negatif (non-alloimmunize insan donör) Pozitif (HLA antijenleri için spesifik, uygun izotip)

63 Antikor tarama ve CM prosedür ve politikaları aşağıdakileri içermelidir: Reaktiflerin standardizasyonu ve optimizasyonu Reaktiflerin validasyonu İnkübasyon ısısı Detaylı Yorum Antikor pozitifliğinin önemlilik düzeyi için eşik değer Poz.sonuçlar için ortalama, fluoresan markır poz. sayısı, relatif ortalama fluoresans,.. Negatif, pozitif ve sekonder kontroller için kabul edilebilir reaktiviteler

64 Böbrek ve/veya pankreas transplantasyonu (modifiye) Canlı donör transplantları için, prospektif crossmatch yapılmalıdır. Prospektif crossmatch yapılmamış ise, retrospektif crossmatch yapılmalıdır. Virtual Crossmatch için Tx protokolü, klinik Tx ekibiyle belirlenmeli ve dökümante edilmelidir.

65 Virtual Crossmatch Unsensitize hastalar için Sensitize hastalar için Virtual Crossmatch Retrospektif Crossmatch

66 Flow cytometry Uygulama Aletin genel standardizasyonu ve bakım Optik standardizasyon Fluoresans standardizasyonu Cihaz temizliği ve bakımı Genel reaktifler Antikor tarama ve cross-match Hücre temelli test Hücre ve bead temelli antikor tarama Kontroller Prosedürler ve politikalar

67 ELISA Cihaz ELISA okuyucu Mikroplate yıkayıcı ELISA reaktifleri Kalite yönetimi ve kontroller Paneller

68 Sonuç Kalite asla rastlantı değildir, her zaman zekice bir çabanın sonucudur. RUSKIN

69

70

71 TEŞEKKÜR EDERİM