INNO-LiPA HLA DQA1. ANAHTAR-KODU: FRI INNO-LiPA HLA-DQA v p 1/12 Türkçe. "Vurgulanan Not değişiklikleri"

Transkript

1 INNO-LiPA HLA DQA1 ANAHTAR-KODU: FRI INNO-LiPA HLA-DQA v p 1/12 Türkçe Tarafından üretildi: Fujirebio Europe N.V. Technologiepark Gent Belgium Tel BTW BE RPR Gent Tarafından dağıtılan: Fujirebio Europe N.V. Tel Fax customer.support@fujirebio-europe.com Fujirebio Germany GmbH Tel Fax germany@fujirebio-europe.com Fujirebio France SARL Tel Fax france@fujirebio-europe.com Fujirebio Italia S.r.l. Tel Fax italy@fujirebio-europe.com Fujirebio Iberia S.L. Tel Fax spain@fujirebio-europe.com "Vurgulanan Not değişiklikleri" Diğer Dillere bakınız / Autres langues voir / Andere Sprachen siehe / Altre lingue vedere / Ver otros idiomas / Outras línguas ver: AVRUPA GR IS LT RO SK TR LI MT EE non-europe US CA AR, BR, CO, UY, AU, NZ, RU :00 17:00 GMT+1 M T W T F S S Fujirebio Europe N.V

2 80703 INNO-LiPA HLA-DQA1 / v1 / ANAHTAR KODU: FRI75959 p 2/12 İÇİNDEKİLER Kullanılan Semboller... 2 Kullanım amacı... 3 Test prensibi... 3 Reaktifler... 3 Açıklama, kullanım için hazırlanması ve önerilen depolama koşulları... 3 Gerekli ama sağlanmayan malzemeler... 5 Güvenlik ve Çevre Koşulları... 5 Örnekler... 7 Manipülasyon prosedürleri... 7 Strip kullanımı... 7 Manuel inkübasyon için talimatlar... 7 Oluklarının içindeki sıvının manuel değişimi için talimatlar... 8 Uyarılar ve önlemler... 8 Manual test prosedür... 8 Denatürasyon ve hibridizasyon... 9 Sıkı yıkama... 9 Renk gelişimi... 9 Otomatik test prosedürü: Sonuçlar Okuma Doğrulama Sonuçların Yorumlanması Yorumlama yazılımı: LiRAS Prosedür sınırlamaları Test performans Test duyarlılığı Doğruluk Çözünürlük (tipleme tablosu v.1.0/ ) Numune reaktivitesi Kesinlik Ticari markalar Kullanılan Semboller Üretici In Vitro Diagnostic Medikal Cihaz Parti kodu Katalog numarası Tarafından Kullanılan Kullanım Talimatlarına başvurun Sıcaklık sınırlaması <n> testleri için yeterli içerir Konjugat 100x Konjugat Diluent Denatürasyon Çözeltisi

3 80703 INNO-LiPA HLA-DQA1 / v1 / ANAHTAR KODU: FRI75959 p 3/12 Hibridizasyon Çözeltisi Durulama Çözeltisi 5x Sıkı Yıkama Çözeltisi Stripler Substrat BCIP/NBT 100x Substrat Tampon Tehlike Uyarı: Kullanım amacı INNO-LiPA HLA-DQA1 insan lökosit antijeni (HLA) DQA1 alellerinin yüksek çözünürlükte moleküler tiplemesi için tasarlanmış, in vitro kullanım için çizgi prob testidir. Test prensibi INNO-LiPA HLA tipleme testi, ters hibridizasyon temeline dayanmaktadır. Amplifiye biotinlenmiş DNA materyali kimyasal olarak denatüre edilir ve ayrılan iplikler, membran temelli stripler üzerine paralel şekilde sabitlenmiş spesifik oligonükleotidler ile hibridize olur. Bu işlemi, yanlış eşleşmiş amplifiye materyalleri uzaklaştırmak için yapılan sıkı yıkama basamağı izler. Sıkı yıkamadan sonra alkalin fostatazlı streptavidin konjugat eklenir ve önceden şekillenmiş herhangi bir biotinlenmiş hibrite bağlanır. Kromojen içeren substrat çözeltisi ile inkübasyon mor/kahve rengi çökelti ile sonuçlanır. Reaksiyon yıkama basamağı ile durdurulur ve probların reaktivite örüntüsü kaydedilir. INNO-LiPA HLA-DQA1 ile bir amplifikasyon kiti (INNO-LiPA HLA-DQA1 Multiplex) biyotinli amplifiye materyalin standardize edilmiş hazırlığı için mevcuttur. Amplifikasyon kiti polimeraz zincir reaksiyonuna (PCR) dayanmaktadır.bu amplifikasyon kiti polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) temeline dayanmaktadır. Amplifikasyon ürünleri sonradan 35 sekans-spesifik probe çizgisi ve 3 kontrol çizgisi bulunan 1 tipleme stribi kullanılarak hibridize edilir (Şekil 1). INNO-LiPA HLA-DQA1: dahil olan basamaklar Basamak 1 HLA-DQA1 lokusunun ekzon 1,2 ve 3 nün multiplex amplifikasyonu Basamak 2 INNO-LiPA HLA-DQA1 stribinde hareketsiz 35 probla hibridizasyon ve sıkı yıkama (56 C). Basamak 3 Renk gelişimi. Basamak 4 Prob reaktivite örüntüsünün yorumlanması. INNO-LiPA HLA-DQA1 allelik seviyede ters hibridizasyon test formatı kullanılarak mümkün olan en iyi çözümü vermek için tasarlanır (standart HLA terminolojisi izlendiğinde allel isminde yıldız işaretinden sonraki ilk dört basamaktır, ör. HLA- DQA1*0101). Reaktifler Açıklama, kullanım için hazırlanması ve önerilen depolama koşulları C de tutulursa, açılmış ve açılmamış, ve orijinal şişelerde saklanan, kaplı test stripleri dahil reaktifler kitin son kullanma tarihine kadar stabildir. Reaktifleri dondurmayın. Son kullanma tarihinden sonra reaktifleri kullanmayın.

4 80703 INNO-LiPA HLA-DQA1 / v1 / ANAHTAR KODU: FRI75959 p 4/12 - Tüm reaktifler ve test striplerini içeren plastik tüpler kullanımdan yaklaşık 60 dakika önce oda sıcaklığına (20-25 C) getirilmiş olmalı ve kullanımdan hemen sonra buzdolabına kaldırılmalıdır. - Kit bileşenlerinin fiziksel görünümündeki değişiklikler kararsızlık veya bozulma belirtisi olabilir. - - Bu kit kontamine DNA nın herhangi kaynağından, özellikle amplifiye DNA ürünlerinden ayrı saklanmalıdır. - - Striplerin kullanımdan önce kıvrılmasını önlenmesi için plastik tüplerin yatay olarak saklanması önerilir. Verilen Reaktifler: Bileşen Miktar Ref. Açıklama Stripler 1x Yeşil markır çizgisiyle işaretli INNO-LiPA HLA-DQA1 için 20 strip içerir. Denatürasyon Çözeltisi Hibridizasyon Çözeltisi Sıkı Yıkama Çözeltisi 1x 1 ml 1x 80 ml 1x 200 ml EDTA içeren alkalin çözeltisi. Kullanıldıktan sonra şişe kapağı derhal kapatılmalıdır, çözeltinin havaya uzun süre maruz kalması denatürasyon gücünde hızlı bir gerilemeye sebep olur % sodyum dodecyl sulfat (SDS) içeren Salin sodyum fosfat EDTA (SSPE) buffer. Hibridizasyon Çözeltisi önceden en az 37 C ye ısıtılmalıdır ve sıcaklık 56 C yi aşmamalıdır (kullanımdan önce bütün kristaller çözünmüş olmalıdır) % 0.1 SDS içeren SSPE tamponu. Sıkı Yıkama Çözeltisi önceden en az 37 C ye ısıtılmalıdır ve sıcaklık 56 C yi aşmamalıdır (kullanımdan önce bütün kristaller çözünmüş olmalıdır). Konjugat Diluent 1x 80 ml NaCl, Triton, protein stabilizatörleri ve koruyucu olarak 0.01% MIT/<0.1% CAA içeren fosfat buffer. Konjugat 100x 1x 0.8 ml Kullanımdan önce Konjugat Seyreltici içinde 1/100 seyreltilecek, protein stabilizatörleri ve koruyucular içeren tampon içerisinde alkalin fosfataz ile etiketli streptavidin. Her test oluğu için 2 ml Konjugat çalışma solüsyonu hazırlayın + 2 ml fazladan (Konjugat çalışma solüsyonu sıkı yıkama esnasında hazırlanabillir) manuel test için. Auto-LiPA için 10 ml fazla hazırlayın. Konjugat çalışma solüsyonu karanlıkta saklanırsa oda sıcaklığında (20-25 C) 24 saat stabildir. Substrat Tampon 1x 180 ml NaCl, MgCl 2 ve koruyucu olarak 0.01% MIT/< 0.1% CAA içeren Tris-tamponu. Substrat BCIP/NBT100x 1x 0.8 ml Kullanımdan önce Substrat buffer içinde 1/100 seyreltilecek, dimethylformamide (DMF) içinde 5-Bromo-4- chloro-3-indolyl phosphate p-toluidine salt (BCIP) ve nitroblue tetrazolium (NBT). Manuel test için her test oluğu için 2 ml Substrat çalışma çözeltisi hazırlayın + 2 ml fazladan (substrat çalışma çözeltisi konjugat inkübasyonu sırasında hazırlanabilir). AutoLiPA için 10 ml fazla hazırlayın. Substrat çalışma solüsyonu oda sıcaklığında (20-25 C) karanlıkta korunduğu sürece 24 saat kararlıdır.

5 80703 INNO-LiPA HLA-DQA1 / v1 / ANAHTAR KODU: FRI75959 p 5/12 Bileşen Miktar Ref. Açıklama Durulama Çözeltisi 5x 1x 80 ml Kullanmadan önce distile veya deiyonize suda 1/5 oranında seyreltilecek (1 kısım + 4 kısım), NaCl, Triton ve koruyucu olarak 0.05% MIT / 0.48% CAA içeren fosfat tamponu. Her test oluğu için 8 ml Durulama çalışma solüsyonu hazırlayın + 10 ml fazladan manuel test için. Auto LiPA için, test oluğu başına 12 ml Durulama Çalışma Solüsyonu hazırlayın +20 ml fazladan. Durulama çalışma solüsyonu 2-8 C de 2 hafta stabildir. İnkubasyon tepsisi 3 - Her biri sekiz küvet içerir. Okuma kartı 1 - Pozitif probların tanımlanması için. Veri raporlama sayfası 2 - Kullanılan striplerin saklanması için. Gerekli ama sağlanmayan malzemeler - INNO-LiPA HLA-DQA1 Multiplex. - - Çalkalayıcı platformlu su banyosu (80 rpm; eğimli kapaklı; sıcaklığı 56 C ± 0.5 C de ayarlanabilen). - Aspirasyon aparatları. - Kalibre edilmiş termometre. - Orbital, karşılıklı veya sallanan platform çalkalayıcı. Öneriler Orbital çalkalayıcı için: dairesel hareket çapı 13 mm 'ye eşit ya da daha üstün olmalıdır 13 mm dairesel hareket için önerilen hız 160 rpm Karşılıklı çalkalayıcı için: İleri geri hareket için önerilen hız dakikada 80 harekettir. Sallanan bir platform çalkalayıcı için: sallama açısı sıvı dökülmesini korumak için 13 'yi geçmemelidir Önerilen hız 50 rpm. - Vorteks mikser veya eşdeğer. - Dereceli silindirler (10, 25, 50, ve 100 ml). - Distile veya deionize su. - Tek kullanımlık eldiven. - Tek kullanımlık steril pipet uçları (tercihen pamuk filtreli). - Strip işleme için forsepsler µl, µl, ve µl dağıtmak için ayarlanabilir pipetler. - Dağıtım Multipipet (Eppendorf, isteğe bağlı). - Zamanlayıcı, 2 saat (± 1 dakika). Güvenlik ve Çevre Koşulları Lütfen Material Safety Data Sheet (SDS) ve potansiyel tehlikeli komponentler içeren işaretli ürün bilgilerini inceleyiniz. En son güncellenen SDS versiyonu almaktadır. Tehlike Sodyum hidroksit içerir H314-P260-P280-P303+P361+P353-P305+P351+P338-P310-P363

6 80703 INNO-LiPA HLA-DQA1 / v1 / ANAHTAR KODU: FRI75959 p 6/12 Uyarı. Tehlike Tehlike Açıklamaları H312 H314 H317 H319 H332 H360D Önlem ifadeleri: P201 P260 P261 P280 2-Chloroacetamide içerir H317-P280-P261-P362+P364-P333+P313-P302+P352 N,N-Dimethylformamide, 5,5'-diphenyl-3,3'-bis (4-nitrophenyl)-2,2'-(3,3'-dimethoxybiphenyl-4,4'-ylene)ditetrazolium dichloride ve metanol içerir H312-H332-H319-H360D P261-P280-P201-P303+P361+P353-P305+P351+P338-P308+P313 Cilt ile temasta zararlı. Ciddi derecede deri yanıkları ve göz hasarına neden olur. Allerjik deri reaksiyonuna neden olabilir. Ciddi derecede göz tahrişine neden olur. Solunması halinde zararlıdır. Fetüsa zarar verebilir. Kullanmadan önce özel talimatlar elde ediniz. Duman/buhar/sprey solumayın. Duman/buhar/sprey solunmaktan kaçının. Koruyucu eldiven/koruyucu giysi/göz koruyucu/yüz koruyucusu kullanın. P303+P361+P353 Cilt temasında(veya saç): Derhal tüm bulaşmış olan kıyafetleri çıkarın. Su/duş ile cildi durulayın. P305+P351+P338 GÖZ TEMASINDA: Dikkatlice bir kaç dakika sudan geçiriniz. Mevcut ve kolaysa kontakt lensleri çıkarın. Yıkamaya devam edin. P308+P313 Maruz kaldığınızda veya endişenlendiğinizde: Tıbbi yardım/destek alın. P310 Hemen bir ZEHİR MERKEZİ/doktor/... başvurun. P333+P313 Ciltte tahriş veya kızarıklık meydana gelirse: Tıbbi yardım/destek alın. P302+P352 Cilt temasında: Bol su ve sabun ile yıkayın. P362+P364 Kirlenen giysileri çıkartın ve tekrar kullanmadan önce yıkayın. P363 Tekrar kullanmadan önce kontamine olmuş giysileri yıkayın. - Sadece yeterince eğitimli personel test prosedürünü yapmak için izinli olmalıdır. - Numune her zaman potansiyel bulaşıcı gibi ele alınmalıdır. Bu nedenle, tüm kan bileşenleri ve biyolojik maddeler potansiyel olarak bulaşıcı olarak kabul edilmelidir. Tüm kan bileşenleri ve tüm biyolojik materyaller aşağıda belirtilen güvenlik prosedürlerine uygun olarak atılmalıdır. 121 C de 15 dakika otoklavlanmalıdır. Tek kullanımlık malzemeleri yakınız. Nihai konsantrasyon ±% 1 sodyum hipokloritli olacak şekilde,sıvı atığı sodyum hipoklorit ile karıştırın. Bertaraf etmeden önce bir gece bekletin. DİKKAT: Asit içeren sıvı atığı sodium hipoklorit eklemeden önce nötralize edin.

7 80703 INNO-LiPA HLA-DQA1 / v1 / ANAHTAR KODU: FRI75959 p 7/12 - Kişisel koruyucu ekipman kullanımı gereklidir: Tehlikeli veya bulaşıcı ajanlar işlenirken eldiven ve koruyucu gözlük kullanılmalıdır. - Atık, kurumun atık bertaraf kurallarına göre ele alınmalıdır. Tüm federal, eyalet ve yerel çevresel düzenlemeler de dikkate alınmalıdır. Örnekler INNO-LiPA HLA-DQA1 testi biyotinli, amplifiye DNA materyali kullandığından, bir amplifikasyon kiti INNO-LiPA HLA-DQA1 Multiplex beraberinde bir araç olarak mevcuttur. Manipülasyon prosedürleri Strip kullanımı - Stripler sadece tek kullanılmak üzere tasarlanmıştır! - Striplere çıplak elle dokunmayın, temiz forsepsler kullanın. - Test striplerinin tanımlaması için kurşun kalem kullanın. Tükenmez kalem vs kullanmayın. Kimliği striplerin üzerindeki marker çizgisinin yukarısına yazın. - Farklı inkübasyon aşamaları boyunca, test stripleri her zaman aynı oluk içinde kalmalıdır. - Kullanılmamış veya gelişmiş stripler yoğun ışık ve ısıdan uzak tutulmalıdır. - Yorumlama, kaplama ve depolama öncesi gelişmiş striplerin tamamen kurumasını bekleyin. - Gelişmiş kuru stripler tercihen C de karanlıkta saklanmalıdır. - Olukları tekrar kullanmayın. Manuel inkübasyon için talimatlar - Hibridizasyon ve sıkı yıkama esnasında 56 C ± 0.5 C de inkübasyon yanlış pozitif (sıcaklık çok düşük) veya yanlış negatif/çok zayıf sinyallerden (sıcaklık çok yüksek) kaçınmak için en önemli aşamadır. Eğimli kapaklı bir çalkalamalı su banyosu sıcaklık değişimleri üzerinde iyi bir kontrol sağlar. Kalibre termometre ile sıkı sıcaklık kontrolü gereklidir. - Yanlış pozitif sinyalleri önlemek için inkübasyon sırasında su banyosunun kapağını her zaman kapatın. - Hibridizasyon ve sıkı yıkama için sıcak hava çalkalayıcısı kullanmayın. - Hibridizasyon ve sıkı yıkama için, oluklar su banyosunun çalkalayıcı platformu üzerine konulmalıdır. Su seviyesini oluk yüksekliğin üçte birine veya yarısına gelecek şekilde ayarlayın. Olukların su üstünde yüzmediğinden emin olun. Su oluklar ile doğrudan temas halinde olmalıdır. - Renk gelişimi için inkübasyon basamakları C arasında olmalıdır. Sıcaklık 20 C'nin altındaysa daha zayıf sonuçlar elde edilebilir. Sıcaklık 25 C'nin üzerinde olursa yüksek bir arka plan ve / ya da yalancı pozitif sinyaller elde edilebilir. - Her zaman protokolde belirtilen süre kadar inkübasyon yapın. - Çalkalamalı su banyosu (hibridizasyon ve sıkı yıkama prosedürü) ve çalkalayıcı (renk geliştirme prosedürü) tarafından üretilen hareket genliği maksimum duyarlılık ve homojen boyama için kritiktir. Bu strip yüzeyi tamamen batmış şekilde olmalıdır. Genlik mümkün olduğu kadar yüksek olmalıdır. Bununla birlikte, olukların kenarları boyunca sıvı dökülmesinden kaçınılmalıdır! Bu çapraz kontaminasyon ve geçersiz sonuca yol açabilir.

8 80703 INNO-LiPA HLA-DQA1 / v1 / ANAHTAR KODU: FRI75959 p 8/12 - Striplerin inkübasyonu esnasında çalkalama, sıvı olukların kenarlarından dökülmeden, hem test striplerinin hem sıvının oluk içinde ileri ve geri hareket etmesi şeklinde yapılmalıdır. - Tepsiyi örtmeyin. Sıkı yıkama ve hibridizasyon inkübasyonu sırasında, oluklar su banyosu içinde ortada bırakılabilir. Mikroplate kapağı ile olukların kaplanması çapraz kontaminasyona neden olabilir. Oluklarının içindeki sıvının manuel değişimi için talimatlar - Sıvı tercihen bir vakum aspiratörüne bağlı bir pipet ile olukdan aspire edilir. Tepsi tüm sıvının oluğun bir ucuna akmasına izin vermek için bir açıyla tutulur. - Her oluğa uygun çözeltiden 2 ml ekleyin ve protokolu izleyin. Bir multipipet (Eppendorf) bu amaç için yararlıdır. - Bu aşamayı test prosedürü kısmında belirtildiği kadar tekrar edin. NOT: - İki aşama arasında striplerin kurumasına izin vermeyin. - Aspirasyon sırasında striplerin yüzeylerinin tahrip olmadığından emin olun. Sıvıyı, stripin üst kısmından marker hattına kadar aspire edin. - Tüm sıvı aspire olduğundan emin olun. - Solüsyon içine tamamen daldırarak tüm stribin iyice yıkandığından emin olun. - Gerektiğinde çalkalayıcı hızını uyarlayın. Uyarılar ve önlemler - Sadece in vitro kullanım için. - Sadece profesyonel kullanım için. - - DNA kontaminasyonundan kaçınmak için, pre- ve post- amplifikasyon aşamaları arasında maksimum fiziksel ayrım önerilir. ayrı odalar, ayrı pipetler ve düğer lab materyali, ayrı lab giysileri ve eldivenler (ve stokları) iyi laboratuvar uygulamaları için minimum önlemlerdir. - Post amplifikasyon odasından pre amplifikasyon odasına herhangi bir dönüşten kaçının. - Otoklavlanmış tek kullanımlık laboratuar malzemesi kullanılması tavsiye edilir. - Tek kullanımlık laboratuar malzemelerini tekrar kullanmayın. - Herbir porsiyonlanmış örnek için yeni bir pipet ucu kullanın. - Bileşenleri aynı lot numarasına sahip olmadığı sürece, farklı kitlerin reaktiflerini karıştırmayın. - Reaktiflerin mikrobiyel kontaminasyonundan kaçının. Manual test prosedür NOT: Farklı inkübasyon aşaması boyunca, test stripleri hep aynı oluk içinde kalmalıdır. İnkübasyon öncesinde kalibre edilmiş bir termometre kullanarak su banyosunun sıcaklığını kontrol edin ve gerekliyse sıcaklığı tepsiyi su banyosuna yerleştirmeden önce ayarlayın. Kapağı her zaman kapalı tutun. Numuneler 1. HLA-DQA1 amplifiye ürünü (10 μl kullanın). Örnek hazırlığı için: INNO-LiPA HLA-DQA1 Multiplex kullanım talimatlarına bakın. NOT: Tam olarak 10 μl amplifiye örnek eklendiğinden emin olun. Gereğinden fazla veya az örnek yanlış tiplemeye sebep olabilir. 2. Blank amplifiye kontrol örneği (negatif kontrol; 10 μl su kullanın).

9 80703 INNO-LiPA HLA-DQA1 / v1 / ANAHTAR KODU: FRI75959 p 9/12 Denatürasyon ve hibridizasyon 1. Çalkalayıcılı su banyosunu 56 C ± 0.5 C ye ısıtın. Sıcaklığı kalibre edilmiş bir termometre ile kontrol edin ve eğer gerekirse ayarlayın. Belirtilen sıcaklığı aşmayın. Hibridizasyon Çözeltisi ve Sıkı Yıkama Çözeltisini kullanmadan önce en az 37 C ye ayarlanmış su banyosunda ısıtın, su banyosu sıcaklığı 56 C yi geçmemelidir. Kullanmadan önce karıştırın. Bütün kristaller çözünmüş olmalıdır. 2. Forsepsler kullanarak tüpten gerekli miktarda INNO-LiPA HLA-DQA1 stribi çıkartın (test örneği başına bir strip). Kör amplifiye kontrol örneği içinde bir strip ekleyin. Kurşun kalem ile şerit üzerindeki mavi renk işaretçi çizgisinin üstüne bir kimlik numarası yazın. 3. Gerekli sayıda test oluğu alın ve tepsiye yerleştirin ( her strip için bir oluk). 4. Her oluğun üst köşesine 10 µl Denatürasyon Çözeltisi pipetleyin. NOT: Kullandıktan sonra şişenin kapağını derhal kapatın μl örnek ekleyin (Örnekler kısmına bakın; INNO-LiPA HLA-DQA1 Multiplex kullanma talimatlarına bakın) ve pipet ile dikkatlice çekip bırakarak karıştırın. Her zaman steril pipet ucu kullanın. Denatürasyonun C de 5 dakika devam etmesine izin verin. 6. Önceden ısıtılmış hibridizasyon çözeltisini çalkalayın ve her oluğa denatüre amplifiye üründen yavaşca 2 ml ekleyin. Yavaşça çalkalayarak karıştırın. Pipetleme sırasında komşu oluklarını kontamine etmemeye özen gösterin. 7. Stripleri derhal oluklara yerleştirin. Stripler çözeltiye tamamen batmalıdır. NOT: Tek kullanımlık eldiven giyin, forseps kullanın C ± 0.5 C çalkalama su banyosuna tepsiyi yerleştirin (80 rpm; manuel inkübasyon için Talimatlara bakın), kapağı kapatın ve 30 dakika inkübe edin. Not: Su banyosundan oluklara su sıçramasından kaçının. Su seviyesini oluk yüksekliğin üçte birine veya yarısına gelecek şekilde ayarlayın. Tepsinin kaymasını engellemek için iki ağırlık arasında sabitleyin. Sıkı yıkama 1. Hibridizasyonun ardından tepsiyi su banyosundan kaldırın. 2. Tepsiyi düşük açıda tutun ve tercihen vakum aspiratöre bağlı pipetle oluktan sıvıyı aspire edin. Her oluğa 2 ml önceden ısıtılmış Sıkı Yıkama Çözeltisi ekleyin, tepsiyi 56 C ± 0.5 C deki çalkalayıcılı su banyosuna yerleştirin, kapağı kapatın ve 3 dakika inkübe edin. 3. İnkübasyondan sonra tepsiyi su banyosundan çıkarın ve oluklardaki sıvıyı aspire edin dakikalık inkübasyon aşaması ve aspirasyon aşamasını bir kere tekrarlayın. 5. Sonunda, her oluğa 2 ml önceden ısıtılmış Sıkı Yıkama Çözeltisi ekleyin ve tepsiyi 56 C ± 0.5 C deki çalkalayıcılı su banyosuna yerleştirin, kapağı kapatın ve 4 dakika inkübe edin. NOT: Konsantre haldeki Durulama Çözeltisi 5x ve Konjugat 100x sıkı yıkama basamağı sırasında dilüe edin. Reaktiflere bakın. Bu Sıkı yıkama protokolü HLA-DQB1 Update, HLA-A Update, HLA-B Update Plus için aynıdır. (3 dk - 3 dk - 4 dk) HLA-DRB1 Plus, HLA-DRB Dec, HLA-DPB, HLA-C için bu Sıkı yıkama protokolü HLA-DQA1 için de kullanılabilir. (2 x 20 sn - 10dk). Renk gelişimi

10 80703 INNO-LiPA HLA-DQA1 / v1 / ANAHTAR KODU: FRI75959 p 10/12 Sonraki bütün inkübasyonlar çalkalayıcıda C de gerçekleştirilir. İnkübasyonlar sırasında oluklardaki sıvı ve stripler homojen bir boyama için ileri geri hareket etmelidir. 1. Her stribi 2 ml Durulama çalışma solüsyonu kullanarak 1 dakika boyunca iki kez yıkayın (oluklardaki sıvının manuel değişimi için Talimatlara bakın). 2. Her oluğa 2 ml Konjugat çalışma çözeltisi ekleyin ve çalkalayıcı üzerinde tepsi çalkalanırken 30 dakika inkübe edin. NOT: Konjugat inkübasyonunun bitmesine yaklaşık on dakika kala Substrat BCIP/NBT 100x Çözeltisini dilüe edin. Reaktiflere bakın. 3. Her stribi 2 ml Durulama çalışma solüsyonu kullanarak 1 dakika iki kez yıkayın ve 2 ml Substrat Buffer kullanarak bir kez daha yıkayın. 4. Her oluğa 2 ml Substrat çalışma çözeltisi ekleyin ve çalkalayıcı üzerinde tepsi çalkalanırken 30 dakika inkübe edin. Dikkat: Eldiven ve koruyucu gözlük giyin. 5. En az 3 dakika çalkalayıcı üzerinde tepsi çalkalanırken 2 ml distile su içinde iki kez stripleri yıkayarak renk gelişimini durdurun. 6. Forseps kullanarak, stripleri oluklardan çıkarın ve absorban kâğıt üzerine koyun. Sonuçları okumadan önce stripleri tamamen kurutun. Renklenmiş stripleri karanlıkta saklayın. Otomatik test prosedürü: Göstergeler ve ilişkili protokoller Fujirebio Avrupa N.V. edinilebilir (bakınız- Sonuçlar Okuma Şekil 1 INNO-LiPA HLA-DQA1 striplerinde faklı oligonükleotid problarının pozisyonunu gösterir. Bir çizgi, test prosedürünün sonunda net bir mor/kahverengi bant belirdiğinde Pozitif kabul edilir. Şekil 1: INNO-LiPA HLA-DQA1 striplerinde markır çizgisi (yeşil çizgi), konjugat kontrol çizgisi (konj. kontrol), 2 HLA-DQA1 kontrol çizgisi ve 35 sequence-specific DNA prob çizgisinin konumu. Doğrulama - Her test çalışmasına bir negatif kontrol dahil edin. Herhangi yeni test prosedürüyle olduğu gibi, ek pozitif ve negatif kontrollerin dahil edilmesi doğru test prosedürünün gerçekleştirilmesi konusunda yüksek derecede güvene erişilene kadar dikkate alınmalıdır. Uygun test koşullarının oluşturulduğunu doğrulamak için referans DNA kullanılması önerilir. - INNO-LiPA HLA-DQA1 striplerindeki en üstteki çizgi (Şekil 1) markır çizgisidir (yeşil renkli çizgi). Bu çizgi striplerin doğru oryantasyonuna izin verir.

11 80703 INNO-LiPA HLA-DQA1 / v1 / ANAHTAR KODU: FRI75959 p 11/12 - Sonraki çizgi tespit prosedürü sırasında reaktif Konjugat ve Substrat çalışma solüsyonunun eklenmesini kontrol eder. Bu çizgi plastik okuma kartındaki Konjugat Kontrol çizgisi ile yanyana gelmelidir. Bu çizgi daima pozitif olmalıdır (değilse: yorumlama yapılmamalı!) ve aynı test çalışmasında her strip üstünde yaklaşık aynı yoğunluğa sahip olmalıdır. - Sonraki 2 çizgi hibridizasyon için uygun miktarda HLA-DQA1 amplifiye materyalin eklenip eklenmediğini gösteren HLA-DQA1 dahili hibridizasyon kontrol çizgileridir (okuma kartında HLA-DQA1 kontrolleri). HLA-DQA1 kontrol 1 çizgisi ekzon 1 amplikonuyla hibridize eder ve HLA-DQA1 kontrol 2 çizgisi ekzon 2 ve 3 amplikonuyla hibridize eder. Bu çizgiler negatif kontrol için hariç her zaman pozitif olmalıdır ama yoğunlukları örnekler arasında farklılık gösterebilir. - Her negatif kontrolün test sonucu Konjugat kontrol çizgisi hariç, strip üzerindeki çizgilerin herhangisi için belirgin sinyal vermemelidir. - Bir stripteki probların renk yoğunlukları bir çizgiden diğerine değişiklik gösterebilir. Sonuçların Yorumlanması - Stripteki konjugat kontrol çizgisi ile plastik okuma kartı üzerindeki konjugat kontrol çizgisi yanyana gelmelidir. - Her bir stribi doğrulamak için ilk önce kontrol çizgilerinin pozitifliğini kontrol edin (ilk üç çizgi: konjugat kontrol, HLA-DQA1 kontrol 1, HLA-DQA1 kontrol 2)(Doğrulama kısmına bakın). - Tipleme sonuçları kit içindeki probların reaktivitesine dayanır. Prob özgüllükleri listesi mevcuttur. - INNO-LiPA HLA-DQA1 striplerinde pozitif olan tüm prob numaralarını belirleyin ve LİPA yorumlama yazılımının bir versiyonunda veriyi girerek HLA-DQA1 tipini sonuçlandırın (Yorumlama yazılımı: LiRAS bakın). Yorumlama yazılımı: LiRAS INNO-LiPA HLA için LiRAS yazılımı LİPA sonuçlarının yorumlanmasını desteklemek için tasarlanmıştır. Prosedür sınırlamaları - Bu ürünün kullanımı hibridizasyon teknikleri konusunda eğitimli personel ile sınırlı olmalıdır. - Sadece iyi laboratuvar uygulamaları ve belirtilen prosedürlerin dikkatli uygulanması spesifik hibridizasyon ve hedef DNA'nın doğru tiplenmesini sağlar. - Yeni alleller prob bölgeleri dışında polimorfizmlere sahip olabilir, sonuçları yorumlarken bu dikkate alınmalıdır. - - "No typing deducible" (LiRAS yazılımı) prob bölgeleri içinde polimorfizmlere sahip yeni alellerden dolayı elde edilebilir. Test performans INNO-LiPA HLA-DQA1 performansı in-house ve bir Birleşik Krallık doku tipleme laboratuvarında değerlendirildi. Toplam 79 isimsiz örnek (Uluslararası HLA DNA Exchange (UCLA örnekleri) örnekleri) analiz edildi (50 harici olarak; 29 in-house). Tüm hibridizasyonlar program HLA56v3 kullanılarak Auto-LiPA cihazı kullanılarak yapıldı. Bu stripler görsel olarak okundu ve yorumlama LiPA HLA v3.02 yorumlama yazılımı için LiRAS klinik deneme sürümüyle yapıldı.

12 80703 INNO-LiPA HLA-DQA1 / v1 / ANAHTAR KODU: FRI75959 p 12/12 Test duyarlılığı Testin test duyarlılığı (başarı oranı) test edilen toplam örnek sayısında INNO-LiPA HLA-DQA1 stribi için elde edilen yorumlanabilir sonuçların oranı olarak hesaplandı (= başarılı amplifikasyon ve tipleme sonucu mevcut, düzenleme ihtiyacı ile veya düzenleme ihtiyacı duyulmadan elde edilen). Bu değerlendirmede test duyarlılığı, başlangıç "no typing deducible" sonucu nedeniyle bir örnek için tekrar testi gerekmesine rağmen 100% dü. (79/79; 95% CI [95.44%; 100%]). Doğruluk Alelik seviyede testin doğruluğu düzenleme ihtiyacı ile veya düzenleme ihtiyacı duyulmadan elde edilen yorumlanabilir LiPA sonucuyla toplam örnek sayısında alternatif DNA tanımlama yöntemi (dizi spesifik primerler (SSP) ve dizi tabanlı tipleme (SBT)) ile elde edilen sonuçlar için aynı olan INNO-LiPA HLA-DQA1 sonuçlarının yüzdesi olarak hesaplandı. Bu değerlendirmede doğruluk başlangıç testinden sonra 93.67% idi (74/79; 95% CI [85.84%; 97.91%]) ve beş örneğin tutarsızlık testinden sonra 100% dü (79/79; 95% CI [95.44%; 100%]). Başlangıç testi üzerine, alternatif tanımlama metodu sırasıyla DQA1*0501 ve DQA1*0505 tanımlarken INNO-LiPA HLA-DQA1 dört örnekte allel DQA1*0505 ve başka örnekte allel DQA1*0502 tanımladı. Beş örneğin hepsi sonradan inhouse dizilendi ve INNO-LiPA HLA-DQA1 ile elde edilen sonuçlar doğrulandı. Çözünürlük (tipleme tablosu v.1.0/ ) Bu çalışma esnasında alelik seviyede gözlenen çözünürlük 100% dü. Numune reaktivitesi Görsel gözlemde bir prob bu değerlendirme esnasında iki kez zayıf yanlış pozitif reaksiyon verdi. Yine de LiRAS yorumlama yazılımı kullanıldığında allelik seviyede uyumlu tipleme elde edildi. Kesinlik In-house, üç farklı kişi tarafından manuel testtte 3 kez beş örnek test edildi. Altı manuel ve altı Auto-LiPA çalışmasında 23 örnek çalışıldı. Prob reaktivitesi bütün kombinasyonlarda karşılaştırılabilir durumdaydı. Sonuçların yorumlanması bütün vakalarda aynıdır. Bilinen reaktiviteye sahip dört örnekten oluşan bir panel ve yorumlama harici olarak ve in-house test edildi. Aynı bir tipleme sonucu tüm durumlarda elde edildi. Ticari markalar - INNO-LiPA, dünya çapında bir ticari markadır örneğin ABD de. - LiPA Benelux da tescili ticari markadır ve dünyanın geri kalanında bir ticari markadır (ABD dahil). - LiRAS Avrupa da tescilli markadır ve dünyanın geri kalanında bir markadır (ABD dahil) - Auto-LiPA dünya çapında bir ticari markadır örneğin ABD de.