Hindi Etlerinden Salmonella spp., Listeria monocytogenes ve Clostridium perfringens in Saptanması ve Karakterizasyonu

Transkript

1 T.C. ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ KESİN RAPORU Proje Başlığı HİNDİ ETLERİNDE SALMONELLA SPP., LISTERIA MONOCYTOGENES VE CLOSTRIDIUM PERFRINGENS İN SAPTANMASI VE KARAKTERİZASYONU Proje Yürütücüsünün İsmi PROF. DR. İRFAN EROL Proje Numarası Başlama Tarihi 2005 Bitiş Tarihi 2007 Rapor Tarihi Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara 2007

2 I: Projenin Türkçe ve İngilizce Adı ve Özetleri Projenin Türkçe Adı: Hindi Etlerinden Salmonella spp., Listeria monocytogenes ve Clostridium perfringens in Saptanması ve Karakterizasyonu Projenin İngilizce Adı: Detection and Characterization of Salmonella spp., Listeria monocytogenes and Clostridium perfringens in Turkey Meat Özet: Bu çalışmada, Ankara daki marketlerde Haziran Ocak 2006 tarihleri arasında satışa sunulan 3 farklı firmaya ait, paketlenmiş formda hindi but, göğüs ve kuşbaşı etlerinden Salmonella spp., Listeria monocytogenes ve 1 Clostridium perfringens in: i) klasik kültür ve/veya immuno manyetik separasyon (IMS) teknikleri ile izole edilmesi, ii) izolatların PCR ile doğrulanması ve ayrıca Clostridium perfringens izolatlarının enterotoksin oluşumundan sorumlu olan cpe geninin varlığı yönünden incelenmesi ile iii) izolatların antibiyotik duyarlılık profilinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Çalışmada toplam 180 hindi eti örneğinin 55 inden (% 30.5) Salmonella spp., 24 ünden (% 13.3) L. monocytogenes ve 22 sinden (% 12.2) C. perfringens izole edilmiştir. PCR tekniği ile 55 Salmonella spp. izolatının 55 inde (% 100) inva geni, 24 L. monocytogenes izolatının 23 ünde (% 95.8) hlya (listeriolysin O) geni, 22 C. perfringens izolatının 22 sinde (% 100) cpa geni tespit edilmiştir. Bu 22 C. perfringens izolatında cpe geninin varlığına rastlanmamıştır. İzolatların antimikrobiyel duyarlılık profilleri disk difüzyon yöntemi ile belirlenmiştir. Çalışmada Salmonella spp. izolatlarında en fazla dirençlilik % 50.9 ile tetrasikline karşı bulunurken bu antibiyotiği % 41.8 ile nalidiksik asit, % 40.0 ile streptomisin ve ampisilin, % 5.4 ile gentamisin izlemiştir. Çoklu direnç bulgusu olarak 5 izolatın 2 antibiyotiğe, 17 izolatın 3 antibiyotiğe, 6 izolatın 4 antibiyotiğe karşı dirençli olduğu saptanmıştır. L. monocytogenes izolatlarından 19 unun (% 82.6) penisiline, 17 sinin (% 73.9) ampisiline karşı dirençli olduğu görülmüştür. İzolatlardan 16 sının ise 2 antibiyotiğe karşı çoklu direnç gösterdiği saptanmıştır. C. perfringens izolatları arasında en fazla dirençlilik % 100 ile trimetoprime karşı bulunurken, bu antibiyotiği % 86.3 ile gentamisin, % 13.6 ile tetrasiklin ve siprofloksasin izlemiştir. Çoklu antibiyotik direnci profiline bakıldığında 17 izolatın 2 antibiyotiğe, 4 izolatın 3 antibiyotiğe karşı dirençli olduğu saptanmıştır. Bu çalışma kapsamında incelenen örneklerin önemli bir bölümünün Salmonella spp., Listeria monocytogenes ve Clostridium perfringens ile kontamine olması ve izolatların

3 değişik antibiyotiklere dirençli bulunması halk sağlığı yönünden potansiyel bir sorun olarak değerlendirilebilir. Bu nedenle üretimin hijyenik koşullarda yapılmasına ve hayvansal gıda üretiminde kullanılan hayvanlarda, antibiyotiklerin profilaktik ve gelişmeyi arttırıcı amaçlı kullanımına ilişkin regülasyonların uygulanmasına özen gösterilmelidir. Summary: The objectives of this study were i) to determine the incidence of Salmonella spp., Listeria monocytogenes and Clostridium perfringens by culture technique and immunomagnetic separation (IMS) in packaged fresh brisket, leg and turkey meat cuts from 3 different producers marketed in Ankara, from June 2005 to January 2006, ii) to verify the isolates by PCR and to detect cpe gene which is responsible for the producing of enterotoxin from C. perfringens isolates, and iii) to detect the antibiotic susceptibility profiles of the isolates by disc diffusion method. In the study 55 (30.5 %) Salmonella spp., 24 (13.3 %) L. monocytogenes and 22 (12.2 %) C. perfringens were isolated from a total of 180 turkey meat samples. According to the PCR analysis, inva gene was detected in 55 Salmonella spp., hlya (listeriolysin O) gene was detected in 23 L. monocytogenes and cpa gene was detected in 22 C. perfringens isolates. In none of the C. perfringens isolates cpe gene was detected. Isolates were tested for antibiotic susceptibility profiles by disc diffusion technique. As a result Salmonella spp. isolates were most often found to be resistant to tetracycline (50.9 %), nalidixic acid (41.8 %), streptomycin and ampicillin (40.0 %) and gentamicin (5.4 %). Multiple antibiotic resistance was observed such as: 5 isolates were resistant to 2 antibiotics, 17 isolates to 3 antibiotics and 6 isolates to 4 antibiotics. Nineteen isolates of L. monocytogenes showed resistance against penicillin (82.6 %) and 17 isolates to ampicillin (73.9 %). In addition to that 16 isolates were multiple resistant to 2 antibiotics. C. perfringens isolates were most often found to be resistant to trimethoprim (100 %) and gentamicin (86.3 %). Relatively lesser resistance was observed against tetracycline and ciprofloxacin (13.6 %). Multiple antibiotic resistance were observed as followed, 17 isolates to 2 antibiotics and 4 isolates to 3 antibiotics. Based on the results of this study, turkey meat was found as a significant source of main foodborne pathogens such as Salmonella spp., L. monocytogenes and C. perfringens, and also high number of the isolates were found to be resistant to some of the widely used antibiotics. It is concluded that turkey meat must be produced under suitable hygienic and 2

4 technological conditions and antibiotics in animals. attention should be paid for current regulation using the II: Amaç ve Kapsam Bu projede; i) Salmonella spp., Listeria monocytogenes ve Clostridium perfringens in klasik kültür ve/veya immuno manyetik separasyon (IMS) teknikleriyle karşılaştırmalı olarak izolasyonu, ii) izolatların inva (Salmonella), hlya (listeriolysin O) (Listeria monocytogenes), cpa ve cpe (Clostridium perfringens) genlerinin PCR ile saptanması, iii) izolatların antibiyotik dirençliliklerinin belirlenmesi, iv) mevsimsel etkinin saptanması amaçlanmıştır. III: Materyal ve Yöntem 3.1 Materyal Bu çalışmada Ankara daki marketlerde, Haziran Ocak 2006 tarihleri arasında satışa sunulan 3 farklı firmaya ait 60 göğüs, 60 but ve 60 kuşbaşıdan oluşan, toplam 180 hindi eti örneği materyal olarak kullanıldı. Göğüs ve but örnekleri yüzeyden alındı. Mevsimsel etki de dikkate alınarak, örneklerin 90 ı Kasım, Aralık ve Ocak aylarında, 90 ı Haziran, Temmuz ve Ağustos aylarında alındı. Paketlenmiş olarak alınan örnekler, soğuk zincir altında laboratuvara getirildikten hemen sonra Salmonella spp., Listeria monocytogenes ve Clostridium perfringens yönünden kültür tekniği ile, Salmonella spp. ve Listeria monocytogenes için aynı zamanda IMS tekniği ile analiz edildi. 3.2 Yöntem Salmonella spp., Listeria monocytogenes ve Clostridium perfringens in kültür tekniği ile izolasyon ve identifikasyonu Örneklerden Salmonella spp. izolasyonunda ISO 6579 (The International Organization for Standardization) (Anon, 2002), FDA (Food and Drug Administration) (Anon, 2003a) ile Flowers ve ark. (1992) tarafından bildirilen yöntem; Listeria monocytogenes izolasyonunda, USDA (United States Department of Agriculture) ve FSIS (Food Safety and Inspection Service) tarafından önerilen yöntem (Lee ve McClain, 1989); Clostridium perfringens 3

5 izolasyonunda, Labbe (1989), Baumgart ve ark. (1990), Schalch ve ark. (1996) ile Baumgart (1997) tarafından bildirilen yöntem uygulandı Salmonella spp. izolasyonu: Her bir hindi eti örneğinden aseptik koşullarda steril plastik torbalara 25 er gr tartılıp, üzerine 225 er ml tamponlanmış peptonlu su (TPS) ilave edildikten sonra karışım stomacherde (AES, AESAP 1068-Easy Mix) 2-3 dakika homojenize edildi. Elde edilen homojenat ön zenginleştirme amacıyla 37 o C de 24 saat inkübe edildi. Ön zenginleştirme işlemini takiben selektif zenginleştirme amacıyla Rappaport-Vassiliadis Broth (RVB, Oxoid CM 0669), Selenite Cystine Broth (SCB, Oxoid CM 0699) ve Tetrathionate Brotha (TTB- American formulation, Oxoid CM 6671) ekim yapılarak, sırasıyla 42 o C, 37 o C ve 42 o C de 24 saat inkübe edildi. Selektif zenginleştirme sıvı besi yerlerinden Brilliantgreen Phenol-red Lactose Sucrose Agara (BPLS, Merck 7237) ve Xylose-Lysine Deoxycholate Agara (XLD, Oxoid CM 0469) ekim yapılarak plaklar 37 o C de saat inkübe edildi. İnkübasyon sonrası BPLS ve XLD agarda üreyen tipik kolonilerden biyokimyasal testler (TSIA testi, LIA test,,üreaz testi) yapıldı. TSIA testi pozitif, LIA testi pozitif ve üreaz testi negatif olan koloniler Salmonella şüpheli olarak değerlendirildi. Biyokimyasal test sonuçları şüpheli olan örneklerden polivalan Salmonella antiserumu (Denka Seiken AS ) ile yapılan test sonucu aglütinasyon veren koloniler Salmonella olarak değerlendirildi. Elde edilen izolatlar ileri analizler için yatık agarda 4 o C de ve gliserinli buyyonda - 85 o C de muhafaza edildi Listeria monocytogenes izolasyonu: Her bir hindi eti örneğinden 10 ar g steril plastik torbaya konulup üzerine 90 ar ml University of Vermont Medium-Modified Listeria Enrichment Broth (UVM Difco 0223) ilave edilip stomacherde (AES, AESAP 1068-Easy Mix) 2-3 dakika homojenize edildi. Homojenat ön zenginleştirme amacı ile 30 C'de saat inkübasyona bırakıldı. Ön zenginleştirme işleminden sonra asıl zenginleştirme işlemi Fraser Broth da (Oxoid CM 0895) 35 C'de saat inkübe edilerek yapıldı. Asıl zenginleştirme brothundan Modifiye Oxford Agar a (MOX, Oxoid CM 0856) ekim yapılarak, plaklar 35 C' de saat inkübasyona bırakıldı. Koyu kahverenkli, etrafı siyah haleli, 1-2 mm çaplı Listeria şüpheli kolonilerden biyokimyasal testler yapılmak üzere, TSA-YE ye (Tryptic Soy Agar-Yeast Extract; Oxoid CM YE ilave edilmiş) geçildikten sonra plaklar 30 C de saat inkübe edildi. TSA-YE de üreyen kolonilerden sırası ile; Gram boyama, katalaz (% 3 lük H 2 O 2 ile), oksidaz (Bactident oxidase, Merck 3300) ve SIM 4

6 mediumda (Sulphate Indole Motility Medium; Merck 5470) hareketlilik testleri yapıldı. İzole edilen Listeria ların identifikasyonu amacıyla % 7 lik koyun kanlı agarda ß-hemoliz ile L- ramnoz, D-ksiloz, D-mannitol, nitrat redüksiyon ve CAMP testleri yapılarak izolatların identifikasyonu gerçekleştirildi. Elde edilen izolatlar ileri analizler için yatık agar 4 o C de ve gliserinli buyyonda -85 o C de muhafaza edildi Clostridium perfringens izolasyonu: Her bir hindi eti örneğinden aseptik koşullarda steril kavanozlara 10 ar gram tartılıp, 90 ar ml Perfringens Enrichment Medium (PEM, Fluid Thioglycollate Medium: Merck 8191+D-Cyclocerine Merck 8097) ilave edilerek, kavanozların üzeri steril parafin ile kapatılıp, anaerob koşullarda, 46 o C de 20 saat süre ile inkübe edildi. Zenginleştirme sonrası gaz ve bulanıklık oluşan kavanozlardan bir öze dolusu Tryptose Sulfite Cycloserine (TSC Agar, Merck 1972) agara ekim yapılarak plaklar anaerob koşullarda (Oxoid Anaerojar, AG0025A - Gas generating kit, Oxoid BR 0038), 46 C de 20 saat inkübe edildi. TSC agarda anaerob koşullarda üreyen siyah renkli C. perfringens şüpheli kolonilerden biyokimyasal testler yapıldı. Gram boyama, katalaz (% 3 H 2 O 2 ), asit fostafaz, hareketlilik, nitrat, laktoz-jelatin ve reverse-camp (S. agalactia ile) testleri yapılarak identifikasyon gerçekleştirildi IMS tekniği ile Salmonella spp. izolasyonu: İmmunomanyetik separasyon amacıyla Salmonella spp. için Dynabeads anti-salmonella (Dynabeads M-280 anti-salmonella, ) kullanıldı. TPS de, ön zenginleştirmesi yapılan homojenattan 1ml alınarak içlerinde 20 µl anti- Salmonella immunomanyetik mikropartüküller (Dynal) bulunan 1.5 ml lik steril santrifüj tüplerine ilave edildi. Süspansiyon immunomanyetik separasyona tabi tutuldu. Prosedürde belirtildiği şekilde phosphate-buffered saline (PBS, ph 7.5, Oxoid BR 014) ile yıkama işlemi yapıldı (Dynal). PBS ile son yıkamadan sonra beadler % 0.1 Tween 20 (Merck ) içeren 100 µl steril PBS içerisinde yeniden süspanse edildi. Konsantre edilen bu sıvıdan BPLS ve XLD Agara ekimler yapılarak bu plaklarda üreyen tipik kolonilerden gerekli testler klasik kültür yönteminde belirtildiği şekilde uygulandı. 5

7 3.2.6 IMS tekniği ile L. monocytogenes izolasyonu: İmmunomanyetik separasyon amacıyla Listeria spp. için Dynabeads anti-listeria (Dynabeads anti-listeria, ) kullanıldı. Half Fraser Brothda ön zenginleştirmesi yapılan homojenattan 1ml alınarak içlerinde 20 µl anti-listeria immunomanyetik mikropartiküller (Dynal) bulunan 1.5 ml lik steril santrifüj tüplerine ilave edildi. Süspansiyon immunomanyetik separasyona tabi tutuldu. Prosedürde belirtildiği şekilde phosphate-buffered saline (PBS, ph 7.5, Oxoid BR 014) ile yıkama işlemi yapıldı (Dynal). PBS ile son yıkamadan sonra beadler % 0.1 Tween 20 (Merck ) içeren 100 µl steril PBS içerisinde yeniden süspanse edildi. Konsantre edilen bu sıvıdan MOX Agara ekimler yapılarak bu plaklarda üreyen tipik kolonilerden gerekli testler klasik kültür yönteminde belirtildiği şekilde uygulandı PCR Tekniği Salmonella spp. için PCR Tekniği Salmonella spp. için PCR koşullarının optimizasyonunu takiben Widjojoatmodjo ve ark., (1991), Fluit ve ark., (1993) ve Erol ve ark., (1999) tarafından önerilen protokol gereği oric gen sekansını oluşturan primer çiftleri (5 -TTA TTA GGA TCG CGC CAG GC-3 5 -AAA GAA TAA CCG TTG TTC AC-3 ) kullanılarak PCR işlemi yapıldı. DNA ekstraksiyonu için yatık TSA da 4 o C de muhafaza edilen izolatlar BHI broth içerisinde 24 saat zenginleştirildi. Kültürden 1 ml ependorf tüpüne alınarak soğutmalı santrifüjde (Eppendorf Centrifuge 5417R) 10 o C de 5000 rcf de 15 dk. santrifüj edildi. Üstte kalan kısım atılarak tortuya 1 ml steril bidistile su konularak vortekslendi. 10 o C de 5000 rcf de 5 dk santrifüj edildikten sonra üstteki sıvı kısım alınarak 200 µl steril bidistile su ile homojenize edildi. 95 o C lik su banyosuna (Memmert WB/OB 7-45, WBU45) konularak 20 dk bekletildi ve işlemin sonunda hemen buz üzerine alındı. Hazırlanan bu DNA ekstraktından 10 µl alınarak 40 µl PCR karışımına [1xReaksiyon buffer (M890A, Promega, flexi buffer), 100 µm dntp mix (U1515, Promega), 2 U Taq DNA Polimeraz (M8305, Promega, 500U), her birinden 0.5 µm primer ve 1.5 mm MgCl 2 (A351H, Promega, 25 mm)] ilave edildi ve toplam 50 µl lik karşımın üzeri mineral yağ ile kapatıldı. Thermocycler da (Biometra, Personal cycler) 94 o C de 1 dakika denatürasyon, 53 o C de 1 dakika bağlanma, 72 o C de 1 dakika uzatma aşamalarını kapsayan 35 siklus ve sonunda 72 o C de 10 dakika bekletilerek amplifikasyon yapıldı. Amplifikasyon ürünleri bir sonraki aşamaya kadar 4 o C de tutuldu. Elde edilen PCR ürünlerinden 10 µl alınarak, 2 µl phicol brom 6

8 phenol blue ile boyanarak, 1 µl/ml ethidium bromide (% 0.1) ile boyanan % 1.5 lik agaroz jelde, 100 Volt elektrik akımında 1 saat yürütülerek elektroforez (Biometra) işlemi yapıldı. Agaroz jel transiluminatöre (Biometra TI1 UV) transfer edilerek, oluşan spesifik bandlar DNA marker ve pozitif kontrol (ATCC 14028) yardımıyla UV ışığı altında değerlendirildi. OriC genine özgü 163 bp ağırlığındaki DNA bandları pozitif olarak kabul edildi ve jellerin dokümantasyonu (Syngene GeneGenius imaging system) yapıldı Listeria monocytogenes için PCR Tekniği L. monocytogenes izolatlarının PCR ile analizinde, Bohnert ve ark. (1992) tarafından önerilen hlya gen sekansını oluşturan (5 - GAA TGT AAA CTT CGG CGC AAT CAG-3 ; 5 -GCC GTC GAT GAT TTG AAC TTC ATC-3 ) primer çifti kullanıldı. DNA ekstraksiyonu için -85 C de cryovialde veya 4 C de yatık agarda saklanan izolatlar BHI brotha geçilerek 30 C de 24 saat inkübe edildi. İnkübasyon sonrası türbidite oluşmuş BHI brothdan 1 ml hücre süspansiyonu, 1.5 ml lik santrifüj tüplerine alınarak 5000 g de (Eppendorf Centrifuge 5417R) 15 dakika santrifüj edillip, santrifüjün ardından süpernatant atılarak 1 ml steril distile su ile dipte kalan pelet vortekslenerek resüspanse edildi. Tüpler 10 C de 5000 g de 5 dakika santrifüj edildikten sonra süpernatant atılıp ve pelet 100 µl steril distile su ile vortekslenerek resüspanse edildi. Elde edilen hücre süspansiyonu 95 C de su banyosunda (Memmert WB/OB 7-45, WBU 45) 20 dakika süreyle bekletildi. PCR amplifikasyonu için, toplam 50 µl hacimde, bileşiminde 1 x PCR buffer (M890A, Promega, flexi buffer), 1.5 mmol 1-1 MgCl 2 (A351H, Promega, 25 mm), her birinden 100 µmol 1-1 olacak şekilde dntp mix (U1515, Promega), her bir primerden 1 µmol 1-1, 2 U Taq DNA polymerase (M8305, Promega,500U), ve 10 µl örnek DNA içeren master mix kullanıldı (Aznar ve Alarcon, 2003). Amplifikasyon işlemi, thermal cycler da (Biometra Personel Cycler) 94 C de 5 dk ilk denatürasyon işleminin ardından, 94 C de 1 dk denatürasyon, 65 C de 1 dk bağlanma ve 70 C de 2 dk DNA uzatma aşamaları 30 siklus olarak yapıldı (Aznar ve Alarcon, 2003). Elde edilen PCR ürünlerinden 10 µl alınarak, 2 µl phicol brom phenol blue ile boyanarak, 1 µl/ml ethidium bromide (% 0.1) ile boyanan % 1.5 lik agaroz jelde, 100 Volt elektrik akımında 1 saat yürütülerek elektroforez (Biometra) işlemi yapıldı. Agaroz jel transiluminatöre (Biometra TI1 UV) transfer edilerek, oluşan spesifik bandlar DNA marker ve pozitif kontrol (ATCC 7644) yardımıyla UV ışığı altında değerlendirildi. HlyA genine özgü 388 bp ağırlığındaki DNA bandları pozitif olarak kabul edildi (Aznar ve Alarcon, 2003) ve jellerin dokümantasyonu (Syngene GeneGenius imaging system) yapıldı. 7

9 Clostridium perfringens için PCR Tekniği Kültür tekniği ile izolasyon ve identifikasyonu yapılan Clostridium perfringens izolatlarının PCR ile analizi, Meer ve Songer (1997) tarafından önerilen cpa gen sekansını oluşturan (5 - GCT AAT GTT ACT GCC GTT GA-3, 5 -CCT CTG ATA CAT CGT GTA AG-3 ) primer çifti ve Lin ve Labbe (2003) tarafından önerilen cpe gen sekansını oluşturan primer çifti (5 - GGA GAT GGT TGG ATA TTA GG-3, 5 -GGA CCA GCA GTT GTA GAT A-3 ) kullanılarak yapıldı. DNA ekstraksiyonu için izolatlar, Fluid Thioglycollate Medium da 37 o C de saat inkübe edilerek zenginleştirildi. Kültürden 1 ml alınarak 5000 devirde 15 dakika santrifüj (Eppendorf Centrifuge 5417R) edildi. Dipte kalan tortu iki kez steril bidistile su ile yıkanıp 200 µl steril bidistile su ile süspanse edildikten sonra 94 o C deki su banyosunda (Memmert WB/OB 7-45, WBU 45) 20 dakika bekletildi. Tüpün tekrar santrifüj edilmesinin ardından 10 µl luk süpernatant, hedef DNA olarak kullanıldı. PCR amplifikasyonu için, toplam 50 µl hacimde, bileşiminde 1 x PCR buffer (M890A, Promega, flexi buffer), 1.5 mmol 1-1 MgCl 2 (A351H, Promega, 25 mm), her birinden 0.2 mm olacak şekilde dntp mix (U1515, Promega), her bir primerden 1 µmol 1-1, 2,5 U Taq DNA polymerase (M8305, Promega,500U), ve 10 µl örnek DNA içeren master mix kullanıldı. Daha sonra tüpler amplifiye edilmek amacıyla Thermal Cycler a (Biometra Personal Cycler) yerleştirildi. Thermal Cycler da 94 o C de 1 dakika, 55 o C de 2 dakika, 72 o C de 3 dakika 30 siklus, 72 o C de 4 dakika daha tutulduktan sonra 4 o C de muhafaza edildi. Elde edilen PCR ürünlerinden 10 µl alınarak, 2 µl phicol brom phenol blue ile boyanarak, 1 µl/ml ethidium bromide (% 0.1) ile boyanan % 1.5 lik agaroz jelde, 100 Volt elektrik akımında 1 saat yürütülerek elektroforez (Biometra) işlemi yapıldı. Agaroz jel transiluminatöre (Biometra TI1 UV) transfer edilerek oluşan spesifik bandlar DNA marker yardımıyla UV ışığı altında değerlendirildi; cpa (324 bp) ve cpe (233 bp) genlerine özgü DNA bandları pozitif olarak kabul edildi, ve jellerin dokümantasyonu (Syngene GeneGenius imaging system) yapıldı İzolatların Antibiyotik Dirençliliğin Saptanması İzolatların antimikrobiyal duyarlılık profilleri disk difüzyon yöntemi (NCCLS- National Committee for Clinical Laboratory Standards) ile belirlendi (Anon, 2003b, Anon 2003 c). Bu amaçla Mueller-Hinton agar (Oxoid, CM0337) kullanıldı. Bu üç patojen bakteri için kullanılan antibiyotik diskleri çizelge 1 de gösterildi. 8

10 Çizelge 1. Salmonella spp., L. monocytogenes ve C. perfringens izolatlarında kullanılan antibiyotik diskleri Kullanılan Antibiyotik Diski Salmonella spp. L. monocytogenes Amoksisilin (10µg, Oxoid CT0161B) Ampisilin (10µg, Oxoid CT0003B) Eritromisin (15µg, Oxoid CT0066B) Gentamisin (10µg, Oxoid CT0024B) Kanamisin (30µg, Oxoid CT0026B) Kloramfenikol (30µg, Oxoid CT0013B) Nalidiksik Asit (30µg, Oxoid CT0031B) Penisilin G (10 U, Oxoid CT0043B) Siprofloksasin (5µg, Oxoid CT0425B) Streptomisin (10µg, Oxoid CT0047B) Tetrasiklin (30µg, Oxoid CT0054B) Trimetoprim (5µg, Oxoid CT0076B) Trimetoprim/Sulfametaksazol (25µg, Oxoid CT0052B) Vankomisin (30µg, Oxoid CT0058B) *: Kullanılan antibiyotik disklerini bildirmektedir. C.perfringens * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * * Tryptic Soy Agardan (TSA; Oxoid CM 0131) alınan koloniler, içerisinde Tryptic Soy Broth (TSB, Oxoid CM 0129) bulunan tüplere transfer edilerek, brotlar 37ºC de, turbiditesi 0.5 McFarland standardına gelinceye kadar (yaklaşık 6-8 saat) inkübe edildi. İnkübasyondan sonra, hazırlanan steril svab ile Mueller-Hinton Agara (Oxoid CM 0337) yayma yöntemi ile ekim yapıldı. Ekimi takiben petriler 15 dk. kurumaya bırakıldıktan sonra, aralarında 30 mm olacak şekilde antibiyotik diskleri yerleştirildi. Petriler 35 o C de, saat inkübasyona bırakıldı. İnkübasyondan sonra disklerin etrafındaki inhibisyon zonlarının çapı ölçüldü. Ölçülen zonlar NCCLS de belirtilen zon çapları esas alınarak duyarlı, orta dirençli ve dirençli olarak sınıflandırılıp, dokümantasyonları yapıldı. * 9

11 IV: Analiz ve Bulgular Bu çalışmada, Haziran Ocak 2006 tarihleri arasında Ankara da tüketime sunulan değişik firmalara ait 60 göğüs, 60 but ve 60 kuşbaşıdan oluşan, toplam 180 hindi eti örneğinde Salmonella spp., ve L. monocytogenes ve C. perfringens in varlığı belirlendi. Örneklerden klasik kültür yöntemi ve IMS ile toplamda 55 inin (% 30.5) Salmonella spp. ile kontamine olduğu saptandı. Ayrıca klasik kültür tekniği ile örneklerin 55 inde (% 30.5), IMS tekniğiyle ise 14 ünde (% 7.7) Salmonella spp. izole ve identifiye edildi (Çizelge 2). Örneklerden her iki yöntemle 24 ünün (% 13.3) L. monocytogenes ile kontamine olduğu saptandı. Ayrıca klasik kültür tekniği ile 16 sında (% 8.8), IMS tekniğiyle ise 23 ünde (% 12.7) L. monocytogenes izole ve identifiye edildi (Çizelge 3). Örneklerin 22 sinin (% 12.2) C. perfringens ile kontamine olduğu saptandı. Çizelge 2. Hindi etlerinden klasik kültür ve IMS teknikleriyle saptanan Salmonella spp. pozitif örneklerin dağılımı. Klasik kültür IMS Aynı örnekte klasik pozitif örnek sayısı pozitif örnek sayısı kültür/ims pozitif örnek sayısı x/n 55/180 14/180 55/180 % x/n (x:pozitif bulunan örnek sayısı; n: analiz edilen örnek sayısı) Çizelge 3. Hindi etlerinden klasik kültür ve IMS teknikleriyle saptanan L. monocytogenes pozitif örneklerin dağılımı. Klasik kültür IMS Aynı örnekte klasik pozitif örnek sayısı pozitif örnek sayısı kültür/ims pozitif örnek sayısı x/n 16/180 23/180 24/180 % x/n (x:pozitif bulunan örnek sayısı; n: analiz edilen örnek sayısı) IMS ile klasik kültür yöntemlerinin izolasyon ve identifikasyonda başarı oranı yönünden sonuçlar değerlendirildiğinde, IMS tekniğinin hindi etlerinden L. monocytogenes tespitinde klasik kültür tekniğine kıyasla daha duyarlı bir teknik olduğu saptandı. Hindi etlerinde Salmonella spp. için ise durumun tam tersi olduğu, klasik kültür tekniğinin IMS tekniğine göre daha duyarlı olduğu saptandı. 10

12 Çalışmada, sıcak aylarda (Haziran, Temmuz, Ağustos) incelenen 90 hindi but, göğüs ve kuşbaşı örneğinin 20 sinden (% 22.2), soğuk aylarda (Kasım, Aralık, Ocak) incelenen örneklerin ise 35 inden (% 38.8) Salmonella spp. izole edildi. Soğuk aylarda alınan örneklerin klasik kültür tekniği ile 35 inin (% 38.8), IMS tekniği ile ise 14 ünün (% 15.5) Salmonella ile kontamine olduğu, sıcak aylarda ise örneklerden klasik kültür tekniği ile 20 sinin (% 22.2) Salmonella ile kontamine olduğu saptandı (Çizelge 4). Bu durum çelişkili görünmekle birlikte Guerin ve ark. (2005) nın tavuk, sığır ve domuzlardaki prevalansı inceledikleri çalışmada bizim bulgularımızla benzer şekilde kış aylarında daha fazla izolat elde ettikleri görüldü. Araştırıcılar soğuk aylarda artış olmasının nedenleri arasında kış aylarında kümeslerde relatif rutubetin fazla olması ve havalandırmanın yetersiz yapılması, Salmonella ların nem ve sıcaklığın uygun olmadığı koşullarda muhafaza edilen kontamine yemlerde çoğalabilmesi, uygun olmayan koşullarda bir sonraki sürüye ve takiben diğer sürülere yayılabilmesini, kışın binaların daha fazla rodentlere maruz kalması, birbirini takip eden sürüler arasında kümeslerin yeterince temizlik ve dezenfeksiyonunun yapılamamasını göstermişlerdir. Mevsimsel farklılığın beklenildiği şekilde sıcak aylara ilişkin örneklerde yüksek çıkmamasının nedenleri arasında kesilen hayvanların Salmonella spp. yi taşıma düzeyi ile mezbahalardaki çapraz kontaminasyonun etkili olduğu düşünülmektedir. Wedderkopp ve ark. (2001) broyler kümeslerinde yaptıkları çalışmada, Jordan ve ark. (2006) ise çiğ et türleri ve pişmiş et örnekleri üzerinde yaptıkları çalışmada mevsimsel bir farkın gözlemlenmediğini bildirmişlerdir. Çalışmada sıcak aylarda (Haziran, Temmuz, Ağustos) incelenen örneklerin 10 undan (% 11.1), soğuk aylarda (Kasım, Aralık, Ocak) incelenen örneklerin ise 14 ünden (% 15.5) L. monocytogenes izole edildi. Soğuk aylarda klasik kültür tekniği ile örneklerin 10 unun (% 11.1), IMS tekniği ile ise 13 ünün (% 14.4) L. monocytogenes ile kontamine olduğu saptandı. Sıcak aylarda ise klasik kültür tekniği ile 6 sının (% 6.6), IMS tekniği ile 10 unun (% 11.1) L. monocytogenes ile kontamine olduğu saptandı. Bu sonuçlara göre hindi etlerinin L. monocytogenes ile kontaminasyonunda mevsimsel bir etkinin olmadığı saptandı (Çizelge 5). C. perfringens yönünden yapılan değerlendirmede sıcak aylarda (Haziran, Temmuz, Ağustos) incelenen örneklerin 15 inden (% 16.6), soğuk aylarda (Kasım, Aralık, Ocak) incelenen örneklerin 7 sinden (% 7.7) etken izole edildi. Dolayısıyla hindi etlerinin C. perfringens ile kontaminasyonunda mevsimsel etkinin önemli olduğu, sıcak aylarda kontaminasyon oranının arttığı saptandı (Çizelge 6). 11

13 Çizelge 4. Hindi but, göğüs ve kuşbaşı etlerinden izole edilen Salmonella spp. lerin mevsimsel dağılımı Örneklerin alındığı aylar Örnek sayısı Pozitif örnek sayısı (%) Sıcak aylar (22.2) (Haziran,Temmuz,Ağustos) Soğuk aylar (38.8) (Kasım,Aralık,Ocak) Toplam (30.5) Çizelge 5. Hindi but, göğüs ve kuşbaşı etlerinden izole edilen L. monocytogenes in mevsimsel dağılımı Örneklerin alındığı aylar Örnek sayısı Pozitif örnek sayısı (%) Sıcak aylar (11.1) (Haziran, Temmuz, Ağustos) Soğuk aylar (15.5) (Kasım,Aralık,Ocak) Toplam (13.3) Çizelge 6. Hindi but, göğüs ve kuşbaşı etlerinden izole edilen C. perfringens in mevsimsel dağılımı Örneklerin alındığı aylar Örnek sayısı Pozitif örnek sayısı (%) Sıcak aylar (16.6) (Haziran, Temmuz,Ağustos) Soğuk aylar 90 7 (7.7) (Kasım,Aralık,Ocak) Toplam (12.2) PCR Analizi Sonuçları: Çalışmada klasik kültür ve IMS teknikleri ile Salmonella spp. olarak belirlenen suşların, oric gen sekansını oluşturan primer çiftleri kullanılarak PCR tekniği ile doğrulaması yapıldı. Bu amaçla incelenen 55 suşun 55 ininde (% 100) Salmonella spp. olduğu belirlendi (Resim 1). 12

14 163 bp Resim 1. PCR ile oric geni tespit edilmiş Salmonella spp. izolatlarının elektroforez görüntüsü (1 ve 8: 100 bp DNA marker. 2: Pozitif kontrol ( Salmonella Typhimurium ATCC 14028) 3: Negatif kontrol. 4-7: oric pozitif Salmonella spp. izolatları) Klasik kültür tekniği ve IMS tekniği ile izole edilen L. monocytogenes lerin doğrulanması amacıyla hlya gen sekansı kullanılarak yapılan PCR analizinde incelenen 24 suşun 23 ünün (% 95.8) L. monocytogenes olduğu belirlendi (Resim 2). 388 bp Resim 2. PCR ile hlya geni tespit edilmiş L. monocytogenes izolatlarının elektroforez görüntüsü (1 ve 8: 100 bp DNA marker. 2: Pozitif kontrol ( L. monocytogenes ATCC 7644) 3: Negatif kontrol 4-7: HlyA pozitif L. monocytogenes izolatları) Çalışmada klasik kültür tekniği ile C. perfringens olarak belirlenen suşların, cpa gen sekansını oluşturan primer çiftleri kullanılarak PCR tekniği ile doğrulaması yapıldı. Bu amaçla incelenen 22 suşun 22 ininde (% 100) C. perfringens olduğu belirlendi. Ayrıca, analiz bulguları sonucunda C. perfringens olarak idendifiye edilen izolatların hiç birisinin cpe geni taşımadığı yapılan PCR analizi sonucu saptandı (Resim 3). 13

15 324 bp Resim 3. PCR ile cpa geni tespit edilmiş C. perfringens izolatlarının elektroforez görüntüsü (1 ve 8: 100 bp DNA marker. 2: Pozitif kontrol (C. perfringens ATCC 13124) 3: Negatif kontrol 4-7: Cpa pozitif C. perfringens izolatları) Antibiyotik Dirençlilik Testi Sonuçları: Salmonella spp. izolatlarında antibiyotik dirençlilik testi sonucunda, izolatlardan 13 ü (% 23.6) yalnızca bir antibiyotiğe dirençli bulunurken, 5 i (% 9.0) iki antibiyotiğe, 17 si (% 30.9) üç antibiyotiğe ve 6 sı (% 10.9) dört antibiyotiğe direnç oluşturmuştur. Bu çalışma bulgularına göre 41 (% 74.5) izolat en az bir antibiyotiğe dirençli bulunurken, 28 (% 50.9) izolatın en az iki antibiyotiğe, 23 (% 41.8) izolatın ise en az 3 antibiyotiğe karşı dirençli olduğu saptanmıştır. İzolatlar arasında en fazla dirençlilik %50.9 ile tetrasikline karşı bulunurken bu antibiyotiği % 41.8 ile nalidiksik asit, % 40.0 ile streptomisin ve ampisilin, % 5.45 ile gentamisin izlemiştir. Çalışmada bazı izolatlarda çoklu dirençliliğinde geliştiği gözlenmiştir. Bu kapsamda 6 1 (% 10.9) izolat tetrasiklin, nalidiksik asit, streptomisin ve ampisiline direnç oluştururken, 15 (% 27.2) izolat tetrasiklin, nalidiksik asit ve ampisiline, 2 (% 3.6) izolat tetrasiklin, nalidiksik asit ve streptomisine, 3 (% 5.4) izolat gentamisin ve streptomisine, 2 (% 3.6) izolat ise tetrasiklin ve streptomisine dirençli olarak saptanmıştır. Trimetoprim ve trimetoprim/sulfametaksazole karşı % 100 lük bir duyarlılık saptanırken, kloramfenikol ve siprofloksasine karşı duyarlılık sırasıyla % 92.7 ve % 91.1 olarak belirlenmiştir. Ayrıca incelenen 55 izolatın 48 inin (% 87.2) kanamisine karşı orta düzeyde dirençli olduğu bulunmuştur (Çizelge 7). 14

16 Çizelge 7. Salmonella spp. izolatlarının antibiyotik duyarlılık testi sonuçları Antibiyotikler Duyarlı Orta Dirençli Dirençli n (%) n (%) n (%) Tetrasiklin 24 (43.6) 3 (5.4) 28 (50.9) Nalidiksik Asit 31 (56.3) 1 (1.8) 23 (41.8) Streptomisin 2 (3.6) 31 (56.3) 22 (40.0) Ampisilin 31 (56.3) 2 (3.6) 22 (40.0) Gentamisin 34 (61.8) 18 (32.7) 3 (5.4) Kanamisin 7 (12.7) 48 (87.2) - Siprofloksasin 51 (92.7) 4 (7.2) - Kloramfenikol 54 (98.1) 1 (1.8) - Trimetoprim 55 (100) - - Trimetoprim/Sulfametaksazol 55 (100) - - L. monocytogenes izolatlarından 20 si (% 86.9) en az bir antibiyotiğe direnç gösterirken, 16 (% 69.5) izolatın ise çoklu direnç (ampisilin + penisilin ) gösterdiği tespit edilmiştir. Çalışmada izolatların 19 unun (% 82.6) penisiline, 17 inin (% 75) ampisiline direnç gösterdiği görülmüştür. İzolatlardan 8 inde (% 34.7) eritromisine 8 inde (% 34.7) de streptomisine orta düzeyde direnç saptanmıştır. İzolatların tamamının kloramfenikol, gentamisin, tetrasiklin ve vankomisine duyarlı oldukları tespit edilmiştir (Çizelge 8). Çizelge 8. L. monocytogenes izolatlarının antibiyotik duyarlılık testi sonuçları Antibiyotik Duyarlı Orta Dirençli Dirençli n (%) n (%) n (%) Ampisilin 6 (26.0) - 17 (73.9) Kloramfenikol 23 (100) - - Eritromisin 15 (65.2) 8 (34.7) - Gentamisin 23 (100) - - Penisilin 4 (17.3) - 19 (82.6) Streptomisin 15 (65.2) 8 (34.7) - Tetrasiklin 23 (100) - - Vankomisin 23 (100)

17 C. perfringens izolatlarında yapılan testler neticesinde 22 izolatın, 1 i (%) yalnızca bir antibiyotiğe dirençli bulunurken, 17 si (%) iki antibiyotiğe, 4 ü (% 14.1) üç antibiyotiğe direnç oluşturmuştur. İzolatların tamamı (% 100) en az bir antibiyotiğe dirençli bulunmuştur. İzolatlar arasında en fazla dirençlilik % 100 ile trimetoprime karşı bulunurken, bu antibiyotiği % 86.3 ile gentamisin, % 13.6 ile tetrasiklin ve siprofloksasin izlemiştir. Çoklu antibiyotik direnci profiline bakıldığında 17 izolatın 2 antibiyotiğe, 4 izolatın 3 antibiyotiğe karşı dirençli olduğu saptanmıştır. İzolatların tamamı nalidiksik asit, ampisilin, penisilin, kloramfenikol ve amoksasiline karşı duyarlılık gösterirken, siprofloksasine karşı 86.3 lük, tetrasikline karşı 77.2 lik, gentamisine karşı % 13.6 lık bir duyarlılık saptanmıştır (Çizelge 9). Çizelge 9. C. perfringens izolatlarının antibiyotik duyarlılık testi sonuçları Antibiyotik Duyarlı Orta Dirençli Dirençli n (%) n (%) n (%) Ampisilin 22 (100) - - Kloramfenikol 22 (100) - - Trimetoprim (100) Tetrasiklin 17 (77.2) 2 (9.0) 3 (13.6) Nalidiksik Asit 22 (100) - - Siprofloksasin 19 (86.3) - 3 (13.6) Gentamisin 3 (13.6) - 19 (86.3) Penisilin 22 (100) - - Amoksasilin 22 (100) - - V: Sonuç ve Öneriler Sonuç olarak, bu çalışmada Ankara da tüketime sunulan değişik firmalara ait toplam 180 hindi eti örneğinden 55 inin (% 30.5) Salmonella spp. ile, 24 ünün (% 13.3) L. monocytogenes ile 22 sinin (% 12.2) C. perfringens ile kontamine olduğu saptandı. Bu veriler ışığında uygun olmayan üretim ve muhafaza koşullarına bağlı olarak hindi parça etlerinin sağlık açısından risk oluşturabileceği sonucuna varıldı. Bu nedenle, hindi kesim ve işleme prosesinde gerekli hijyenik ve teknik koşulların sağlanması halk sağlığı açısından önem taşımaktadır. Diğer taraftan çalışmada izole edilen Salmonella spp, L. monocytogenes ve C. perfringens izolatlarının birçok antibiyotiğe karşı dirençli bulunması da halk sağlığı yönünden potansiyel bir sorun olarak değerlendirilebilir. Özelikle entansif hayvan yetiştiriciliğinde ve 16

18 hastalıkların tedavisinde bilinçsiz ve aşırı antibiyotik kullanımı engellenmeli, antibiyotiklerin gıda üretiminde kullanılan hayvanlarda profilaktik ve gelişmeyi arttırıcı amaçlı olarak kullanımına ilişkin AB direktifleri ile uyumlu olan regülasyonların titizlikle uygulanmasına özen gösterilmelidir. VI: Kaynaklar ANON (2002). Microbiology of foods and animal feeding staff-horizontal method for the detection of Salmonella spp. International Standart (ISO, 6579). ANON (2003a). Salmonella. Bacteriological Analytical Manual. Chapter 5. Food and Drug Administration. (FDA). ANON (2003b). NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards). Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. Approved Standart M2-A8. Pennsylvania, USA. ANON (2003c)., NCCLS (National Committee for Clinical Laboratory Standards). Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing of Anaerobic Bacteria; Volume 24 Number 2 ISSN Approved Standard Sixth Edition. M11-A6, Pennsylvania, USA. AZNAR, R., ALARCO N, B. (2003). PCR detection of Listeria monocytogenes: a study of a multiple factors affecting sensitivity. J. Appl. Microbiol. 95: BAUMGART, J., BAUM, O., LIPPERT, S. (1990). Schneller und direkter Nachweis von Clostridium perfringens. Fleischwirtsch., 70 (9): BAUMGART, J. (1997). Mikrobiologische Untersuchung von Lebensmitteln. Behr s Verlag. Hamburg BOHNERT, M., DILASSER, F., DALET, C., MENGAUD, J., COSSART, P. (1992). Use of specific oligonucleotides for direct enumeration of Listeria monocytogenes in food samples by colony hybridization and rapid detection by PCR. Res. Microbiol. 143: EROL, İ., HILDEBRANDT, G., KLEER, J., YURTYERİ, A. (1999). Kopplung von Immunomagnetischer separation und Polymerase-kettenreaktion zum Schnellachweis von Salmonellen in Hackfleisch und Geflügelinnereien. Berl. Münch. Tieraerztl.Wschr., 112: FLOWERS, R.S., D AOUST, J.Y., ANDREWS, W.H., BAILEY, J.S. (1992). Salmonella. In: Compendium of the Methods for the Microbiological Examinations of Food. Vanderzant, C., Splittoesser, D.F. (eds.). American Public Health Assoc. 3 rd.ed FLUIT, A.C., WIDJOJOATMODJO, M.N., BOX, A.T.A., TORENSMA, R., VERHOEF, J. (1993). Rapid detection of Salmonella in poultry with the magnetic Immuno-Polymerase Chain Reaction assay. Appl. Environ. Microbiol., 59(5): GUERIN, M.T., MARTIN, S.W., DARLINGTON, G.A., RAJIC, A. (2005). A temporal study of Salmonella serovars in animal in Alberta between 1990 and Can. J. Vet. Res., 69: JORDAN, E., EGAN, J., DULLEA, C., WARD, J., MCGILLICUDDY, K., MURRAY, G., MURPHY, A., BRADSHAW, B., LEONARD, N., RAFTER, P., MCDOWELL, S. (2006). Salmonella surveillance in raw and cooked meat and meat products in the Republic of Ireland from 2002 to Int.J. Food Microbiol., 112: LABBE, R.G. (1989). Clostridium perfringens. In: Foodborne Bacterial Pathogens, M.P. DOYLE (Ed.). Marcel Decker Inc., New York and Basel,

19 LEE, W.H., MCCLAIN, D., (1989). Laboratory communication No.57, U.S.D.A., F.S.I.S Microbiology Division, Bethesda. LIN, Y., LABBE, R. (2003). Enterotoxigenicty and genetic relatedness of Clostridium perfringens isolates from retail foods in the United States. Appl. Environ. Microbiol., 69 (3): MEER, R.R., SONGER, J.G. (1997). Multiplex polymerase chain reaction assay for genotyping Clostridium perfringens. Am. J. Vet. Res. 58: SCHALCH, B., EISGRUBER, H., GEPPERT, P., STOLLE, A. (1996). Vergleich von vier Routineverfahren zur Bestaetigung von Clostridium perfringens aus Lebensmitteln. Arch. Lebensmittelhyg., 47: WEDDERKOPP, A., GRADEL, K.O., JORGENSEN, J.C., MADSEN, M. (2001). Pre-harvest surveillance of Campylobacter and Salmonella in Danish broiler flocks: a 2 year study. Int. J. Food Microbiol. 68(1-2): WIDJOJOADMODJO, M.N., FLUIT, A.C., TORENSMA, R., KELLER, B.H., VERHOEF, J. (1991). Evaluation of the magnetic immuno-pcr assay for rapid detection of Salmonella. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis., 10(11): VII: Ekler a. Mali bilanço ve açıklamaları Sarf malzemeler ve cihazlar satın alınmış, kullanılmış ve sonuçları yukarıda verilmiştir. b. Makine ve teçhizatın konumu ve ilerideki kullanımına dair açıklamalar (BAP demirbaş numaraları dahil) c. Teknik ve bilimsel ayrıntılar (varsa kesim III de yer almayan analiz ayrıntıları) Başka teknik ayrıntı yoktur. d. Sunumlar(bildiriler, teknik raporlar) Bu çalışmaya ait verilerin bir kısmı aşağıda belirtilen kongrede sunulmuştur. EROL, İ., BİLİR ORMANCI, F.S., AYAZ, N.D., İŞERİ, Ö., SARIGÜZEL, D. (2006). Hindi etlerinden izole edilen Salmonella spp., Listeria monocytogenes ve Clostridium perfringens izolatlarının antibiyotik dirençliliklerinin belirlenmesi. II. Ulusal Veteriner Gıda Hijyeni Kongresi, Eylül İstanbul, s e. Yayınlar (hakemli bilimsel dergiler) ve Tezler Detection of Listeria monocytogenes in turkey meat by immunomagnetic separation and PCR determination of the antibiotic resistance (Yayına hazırlanmaktadır). Molecular typing of Clostridium perfringens isolated from turkey meat by multiplex PCR (Yayına hazırlanmaktadır). 18