AMPLIQUALITY HCV-TS REF 03-07R-20 (20 test) REF 03-07R-XX (5 test)

Transkript

1 KULLANIM TALİMATI AMPLIQUALITY HCV-TS REF 03-07R-20 (20 test) REF 03-07R-XX (5 test) Alel spesifik reverse hibridizasyon ile Hepatit C Virüs genotipleme sistemi

2

3 1. ÜRÜN BİLGİSİ 1.1. Kullanım amacı KİT İÇERİĞİ 4 3. REAKTİFLERİN SAKLANMASI VE STABİLİTESİ 5 4. KULLANIM İÇİN UYARILAR VE ÖNLEMLER 5 5. GÜVENLİK KURALLARI Genel güvenlik kuralları Kitle ilgili güvenlik kuralları 6. GEREKLİ AMA SAĞLANMAYAN MATERYALLER İsteğe bağlı materyaller 9 7. GİRİŞ TEST PRENSİBİ ÜRÜN TANIMI ÖRNEK BAŞLAMA: TİP VE SAKLAMA PROTOKOL Prosedürel notlar ve ön aşamalar Denatürasyon ve Hibridizasyon Denatürasyon Hibridizasyon Boyama Protokolü KALİTE DEĞERLENDİRME 13. SONUÇLARIN YORUMLANMASI 14. SORUN GİDERME CİHAZ PERFORMANSI Diagnostik özgüllük Diagnostik duyarlılık 22 1

4 15.3. Analitik Duyarlılık Tekrarlanabilirlik 16. CİHAZ SINIRLAMALARI 17. YOK ETME TEKNİK DESTEK REFERANSLAR VE SEMBOLLER STRİPLER ÜZERİNDE TESPİT İÇİN KISA PROTOKOL: HIZLI REHBER 27 2

5 1. ÜRÜN BİLGİSİ 1.1. Kullanım amacı AMPLIQUALITY HCV-TS kit reverse line blot ile Hepatit C Virüs (HCV) genotipler 1-6 nın tanımlanması için IVD dir. Çoğu durumda ek bilgi subtipler için mevcuttur. Bu test viral tarama veya onaylama için kullanılmak üzere değildir ve sadece zaten pozitif olarak tespit edilmiş örnekler için kullanılmalıdır. Bu kit 5 -UTR bölge amplikonlarla onaylanmıştır, şunlarla elde edilen: COBAS TaqMan HCV Test (Roche Moleküler Sistem tarafından üretilen), High Pure System ile kullanım için v2.0 içeren (Roche Moleküler Sistem) ve COBAS Ampliprep (Roche Moleküler Sistem). Bu kılavuz aşağıdaki ürünlere işaret eder: AMPLIQUALITY HCV-TS Reverse line blot ile HCV genotipleme için gerekli tüm reaktifleri içerir. Kod Ürün PKG 03-07R-20 AMPLIQUALITY HCV-TS 20 test 03-07R-XX AMPLIQUALITY HCV-TS 5 test 3

6 2. KİT İÇERİĞİ KUTU R + 2 C / + 8 C DE SAKLAYIN TANIM ETİKET TÜP VEYA KAPAK RENGİ 20 test 5 test Spesifik problarla naylon stripler HCV TS STRIP 2 x 10 5 Kullanıma hazır NaOH < %2 içeren Denatürasyon Solüsyonu Kullanıma hazır Hibridizasyon Solüsyonu Kullanıma hazır Konjugat Seyreltici solüsyon Streptavidin-Alkalin Fosfataz Konjugat Kullanıma hazır Durulama solüsyonu Substrat: suda çözünmek için tabletlerde NBT/BCIP Kullanıma hazır Stop Solüsyonu Sitrik asit <%0.5 içeren 8 tek kullanımlık inkübasyon kanallarının her biri ile hibridizasyon ve boyama tepsileri Strip okuma ve sonuçların yorumu için şeffaf film DEN Xi:tahriş edici R 36/37/38 S26 Beyaz 1 x 1 ml 1 x 1mL HYB-2 Kırmızı 1 x 25 ml 1 x 25 ml CON-D1 Sarı 1 x 50 ml 1 x 25 ml CON Sarı 1 x 15 L 1 x 15 µl RIN Yeşil 1 x 50 ml 1 x 50 ml NBT/BCIP Renkli şişe 4 tablet 1 tablet STOP Mavi 1 x 25 ml 1 x 25 ml Strip toplama levhası 2 1 ÇANTA 1 30 C / -20 C DE SAKLAYIN TANIM Hybridizasyon aktivasyon reaktifi ETİKET HYB ACT TÜP VEYA KAPAK RENGİ 20 test 5 test Menekşe rengi 1 x 70 ul 1 x 20 ul ÇANTA 2 30 C / -20 C DE SAKLAYIN TANIM Pozitif Kontrol, genotip HCV 2 nin5 UTR amplikonu ETİKET TÜP VEYA KAPAK RENGİ 20 test 5 test P-CTRL Mavi 1 x 50 ul 1 x 20 ul 4

7 3. REAKTİFLERİN SAKLANMASI VE STABİLİTESİ Kitin her bileşeni her ambalajın etiketinde belirtilen talimatlara göre saklanmalıdır. Özellikle: KUTU R ÇANTA 1 ve C/+ 8 C de saklayın 30 C/ 20 C de saklayın Önerilen sıcaklıkta saklandığında, ilk açıldıktan sonra tüm test reaktifleri etikette belirtilen son kullanma tarihlerine kadar stabildir. 4. KULLANIM İÇİN UYARILAR VE ÖNLEMLER Bu ürün sadece IN VITRO kullanım içindir ; Kiti tanı için uygulanan moleküler biyoloji tekniklerinde eğitimli ve yetişmiş nitelikli araştırmacılar tarafından kullanılmalıdır; Kit prosedürüne başlamadan önce, dikkatlice ve tamamen kullanım kılavuzunu okuyun; Ürünü ışık ve ısı kaynaklarından uzak tutun; Son kullanma tarihi geçmiş kitin herhangi bir kısmını kullanmayın; Saklama koşulları ya da kutu bütünlüğü hakkında herhangi bir şüphe veya soru durumunda, AB ANALITICA teknik destek ile irtibata geçin: laboratorio@abanalitica.it Intra-laboratuvar sıcaklık koşulları+ 15 C C arasında kalmalıdır ve bağıl nem tüm test prosedürü boyunca %80i geçmemelidir. Bu aralıklara uymayan sıcaklıklar ve nem geçersiz sonuçlara yol açabilir. Bu durumda test tekrarlanmalıdır; Her deneyde negatif ve pozitif kontrollerin olması önemlidir; Kiti kontamine DNA nın herhangi kaynağından uzakta saklayın, özellikle amplified nükleik asit; 5

8 Kişisel koruyucu giyim kullanın, tek kullanımlık eldivenler dahil, test prosedürü boyunca. Steril filtre uçlar kullanın ve her bir hacim dağıtılırken yeni bir uç kullanın. Ağızla pipetleme yapmayın; Reaktiflerin mikrobiyel kontaminasyonundan kaçının; Çalışma tezgahı yüzeyini 5% sodyum hipoklorit ile yıkayın. Steril tek kullanımlık laboratuvar materyalleri kullanın; Tepsileri veya diğer tek kullanımlık materyalleri yıkamayın veya tekrar kullanmayın; Tüm protokolün tüm aşamaları boyunca tepsiyi naylon film veya kapaklarla kapatmayın ; Çapraz-kontaminasyonu önlemek için, flakon ya da şişe kapaklarını birbirleri ile değiştirmeyin; Bir kitte sağlanan reaktifler tek bir birim olarak düşünülmelidir. Farklı lotlar veya kitlerden reaktifler kullanmayın veya karıştırmayın; Reaktif solüsyonları renksiz ve kokusuzdur; kit bileşenlerinin fiziksel görünümündeki değişiklikler instabilite veya bozulmaya işaret edebilir; Alanı farklı bölümlere ayırın: eksraksiyon, amplifikasyon ve tespit; aralarında cihazları ve sarfları paylaşmayın (pipetler, uçlar, tüpler, v.s); aşamalar arasında veya gerekirse daha sık eldivenleri değiştirin; laboratuvar giysisi ve eldivenler her alanda giyilmelidir ve alanı terk etmeden önce çıkartılmalıdır. İyi laboratuvar uygulamaları konusunda rehberlik için Onaylı Kılavuzlara ayrıca bakabilirsiniz, CLSI MM3-A2, bulaşıcı hastalıklar için Moleküler tanı Yöntemleri (CLSI, 2006). Tüm pipetleme aletleri ve cihazları dikkatle kullanın ve kalibrasyon ve kalite kontrol için üreticinin talimatlarını izleyin; NBT/BCIP direkt ışığa maruz kalmamalıdır çünkü kolayca degrade olur. Tabletler bir kez suda çözüldüğünde BCIP/NBT solüsyonu yoğun sarı renge sahip olmalıdır. Bir renk değişimi reaktif için instabilite veya bozulmaya işaret edebilir. 6

9 Gelişen kuru stripleri oda sıcaklığında ışıktan koruyarak saklayın. 5. GÜVENLİK KURALLARI 5.1. Genel güvenlik kuralları Reaktifleri ve klinik örnekleri kullanırken tek kullanımlık eldivenler giyin ve çalışmanın sonunda elleri yıkayın; Ağızla pipetleme yapmayın; Enfeksiyon maddelerinin yokluğunu garanti eden diagnostik yöntem olmadığından, her klinik örneği potansiyel olarak bulaşıcı kabul etmek ve öyle kullanmak iyi bir kuraldır; Klinik örneklerle direkt temas eden tüm cihazlar kontamine olmuş kabul edilmelidir ve öyle atılmalıdır. Örneklerin kazara dökülmesi durumunda %10 Sodyum Hipoklorit ile temizleyin. Temizlemek için kullanılan malzemeler kontamine ürünler için özel konteynerlerde atılmalıdır; Klinik örnekler, materyaller ve kontamine ürünler dekontaminasyon sonrası atılmalıdır: 5% Sodyum Hipoklorit solüsyonunda 30 dakika batırın. (her 10 hacim kontamine sıvı için %5 Sodyum Hipoklorit solüsyonundan 1 hacim) VEYA en az 2 saat 121 C de otoklav (NOT: Sodyum Hipoklorit içeren solüsyonları otoklavlamayın!!). 7

10 5.2. Kit ile ilgili güvenlik kuralları Bu kit casein ve Streptavidin-Alkalin Fosfataz Konjugat gibi hayvan kaynaklı reaktifler içerir. Bu kitten türetilen riskler tek bileşenler ile ilişkilidir. Tehlikeli bileşenler: DEN SOLÜSYONU: NaOH < 2% içerir Risk tanımı: Tehlike sembolü(leri): Xi R-ifade(ler): 36/38 S- ifade(ler): 26 Tahriş edici RISK CÜMLELERİ VE S CÜMLELERİ R 36/37/38 S 26 Gözler ve cilt için tahriş edici; Gözlerle temas halinde, hemen bol su ile durulayın ve tıbbi yardım alın Kitin malzeme güvenlik bilgi formu (MSDS) istek üzerine mevcuttur. 8

11 6. GEREKEN AMA SAĞLANMAYAN MATERYALLER Mikropipetler (aralık: µl; 2-20 µl; µl; µl) ve karşılık gelen filtre uçlar; Otomatik pipettor ve steril dereceli pipetler; Hibridizasyon banyosunda sıvılar için aspirasyon sistemi; Orbital çalkalayıcı; Thermoshaker veya su banyosu (Dubnoff) 50 C ± 0.5 C ulaşabilen ve kalabilen; önerilen çalkalama hızı: su banyosu için 80 rpm ve Thermoshaker için maksimum 250 rpm; Tek kullanımlık eldivenler; Reaktiflerin hazırlığı için Falcon -type tüpler; Distile veya deiyonize su, Cımbız; Kalibre termometre İsteğe bağlı materyaller Aspirasyon cihazı; Stripleri işleme aşamasının otomasyonu için ekipman. Daha fazla detay için AB ANALITICA teknik destek ile irtibata geçin: (laboratorio@abanalitica.it), fax ( ) veya telefon hattı (tel ). 9

12 7. GİRİŞ Hepatit C virüsü Flaviviridae ailesine aittir ve genomu yüksek derecede değişkenlik ile karakterizedir. Aslında altı ana HCV genotipi (Simmonds et al tarafından 1-6 genotipler olarak sınıflandırılan) phylogenetik ve genom sequence analiz ile tanımlanır. Tek HCV genotipleri nükleotid dizilerinin yaklaşık %30u için aralarında farklıdır (Simmonds et al, 2005). Her genotip farklı subtiplerden oluşur, küçük harflerle gösterilir. Aynı genotipe ait farklı HCV subtipleri nükleotid dizilerinin yaklaşık %20si için kensi aralarında farklıdır (Figür 1). Sonuçta, her HCV subtip tek hastada bulunan viral subtip içinde belli bir frekansla kendiliğinden oluşan rastgele mutasyonlar nedeniyle birçok farklı varyant veya quasitürlerinden oluşur. Figür 1: NS5B bölgesinin nükleotid dizisine dayanarak HCV genotipi ve subtip sınıflandırma, P. Simmonds tarafından. Viral genotipleme farmakolojik tedavi için özellikle önemlidir, tedavinin süresi ve dozlamasını belirttiği için. HCV genotiplerinin coğrafi dağılımında bariz bir farklılık vardır: belli genotipler dünya çapında dağılım gösterir, diğerleri sadece bazı coğrafi bölgelerde bulunurken (Mellor et al., 1995). HCV genotipi yaygın olarak İtalya da bulunur,1b genotipidir. Arupa da HCV genotip sıklığı ile ilgili tam veri yoktur ama büyük olasılıkla HCV ile enfekte hastaların üçte ikisi genotip 1 enfeksiyonu verir; kalan hastalar ağırlıklı olarak genotip 2 ve 3 verir. 10

13 Genotip dağılımı farklı hasta popülasyonlarında tek coğrafi bölge içinde ayrıca büyük ölçüde değişebilir: örneğin, 3a HCV genotipi gençler ve uyuşturucu bağımlıları arasında daha sıktır. 8. TEST PRENSİBİ AMPLIQUALITY HCV-TS kiti reverse hibridizasyon yöntemine dayanır, viral 5 -UTR bölgesinin biotin-etiketli amplikonu HCV genotip-spesifik oligonükleotid problar için hibridize olur, naylon bir strip üzerinde sabitlenir 9. ÜRÜN TANIMI AMPLIQUALITY HCV-TS kiti reverse hibridizasyon yöntemine dayanır, spesifik problar, naylon striplere tutturulan, amplified viral bölge (5 UTR) ile hibridize edilir. Strip üzerindeki her prob arasındaki uygunluk ve HCV genotipleri aşağıdaki şemada gösterilmiştir: PROB PROB N.1 Tanım Evrensel Dizi PROB N.2 Genotip 1 PROB N.3 Genotip 1 PROB N.4 PROB N.5 PROB N.6 Genotip 1 b Genotip 1 b Genotip 1 a PROB N.7 Genotip 2 PROB N.8 Genotip 2 PROB N.9 Genotip 2 PROB N.10 Genotip 3 PROB N.11 Genotip 3 PROB N.12 Genotip 4 PROB N.13 Genotip 4 PROB N.14 Genotip 5 PROB N.15 Genotip 6 11

14 Bu kit 5 UTR viral bölge amplikonu ile kullanılmalıdır, şunlarla elde edilen: COBAS TaqMan HCV Test (Roche Moleküler Sistem tarafından üretilen), High Pure Sistem ile kullanım için v2.0 dahil (Roche Moleküler Sistem) ve COBAS Ampliprep (Roche Moleküler Sistem). Bu kit COBAS TaqMan HCV Testten elde edilen biyotinli olmayan amplikonlar ile kullanılabilir, amplikon denatürasyon aşaması esnasında HYB ACT solüsyonunun kullanımı sayesinde. Bu strip boyama reaksiyonunun başarısını izleyen boyama kontrol bandı içerir. Çoğu durumda genotiple ilgili HCV pozitif örnek tanımlayan evrensel HCV probu ayrıca strip üzerinde mevcuttur. Genotip sonucunun okunması strip üzerine şeffaf film kaplayarak ve sayfa 20de yorumlama tablosunda belirtilen modellerle strip üzerinde bulunan bantların modeli kıyaslanarak yapılır. 12

15 10. BAŞLANGIÇ ÖRNEĞİ: TİP VE SAKLAMA Test için gerekli başlangıç örneği viral 5 UTR bölgesinin amplifikasyon ürünüdür, şununla elde edilen: COBAS TaqMan HCV Test Amplikonlar kullanılana kadar hemen 30 C / 20 C de saklanmalıdır, iyi bir genotipleme testi elde etmek için. 15 IU / ml altında viral yükleme ile örnekler üzerinde AMPLIQUALITY HCV- TS kullanımı önerilmez. Not! Cobas TaqMan HCV Test ile elde edilen amplikonlar hemen 30 C / 20 C de saklanmalı ve 4 ay içinde genotipleme testi için kullanılmalıdır. PCR ürünü için dondurma/çözdürme tekrarından kaçının. Not! Otomatik ekstraksiyon aşamasından türeyen TaqMan örnekleri tüpün altında siyah silica taneleri içerebilir. Silica artıkları hibridizasyon protokolüne müdahele edebileceği için tanelerin pipet ucuna temasından ve alınmasından kaçının. Bu nedenle, örneğin tam çözünmesinden sonra kısa bir santrifüj aşaması önerilir, genotipleme analizi için gereken aliquot alımından önce. 11. PROTOKOL Prosedürel notlar ve ön aşamalar Tüm reaktifleri ve stripleri kullanmadan önce yaklaşık 30 dakika oda sıcaklığına getirin; kullanımdan sonra; HYB ACT ve Pozitif Kontrol solüsyonlarını 20 C ye geri koyun; diğer tüm reaktifleri buzdolabına koyun; HYB ACT solüsyonu 8-10 dondurma/çözdürme döngüsü kabul edebilir. HYB ACT solüsyonu dondurma/çözdürme döngüsü için 10 döngüden sonra kitin performansı test edilmedi. Oda sıcaklığı 20 C - 25 C de olmalıdır; Banyoyu veya thermalshaker 50 Cde ısıtın ve tüm prosedür boyunca +/- 0.5 C hata ile verilen sıcaklığı korumasını sağlayın; Sıcaklık çok düşükse, test yanlış pozitif sonuçlar verebilir; sıcaklık çok yüksekse, çok zayıf sinyaller veya yanlış negatif sonuçlar 13

16 gözleyebilirsiniz. Kalibre termometre kullanın, çünkü sıkı sıcaklık kontrolü gereklidir; Su banyosundan tepsiye su sıçramasından kaçının. Su banyosundaki su seviyesini tepsi yüksekliğinin üçte biri ile yarısı arasında olacak şekilde ayarlayın; Tepsinin kaymasını önlemek için, gerekirse ağırlıklarla sabitleyin. HYB-2 Solüsyonu ve CON-D1 Solüsyonunu banyoda 50 C ± 0.5 C ye ön ısıtma yapın; Stripleri kullanmak için cımbız kullanın. Elinizdeki yağlar hibridizasyon ve renk gelişimine müdahele edebileceğinden ellerinizle striplere dokunmayın; TaqMan amplifikasyon örneği ve strip arasındaki çizginin korunması önemlidir. Strip üzerindeki marker çizgisinin üstüne yazmak için sadece kalem kullanın. 14

17 11.2. Denatürasyon ve Hibridizasyon Denatürasyon Su banyosu veya thermal shaker sıcaklığını 50 C ± 0.5 C ye stabilize edin. Banyoda HYB-2 Solüsyonunu ve CON-D1 Solüsyonunu 50 C ± 0.5 C ye ön ısıtma yapın. TaqMan Roche amplikon: Bu amplikon hibridizasyon aşamasına başlamadan önce denatüre edilmelidir. HYB-ACT solüsyonu amplikonun biyotinlenmesine izin vermek için eklenmelidir. Aşağıdaki tabloda belirtildiği gibi bir tüpte amplikon ve reaktifleri karıştırın: TaqMan Roche amplikonundan başlayarak genotipleme TaqMan Roche amplikon DEN Solüsyonu HYB ACT Solüsyonu 10 ul 20 ul 2.5 ul Her çalışmada bir HCV pozitif kontrol (P-CTRL, kitte dahil) ve bir negatif kontrol (bir negatif TaqMan örnek) dahil edin. Pozitif kontrol, kitte dahil, biyotinlenmiş değildir ve TaqMan Roche amplikon örnekleri için aynı prosedür izlenerek denatüre edilmelidir. P-CTRL 5 dondurma/çözdürme döngüsü kabul edebilir. 5 dondurma/çözdürme döngüsünden fazlası için P-CTRL performansı test edilmedi. 5 dakika oda sıcaklığında inkübe edin. Hibridizasyon aşamasında denatüre amplikonun tüm hacmini kullanın Hibridizasyon Stripleri cımbızlarla alın ve temiz bir yüzey üzerine yerleştirin. Kalemle onları konumlandırma çizgisi üstünde numaralandırın. Her zaman stripleri kullanırken eldiven giyin. Tepsiyi thermobath veya thermal shaker içine yerleştirin. Thermobath kullanılması halinde, su seviyesinin tepsinin yarı yüksekliğinde 15

18 olduğundan emin olun (thermobath suyu kesinlikle tepsinin içine girmemelidir). 1 ml önceden ısıtılmış HYB-2 Solüsyonunu her kullanılan kanala ekleyin ve cımbızlarla her birine bir strip yerleştirin. Bu stripler solüsyonda tamamen batmış olmalıdır ve tutturulan prob ile yanı (siyah çizginin varlığıyla tanımlanabilen) yukarı bakmalıdır. Stribin sıvı içine yerleştirilirken baş aşağı dönmesi halinde doğru oryantasyona koymak için cımbız kullanın. Her kanala denatüre amplikon ekleyin, yukarıda belirtildiği gibi; Hassas şekilde çalkalayarak 60 dk ± 2 dk 50 C ± 0.5 C de inkübe edin. Waterbath yaklaşık olarak 80 rpm de ve thermal shaker için max 250 rpm ayarlayın. Gerekirse tepsiyi sabitleyin. Her stribin tamamen batmış olarak kalmasını ve serbestçe hareket etmesini sağlayın Boyama Protokolü İnkübasyon bitmeden önce aşağıdaki gibi kısaca streptavidine-alcaline fosfataz konjugat (CON Solüsyonu) seyreltin: N örnek için karışım: - N x 0.5 μl CON Solüsyonu - N x 1 ml önceden ısıtılmış CON-D1 Solüsyonu Hibridizasyon sıvısını tamamen aspire edin, sonra 1 ml önceden ısıtılmış CON-D1 solüsyonu ekleyin; 2 dakika 50 C ± 0.5 C de tepsiyi thermal bath veya thermal shaker içine geri koyun, hafifçe çalkalayarak. Kanallardan sıvıyı tamamen aspire edin ve 1 ml streptavidine-alcaline fosfataz konjugat ekleyin, önceden ısıtılmış CON-D1 Solüsyonunda önceden seyreltilen; tekrar 15 dk ± 2 dk 50 C ± 0.5 C de inkübe edin, hafifçe çalkalayarak. Bu arada, aşağıda belirtildiği gibi Boyama Solüsyonunu hazırlayın: 10 ml distile su içinde 1 tablet NBT/BCIP çözün 16

19 Dikkat: Bir çözülmüş tablet NBT/BCIP den elde edilen boyama solüsyonunun miktarı 10 strip için yeterlidir! Elde edilen boyama solüsyonu karanlıkta saklanmalıdır. Taze solüsyon kullanılması tercih edilir, ama bu mümkün değilse tamamen karanlıkta en fazla 3 gün 30 C / 20 C de dondurucuda saklanabilir (tüpün aluminium folyo ile sarılması önerilir!). Donmuş solüsyon sadece bir kez dondurma/çözdürme döngüsü için tekrar kullanılabilir. Konjugat ile inkübasyonun sonunda tüm sıvıyı aspire edin ve 1 ml RIN Solüsyonu ekleyin. 2 dakika için çalkalama altında oda sıcaklığında tepsiyi yerleştirin. Sıvıyı tamamen aspire edin ve 2 dakika için çalkalama altında oda sıcaklığında 1 ml RIN Solüsyon ile tekrar yıkayın. Tepsiyi boşaltın ve önceden hazırlanan 1 ml Boyama Solüsyonu ekleyin. Oda sıcaklığında çalkalama altında karanlıkta dakika inkübe edin. İnkübasyon süresi çevresel koşullara (ör.laboratuvar sıcaklığı) ve örneğin viral yüklemesine bağlı olarak değişebilir. Uzun süren inkübasyon süresi arka plan boyamasında artışa sebep olabilir, sonuçların yorumlanmasına müdahele edebilir. Tepsiyi boşaltın ve 2 dakika 1 ml STOP Solüsyonu ile yıkayarak boyama reaksiyonunu durdurun. Sıvıyı aspire edin ve 2 dakika distile su ile yıkayın. Cımbızlarla tepsiden stripleri çıkartın ve iki parça kağıt havlu arasında kurumalarına izin verin. Sonuçları okumadan önce tamamen stripleri kurutun. Gelişmiş ve kurumuş stripleri ışıktan koruyarak saklayın. 17

20 12. KALİTE DEĞERLENDİRME Stripleri bir veri raporlama levhası veya eşdeğerine tutturun. Her stribi şeffaf film ile kaplayın (kit içinde dahil), ve strip üzerinde mevcut olan bir film üzerinde Boyama Kontrolü hizalayın. Boyama kontrol bandı, şeffaf film hizalaması için bir referans olmanın yanı sıra, strip doğru işlendiğinde her zaman pozitiftir. Özellikle konjugat bağlarının ve substrat reaksiyonunun etkinliğini onaylar. Bu çizginin yoğunluğu aynı test çalışmasındaki her strip üzerinde benzer olmalıdır. Özellikle boyama kontrol bandının varlığı konjugat bağlanmasını ve onun substrat ile reaksiyonunun etkinliğini onaylar. Strip üzerinde gri/kahverengi bir bant göründüğünde bant pozitif düşünülür, renk gelişimi prosedürünün sonunda. Strip üzerindeki bantlar arasındaki renk yoğunlukları bir banttan diğerine farklı olabilir. Sonuçların yorumlamasına başlamadan önce, çalışmada bulunan pozitif ve negatif kontrol sonuçlarını kontrol edin. 1. Negatif kontrol (TaqMan negatif örnek) sadece Boyama Kontrol bandına sahip olmalıdır. Strip üzerinde başka herhangi bir bant için belirgin sinyal olmamalıdır. 2. Pozitif kontrol (P-CTRL), genotip 2 ile ilişkili, aşağıdaki bantlarda pozitif sonuçlar vermelidir: Boyama Kontrol bandı, bant 1, bant 7, 8, 9,13. Eğer kontrol o kontrol için belirtilenden başka bir model verirse, çalışma geçersizdir ve tekrarlanmalıdır. 18

21 13. SONUÇLARIN YORUMLANMASI Her stribi şeffaf film ile kaplayın (kit içinde dahil), ve strip üzerinde mevcut olan bir film üzerinde Boyama Kontrolü hizalayın. Stripte elde edilen bant modelleriyle yorumlama tablosunda (Tablo 1) belirtilenleri kıyaslayın. Boyama kontrol bandının varlığı konjugat bağlanmasını ve onun substrat ile reaksiyonunun etkinliğini onaylar. Evrensel HCV Sequence varlığı HCV 5 UTR amplikonun varlığını belirtir. Yine de bu prob belli yorumlama modellerinde olmayabilir. Yorumlama tablosunda raporlanan her bant modeli tablonun alt satırında bulunan alfanumerik kod ile belirtirtilir (ör. p1, p2,.. p23, v.s). Bu kodun tek amacı aynı genotipe ait olan farklı bant modelleri arasında ayrım yapmayı kolaylaştırmaktır ve kendi genotiplemesi ile ilgili herhangi bir yolla değil. Sonuçlanan bant modelinin yorumlama tablosunda olmaması halinde, sonuç yorumlanamaz. Başka genotipleme yöntemi (sequencing) örnek genotipleme için gerekebilir. Bu durumda AB ANALITICA teknik servis ile irtibat kurmanızı öneririz: (laboratorio@abanalitica.it), fax ( ) veya telefon hattı (tel ). NOT: Bant modeli p13, genotip 1a/1b ile ilgili, hem 1a hem 1b genotiplerinde bulunan 5 UTR sequence tanımlar. Bu nedenle the viral subtyping bu model için mümkün değildir. Bant modeli p15, genotip 1 ile ilgili, vakaların %80ninde 1a genotipde ve kalanların %20sinde 1b genotipde oluşan 5 UTR sequence tanımlar. Bu nedenle bu gibi bir model örnek subtyping için gerekli anahtar bilgiyi vermez. 19

22 Tablo 1: Olası genotipleme modelleri yorumlama tablosu. HCV-TS Interpretation Chart GENOTYPE 2 GENOTYPE 3 GENOTYPE 4 5 GENOTYPE 6 1a 1b 1a/1b 1 2a/2c 2b 2 3a 3 4a 4 5a 6a o 6b 6 1 x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x 1 2 x x x x x x x x x x x x x x x x 2 3 x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x 3 4 x x x x x x x x x x x x x x x x x x 4 5 x x x x x x x x x x x 5 6 x x x x x x x x x x x x x 6 7 x x x x x x x x x x x x x x x 7 8 x x x x x x 8 9 x x x x x x 9 10 x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x 15 p1 p2 p3 p4 p5 p6 p7 p8 p9 p10 p11 p12 p13 p14 p15 p17 p18 p19 p20 p21 p22 p23 p24 p25 p26 p27 p28 p29 p30 p31 p32 p33 p34 p35 p36 p37 p38 p39 p40 p41 p42 p43 p44 p45 p46 p47 p48 p49 p50 p51 p52 p53 p54 p55 p56 p57 p58 n. probe GENOTYPE 1 n. probe 20

23 14. SORUN GİDERME 1. Zayif veya bant yok, ayrıca striplerin tümünde boyama kontrol bandı için Çok az veya hiç konjugat veya substrat kullanıldı. Substrat uygun değil, çok fazla dondurma/çözdürme döngüsünden dolayı. 2. Heterojen Boyama Stripler farklı inkübasyon aşamaları esnasında tamamen daldırılmış değildi. Tepsi hibridizasyon esnasında yeterince çalkalanmadı. 3. Boyama kontrol bandı hariç bant yok Agaroz jel elektroforez ile reverse hibridizasyon öncesi örneğin HCV pozitivitesini kontrol edin; Eğer örnek agaroz jel elektroforezde pozitif çıkarsa, başka genotipleme yöntemi (sequencing) gereklidir. Bu durumda AB ANALITICA teknik servis ile irtibat kurmanızı öneririz: fax (+39) , veya tel. (+39) ). 4. Beklenmeyen sonuçlar Genotipleme çalışmasının stribin anormal boyamasını vermesi halinde (ör. sert arka plan, generic özgüllük olmayan, v.s), aşağıdaki durumların bazısı meydana gelmiş olabilir: Yanlış inkübasyon sıcaklığı. HYB-2 ve/veya CON-D1 Solüsyonu uygun ön ısıtma olmadı. İlk yıkama aşamaları esnasında ıslatmalardan dolayı bitişik kanalların kontaminasyonu. Amplified DNA miktarı ve spesifik reaksiyon koşullarına bağlı olarak bir bandın hızlı ve yoğun gelişimi oluşabilir. Bu durumda çaprazhibridizasyon bantlarının gelişimini önlemek için hemen substrat inkübasyonunu kesin. Herhangi bir sorun veya soru için, AB ANALITICA teknik servis ile irtibat kurun: fax (+39) , veya tel. (+39) ). 21

24 15. CİHAZ PERFORMANSI AMPLIQUALITY HCV-TS kitinin performans özelliklerini tanımlamak için kullanılan çoğu örnek HCV-pozitif bireylerden İtalya da toplandı. Bu örneklerin pozitifliği COBAS TaqMan HCV kit testle amplifikasyon ile onaylandı; elde edilen PCR ürünü AMPLIQUALITY HCV-TS ile genotipleme için kullanıldı. Sonuçlar NS5b bölgesinin dizilemesinde elde edilen sonuçlarla kıyaslandı. Genotip HCV 1 (subtypes a ve b), HCV 2, 3, 4,5 ve 6 nın pozitif örnekleri Common Technical Specification göre test edildi, 27 Kasım 2009 tarihli 2009/886/EC. Her genotipin her subtipi test edilmedi Diagnostik özgüllük UTR amplikonları, HCV negatif RNA örneklerinden COBAS TaqMan HCV Test ile elde edilen, AMPLIQUALITY HCV-TS kit ile analiz edildi. HCV genotipleme bantlarının yokluğu negatif örneklerden elde edilen tüm amplikonlarda onaylandı. Sonuçlar Diagnostik özgüllük değerinin %100 olarak belirlenmesine izin verdi Diagnostik duyarlılık AMPLIQUALITY HCV-TS kitinin test edilen örnekler için genotiplemeyi doğru olarak belirleme yeteneği, COBAS TaqMan HCV Test ile amplifiye edilmiş 212 HCV RNA pozitif örnek üzerinde değerlendirildi. Örnekler HCV genotipleri 1-6 nın temsilcisi olarak seçildi ve Common Technical Specification göre, 27 Kasım 2009 tarihli 2009/886/EC, viral yüklemeleri 15 to 6 x 10 7 IU / ml den dağıtıldı. Elde edilen genotipleme sonuçları viral NS5b bölgesinin dizilemesi ile aynı örnekler üzerinde elde edilenler ile kıyaslandı. Analiz genotip seviyesinde ve ayrı ayrı genotip 1in subtip a ve b sini düşünen subtip seviyesinde yürütüldü. 212 stribin tümü yorumlanabilir ve referans yöntemi ile genotip bakımından tutarlı idi (212/212). Bu nedenle DIAGNOSTIK DUYARLILIK genotip seviyesinde %100 elde edildi. DIAGNOSTIK DUYARLILIK 1 a ve 1 b genotipleme için subtip seviyesinde %95,7 elde edildi. 22

25 15.3. Analitik duyarlılık Duyarlılık sınırını belirlemek için bir referans HCV-RNA hazırlama kullanıldı (PEI Refarans Hazırlama HCV-RNA) dört farklı nicel NAT testi kullanılarak WHO Uluslararası Standart HCV-RNA karşı kalibre edildi. Niceliksel referans standartın seri dilüsyonları, IU/ml viral genom aralığında, analitik duyarlılığı belirlemek için 2 ayrı analizde test edildi. Ekstraksiyon ve amplifikasyon sonrası amplikonlar sekiz tekrarda stripler üzerinde analiz edildi. Probit analizi ile hesaplandığı gibi AMPLIQUALITY HCV-TS kitinin analitik duyarlılık sınırı 1240 UI/ml viral genomdur Tekrarlanabilirlik Cihaz AMPLIQUALITY HCV-TS tekrarlanabilirliği COBAS TaqMan HCV Test ile birlikte belirlendi. HCV RNA pozitif örnekler COBAS TaqMan system ile üç bağımsız aşamada amplifiye edildi. Genotiplemenin üç aşaması AMPLIQUALITY HCV-TS kitlerinin üç farklı lotu ile her amplifikat kullanılarak yapıldı (üç tekrarda), inter-assay ve intra-assay değişkenliğini doğrulamak için. Lotlar arasında, aynı örneğin tekrarında veya genotiplerde gözlenen veride farklılık yoktur. 16. CİHAZ SINIRLAMALARI Bu genotipleme testi sadece probların seçildiği genic bölgenin sınırları içinde çalışır. Bu nedenle bu bölgenin dizilemesi belirsiz durumlarda analizi tamamlayabilir. Nükleik asit hibridizasyonuna dayalı herhangi bir tespit sistemi ile olduğu gibi, beklenmeyen sonuçların oluşması muhtemeldir, probların dizayn edildiği bölgede düşen genic dizilemedeki mutasyonların varlığı ve bunun için testin gelişmemesi sebebiyle. Bu kitin kullanımı moleküler biyoloji tekniklerinde iyi bilgiye sahip kalifiye personel ile sınırlıdır. AMPLIQUALITY HCV-TS kiti COBAS TaqMan HCV Test ve High Pure System ile kullanım için COBAS TaqMan HCV Test v2.0 ve COBAS Ampliprep ile elde edilen 5'UTR PCR ürününden genotipleme için dizayn edilir. 23

26 Performans özellikleri başka HCV amplifikasyon kiti kullanılarak tanımlanmadı. Nadir durumlarda COBAS TaqMan HCV PCR ürününde inhibitörlerin potansiyel varlığı sebebiyle inhibisyon fenomeni gözlendi. Başarılı örnek genotiplemesi için, örneğin amplifikasyonunun tekrarlanması gerekliydi. Bant modeli p13, genotip 1a/1b ile ilgili, hem 1a hem 1b genotiplerinde bulunan 5 UTR sequence tanımlar. Bu nedenle the viral subtyping bu model için mümkün değildir. Bant modeli p15, genotip 1 ile ilgili, vakaların %80ninde 1a genotipde ve kalanların %20sinde 1b genotipde oluşan 5 UTR sequence tanımlar. Bu nedenle bu gibi bir model örnek subtyping için gerekli anahtar bilgiyi vermez. Nadir durumlarda yorumlanamayan modeller görünebilir. Bu HCV genomunun dizi heterojenliği, karıştırılmış enfeksiyonlar veya çapraz kontaminasyonlar, rekombinant HCV izolatları nedeniyle olabilir (Kalinina O. et al., 2002). 17. YOK ETME Tehlikeli veya biyolojik olarak kontamine mateyalleri kurumunuzun uygulamalarına göre yok edin. Güvenli ve kabul edilebilir bir şekilde ve uygun laboratuvar uygulamaları ve yerel çevresel düzenlemelere uygun olarak tüm materyalleri atın. 18. TEKNİK DESTEK Müşteri desteği için, lütfen AB ANALITICA teknik servisle irtibata geçin: laboratorio@abanalitica.it, fax (+39) , veya tel. (+39) ). 24

27 19. REFERANSLAR VE SEMBOLLER Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI, formerly NCCLS) Molecular Diagnostics Methods for Infectious Diseases: Approved Guideline- Second Edition (MM3-A2).2006; 26 (8). Kalinina O., Norder H, Mukomolov S. and Magnius LO. A Natural intergenotypic recombinant of hepatitis C virus identified in St. Petersburg. J. Virol : Mellor J, Holmes E. C., Jarvis L. M., Yap P. L., Simmonds P. and The International HCV Collaborative Study group, Jornal of General virology, 76, , Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA and Arnheim N, Science 230, , 1985 Simmonds P, Bukh J., combet C., Deléage G., Enomoto N., Feinstone S., Halfon P., Inchauspè G., Kuiken C., Maertens G., Mizokami M., Murphy D. G., Okamoto H, Powlotsky JM, Penin F, Sablon E, Stuyver LJ, Thiel HJ, Weinwe AJ, Widell A, Hepathology 42, ,

28 SEMBOLLER Sembol 0123 Tanım onaylanmış kuruluşun tanımlama numarası ile CE İşareti Kullanım talimatına başvurun Dikkat, beraberindeki belgelere başvurun Güneş ışığından uzak tutun Sıcaklık sınırlamaları Son kullanma tarihi Üretici Grup kodu Katalog numarası In vitro diagnostik medikal cihaz 20 test için yeterli içerir Xi: Tahriş edici 26

29 20. STRIPLER ÜZERİNDE TESPİT İÇİN KISA PROTOKOL:HIZLI REHBER AŞAMA 1) Amplikon denatürasyonu 2) Hibridizasyon 3) Sıkı Yıkama 4) Streptavidine-AP Konjugat inkübasyonu GEREKLİ REAKTİFLER 10 µl TaqMan amplikon µl HYB ACT + 20 µl DEN HYB-2 (50 C ye önceden ısıtılmış) + denatüre amplikonlar CON-D1 ( 50 C ye önceden ısıtılmış) CON seyreltilmiş (0.5 µl CON + 1 ml CON-D1 50 C ye önceden ısıtılmış) 5) Durulama RIN 6) Durulama RIN 7) Boyama reaksiyonu 8) Boyama reaksiyonunun durdurulması BOYAMA (10 ml H2O distillate içinde 1 tablet NBT/BCIP çözün) STOP 9) Son durulama Distile su INKUBASYON KOŞULLARI INKUBASYON SÜRESİ (DAKİKA) Oda sıcaklığı 5 50 C çalkalama ile 50 C çalkalama ile 50 C çalkalama ile Oda sıcaklığı çalkalama ile Oda sıcaklığı çalkalama ile Oda sıcaklığı çalkalama ile KARANLIKTA Oda sıcaklığı çalkalama ile Oda sıcaklığı çalkalama ile Bu kısa protokol özeti tam değildir. Tam talimatlar için, dikkatlice bölüm 11 okuyun (sayfa 13-17).

30 28

31

32 AB ANALITICA srl Via Svizzera PADOVA, (ITALY) Tel Fax info@abanalitica.it