ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Serkan HALİSKARANFİL TERMOALKALİFİLİK AMİLAZ VE SELÜLAZ ENZİM (MULTİ ENZİM) ÜRETİCİSİ BACILLUS sp. İZOLASYONU, ENZİMLERİN KARAKTERİZASYONU VE BİYOTEKNOLOJİK UYGULANABİLİRLİĞİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ADANA, 2012

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TERMOALKALİFİLİK AMİLAZ VE SELÜLAZ ENZİM (MULTİ ENZİM) ÜRETİCİSİ BACILLUS sp. İZOLASYONU, ENZİMLERİN KARAKTERİZASYONU VE BİYOTEKNOLOJİK UYGULANABİLİRLİĞİ Serkan HALİSKARANFİL YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Bu Tez 19/10/2012 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Oyçokluğu ile Kabul Edilmiştir.... Prof. Dr. Burhan ARIKAN DANIŞMAN..... Prof. Dr. Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ ÜYE Doç. Dr. Ramazan BİLGİN ÜYE Bu Tez Enstitümüz Biyoloji Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. Selahattin SERİN Enstitü Müdürü Bu Çalışma Ç. Ü. Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: FEF2012YR22 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ TERMOALKALİFİLİK AMİLAZ VE SELÜLAZ ENZİM (MULTİ ENZİM) ÜRETİCİSİ BACILLUS sp. İZOLASYONU, ENZİMLERİN KARAKTERİZASYONU VE BİYOTEKNOLOJİK UYGULANABLİRLİĞİ Serkan HALİSKARANFİL ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI Danışman: Prof. Dr. Burhan ARIKAN Yıl: 2012, Sayfa: 163 Jüri : Prof. Dr. Burhan ARIKAN : Prof. Dr. Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ : Doç. Dr. Ramazan BİLGİN Bu çalışmada, doğal ortamdan izole edilen Bacillus sp. suşundan termoalkalifilik amilaz ve selülaz (multi enzim) enzimlerinin üretimi ve karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Selülaz ve amilaz enzim sentez yeteneği olan suşlar seçilmiş ve en iyi suş belirlenerek Bacillus sp. SHK-7 olarak tanımlanmıştır. Enzim üretimi için optimum sıcaklık ve ph belirlenip, enzimin kısmi saflaştırılması ve karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Zimogram SDS-PAGE analizi ile selülaz enzimi 68.9 kda ağırlığında tek band olduğu belirlenmiştir. Selülaz enzimi maksimum aktivitesini 60ºC ve ph 8.0 de göstermektedir. İnce tabaka kromatografisi yöntemiyle hidroliz ürünleri olarak maltoz ve maltoz kökenli oligosakkaritler olduğu belirlenmiştir. Amilaz enzimi zimogram nativ PAGE ile 302 kda ve 453 kda moleküler ağırlığa sahip iki aktivite bandına sahip olduğu belirlenmiştir. Enzim optimum aktivitesini ph 8.0 ve 80ºC de göstermiştir. Enzim çeşitli deterjan ve metal iyonları varlığında stabildir. Hidroliz ürünleri olarak ince tabaka kromatografisi ile maltoz ve maltoz kökenli oligosakkaritleri meydana getirdiği belirlenmiştir. Bu sonuçlara göre SHK-7 selülaz ve amilaz enzimleri termofil, alkalifil, halotolerant, termostabil ve alkali-stabil özellik göstermekte olup başta deterjan endüstrisi olmak üzere tekstil, gıda ve içecek endüstrilerinde kullanılabilir özelliktedirler. Anahtar Kelimeler: Bacillus sp., multi enzim, termoalkalifilik, selülaz, amilaz I

4 ABSTRACT MSc. THESIS ISOLATION OF THERMOALKALIPHILIC AMYLASE AND CELLULASE (MULTI ENZYMES) PRODUCING BACILLUS sp. STRAINS, ENZYME PRODUCTION, CHARACTERIZATION AND INVESTIGATION OF BIOTECHNOLOGICAL APPLICATIONS Serkan HALİSKARANFİL DEPERTMANT OF BIOLOGY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF CUKUROVA Supervisor : Prof. Dr. Burhan ARIKAN Year: 2012, Pages: 163 Jury : Prof. Dr. Burhan ARIKAN : Prof. Dr. Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ : Assoc. Prof. Dr. Ramazan BİLGİN In this study, the production and characterization of thermoalkaliphilic amylase and cellulase enzymes (multi enzymes) from Bacillus sp. strain which is isolated from soil samples were carried out. The bacterial strains containing the mentioned enzymes were isolated then, the best of selected and determined as Bacillus sp. SHK-7. After optimization of enzyme production conditions for temperature and ph, the enzymes were particular purified and characterized. The molecular weight of the cellulase enzyme was estimated to be 68.9 kda as a single active band, by zymogram SDS-PAGE analyses. The maximum activity of the cellulase was at 60ºC and ph 8.0. The enzyme was stable in the presence various detergent. Maltose and maltose-derived oligosaccharide were determined as hydrolysis products by thin layer chromatography. The zymogram native PAGE analyses of the amylase enzyme revealed a two active band with molecular weight of 302 kda and 453 kda. The optimum temperature and ph of the amylase enzyme determined as 80ºC and ph 8.0. The enzyme was stable in the presence of various detergent and metal ions. Maltose and maltose-derived oligosaccharide were determined as hydrolysis products by thin layer chromatography. According to these results, SHK-7 cellulase and amylase enzymes are thermophile, alkaliphile, halotolerant, thermostable and alkali-stable. Owing to these characteristics, the cellulase and amylase enzymes obtained in this research can be used as additive in detergent, textile, food and drink industries. Keywords: Bacillus sp., multi enzyme, thermoalkaliphilic, cellulose, amylase II

5 TEŞEKKÜR Yüksek Lisans çalışmam boyunca hiçbir şekilde maddi ve manevi desteğini esirgemeyen, bilgi ve birikimini sürekli sabır çerçevesinde sunan danışman hocam sayın Prof. Dr. Burhan ARIKAN a teşekkürü bir borç bilirim. Tez çalışmalarım boyunca güler yüzüyle her an desteğini hissettiğim hocam sayın Prof. Dr. Hatice KORKMAZ GÜVENMEZ e saygılarımı sunarım. Yüksek Lisans eğitimim boyunca en zor günlerimde bana kol-kanat geren tüm Moleküler Biyoloji Laboratuarı Doktora ve Yüksek Lisans öğrencisi arkadaşlarıma en içten sevgilerimi sunarım. Başta hayatını eğitimime adayan ve bunun için elinden gelen hiçbir fedakârlığı esirgemeyen babam Mahmut Nedim HALİSKARANFİL e, canımdan çok sevdiği annem Hülya HALİSKARANFİL e, tüm kardeşlerime ve HALİSKARANFİL ailesine teşekkür ederim. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ... I ABSTRACT... II TEŞEKKÜR... III İÇİNDEKİLER... IV ÇİZELGELER DİZİNİ...X ŞEKİLLER DİZİNİ... XII SİMGELER VE KISALTMALAR... XIV 1. GİRİŞ Bacillus Cinsi Hakkında Genel Bilgiler Bacillus ların Önemi Bacillus ların Habitatı Bacillus ların Metabolizması Enzimler ve Bazı Özellikleri Enzimlerin Numaralandırılması ve Sınıflandırılması Oksidoredükteazlar Transferazlar Hidrolazalar Liyazlar İzomerazlar Ligazlar Multienzimler Nişasta ve Amilazlar Amilazların Kullanım Alanları Deterjan Endüstrisi Gıda Endüstrisi İçecek Endüstrisi Yem Endüstrisi Tekstil Endüstrisi Diğer alanlar IV

7 1.6. Selüloz ve Selülazlar Selülazların Kullanım Alanları Deterjan endüstrisi Tekstil Endüstrisi Gıda Endüstrisi Kağıt Endüstrisi Yem Endüstrisi Bira ve Şarap Endüstrisi Diğer Alanlar Ekstremofiller Elektroforez Elektroforez Yöntemleri Kromatografi İnce Tabaka Kromatografisi ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR MATERYAL VE METOD Materyal Bakteri İzolasyonunda ve Teşhisinde Kullanılan Besiyerleri N1 Besiyeri CMC-LB Agar Besiyeri M9-Nişasta Agar Besiyeri Kullanılan Çözeltiler NaOH Çözeltisi Kongo Kırmızısı NaCI Çözeltisi Lugol Etanol Sodyum-Fosfat Tamponu Sodyum-Fosfat Tamponu Glisin-NaOH Tamponu Borax-NaOH tamponu V

8 Dinitro Salisilik Asit (DNS) SDS-PAGE Yönteminde Kullanılan Solüsyonlar Solüsyon A Solüsyon B (4X) Solüsyon C (4X) Amonyum Persülfat (AMPS) (%10) Örnek Yükleme Tamponu (5X) Elektroforez Tamponu Jel Boyama (Staining) Solüsyonu Jelden Boyayı Geri Alma (Destaining) Solüsyonu SDS-PAGE Zimogram Analizinde Kullanılan Renatürasyon Solüsyonları İnce Tabaka Kromatografisi Solüsyonları Butanol-Asetik Asit-Distile Su %20 lik Sülfirik Asit (H 2 SO 4 ) Çözeltisi Kloroform-Asetik Asit-Distile Su Çözeltisi Anilin-Difenilamin-Ortofosforik Asit Çözeltisi D-Glikoz Çözeltisi (%1 w/v) Maltoz Çözeltisi Metod Bakteri İzolasyonu ve Teşhisi Bacillus sp. Suşlarının İzolasyonu Bakteri Teşhisi Enzimlerin Aktivitelerinin Belirlenmesi Katı Besiyerinde Amilaz Aktivitesinin Belirlenmesi Katı Besiyerinde Selülaz Aktivitesinin Belirlenmesi Katı Besiyerinde Proteaz Aktivitesinin Belirlenmesi Bacillus sp. Bakterilerinin Katı Besiyerinde Ürediği ve Enzim Sentezinin Gerçekleştiği Sıcaklık ve ph Aralıklarının Belirlenmesi Amilaz Enziminin Üretimi ve Kısmi Saflaştırılması VI

9 Selülaz Enziminin Üretimi ve Kısmi Saflaştırılması Enzimlerin Optimum Aktivite Gösterdikleri Ph Değerlerinin Belirlenmesi Enzimlerin Optimum Aktivite Gösterdikleri Sıcaklık Değerlerinin Belirlenmesi Enzimlerin Sıcaklık Stabilitelerinin Belirlenmesi Enzimlerin ph Stabilitelerinin Belirlenmesi Enzim Aktivitesine İnhibitör, Şelatör, Deterjan ve Metal İyonlarının Etkisi NaCI ün Enzim Aktivitesi Üzerine Etkisinin Belirlenmesi Elektroforetik Yöntem İle Moleküler Ağırlık ve Zimogram Analizi Ayırıcı Jelin Hazırlanması (%10) Dengeleme Jelinin Hazırlanması Amilaz Enziminin Zimogram Analizi İçin Doğal (Nativ) Jel Hazırlanması Enzim Örneklerinin Jele Yüklenmesi ve Yürütülmesi SDS-PAGE Jelin Boyanması ve Zimogram Analizleri Enzimin Substrat Reaksiyonu Sonunda Açığa Çıkan Son Ürünlerin İnce Tabaka Kromatografisi İle Saptanması Amilaz Enzimine Ait Son Ürünlerin Belirlenmesi Selülaz Enzimine Ait Son Ürünlerin Belirlenmesi BULGULAR VE TARTIŞMA Bacillus sp. Suşlarının İzolasyonu ve Tanımlanması SHK-7 Suşunun Katı Besiyerinde Ürediği, Selülaz ve Amilaz Enzimlerinin Sentezini Gerçekleştirdiği ph ve Sıcaklık Aralığı Sonuçları SHK-7 Amilaz Enziminin Enzimatik Özellikleri SHK-7 Amilaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği ph Değerine Ait Bulgular SHK-7 Amilaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği Sıcaklık Değerine Ait Bulgular SHK-7 Amilaz Enziminin Sıcaklık Stabilitesine Ait Bulgular VII

10 SHK-7 Amilaz Enziminin ph Stabilitesine Ait Bulgular SHK-7 Amilaz Enzimi Üzerine Farklı NaCI Konsantrasyonlarının Etkisi SHK-7 Amilaz Enzim Aktivitesine İnhibitör, Şelatör, Metal İyonları ve Deterjanların Etkisi SHK-7 Amilaz Enziminin Nativ PAGE ve Zimogram Analizi SHK-7 Amilaz Enziminin İnce Tabaka Kromatografi (TLC) Sonuçları SHK-7 Selülaz Enziminin Enzimatik Özellikleri SHK-7 Selülaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği ph Değerine Ait Bulgular SHK-7 Selülaz Enziminin Optimum Aktivite Gösterdiği Sıcaklık Değerinin Belirlenmesi SHK-7 Selülaz Enziminin Sıcaklık Stabilitesine Ait Bulgular SHK-7 Selülaz Enziminin ph Stabilitesine Ait Bulgular SHK-7 Selülaz Enzimi Üzerine Farklı NaCI Konsantrasyonlarının Etkisi SHK-7 Selülaz Enzim Aktivitesine İnhibitör, Şelatör, Metal İyonları ve Deterjanların Etkisi SHK-7 Selülaz Enziminin İnce Tabaka Kromatografi (TLC) Sonuçları SHK-7 Selülaz Enziminin SDS-PAGE ve Zimogram Analizi Sonuçları SONUÇLAR VE ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ VIII

11 IX

12 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 4.1. Bacillus sp. SHK-7 nin 30ºC de ve farklı ph değerlerinde M9 Nişatalı katı besiyerindeki koloni ve aktivite zon çapları Çizelge 4.2. Bacillus sp. SHK-7 nin 40ºC de ve farklı ph değerlerinde M9 Nişatalı katı besiyerindeki koloni ve aktivite zon çapları Çizelge 4.3. Bacillus sp. SHK-7 nin 50ºC de ve farklı ph değerlerinde M9 Nişatalı katı besiyerindeki koloni ve aktivite zon çapları Çizelge 4.4. Bacillus sp. SHK-7 nin 60ºC de ve farklı ph değerlerinde M9 Nişatalı katı besiyerindeki koloni ve aktivite zon çapları Çizelge 4.5. Bacillus sp. SHK-7 nin 30ºC de ve farklı ph değerlerinde CMC içeren katı besiyerindeki koloni ve aktivite zon çapları Çizelge 4.6. Bacillus sp. SHK-7 nin 40ºC de ve farklı ph değerlerinde CMC içeren katı besiyerindeki koloni ve aktivite zon çapları Çizelge 4.7. Bacillus sp. SHK-7 nin 50ºC de ve farklı ph değerlerinde CMC içeren katı besiyerindeki koloni ve aktivite zon çapları Çizelge 4.8. Bacillus sp. SHK-7 nin 60ºC de ve farklı ph değerlerinde CMC içeren katı besiyerindeki koloni ve aktivite zon çapları Çizelge 4.9. Bacillus sp. SHK-7 amilaz enziminin optimum ph değerleri Çizelge Bacillus sp. SHK-7 amilaz enziminin optimum aktivite sıcaklığı ve değerleri Çizelge Bacillus sp. SHK-7 amilaz enzimi sıcaklık stabilitesine ait sonuçlar Çizelge Bacillus sp. SHK-7 amilaz enzimi ph stabilitesine ait sonuçlar Çizelge Bacillus sp. SHK-7amilaz enzimi aktivitesi üzerine farklı NaCI konsantrasyonlarının etkisi Çizelge İnhibitör, şelatör, metal iyonları, deterjanlar ve okside edici ajanların etkisine ait sonuçlar Çizelge Bacillus sp. SHK-7 selülaz enziminin optimum aktivite gösterdiği ph değeri Çizelge Bacillus sp. SHK-7 selülaz enziminin optimum aktivite gösterdiği sıcaklık değeri X

13 Çizelge Bacillus sp. SHK-7 selülaz enziminin sıcaklık stabilitesi sonuçları Çizelge Bacillus sp. SHK-7 selülaz enziminin ph stabilitesine ait sonuçlar Çizelge 4.19.Bacillus sp. SHK-7 selülaz enziminin aktivitesi üzerine farklı NaCI konsantrasyonlarının etkisi Çizelge Selülaz enzimi üzerine inhibitör, şelatör, metal iyonları, deterjanlar ve okside edici ajanların etkisine ait sonuçlar XI

14 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 4.1. Bacillus sp. SHK-7 nin 50ºC ve farklı ph lardaki (ph aralığı) koloni çapı ve aktivite zonu görüntüsü Şekil 4.2. Bacillus sp.shk-7 amilaz enziminin aktivite gösterdiği optimum ph değeri ve aralığı Şekil 4.3. Bacillus sp. SHK-7 amilaz enziminin optimum aktivite gösterdiği sıcaklık değeri ve aralığı Şekil 4.4. Bacillus sp. SHK-7 amilaz enzimi sıcaklık stabilitesine ait sonuçlar Şekil 4.5. Bacillus sp. SHK-7 amilaz enziminin ph stabilitesine ait sonuçlar Şekil 4.6. Bacillus sp. SHK-7 amilaz enzimi aktivitesi üzerine %3-30 NaCI konsantrasyonlarının etkisi Şekil 4.7. Bacillus sp. SHK-7 amilaz enzimi aktivitesi üzerine inhibitör, şelatör, metal iyonları, deterjan ve okside edici ajanların etkisi Şekil 4.8. Bacillus sp. SHK-7 amilaz enzimi moleküler ağırlığı ve zimogram analizi Şekil 4.9. Bacillus sp. SHK-7 amilaz enziminin ince tabaka kromatografi son ürünlerinin belirlenmesi Şekil Bacillus sp. SHK-7 selülaz enziminin aktivite gösterdiği optimum ph değeri ve aralığı Şekil Bacillus sp. SHK-7 selülaz enziminin optimum aktivite gösterdiği sıcaklık değeri ve aralığı Şekil Bacillus sp. SHK-7 selülaz enzimi sıcaklık stabilitesi sonuçları Şekil Bacillus sp. SHK-7 selülaz enziminin ph stabilitesine ait sonuçlar Şekil Bacillus sp. SHK- selülaz enzim aktivitesi üzerine %3-30 NaCI konsantrasyonlarının etkisi Şekil Bacillus sp. SHK-7 selülaz enzimi üzerine inhibitör, şelatör, metal iyonları, deterjan ve okside edici ajanların etkisi Şekil Bacillus sp. SHK-7 selülaz enziminin ince tabaka kromatografisi son ürünlerinin belirlenmesi XII

15 Şekil Bacillus sp. SHK-7 selülaz enzimine ait moleküler ağırlık ve zimogram analizi XIII

16 SİMGELER VE KISALTMALAR mm M CMC DNS PMSF α β PAGE SDS AMPS v/v rpm dev. TLC EDTA sp. : Milimolar : Molar : Karboksimetilselüloz : Dinitrosalisilik asit : Fenil metil sülfonil florid : Alfa : Beta : Poliakrilamid jel elektroforezi : Sodyum dodesil sülfat : Amonyum persülfat : Hacim/hacim : Revolutions per minute (dakikadaki dönüş sayısı) : Devir : Thin Layer Chromatography : Etilen diamino tetra asetik asit : Tür XIV

17 XV

18 1.GİRİŞ Serkan HALİSKARANFİL 1. GİRİŞ Enzimler canlı sistemlerdeki metabolizmayı oluşturan tüm biyokimyasal reaksiyonların neredeyse tamamında görev yapan biyolojik katalizörlerdir. Enzim terimi ilk kez 1878 yılında Kuhne tarafından kullanılmıştır yılında Eduard Buchner hücrelerden fonksiyonel enzimleri ekstrakte ettiğini bildirmiştir (Paulo ve Gübitz, 2003). Enzimler kimyasal reaksiyonlarda değişikliğe uğramadan reaksiyon hızını arttıran maddelerdir. Enzimler olmaksızın çoğu reaksiyon biyolojik sistemlerde var olandan daha yüksek sıcaklık ve enerji düzeylerine ihtiyaç duyarlar. Enzimler diğer moleküller için özellikli bağlanma bölgelerine sahip proteinlerdir. Zayıf bağlanma reaksiyon hızını arttırmak için enzimlere büyük olanak sağlar. Bugün enzimoloji biyokimyasal çalışmaların merkezini oluşturmaktadır. Enzimler besin üretimi, gen klonlama ve ileri tedavi tekniklerine kadar birçok alanda (özellikle mikrobiyal endüstri ve genetik) yaygın uygulama alanı bulmuşlardır (Lerner ve Lerner, 2003). Doğada bulunan enzimler antik çağlardan bu yana sirke, şarap, bira, peynir gibi besin ürünleri ile keten ve dericilik gibi alanlarda kullanılmaktadır. Yirminci yüzyılın son dönemlerinde fermantasyon uygulamalarının yaygınlaşması sonucu, uygun suşların kullanılması ile geniş ölçekli ve daha saf enzim üretimi gerçekleştirilmiştir. Bu gelişmeler kullanışlı endüstriyel ürünlerin üretimi sürecinde enzimlerin kullanılmasına olanak sağlamıştır. Endüstriyel enzimler dünya pazarında meyve suyu, tekstil, fırıncılık, süthane, biracılık, nişasta ve deterjan gibi farklı alanlarda kullanılmışlardır. Endüstriyel enzimlerin çoğu ekstrasellüler özelliğe sahiptirler (Vroemen, 1983). Endüstriyel enzimlerin kullanımı dünya genelindeki değeri tahmini olarak 1995 yılında 1 milyon dolar iken 2000 yılında 1,5 milyon dolar olmuştur (Kirk ve ark, 2002). Endüstriyel enzimlerin en büyük piyasasını deterjan endüstrisi oluşturmaktadır (Saeki ve ark, 2007). Fırıncılık ve hayvan yemi endüstrileri son yıllarda hızlı büyüme göstermiştir. Deterjan katkı maddesi olarak enzimlerin kullanımı hem değer hem de hacim olarak endüstriyel enzimlerin hala en geniş uygulaması görünümündedir (Kirk ve ark, 2002). 1

19 1.GİRİŞ Serkan HALİSKARANFİL Günümüzde kullanılan endüstriyel enzimlerin büyük çoğunluğu hidrolitik karakterdedirler. Proteazlar özellikle deterjan ve süt endüstrisinde yoğun kullanımlarından dolayı endüstriyel alanda diğer enzimlere göre daha yaygın bir uygulamaya sahiptirler. Çeşitli karbonhidratazlar (öncelikli olarak amilazlar ve selülazlar) nişasta, tekstil, deterjan ve fırıncılık endüstrilerinde kullanılan ikinci büyük enzim grubudur (Kirk ve ark, 2002). Bu alanlarda kullanılan enzimlerin çok spesifik olmaları, yüksek aktiviteye sahip olmaları ve stabil olmaları arzu edilmektedir. Dünya piyasasında kullanılan endüstriyel enzimlerin yaklaşık %60 ı Avrupa da, %40 ı da ABD ve Japonya da üretilmiştir. Fotosentez güneş enerjisinin canlılar tarafından en verimli kullanıldığı yoldur. Fotosentez sonunda bitkiler tarafında yüksek miktarda enerji depolanır. Bu şekilde bitkisel materyal doğada en fazla bulunan yüksek enerjili bir geri dönüşüm kaynağı şekline gelmektedir (Rajoka ve Malik, 1997). Selülozik materyalin istenilen metabolitlerin veya biyo yakıtların üretilmesi amacı ile hidrolize edilmesi bu yapılara stratejik bir özellik kazandırmaktadır (Sukumuran ve ark, 2005). Selülazların biyoteknolojide kullanılmaları 1980 lerin başlarında başlamış olup ilk uygulama hayvan yeminde gerçekleştirilirken bunu gıda endüstrisi izlemiştir. Sonraki yıllarda enzimlerin kullanım alanı tekstil, çamaşır deterjanı ve kâğıt endüstrilerinde yoğunlaşmıştır. Selülozik biyolojik materyal yeryüzünde en bol bulunan geri dönüşümlü biyomas kaynağıdır. Selülaz enziminin kullanım alanları arasında; meyve ve sebze sularının elde edilmesi ve berraklaştırılması, meyve nektar ve pürelerinin üretimi, zeytinyağı üretimi, fırın ürünlerinin kalitesinin arttırılması, bira ve şarap endüstrisi, hayvan yemi üretimi (monogastrik ve ruminant hayvan yemlerinin üretimi), tekstil endüstrisi ve çamaşır deterjanı endüstrisi, kotların biyolojik taşlanması, kot dışı kumaşların biyolojik parlatılmasında ve giysilerden kirliliklerin uzaklaştırılması yer almaktadır. Bu alanlar daha ayrıntılı incelendiği zaman; Kâğıt endüstrisi alanında kağıt hamuru üretimi, ambalaj kağıt hamurlarının ağartılması, liflerin biyolojik modifikasyonu, mürekkebin kullanılmış kağıttan biyolojik uzaklaştırılması gibi uygulamalar söz konusudur. 2

20 1.GİRİŞ Serkan HALİSKARANFİL Ayrıca gıda endüstrisi, tarımsal artıklar ve deterjan endüstrisi diğer uygulama alanlara arasında yer almaktadır. Bu enzimlerin uygulamaların da ekstrem ph değerleri ve yüksek sıcaklıklarda aktivite ve stabilite göstermeleri temel hedeflerdir. Selülazların kullanıldığı endüstrilerdeki temel sorun enzim üretimindeki maliyet yüksekliğidir. Endogulkanazlar selülozun parçalanması aşamasında ilk etkiyi gösteren ve polisakkaritin parçalanmasında kritik görev yapan enzimlerdir. Endoglukanazlar kumaş, biyoenerji, kâğıt ya da besin endüstrilerinde çokça kullanıma sahiptirler. Çevrenin korunması için daha birçok endüstride enzimatik tekniklerin kullanılması gerekmektedir. Termostabil selülazlar birçok endüstri alanında uygulama bulmuşlardır (Bhat, 2000; Peng ve ark, 2011). Kirlilik; liflerin yüzeylerinde ya da kumaş ile kirleticiler arasındaki itici güçlerin artması ve iç kısımlardaki yüzey tansiyonun düşmesiyle kirleticilerin iç yüzeylerde birikmeleridir. Çeşitli alkalin protezlar uzun zamandan bu yana protein materyalleri ile kirlenmiş giysilerin temizlenmesinde deterjanların güçlendirilmesi için biyolojik olarak kullanılmaktadır (Ito, 1997). Kumaşların temizlenmesi için kullanılan geleneksel deterjanların mekanizmaları, kirlenmiş lifler veya ipliklerin yüzeylerinde bulunan materyallerin enzimler (proteaz, amilaz, lipaz) ve yüzey aktif maddelerin fizikokimyasal etkileşimlerine dayanmaktadır. Fakat kirlilikler yalnızca pamuk liflerinin yüzeylerinde değil, aynı zamanda pamuk liflerinin iç kısımlarındaki amorf iç lif bölgelerinde de nüfuz etmiş olabilir. Geleneksel deterjanlarla yıkamalardan sonra dahi pamuk liflerinde kirlikler kalmaktadır. Alkalin selülazların aktiviteleri deterjanların alkalin bileşenleri ile uyumludur ve kıyafetlerin yıkanması için uygundur. Pamuk liflerinin yüzeylerindeki mikro fibrilleri uzaklaştırma yeteneği olan selülazlar pürüzsüz bir yüzey için pamuk liflerini onarması amacı ile çamaşır deterjanlarına eklenmiştir. Birçok yıkamadan sonra belirgin olarak selülazların anti-pamuklaşma etkileriyle yüzeyler pürüzsüzleşmektedir (Hoshino ve ark, 2000). 3

21 1.GİRİŞ Serkan HALİSKARANFİL Selülazların uygulama alanları ilk olarak kağıt, deterjan, tekstil, gıda ve yem endüstrilerinde biyomasın geri dönüşümünde uygulanmış olup dünya enzim piyasasında önemli bir yere sahiptir. Fosil yakıtların azalmasıyla geri dönüşümlü enerji ve yakıtlar için alternatif kaynakların bulunması ihtiyacı artmıştır, bunun sonucunda selülaz ve diğer enzimlerin kullanıldığı lignoselülozik biyomasın biyo-çevrimine yoğun bir ilgi başlamıştır. Tekstil endüstrisinde, kotların sünger taşı yerine biyolojik taşlanmasını sağlayarak daha fazla yumuşaklık ve solukluk kazandırılır. Kumaşlardan çıkıntı yapan küçük lif uçlarını kopartarak yumuşaklık ve defibrilasyonu sağlar. Selülazlar aynı zamanda gıda boyar maddelerinin üretimi ve karotenoidlerin ekstraksiyonunda da kullanılmışlardır (Sukumaran ve ark, 2005). Karbonhidrat içeren endüstriyel proseslerin büyük çoğunluğu özellikleri nedeniyle biyoteknolojik dönüşüme uygundurlar. Nişasta bitkisel karbohidratlar arasında çok önemli bir karbon ve enerji kaynağı olup, toplam biyo sentez içerisinde selülozdan sonra ikinci sırada yer almaktadır. En önemli nişasta kaynakları mısır, buğday ve patatestir (Buchholz ve Seibel, 2008). Enzimler nişasta endüstrilerinde başarılı bir uygulama alanı bulmuşlardır. α- amilazlar ilk olarak nişastayı oligosakkaritlere parçalamak için kullanılmıştır. Endüstriyel uygulamalarda kullanılan enzim 105 C de aktivite göstermeli ve 90 C de 1-2 saat stabil kalmalıdır (Aehle, 2007). Amilaz enziminin kullanımı dünya enzim piyasasında yaklaşık %25-33 lük bir pazara sahiptir. Günümüzde nişastanın hidroliz işlemlerinde özellikle gıda uygulamalarında kimyasallar yerini enzimatik hidrolize bırakmıştır (Rezaei ve ark, 2010). Ekmek ve fırıncılık ürünleri temel besin kaynaklarıdır. Her yıl dünya genelinde 600x10 6 tonun üzerinde buğday yetiştirilmektedir. Ekmek yapımında tarih boyunca enzimler çok önemli rol oynamışlardır. Antik mısırlarda dahi enzimlerin etkileri bilinmeden kullanılmışlardır. Ticari deterjanlarda kullanılan amilazlar Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus licheniformis ve Aspergillus türlerinden izole edilmiş termostabil α-amilazları içermektedir. α-amilazlar polisakkaritlerin içerdiği α-1,4 glikoz bağlarını hidrolize ederler. 4

22 1.GİRİŞ Serkan HALİSKARANFİL Enzim nişasta, glikojen ve oligosakkaritler üzerine rasgele etki gösterir. Çamaşır deterjanları için tercih edilen amilazlar hem toz hem de sıvı şekilde kullanılmaktadırlar. Diğer bir nişasta parçalayan enzim β-amilazlardır (E.C ), fakat bu enzim deterjan uygulamaları için endüstriyel boyutta ticarileşmemiştir. Nişastanın daha fazla parçalanması amilaz ve pullulanaz enzim sistemlerinin ortak kullanılmasıyla sağlanabilir (Aehle, 2007). α-amilazlar 1970 lerin başlangıcından beri deterjanlarda kullanılmakta olup bu ilginin artmasında farklı formdaki nişasta içeriklerinin (bebek maması, meyve püreleri, ketçap ve puding gibi) gıda ürünlerinde kullanılması yer almaktadır (Schafer ve ark, 2007). α-amilazlar nişasta içerikli kirliliklerin degradasyonunu katalizler ve kumaşa bağlanmış diğer kirlilik ve lekelerin nişasta kaynaklı yapışkanlığını hidrolizleyerek temizliğe katkı sağlar. Çamaşır deterjanlarında kullanılan amilaz enzimi partikül kirlenmesi ve nişasta kombinasyonu sonucunda beyaz kumaşların grileşmesini önler ve kirlenmiş kumaşların beyazlığının arttırılmasında katkı sağlar. Deterjanlara karıştırılan bakteriyel α-amilazlar proteazlarla birlikte tam uyum içerisinde kullanılmaktadır (Aehle, 2007). Mikrobiyal kaynaklı enzimler gıda, kağıt, tekstil ve deterjan endüstrilerinde geniş bir kullanım potansiyeline sahiptir. Endüstriyel önemlerinden dolayı uygun enzimleri üreten yeni bakteriyel suşların izolasyonuna olan ilgi devam etmektedir (Ghorbel ve ark, 2009). Mikrobiyal kaynaklar maaliyet, tutarlılık, üretim için daha az zaman harcanması, işlem modifikasyon ve optimizasyonunun kolaylığı gibi avantajlardan dolayı endüstriyel üretimler için kullanılmaktadır (Prakash ve Jaiswal, 2010). Endüstrinin hemen her alanında kullanılan enzimler genellikle mikroorganizmalardan elde edilmektedir. Bunun nedeni mikroorganizma kaynaklı enzimlerin bitkisel veya hayvan kaynaklı enzimlere göre katalitik aktivitelerinin çok yüksek olması, istenmeyen yan ürün oluşturmamaları, daha stabil ve ucuz olmaları, fazla miktarda elde edilebilmeleri gibi avantaja sahip olmalarıdır (Güven, 2011). Doğada özellikle bazı Bacillus türlerinde bu enzimler sentezlenmektedir (Ghorbel ve ark, 2009). 5

23 1.GİRİŞ Serkan HALİSKARANFİL Bacillus ların habitatları toprak olmasına rağmen doğada hava, su ve yiyecek gibi birçok ortamda bulunabilirler. Bu cins bakteriler, antibiyotik, enzim ve toksin üretimi gibi özellikleri ve kolay üretilebilmeleri nedeni ile bakteriler arasında dikkat çeken mikroorganizmalardır (Ediz ve Beyatlı, 2005). Bacillus cinsinin üyeleri selülaz ve amilaz gibi endüstriyel önemi yüksek çeşitli ekstrasellüler enzimler üretmektedirler (Ito, 1997; Ediz ve Beyatlı, 2005). Bacillus cinsinden üretilen selülaz, amilaz, pektinaz, proteaz gibi çeşitli termostabil alkalin hidrolitik enzimler birçok endüstriel alanda kullanılmaktadırlar (Aygan ve ark, 2011) Bacillus Cinsi Hakkında Genel Bilgiler Bacillus cinsi bakteriler çubuk şeklinde düz ya da düze yakın hücrelerdir. Çoğu zor şartlara dirençlidir. Peritriş flagellalı ve flagellaları hareketlidir. Aerobik ve fakültatif anaerob olup endospor oluştururlar. Tek ya da gruplar halinde gelişebilen, çift veya zincir şeklindedirler (Zemek ve ark, 1981). Vejetatif hücreler 0.5x1.2 μm ile 2.5x10 μm çapındadır. Geneli beyaz veya krem renkli kolonilere sahiptir. Bazı türlerinde sarı, pembe, portakal rengi ve siyah renklerde pigmentli kolonilere de rastlanır. Bacillus ların termofilik, mezofilik ve psikrofilik türleri bulunur. Çok yüksek sıcaklık derecelerinde bile canlı kalırlar. Genellikle C de ve ph 7.0 civarında ürerler. Karbon kaynağı olarak organik asit, şeker ve alkol içeren, nitrojen kaynağı olarak da amonyum bulunduran sentetik ortamlarda çok iyi ürerler. Bacillus cinsi uygun olmayan şartlarda spor oluşturma yeteneğindedir. Oluşturduğu endospor silindirik, oval, yuvarlak veya böbrek şeklinde olabilir. Buna ilaveten sporlar hücre içerisinde sentral ya da subterminal olarak yerleşebilir. Bacillus lar genellikle karbonhidrat kapsülü bulundururlar. Tipik habitatları toprak olmasına rağmen doğada geniş olarak, süt ve süt ürünlerinden, hava, su ve yiyecek gibi birçok ortamdan elde edilirler. 6

24 1.GİRİŞ Serkan HALİSKARANFİL Katalaz ve asit üretirler ama gaz oluşturmazlar. Bacillus ların bazı türleri yiyecekler için önemli olabilirler. Bazı Bacillus ların proteolitik enzimleri peynir yapımında kullanılabilir. Bu bakterilerin yağları ve proteinleri parçalama yetenekleri çok yüksektir. Bu nedenle de basiller, sürekli çürüme ve bozulma ortamında bulunurlar. Bazı türleri de böcek patojenidir. Bacillus ların birkaç türü polipeptit sınıfından antibiyotik üretir. Antibiyotiklerin kültürlerde sporulasyon aşamasında oluştuğu bildirilmiştir Bacillus'ların Önemi Bacillus cinsi bakteriler, antibiyotik, enzim ve toksin üretimi gibi metabolik özellikleri ile endüstriyel öneme sahip olmaları ve kolay üretilebilmeleri sebebiyle, bakteriler arasında dikkat çeken mikroorganizmalardandır. Ayrıca, sporlanma kabiliyetleri ve metabolizma faaliyetlerinin çeşitliliğinin, geniş bir çevreye yayılmalarında önemli avantajlar sağladığı da belirtilmektedir. Birçok biyoteknolojik çalışmada kullanılan Bacillus lar, ürettikleri proteinler nedeniyle ticari öneme sahiptirler (Kim ve ark, 2005; Annamalai ve ark, 2011b). Bacillus ların ürettiği endüstriyel enzimlerden olan selülaz ve amilazlar deterjan endüstrisinde; nötral proteazlar süt endüstrisinde; farklı amilaz ve pullulanazlar besin ve meyve suyu endüstrisinde kullanılmaktadır Bacillus'ların Habitatı Bacillus lar, sporları nedeniyle biyosferde birçok farklı çevreden izole edilebilirler. Cinsin asıl habitatı, çok çeşitli topraklardır. Toprak mikroflorasında yer alan Bacillus lar besin maddeleri açısından zengin topraklarda bulunabildikleri gibi, besince fakir topraklardan da izole edilebilirler. Örneğin, B. subtilis, B. licheniformis ve B. cereus kompleks besin maddelerine ihtiyaç duymazken, B. polymyxa ve B. azotofixans gibi türler geliştirmek için bitki rizosferine ihtiyaç duyarlar. 7

25 1.GİRİŞ Serkan HALİSKARANFİL Endospor yapan Bacillus türleri toprak, bitki rizosferi, gıda ve bazı canlıların bağırsak sistemlerinden izole edilebilirler. Bunun yanı sıra, Mosquito, Lepidoptera, Diptera ve Coleoptera böceklerinin larvalarından da izole edilmiştir. Birçok mikroorganizma çeşidi gibi Bacillus lar içinde önemli bir habitat olan topraktaki farklı ortam şartları, mikroorganizma çeşidinin de artmasına yol açar. Genel olarak iyi havalanmış, nemli ve yüksek organik materyal içeren toprakları seçen mikroorganizmalar, toprağın ilk 10cm lik üst kısmında yüksek sayıda bulunurlar. Topraktaki populasyon yoğunluğunun büyük bir kısmını bakteriler ( bakteri/1 gr toprak) oluşturur. Bacillus türleri toprakta geniş bir yayılıma sahip oldukları gibi deniz ve tatlı sularda, buraların sedimentlerinde de bulunabilirler. Bazı Bacillus lar ise ekstrem şartlarda büyüyebilme kapasitesindedirler ve üre içeren, yüksek ph değeri olan, asitli veya yüksek ısılı ortamlardan izole edilebilirler (Ediz ve Beyatlı, 2005). Bacillus türlerinin çeşitli besinlerde bulundukları ve besin maddelerinin dönüşümü ve bozulmalarında rol oynadıkları bilinmektedir Bacillus'ların Metabolizması Genelde prototrof oldukları halde, oksotrof türlere de rastlanır. Bacillus lar çok çeşitli metabolik özelliklerinin yanı sıra, geniş fizyolojik yetenekleri ile de psikrofilikten termofiliğe; asidofilikten alkalifiliğe; halotoleranttan halofiliğe geniş bir yelpazeye sahiptir ve bu nedenle endüstriyel uygulamalarda kullanılma potansiyelleri yüksektir. Bacillus sp. doğada geniş çapta yayılmaktadır. Çünkü bunların sporları olumsuz koşullara dayanıklıdır. Bacillus sp. laboratuvar kültüründe yaygın kontaminantlardır (Ediz ve Beyatlı, 2005) Enzimler ve Bazı Özellikleri Enzimlerin büyük bir kısmı proteindir. Enzimler bir polipeptit zincirinden daha fazla sayıda bileşenden meydana gelebilirler. Her bir polipeptit zinciri sahip olabileceği katalitik aktivite ve alt birimlere göre isimlendirilir. 8

26 1.GİRİŞ Serkan HALİSKARANFİL Enzimler aktif bölge olarak adlandırılan yapılarındaki bölgelerde özel katlanmalarla substratlara bağlanırlar. Bir enzimin aktif bölgesi 2 anahtar bölge içerir. Birincisi reaksiyon boyunca substrat ile etkileşim içinde olan bölge, diğeri ise enzimin kimyasal gruplarının substratla etkileşmesini sağlayan bağlanma bölgesidir (Lerner ve Lerner, 2003). Birçok kimyasal ve fiziksel parametre enzimin katalizleme oranı üzerinde etkilidir. Bu değişikliğin nedeni protein yapısının etkilenmesinden kaynaklandığı düşünülmektedir (Paulo ve Gübitz, 2003). Aktif bölgedeki amino asitlerin ph sı, polaritesi ve hidrofobik durumu enzim aktivitesini etkileyen faktörlerdir. Enzimler sahip oldukları fizyolojik ph da ve uygun bir ısıdaki sulu çözücülerde genel olarak oldukça aktiftirler. Çoğu enzim elektronlar, atomlar ya da atom gruplarının transferini katalizlerler. Bilinen enzimlerin binlercesi bu şekildedir, fakat bunlar biyolojik aktivitelerine göre sınıflandırılacak olunursa 6 büyük grup içerisini girerler: Oksiredüktazlar, transferazlar, hidrolazlar, liyazlar, izomerazlar ve ligazlardır. Enzimlerin genel olarak optimum aktivite gösterdikleri ph aralığı vardır. Ortam ph sı substrat iyonizasyonu ve aktif bölgedeki katalitik grupların iyonizasyonunu etkileyecektir. Elektostatik etkileşimler ph ile kontrol edilirler. Bir reaksiyonun ph sı, makromolekülün 3 boyutlu yapısı için kritik amino asitleri etkileyerek enzimin konformasyonunu kontrol edilebilir (Lerner ve Lerner, 2003). Çok sayıda kimyasal madde, enzimlerin katalitik aktivitelerine indükleyici ya da inhibe edici yönde etki etmektedir. Birçok inorganik iyonun enzimleri aktive ettiği belirtilmiştir. Aktivatör iyon, koenzim ya da kosubstrat kompleksindeki reaksiyona doğrudan dâhil edilebilir. (ör/ Fe iyonları ATP-Mg ya da flavin kompleksine bağlanır). Diğer yandan iyon, enzimin bir parçasıdır ve hem aktif konformasyon için düzenleyici olarak etki gösterir (alkalin fosfatazdaki Zn iyonları gibi) hem de aktif bölgeye doğrudan bağlanır (karboksipeptitazdaki Zn ya da Co iyonları gibi) (Aehle, 2007). İnhibitörler, enzimlerin bağlanmalarını değiştirerek aktivitelerini inhibe ederler. İnhibitörler substratın yapısına benzeyebilirler bu nedenle enzimin bağlanmasında substrat ile rekabet eder. İnhibitörler, büyük organik moleküller, küçük organik moleküller veya iyonlar olabilirler (Lerner ve Lerner, 2003). 9

27 1.GİRİŞ Serkan HALİSKARANFİL 1.3. Enzimlerin Numaralandırılması ve Sınıflandırılması Enzimler ilk olarak etki ettikleri substratlara göre sonlarına az eki getirilerek kullanılmıştır. Ancak bu sınıflandırma birden daha fazla enzim sistemini açıklamaya yetmemiştir. Enzim konseyinin raporlarına göre, enzimler katalizledikleri reaksiyon tipine bağlı olarak 6 ana grup içerisinde sınıflandırılmışlardır. Böylece kesin bir sınıflandırma yapılmıştır. Her gruptaki enzimlere özel kod numaraları (E.C.) verilmiştir. Her gruptaki enzimler alt gruplara ayrılmak üzere 4 noktalama işareti kullanılır; 1-İlk numara enzimin ait olduğu 6 sınıfın hangisini içerisine girdiğini göstermektedir, 2-İkinci noktalama alt sınıfı 3-Üçüncü noktalama enzimin alt-alt sınıfını ve 4-Dördüncü noktalama ise enzimin içinde bulunduğu alt-alt sınıftaki seri numarasını göstermektedir. Katalizledikleri reaksiyonlara göre sınıflandırılan enzimlerden, farklı enzimlerin aynı reaksiyonları gösterenlerine izoenzim denir (Paulo ve Gübitz, 2003). Enzimlerin gösterdikleri özelliklere göre sınıflandırıldığı altı grup aşağıdaki gibidir; Oksidoretükteazlar Bu sınıf redox reaksiyonlarını katalizleyen tüm enzimleri kapsar. İlk olarak dehidrojenaz olarak isimlendirilmişlerdir, ancak redüktaz olarak kullanılmaktadır. Oksidazlar yalnızca oksijen olduğunda kullanılan azaltıcı akseptörlerdir. Sistematik isimleri vericiye göre şekillenmiştir; akseptör oksidoredüktaz. 10

28 1.GİRİŞ Serkan HALİSKARANFİL Transferazlar Transferazlar fosfat, glycosyl, amino, acyl, metil gibi spesifik bir grubun bir maddeden diğerine transferini katalizler. Normal olarak akseptör gruptransferaz ya da verici grouptransferaz ismi önerilmiştir. Sistematik ismi ise vericiye göre şekillenmiş akseptör grup transferaz dır Hidrolazlar Hidrolazlar C-O, C-N, C-C ve diğer bazı bağların hidrolitik ayrılmalarını katalizlerler. Genellikle -az son eki ile substrat isminden ibaret bir isim önerilmiştir. Sistematik ismi her zaman hidrolaz içerir Liyazlar C-C, C-O, C-N ve diğer bağlar arasındaki ilişki liyazlar tarafından elemine edilir. Dekarboksilaz, aldolaz, dehitrataz gibi isimler alırlar (sırasıyla CO 2, aldehit ve suyu eleminine ederler). Sistematik isimleri ise substrat group-lyase şeklinde biçimlenir İzomerazlar İzomerazlar molekül içi geometrik ya da yapısal yeniden düzenlemeyi katalizler. İsomerizmin farklı tipleri, rasemaz, epimeraz, izomeraz, tautomeraz, mutaz veya sikloizomeraz gibi isimlendirmeler yol açmıştır Ligazlar Ligazlar iki molekülün bir birine bağlanmasını sağlarlar (Aehle, 2007). 11

29 1.GİRİŞ Serkan HALİSKARANFİL 1.4. Multienzimler Karbon döngüsünde yer alan organizmalar komplex substratları parçalamak için sinerjik etkili enzimler üretirler. Bu özellik organizmalara doğada önemli avantajlar sağlamaktadır (Dyk ve ark, 2010a). Bitkisel biyolojik kütleler pektik maddeler, hemiselüloz, ksilan, selüloz ve diğer polisakkaritlerden meydana gelmiş bir karışımdır. Hemiselüloz ve pektin polisakkaritlerin yanı sıra aromatik lignin polimerleri ile etkileşerek bitki hücre duvar yapılarının daha güçlü olasını ve sertlik kazanmasını sağlamaktadırlar. Bu nedenle bu polisakkaritlerin hızlı ve tam olarak hidrolizi için sadece β-glikozidaz, sellobiyohidrolaz ve endo-β-1,4-glukanaz gibi β-1,4-glikozidik zincirlerini parçalayan enzimler değil aynı zamanda diğer polisakkarit yapıları parçalayacak enzimlerin de varlığına ihtiyaç vardır (Pason ve ark, 2010). Bazı organizmalar selülaz ve ksilanaz gibi ekstraselüler enzimleri birlikte üretirler. Bu sayede komplex bitkisel materyallerdeki fermente edilebilir şekerlerin parçalanması oldukça etkili şekilde gerçekleştirirler (Dyk ve ark, 2010). Multienzimler iki veya daha fazla enzim içeren sistemler olarak tanımlanmışlardır. Multienzimlerin fonksiyonel birleşimler ve işbirlikleri onlara tek enzimlerden daha fazla avantajlar sunmaktadır. Şimdiye kadar multienzimler deterjan, besin ve yem endüstrilerinde önemli rol oynamışlardır (Zhang ve ark, 2004). Multienzim sistemleri (proteinaz, lipaz ve esteraz) doğal peynirlerin olgunlaştırılmalarında kullanılmışlardır. Yine multienzimler sindirilebilir yağların ekstraksiyonunda da kullanılmaktadırlar (Negi ve Banerjee, 2009) Nişasta ve Amilazlar Karbohidratlar (CH 2 O) n kimyasal formülüne sahip olup, karbon, oksijen ve hidrojenden meydana gelmektedirler. Çoğu karbohidratlar azot ve fosfor gibi farklı yapıları da içermektedirler. Karbohidratlar; monosakkaritler, oligosakkaritler ve polisakkaritler olmak üzere 3 temel gurupta sınıflandırılmaktadır. Bitkilerdeki en önemli polisakkaritler selüloz ve nişastadır. 12

30 1.GİRİŞ Serkan HALİSKARANFİL Nişasta granülleri hücreden hücreye geçmez bu nedenle doku içerisinde sentezlenmek zorundadır (Pallardy, 2008). Nişasta tüm yüksek bitkiler için önemli bir karbohidrat rezerv kaynağı olup suda çözünmez granüllerden oluşmaktadır. Bazı durumlarda kurumamış bir bitkinin %70 inden fazlasını oluştururlar. Nişastayı oluşturan granüllerin şekli ve büyüklüğü bitki türünden türüne değişmektedir (Aiyer, 2005). Nişasta, yüzlerce glikoz molekülünün α-1,4 ve α-1,6 glikozidik bağlarıyla bağlanması ile oluşmuş polisakkarittir. Nişasta 2 büyük kısımdan oluşur; amiloz ve amilopektin. Amiloz; glikoz monomerinn α-(1,4) glikozidik bağ ile bağlanarak oluşturduğu dallanmamış lineer yapıdır (nişastanın %20-30 u). Amilopektin; lineer yapıya ek olarak dallanmalar gösterir, amilozdan her 8-9 glikoz ünitesinden sonra α-(1,6) glikozidik bağla bağlanmış dallanmalar meydana getirir. Her dalda yaklaşık adet glikoz monomeri bulunmaktadır (Janecek, 2009; Schafer ve ark, 2007). Nişasta yapılarının diğer polimerler de olduğu gibi tamamen hidroliz olabilmesi için enzim kombinasyonlarına ihtiyacı vardır (Haki ve Rakshit, 2003). Nişastayı parçalayan enzimler amilazlar olarak adlandırılırlar. İlk olarak amilaz terimi amiloz, amilopektin, glikojen ve bunların parçalanma ürünlerinin α-1,4 glikozidik bağlarını hidrolizleyen enzimler olarak tanımlanmışlardır (Janecek, 2009; Aiyer, 2005). Amilazlar 2 kategori içerisinde sınıflandırılabilirler; endoamilazlar ve ekzoamilazlar. Endoamilazlar nişasta molekülünün iç kısımlarında rastgele hidroliz gerçekleştirerek, düz ve dallanmış farklı uzunluktaki oligosakkaritleri meydana getirirler. Ekzoamilazlar arka arkaya indirgenmemiş son uçlara etki ederek kısa son ürünlerin oluşmasını sağlarlar (Reddy ve ark, 2003). Son zamanlarda nişasta ve benzer polisakkaritleri parçalayabilen yeni enzimler belirlenmiştir. Bu yapılardaki α-1,4 veya α-1,4 ve/veya α-1,6 bağlarını parçalayan mikrobiyal orijinli enzimleri, 6 sınıf içerisinde toplamak mümkündür. 1. α-1,4 bağlarını hidrolizleyen (Liu ve ark, 2010) ve α-1,6 bağlarını atlayan endo etkili α-amilazlar, 13

31 1.GİRİŞ Serkan HALİSKARANFİL 2. α-1,4 bağlarını hidrolizleyen ve α-1,6 bağlarını geçemeyen β-amilazlar, bunlar ekzo ekili olup son ürün olarak yoğun şekilde maltoz açığa çıkartırlar, 3. α-1,4 ve α-1,6 bağlarını hidrolizleyen ekzo etkili amiloglikozidazlar (glikoamilaz), 4. Yanlızca α-1-6 bağlarını hirdolizleyen pullulanaz ve diğer dallanma hidrolizleyici enzimler, 5. Amiloz ve amilopektin üzerine diğer enzimlerin etkileriyle oluşmuş kısa zincirli oligosakkarilerdeki α-1,4 glikozidik bağlarını hidrolizleyen α- glukozidazlar, 6. Nişatayı siklodekstrin (cyclodextrin) adı verilen indirgenmemiş siklik D- glukozil polimerlerine hidrolizleyen enzimler (Aiyer, 2005). Amilazlar en önemli enzimler arasında yer almakta ve biyoteknoloji uygulamalarında önemli bir yer tutmaktadırlar. Bitkiler, hayvanlar ve mikroorganizmalar gibi çeşitli kaynaklardan elde edilebilmelerine rağmen mikrobiyal kaynaklı enzimler endüstri için daha önemlidirler (Burhan ve ark, 2003). Mantar ve bakteri kaynaklı enzimler modifikasyon ve optimizasyonlarının kolaylığı, üretimlerinin daha az zaman alması ve düşük maliyetli olmaları gibi avantajlarından dolayı endüstriyel uygulamalarda önemli bir role sahiptirler (Prakash ve Jaiswal, 2010). Amilazların endüstriyel önemlerinden dolayı deterjan endüstrisi için alkalin amilaz gibi enzim üretebilen yeni bakteriyel suşların izolasyonu konusunda yoğun çalışmalar vardır (Burhan ve ark, 2003). α-amilazlar amiloz zincirindeki glikoz birimleri arasında bulunan α-1,4 bağlarını rastgele parçalayarak; glukoz, maltoz ve maltotirioz birimlerine çeviren ekstrasellüler enzimlerdir (Bano ve ark, 2011; Hoshino ve ark, 2006). α-amilazlar endüstriyel alanda nişasta hidrolizinde yaygın olarak kullanılmaktadırlar (Buchholz ve Seibel, 2008). Çoğu α-amilazlar yapılarında Ca +2 ve Na + bulunduran metallo enzimlerdir. Ca +2 α-amilazın doğru konformasyon, termostabilite ve aktivitesinin sürdürülebilmesinde çok önemli rol oynamaktadır (Liu ve ark, 2010). 14

32 1.GİRİŞ Serkan HALİSKARANFİL Amilazların Kullanım Alanları Amilazlar, biracılık ve damıtma, kağıt, fermantasyon, gıda, tekstil ve nişastanın şekerleştirme uygulamalarında (Rezaei ve ark, 2010; Kumar ve ark, 2010; Annamalai ve ark, 2011b; Asgher ve ark, 2007) yaygın bir kullanım göstermekle birlikte, klinik, medikal ve analitik kimya gibi diğer bazı alanlarda da kullanılmaktadırlar (Reddy, 2003) Deterjan Endüstrisi Deterjanlardaki enzimler, daha verimli bir yıkamanın oluşabilmesi için kirlilikleri küçük parçalara ayırır ve onların uzaklaştırılmasını arttırır. Bu amaçla amilazlar nişasta ve türevlerinin uzaklaştırılması için kullanılır (Tanaka ve Hoshino, 1999; Paulo ve Gübitz, 2003; Souza ve Magalhaes, 2010). α-amilazlar 1970 lerin başlangıcından beri deterjanlarda kullanılmaktadırlar. Nişasta tekstil ürünleri üzerinde bir film oluşturduğundan, tekstil ürünleri yüzeylerindeki nişastanın uzaklaştırılması bu enzimler tarafında gerçekleştirilir (Schafer ve ark, 2007). Özellikle alkalin amilazlar deterjan endüstrisinde kullanılmıştır (Aiyer, 2005) Gıda Endüstrisi Bu enzimler şekerleştirme, meşrubat ve gıda endüstrilerinde nişastalı maddelerin şekerleştirilmesi ve sıvılaştırılması gibi uygulamalarda geniş bir kullanım bulmuştur (Aehle, 2007). Gıda endüstrisinde α-amilazlar undaki nişasta içeriklerinin daha iyi parçalanabilmesi için ekmek hamurlarına eklenmiş ve böylece hamurun viskozitesi azaltılmış, fermantasyon hızı arttırılarak ürünlerin yapısı ve hacmi arttırılmıştır. α-amilazlar bayatlamayı önleyici olarak kullanılıp unlu mamullerin yumuşaklığının korumasına yardım eder, böylelikle ürünlerin raf ömrünü uzatır (Aehle, 2007; Souza ve Magalhaes, 2010). Ayrıca şeker kamışı suyundaki sakkaroz bileşenlerinin parçalanmasında da kullanılmıştır. 15

33 1.GİRİŞ Serkan HALİSKARANFİL Dondurma ve diğer dondurulmuş gıdalarda buz kristallerinin oluşumunu geciktirmesinden dolayı maltodextrin üretiminde kullanılmıştır (Polaina ve MacCabe, 2007). Amilazlar tatlandırıcı ve intravenöz seker takviyesi olarak geniş ölçüde kullanılan maltozların üretiminde kullanılmaktadırlar. Bunun için özellikle patates, mısır, tatlı patates ve cassava kullanılmıştır. Bunun yanında amilazlar, yüksek furuktoz içerikli şurupların mısır nişastasından oligosakkarit karışımlarının elde edilmesinde kullanılmışlardır (Aiyer, 2005) İçecek Endüstrisi Meyve suyu üretiminde meyvelerdeki nişasta yapılarının parçalanması amacıyla kullanılmıştır. Amilazlar biracılıkta arpadan malt eldesi sırasında arpanın nişasta içeren endosperminin parçalanmasında kullanılmış olup, oluşan pürelerin filtrasyonları hem daha hızlı hem de daha kolay gerçekleştirilmektedir (Aehle, 2007) Yem Endüstrisi Kümes hayvanlarının mısır temelli yemlerinde nişastanın sindirilebilirliğini arttırmak için diğer enzimlerle birlikte kullanılmış, özellikle sütten yeni kesilmiş domuzların beslenmesinde yem katkısı olarak kullanılmış ve kullnılmaktadır (Aiyer, 2005; Aehle,2007) Tekstil Endüstrisi Tekstil ürünlerinin dokuma işlemlerinde daha sağlam olması için uygulanan haşıllama işleminden sonra nişastanın uzaklaştırılması için kullanılmıştır (Paulo ve Gübitz, 2003; Aiyer, 2005; Aehle, 2007; Souza ve Magalhaes, 2010). 16

34 1.GİRİŞ Serkan HALİSKARANFİL Diğer Alanlar Amilaz enzimleri belirtilen alanların yanı sıra kozmetik ve protez dişlerdeki nişastalı kalıntılarının temizliğinde kullanılmaktadır (Aehle, 2007). Etanol en çok kullanılan sıvı bio yakıttır. Etanol üretimi için dünyanın birçok yerinde hem kolay bulunan ham madde hem de ucuz olmasından dolayı nişasta en çok kullanılan substrat olmuştur. Bu işlemde nişasta hidroliz için sıvılaştırma ve şekerleştirme adı verilen iki enzimatik uygulama ile fermente edilebilir şekerlere dönüştürülür. Bu işlemler için amilolitik enzimlere gereksinim vardır. Amilaz enzimi, kağıt endüstrisinde de kullanım alanı bulmuştur. Yazma işleminin daha kaliteli olması için kağıt yüzeylerinin daha pürüzsüz ve sert olması amacıyla kaplama işlemi yapılır. Nişasta mükemmel bir haşıllama ajanı olarak kullanılmış ve bu şekilde kağıtlara dayanıklılık ve sertlik kazandırılmıştır. İşlem tamamlandıktan sonra fazla nişastanın uzaklaştırılması için amilazlar kullanılmıştır (Souza ve Magalhaes, 2010) Selüloz ve Selülazlar Selülozik materyaller kimyasal ve ya enzimatik çevrim ile etanol üretimi için substrat olarak kullanılabilen ve doğada en bol bulunan geri dönüşümlü biyokütledir (Andriani ve ark, 2011). Selüloz biyolojik parçalanmaya karşı doğal olarak dayanıklı olup sağlam ve çözünmez yapısıyla diğer polisakkaritlerden farklıdır (Yang ve ark, 2010). Selüloz, bitki biyokütlesinin yaklaşık %40 ını oluşturmaktadır. Yaklaşık glikoz biriminin ß-1,4- glikozidik bağlar ile lineer bir şekilde bağlanması ile oluşur. Selülozun suya karşı yüksek bir çekiciliği olmasına rağmen, suda hiç çözünmez. Selüloz en az üç farklı enzimin sinerjistik çalışması ile glikoza hidrolize olabilir (Kıran ve ark, 2006). Selülazlar; selülozlardaki β-1,4 bağlarını hidroliz ederek son ürün olarak glukoz, sellobiyoz ve sello-oligosakkaritleri meydana getirirler. 17

35 1.GİRİŞ Serkan HALİSKARANFİL Selülaz enzimlerinin üç ana tipi vardır; sellobiyohidrolazlar (1,4-β-D-glucan sellobiyohidrolaz, EC ), endo-β-1,4-glukanaz (EG yada endo-1,4-β-dglukan 4-glukanhidrolaz, EC ) ve β-glukozidaz (BG, EC ) (Sukumaran ve ark, 2005). Endoglukanazlar selülozları rastgele parçalayarak oligosakkaritleri, sellobiyozları ve glukozları oluştururken, ekzoglukanazlar (sellobiyohidrolazlar) selülozdaki β-1,4-d-glukozidik bağlarını hidrolizleyerek indirgenmemiş uçlardan sellobiyozların serbest kalmasını sağlarlar. β-glikozidazlar ise sellobiyozları glikoza hidrolize ederler (Haki ve Rakshit, 2003). Selülozun enzimatik hidrolizi için genellikle selülaz salgılayan mikroorganizmaların ortama doğrudan ilave edilmesi şeklinde uygulamalar gerçekleştirilmiştir. Ancak elde edilen verimin düşük olduğu görülmüştür. Bununla beraber, selülozu selülaz ile doğrudan muamele etmek daha iyi bir çözüm olarak ortaya çıkmıştır. Bu işlem öncelikle selülazın üretilmesi, kısmen saflaştırılması ve hidroliz çalışmaları için kullanılması şeklinde gerçekleştirilir. Pek çok mikroorganizmanın selülaz ürettiği bulunmuştur. Enzimatik hidroliz, enerjinin idareli kullanılması ve toksik maddelerin veya aşındırıcı asitlerin kullanılmasına ihtiyaç bırakmamasından dolayı oldukça avantajlıdır. Bu nedenle selülozun, selülaz ile hidrolizi yaygın şekilde araştırılan bir konudur. Selülazın, selülozun yüzeyine yapıştığı ve substrat boyunca hareket ederek bir takım katalitik reaksiyonları gerçekleştirdiği bulunmuştur. Enzim, substrat tan ayrılarak ve substrat ın başka bir bölgesine yapışarak katalitik aktivitesini göstermektedir (Kıran ve ark, 2006). Selülazlar birçok alandaki kullanımlarından dolayı dünya genelinde üçüncü en büyük endüstriyel enzimlerdir. Mikroorganizmalar arasında aerobik, anaerobik bakteriler, beyaz çürükçül ve yumuşak çürükçül mantarlar ve anaerobik mantarlara kadar selülaz üretimi yaygındır. Selülazlara karşı ortaya çıkan talep çeşitli uygulamalarda kullanılabilirliğinden dolayı sürekli artmaktadır. Tekstil, deterjan, kağıt endüstrisi selülazların kullanıldığı birkaç endüstriel alandır. 18