KÜLTÜR BALIKÇILIĞINDA SPERM KALİTESİNİ ETKİLEYEN FAKTÖRLER

Transkript

1 KÜLTÜR BALIKÇILIĞINDA SPERM KALİTESİNİ ETKİLEYEN FAKTÖRLER C.Kaya GÖKÇEK, Mehmet NAZ Mustafa Kemal Üniversitesi Su Ürünleri Fakültesi, Antakya, HATAY E-Posta: ÖZET Balıkçılık endüstrisinde, her iki gametin kalitesinin döllenme ve larva yaşama oranı üzerine etkisi bilindiği halde, yumurta ve larva kalitesi sperme oranla daha fazla ön plana çıkmıştır. Kültüre alınmış balıkların sperm kalitesi; spermin toplanması, dölleme öncesi depolanması ve dölleme prosedürü ile doğrudan ilişkilidir. Sperm kalitesinin tanımlanmasında farklı görüşler olmasına rağmen, sperm aktivitesi spermin kalitesini tanımlamada en çok kullanılan özelliktir. Bu çalışmada temel olarak üç hedef belirlenmiştir; balıktaki sperm kalitesini tanımlamak, sperm kalitesini ölçmede kullanılan yaygın metotları sunmak ve sperm aktivitesini ölçmede kullanılan bilgisayar destekli analiz yöntemlerini tanıtmaktır. ANAHTAR SÖZCÜKLER: Sperm, sperm aktivitesi, sperm kalitesi, bilgisayar destekli sperm analizi ABSTRACT The fish farming industry has been focused on the quality of eggs or larvae rather than that of sperm, even though the quality of both gametes effects on fertilization and larval survival ratio has been known. Sperm quality of cultured fishes is directly connected with collection of sperm, storage of sperm prior to fertilization or the fertilization procedure. Although other approaches for quantification of sperm quality have been suggested, motility is most commonly used in definition of sperm quality. The objectives of this study are three-fold; to define sperm quality in fish, to give some of commonly methods used for the assessment of sperm quality and to present computer-aided analysis methods of sperm motility as a measure of sperm quality. KEYWORDS: Sperm, motility, sperm quality, computer-assisted sperm analysis GİRİŞ Balık yetiştiriciliğinde, doğadan yakalanmış damızlık balıklardan yüksek kaliteye sahip gamet temini, sağlıklı yavruların meydana gelmesini garanti altına almada oldukça önemli bir rol arz etmektedir (Kjorsvik et al., 1990; Bromage and Roberts,1995). Balık yetiştiriciliği endüstrisi, sperm kalitesinden daha çok yumurta ve larva kalitesi üzerine odaklanmıştır. Halbuki, erkek damızlıklardan elde edilen spermin kalitesi, sağlıklı yavruların elde edilmesinde en az yumurta kalitesi kadar önemlidir. Buna rağmen, ticari kuluçkahanelerde sperm sıvısı genellikle hem kalite hem de miktar açısından yetersizdir ve yetiştiriciliği sürekli yapılan türlerde bile zaman zaman başarısız dölleme sonuçları olabilmektedir. Bu durum, Karabalık (Clarias gariepinus) ta olduğu gibi sağım yoluyla erkek damızlık balıklardan sperm temininin olanaksızlığı şeklinde de karşımıza çıkabileceği gibi, ayrıca hormon kullanım zorunluluğunun yanında, sağım sırasında sperm sıvısına idrar karışma olasılığı da bulunmaktadır. Bununla birlikte, kalkan (Psetta maxima) ve dilbalığı (Pleuronectes ferrugineus) gibi bazı türlerde erkek damızlıklardan 1 mlt den daha 473

2 az sperm alınabilmektedir (Suquet et al., 1992; Clearwater and Crim,1998). Bu durumda dölleme başarısını olumsuz yönde etkilemektedir. Yukarıda bahsedilen problemlerin üstesinden gelebilmek için, balık sperm sıvısının saklanması ve eş zamanlı gamet temini, yetiştiricilikte alınması gereken zaruri önlemler olarak önerilmektedir. Ancak, donmuş olarak sperm sıvısının muhafazasının yumurtayı dölleme oranını düşürdüğü bildirilmiştir (Billard,1983; Saad et al.,1988; Dreanno et al., 1997). Ticari olarak yetiştiriciliği yapılan bir çok türde, birkaç erkeğin sperm sıvılarının karıştırılarak yapıldığı dölleme işlemi en yaygın olarak kullanılan metottur. Bu yöntemle döllenme oranı yüksek olmasına rağmen, tüm erkek damızlıkların katkısı sperm hücreleri arasındaki rekabetten dolayı eşit miktarda olmayabilmektedir (Gage et al.,1998; Mjolnerod et al.,1998; Bekkevold et al.,2002; Vladic et al.,2002). Ayrıca, az sayıda damızlık balık kullanımı durumlarında, tüm erkek damızlıklardan elde edilen sperm sıvılarının aynı kalitede olması arzulanmaktadır. Bu yüzden, erkek damızlıklar arasındaki sperm kalitesi farklılığının tespit edilebilmesi dölleme başarısı açısından oldukça büyük bir önem arz etmektedir. Bu çalışmada temel olarak üç hedef belirlenmiştir; balıktaki sperm kalitesini tanımlamak, sperm kalitesini ölçmede kullanılan yaygın metotları sunmak ve sperm aktivitesini ölçmede kullanılan bilgisayar destekli analiz yöntemini tanıtmaktır. SPERM KALİTESİNİN TANIMI Temel olarak sperm kalitesi, spermin yumurtayı dölleyebilme kapasitesinin bir ölçüsüdür. Burada en önemli iki faktör; sperm sıvısındaki sperm hücrelerinin sayısı ve hareketliliğidir. Sperm hareketliliği, sperm kalitesini tanımlamada en yaygın olarak kullanılan parametredir (Bromage and Roberts, 1995). Bununla beraber, spermin dölleme kapasitesiyle direk olarak ilişkili tüm fiziksel parametreler, potansiyel olarak sperm kalitesini ölçmede kullanılabilir. Bugüne kadarki yapılan araştırmalarda sperm yoğunluğu, osmotik yapı, sperm sıvısının ph ı, sperm sıvısının kimyasal yapısı, enzimatik aktiviteler, adenozintrifosfat (ATP) konsantrasyonu, hareketlilik, morfolojik yapı, dölleme kapasitesi ve diğer özellikler sperm kalitesini tanımlamada kullanılan fiziksel parametrelerdir (Billard and Cosson, 1992; Ciereszko and Dabrowski, 1993, 1994; Billard et al., 1995; Lansteiner et al., 1996, 1998; Fauvel et al., 1998; Geffen and Evans, 2000; Chowdhury and Joy, 2001). Ancak, dölleme kapasitesi farklı çevresel faktörlere bağlı olarak damızlık bireyler arasında farklılık gösterebilmektedir (Dreanno et al., 1998). Bu yüzden, her bir damızlık birey için tam bir sperm kalitesi tanımlaması yapmak oldukça zordur. Örneğin, hareketsiz sperm hücrelerinin bile dölleme yeteneği olduğu özlenmiştir (Truscott and Idler, 1969). Aslında, bazı parametrelerin kolayca ölçülebilmesi ve yaygın olarak kullanılmasının (örneğin; sperm miktarı, yaşama oranı, bireysel hareketlik vb.) mümkün olduğu çalışmaların yanında, kimi çalışmalar çok daha komplike (Örneğin; biyokimyasal analizler) ve yüksek maliyetli (örneğin; objektif ve kantitatif hareketlilik) araştırmalardır. Dolayısıyla, sperm kalitesinin değerlendirilmesinde kullanılacak metotların seçilmesinde bahsedilen faktörler göz önüne alınmalıdır (Casson et al.,2000). SPERM KALİTESİNİ ETKİLEYEN FAKTÖRLER Balık çiftlikleri ve kuluçkahanelerde, sperm kalitesi biyotik ve abiyotik faktörlerin etkisi altındadır. Genetik, fiziksel ve çevresel faktörlerin kompleks bir etkileşimi sonucu erkek damızlık balıkların sperm kalitesi her bireyde farklılık gösterebilmektedir. Bu yüzden, dölleme işlemi öncesinde, erkek damızlıkların bakımı, beslenmesi ve dölleme öncesi spermin en iyi şekilde muhafazası ticari 474

3 işletmeler için hayati önem arz etektedir (Rurangwa et al., 2004). Yetiştiricilikte, damızlık balıklar genellikle tanklar yada kafeslerde doğada olması gerekenden çok daha yoğun bir şekilde stoklanırlar ve yapay yemlerle beslenirler. Ayrıca, tesislere gelen suya endüstriyel yada tarım ilaçlarından kaynaklanan kirletici maddeler bulaşabilmektedir. Aşırı stok yoğunluğuna bağlı olarak oluşan ve antibiyotik kullanımı gerektiren rahatsızlıklarda meydana gelebilmektedir. Bu gibi durumlarda meydana çıkan stres faktörü, bağışılık sistemini olumsuz yönde etkileyerek, hastalıklara karşı hassasiyeti arttırmaktadır. Başarılı bir dölleme elde etmek için, doğadakine yakın bir sperm kalitesi gerekmektedir. Ancak, ticari çiftliklerde yapılan bir dizi uygulama ve çevresel faktörler, damızlık balıkların sperm kalitesini direk olarak etkilemektedir. Çiftliklerde damızlık balıkların sperm kalitesini etkileyen faktörler üç ana başlık altında aşağıdaki tabloda verilmiştir. Tablo 1. Ticari çiftlik ve kuluçkahanelerde erkek damızlık balıkların sperm kalitesini etkileyen faktörler Damızlık Bakımı Dölleme İşleminin Etkisi Saklama Koşulları Fotoperiyot ve Sıcaklık Anestezi Kullanımı Soğuk Muhafaza (4 0 C) Besleme Üre Kontaminasyonu Donmuş Muhafaza Su ve Yem Kalitesi Dölleme Sıcaklığı (Cryopreservation) Stres Üreme sezonu Hastalıklar Hormon enjeksiyonu Stoğun Yaşı BALIKLARDA KULLANILAN SPERM KALİTESİ ANALİZLERİ Ticari balık yetiştiriciliğinde sperm kalitesinin tespiti, yapay döllemenin verimliliğini arttırabilmek için kaçınılmazdır. Bu yüzden, sperm kalitesini hızlı ve sağlıklı bir şekilde tespit edebilen analiz metodu, büyük ölçüde üretimi garanti altına alabilecek bir rol oynayacaktır. Günümüze kadar yaygın olarak kullanılmış olan analiz metotları, subjektif metot ve yarı-sayısal metot (semi-quantitative metod) tur. Bunun yanında, özellikle son yıllarda memeliler ve kuşlarda kullanılmış bilgisayar destekli sperm analiz (Computer-assisted sperm analysis) metodu, balık yetiştiriciliği sektöründe de kullanılmaya başlanmıştır. Subjektif Metod (Subjective method) Uzun yıllar boyunca balık sperminin kalitesini belirlemede, hareketlilik özelliğini tanımlayan aktif hareketli sperm hücresi yüzdesi ve hareketliliğin genel durumu gibi özellikler subjektif metodun temelini oluşturmuştur (Guest et al., 1976; Billard et al., 1978; Memaster et al., 1992). Bu metotta, 0 (hareketsiz) ve 5 (tüm hücreler hareketli) arasında rast gele seçilmiş bir dereceleme yöntemi kullanılmaktadır (Guest et al.,1976). Sınıflandırmada kullanılan 0 değeri hiçbir hareketliliğin gözlenmediğini; 1 değeri % 25 ten az hareketlilik olduğunu, 2 değeri % 50 ye varan bir hareketlilik olduğunu, 3 değeri % 75 e varan bir hareketlilik olduğunu, 4 değeri % 75 ten fazla hareketlilik olduğunu ve 5 değeri ise tüm hücrelerin hareketli olduğunu göstermektedir (Viveiros et al., 2003). Levrek balığında hücrenin hareketliliği yanında, hızı, gücü ve ileri doğru aktif hareket yeteneği de sınıflamada göz önüne alınmaktadır (Sansone et al., 2002). Ancak, bu doğrusal olmayan (nonlinear) rast gele veriler yüzünden, istatistiksel bir analiz yapmak olanaksızdır. Dolayısıyla, tekniğin subjektif yani laboratuar şartları ve araştırıcının tecrübesine bağlı olarak farklı sonuçlar verme olasılığı, metodun güvenirliliğini azaltmaktadır. 475

4 Yarı-Sayısal Metod (Semi-quantitative metod) Sperm hareketliliğinin ölçümünde, hassasiyeti arttırmak ve analizi standardize edebilmek için sayısız teşebbüste bulunulmuştur. Subjektifliğin üstesinden gelebilmek ve analiz yönteminin inandırıcılığını arttırmak amacıyla birçok teknik geliştirilmiştir. Sperm hareketliliğini ölçmede kullanılan yarı-sayısal metod, iki veya daha fazla gözlemcinin video kasete kaydedilmiş görüntüleri incelemesi şeklinde uygulanmaktadır. Olduğu yerde titreşen ve kendi etrafında dönen sperm hücreleri hareketsiz, yalnızca ileri doğru hareket edebilen sperm hücreleri hareketli olarak kabul edilmektedir (Aas et al., 1991). Video kayıtları, yavaşlatılmış bir şekilde sürekli ileri ve geri sarılmak suretiyle incelenmektedir. Ekran üzerinde ızgara şeklinde çizgiler çizilir ve ilk önce hareketli spermler sayılır. Bu sayede, spermin gerçekten hareketli mi, yoksa sadece titrediği veya kendi etrafında dönüp dönmediği kolayca anlaşılır. Bu yöntem birçok sayım tekniğinden çok daha az subjektif sonuçlar vermektedir. Toplam hareketlilik süresi, kronometre aracılığıyla, tüm sperm hücrelerinin % 50 sinin hareket ettiği andan % 95 inin hareket etmeyi bıraktığı ana kadar geçen sürenin ölçülmesiyle elde edilir. Bu teknikte, her bir spermin değerlendirilmesi ve hızının ölçülmesi gözlemcinin tecrübesine bağlı olmakla beraber, aşırı zaman kaybına sebep olmaktadır. Tekniğin, sayısal ölçümde yüksek doğruluk yüzdesine sahip olmasına rağmen, geniş zaman gerektiren ve kısmen de olsa subjektif bir teknik olması, yöntemin inandırıcılığı açısından tartışmalara sebep olmaktadır (Rurangwa et al., 2004). Bilgisayar Destekli Sperm Analiz Metodu (Computer-assisted sperm analysis (CASA)) Bilgisayar destekli sperm analizi, görüntüleme yazılımı ile donatılmış bir bilgisayar aracılığıyla fotomikrogrofi ve videomikrogrofi tekniklerinin uygulandığı bir analiz metodudur. İlk kez, memeli ve kuşlarda kullanılan bu sistem, son yıllarda balıklar ve diğer sucul organizmaların incelenmesinde de kullanılmaya başlanmıştır. Memeliler ve kuşlarla mukayese edildiğinde, balık sperm hücrelerinin yaşam sürelerinin çok kısa olması ve hareketlilik süresince çok yoğun kamçı hareketi yapmaları, bu sistemin balıklarda kullanılmasını geciktirmiştir (Billard and Cosson, 1992). Sistem, balıklarda ilk kez, alabalıklardaki aktif sperm hareketlerini tespit etmede kullanılmıştır. Bu çalışmadan sonra, birçok diğer türde analiz yöntemleri geliştirilmiştir. Bu sistem temel olarak, monitöre sinyal gönderen ve mikroskop üzerine monte edilmiş bir CCD kamera, kayıt cihazı ve bilgisayardan oluşmaktadır (Boyer et al., 1989). Sperm hareketleri, daha sonra analiz edilmek üzere videoya kaydedilir. Sperm hareketliliğini ölçmede kullanılan en yaygın iki parametreden biri, yörünge boyunca süren eğik hız (EH), diğeri ise hareketliliğin başladığı ve bittiği nokta arasındaki doğrusal hız (DH) dir (Kime et al., 2001; Rurangwa et al.,2002; Jobling et al., 2002). Eğer yörünge doğrusal bir hat ise, EH ve DH birbirine eştir. Bununla beraber, DH/EH oranı sperm hücresinin hareketliliği ve kalitesi hakkında bilgi vermektedir. Sperm sıvısının ortama salınmasını takiben, kemikli balıkların sperm hücreleri genellikle doğrusal yada çok hafif eğik bir yörünge çizerler. Bu analiz yönteminde, hareketli sperm hücrelerinin oranı ve hareketlilik miktarının tespiti, sperm sayısının belirlenmesinde kullanılan en önemli iki parametredir. Bunun yanında, dölleme başarısı sperm hücrelerinin hareketlilikleri ve hızlarıyla doğrudan ilişkilidir. Bugüne kadar, sperm kalitesinin tespitinde belirlenen diğer fiziksel özelliklerin kesin etkileri tam olarak belirlenememiştir (Rurangwa et al.,2004). 476

5 SONUÇLAR VE TARTIŞMA Balık çiftlikleri ve kuluçkahanelerin yetiştiricilik uygulamalarının birçok safhasında, gerçek ve inandırıcı bir sperm kalitesi ölçümüne ihtiyaç duyulmaktadır. Ancak, balıklarda bilgisayar destekli sperm analizinin kullanılmaya başlanmasından on senelik bir süre geçmesine rağmen, çok az sayıda araştırma merkezi bu sistemi kullanmaktadır. Bu durumun en önemli sebebi olarak, analiz için gerekli olan ekipmanların yüksek maliyeti gösterilmektedir. Günümüzde, sistemin sperm hareketlilik karakterleri ve dölleme kapasitesi arasındaki pozitif ilişkiyi daha objektif ve doğru bir şekilde ispatlanmıştır (Rurangwa et al.,2004). Bu sistemin uygulamaya aktif olarak geçirilmesinin, yapay yolla dölleme başarısını arttıracağı, erkek damızlık balıkların sperm kaliteleri arasındaki farklılığın daha belirgin bir şekilde ortaya konulacağı, sperm bankalarının yönetimi ve sperm sıvılarının uzun süreli muhafaza (Cryopreservation) yöntemlerinin daha sağlıklı bir şekilde uygulanacağı inancı her geçen gün artmaktadır. KAYNAKLAR Aas, G.H., Refstie, T., Gjerde, B., 1991, Evaluation of milt quality of Atlantic salmon. Aquaculture 95, Bekkevold, D., Hansen, M.M., Loeschcke, V., 2002, Male reproductive competition in spawning aggregations of cod (Gadus morhua, L.). Mol. Ecol. 11, Billard, R., 1978, Changes in structure and fertilizing ability of marine and freshwater fish spermatozoa diluted in media of various salinities. Aquaculture 14, Billard, R., 1983, Effects of coelomic and seminal fluids and various saline diluents on the fertilisability of spermatozoa in rainbow trout Salmo gairdneri. J. Reprod. Fertil. 68, Billard, R., Cosson, J., 1992, Some problems related to the assessment of sperm motility in freshwater fish. J. Exp. Zool. 261, Billard, R., Cosson, J., Crim, L.W., Suquet, M., 1995, Sperm physiology and quality. In: Bromage, N., Roberts, R. (Eds.), Broodstock Management and Egg and Larval Quality. Blackwell, Oxford, pp Boyer, S.P., Davis, R.O., Katz, D.F., 1989,Automated semen analysis. Current problems in obstetrics. Gynecol. Fertil. 12, Bromage, N.R., Roberts, R.J. (Eds.), 1995,Broodstock Management and Egg and Larval Quality. Blackwell Science Ltd., Oxford, 424 pp. Chowdhury, I., Joy, K.P., 2001, Seminal vesicle and testis secretions in Heteropneustes fossilis (Bloch): composition and effects on sperm motility and fertilisation. Aquaculture 193, Ciereszko, A., Dabrowski, K., 1993, Estimation of sperm concentration of rainbow trout, whitefish and yellow perch using spectrophotometric technique. Aquaculture 109, Ciereszko, A., Dabrowski, K., 1994, Relationship between biochemical constituents of fish semen and fertility. The effect of short term storage. Fish Physiol. Biochem. 12, Clearwater, S.J., Crim, L.W., 1998, Gonadotropin releasing hormone-analogue treatment increases sperm motility, seminal plasma ph and sperm 477

6 production in yellowtail flounder Pleuronectes ferrugineus. Fish Physiol. Biochem. 19, Cosson, M.P., Billard, R., Gatti, J.L., Christen, R., 1985, Rapid and qualitative assessment of trout sperm motility using stroboscopy. Aquaculture 46, Cosson, J., Linhart, O., Mims, S.D., Shelton, W.L., Rodina, M., 2000, Analysis of motility parameters from paddlefish and shovelnose sturgeon spermatozoa. J. Fish Biol. 56, Dreanno, C., Suquet, M., Quemener, L., Cosson, J., Fierville, F., Normant, Y., Billard, R., 1997, Cryopreservation of turbot (Scophthalmus maximus) spermatozoa. Theriogenology 48, Dreanno, C., Suquet, M., Desbruyeres, E., Cosson, J., Delliou, H., Billard, R., 1998, Effect of urine on semen quality in turbot (Psetta maxima). Aquaculture 169, Fauvel, C., Savoye, O., Dreanno, C., Cosson, J., Suquet, M., 1998, Characteristics of sperm of captive seabass (Dicentrarchus labrax L.) in relation to its fertilisation potential. J. Fish Biol. 54, Gage, M.J.G., Stockley, P., Parker, G.A., 1998, Sperm morphometry in the Atlantic salmon. J. Fish Biol. 53, Geffen, A.J., Evans, J.P., 2000,Sperm traits and fertilisation success of male and sex-reversed female rainbow trout (Oncorhynchus mykiss). Aquaculture 182, Guest, W.C., Avault, J.W., Roussel, J.D., 1976, Preservation of channel catfish sperm. Trans. Am. Fish. Soc. 3, Jobling, S., Coey, S., Whitmore, J.G, Kime, D.E., Van Look, K.J.W., McAllister, B.G., Beresford, N., Henshaw, A.C., Brighty, G., Tyler, C.R., Sumpter, J.P., 2002, Wild intersex roach (Rutilus rutilus) have reduced fertility. Biol. Reprod. 67, Kime, D.E., Van Look, K.J.W., McAllister, B.G., Huyskens, G., Rurangwa, E., Ollevier, F., 2001, Computerassisted sperm analysis (CASA) as a tool for monitoring sperm quality in fish. Comp. Biochem. Physiol. 130, Kjørsvik, E., Mangor-Jensen, A., Holmefjord, I., 1990, Egg quality in fishes. In: Blaxter, J.H.S., Southward, A.J. (Eds.), Adv. Mar. Biol., vol. 26, pp Lahnsteiner, F., Berger, B., Weismann, T., Patzner, R.A., 1996, Motility of spermatozoa of Alburnus alburnus (Cyprinidae) and its relationship to seminal plasma composition and sperm metabolism. Fish Physiol. Biochem. 15, Lahnsteiner, F., Berger, B., Weismanu, T., Patzner, R.A., 1998, Evaluation of the semen quality of the rainbow trout, Oncorhynchus mykiss, by sperm motility, seminal plasma parameters, and spermatozoal metabolism. Aquaculture 163, McMaster, M.E., Portt, C.B., Munkittrick, K.R., Dixon, D.G., 1992, Milt caracteristics, reproductive performance, and larval survival and development of white sucker exposed to bleached kraft mill effluent. Ecotoxicol. Environ. Saf. 23,

7 Mjolnerod, I.B., Fleming, I.A., Refseth, U.H., Hindar, K., 1998, Mate and sperm competition during multiplemale spawnings of Atlantic salmon. Can. J. Zool. 76, Rurangwa, E., Biegniewska, A., Slominska, E., Skorkowski, E.F., Ollevier, F., 2002, Effect of tributyltin on adenylate content and enzyme activities of teleost sperm: a biochemical approach to study the mechanisms of toxicant reduced spermatozoa motility. Comp. Biochem. Physiol. 131, Rurangwa, E., Kime, D.E., Ollevier, F., Nash, J.P., 2004, The measurement of sperm motility and factors affecting sperm quality in cultured fish. Aquaculture234,1-28. Saad, A., Billard, R., Theron, M.C., Hollebecq, M.G., 1988, Short-term preservation of carp (Cyprinus carpio) semen. Aquaculture 71, Sansone, G., Fabbrocini, A., Ieropoli, S., Langellotti, A.L., Occidente, M., Matassino, D., 2002, Effects of extender composition, cooling rate, and freezing on the motility of sea bass (Dicentrarchus labrax, L.) spermatozoa after thawing. Cryobiology 44, Suquet, M., Omnes, M.H., Normant, Y., Fauvel, C., 1992, Influence of photoperiod, frequency of stripping and presence of females on sperm output in turbot (Scophthalmus maximus). Aquac. Fish. Manage. 23, Truscott, B.R., Idler, D.R., 1969, An improved extender for freezing Atlantic salmon spermatozoa. J. Fish. Res. Board Can. 26, Viveiros, A.T.M., Jatzkowski, A., Komen, J., 2003, Effects of oxytocin on semen release response in African catfish (Clarias gariepinus). Theriogenology 59, Vladic, T.V., Afzelius, B.A., Bronnikov, G.E., 2002, Sperm quality as reflected through morphology in salmon alternative life histories. Biol. Reprod. 66,