YÖNTEMLERİ. Prof. Dr. Hasan Bayram Gaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi Göğüs Hastalıkları AD E-posta:

Transkript

1 IN VİTROV ARAŞTIRMA YÖNTEMLERİ Prof. Dr. Hasan Bayram Gaziantep Üniversitesi Tıp Fakültesi Göğüs Hastalıkları AD E-posta: Toraks 11.Yıllık Kongresi, Antalya Nisan 2008

2 Amaç Deneysel araştırmada in vitro yöntemler ve kullanım alanları konusunda genel bilgi sahibi olma Solunum yolunun hücre dizileri ile primer hücre kültürlerinin elde ediliş yöntemleri hakkında bilgi sahibi olma Bu kültürlerin araştırmalarda sunduğu olanaklar ile kullanılan yöntemler hakkında bilgi sahibi olma Katılımcıları bu yöntemleri öğrenme ve kullanmaları konusunda teşvik etme

3 Sunu Akışı Giriş; Araştırma laboratuarı Araştırma yöntemleri nerede/niçin kullanılır? Genel olarak in vitro araştırma yöntemleri Hücre dizilerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı Primer hücre kültürlerinin elde edilişi ve araştırmalarda kullanımı Özet

5 İn Vitro Araştırma Laboratuarı Nasıl kurulur? Kaynak; DPT, Üniversite fonları, TÜBİTAK Profesyonel destek Personel; biyolog, teknisyen, asistan

6

7

8

9

10 İn vitro yöntemler nerede kullanılır? İn vivo koşullarda alınan bir örneğin incelemesi; Periferik kan, idrar, dışkı, BOS vs. Ekspirasyon havası, balgam, biyopsi, BAL Deney hayvanlarından alınan örnekler; kan, hava yolu-akciğer sıvıları, akciğer dokusu İn vitro koşullarda doku ve hücre kültürü elde edilmesi ve incelenmesi Periferik kan kültürleri; mono nükleer hücreler, eozinofil vs Hava yolu hücre kültürleri; Hücre dizileri, primer hücre kültürleri vs

11 İn Vitro Yöntemler Niçin Kullanılır? Bir enzim, elementin direkt ölçümü; ALT, AST, Na, K vs Hücre fonksiyon/bütünlüğünün araştırılması; silya titreşimi, elektriksel direnç, permabilite Hücrenin canlılığı; MTT (tetrazolium tuzu), trypan blue Anahtar bir proteinin belirlenmesi; ELISA, Western Blot Gen düzeyindeki bozukluk/aktivasyonunun incelenmesi: PCR, RT-PCR Bir protein/antijenin ekspresyonu; immüno-sito kimya Hücrelerin (büyüklük/eksprese ettiği belirtece göre) ayrılması/belirlenmesi; akım sitometri ( flow cytometry )

13 Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA)/Enzyme ImmunoAssay (EIA) ( enzime bağlı secondary ab ) (Substrat) ( detecting ab ) ( capture ab ) (Nümune)

14 ELİSA

15 ImmunoSito/Histokimya Enzimatik Yöntem Floresan Yöntemi

16 Blotting (leke) Southern blot; DNA dizisi (sequence,sekans) Western blot; protein antibody ile Northern blot; gen ekspresyonu RNA ile Southwestern blot: DNA bağlı protein Far-western blot: Protein, non-antibody protein ile

17 Western Blot (Immunoblot) Doku homojenatı/ekstraktı, hücre Spesifik proteini, düzeyini belirlemek

18 Polymerase Chain Reaction (PCR)

19 Microarray (Mikrodizi) DNA microarray leri; cdna microarray, oligonucleotide microarrays Protein mikroarray Tissue mikroarray Transfection mikroarray (hücre microarray) Kimyasal bileşik mikroarray Antibody mikroarray Gene Chip Analizleri

20 DNA Mikroarray Gen/genom chip, DNA chip, gen array Tek bir geni temsil eden mikroskobik DNA spotlarının bir kolleksiyonu Diğer arraylar dan farkı ya DNA yı ölçer, ya da ölçüm sistemlerinin bir parçası olarak DNA yı kullanırlar.

21 Genomic Bir organizmanın bütün genomunun araştırılması Organizmaların bütün DNA dizilerinin(sekans) tespitine dayalı çalışmalar

22 Proteomic Genomic ile analoji yaratmak amacıyla kullanılır Genel olarak protein çalışmaları (yapı ve fonksiyonları) Proteome ; protein ve genome dan oluşur. Bir organizma tarafından üretilen tüm proteinler

23 Small Interfering RNA (sirna) short interfering RNA veya silencing RNA Spesifik rolleri olan nükleotid uzunluğunda çift-sarmal RNA moleküllerinden oluşur. sirna transfeksiyon yoluyla hücreye verilerek Spesifik geni etkisizleştirme de (knock down) kullanılabilir

24 Flow Cytometry DNA (hücre siklüsü, proliferasyonu vs) Apopitozis çalışmalarında Hücre yüzey antijenlerinin belirlenmesinde (CD markerları) Hücre içi antijenler (sitokin, mediatör vs) Kromozom analiz ve tespitinde RNA çalışmalarında Protein ekspresyon ve lokalizasyonunda

25 support/training/online/itf/index.shtml

26 Akım Sitometri (Flow Cytometry) Tek dalga ışın demeti(lazer) sıvı akımına yönlendirilir Çevredeki detektörler ışığın kırılma yönü, yaydığı floresan ışığının tespitiyle hücre/partiküllerin belirlenmesi esasına dayanır

27 Hücre Siklüs Ölçümü

29 Hücre Kültürleri İn vivo uygulamalarda etik, güvenlik sorunları Uygun çalışma modeli Hücre fizyolojisi, biyokimyası vb Patogenez; rinit, astım, KOAH, kanser Toksikoloji; kimyasallar, zehirler, çevresel irritanlar (hava kirliliği), biomas Terapötik; Ca tedavisi, steroidler, β 2 - agonist, teofilin, yeni ajanlar, vs

30 Hücre Dizileri ( Cell line ) Normal hücreler (ölümsüz) immortal hale getirilirler (viruslar, SMV40); BEAS-2B (Bronş epitel hücreleri) 16 HBE-14o- hücreleri (Bronş epitel hücreleri) Kanserleşmiş hücreler kullanılır A549 hücreleri (akciğer karsinoma hücreleri) NHLI Cell Culture Protocols, American Type Culture Collection

31 DMEM, %10 FCS, 2mM L-glutamine Tek katman ( monolayer ) oluşturur A549 (İnsan Alveolar Epitel Hücreleri) (Hoffman Modüle Kontrast Mikroskobu x400)

32 Dizel Egzoz Partikülleri DEP (medyan=0.4μm)

33 Hücre Canlılığı -MTT SF FCS % Dizel Egzoz Partikülleri (μg/ml)

34 Optik Dansite DEP nin A549 hücre canlılığı üzerine etkisi ***p< μg/ml DEP * FCS (%10) 0 * saat * * Dizel Egzoz Partikülleri (μg/ml) * * Optik Dansite Optik Dansite FCS (%10) FCS saat * * Dizel Egzoz Partikülleri ( μg/ml) saat * * * (%10) Dizel Egzoz Partikülleri ( μg/ml) * *

35 DEP ( μg/ml) ile 72s İnkübasyonun A549 dan Sitokin Salınımına Etkisi IL-8 (pg/ml) * GM-CSF (pg/ml) * 0 0 Serum Dizel Egzoz Partikülleri ( μg/ml) Serum Dizel Egzoz Partikülleri ( μg/ml)

36 Percent of cells DEP (10μg/ml) nin A549 hücre proliferasyonuna etkisi ** *** *** *** G 0/1 S G 2 /M Cell cycle compartments Number SF Channels (FL2-H) * G0G1 G2M S-Phase ** Serum Free DEP (10μg/ml) FCS (10%) Bayram H et al, Eur Respir J 2006

37 DEP (10μg/ml) nin A549 hücre apoptozisine etkisi Hücrelerin %'si * ** * SF * FCS(10%) SF DEP (10μg/ml) *P<0.05 and **P<0.005 vs SF 0 LL(A-/P-) LR(A+/P-) UR(A+/P+) UL(A-/P+) Kuadrantlar Bayram H et al, Eur Respir J 2006

38 DEP nin A549 hücre p21 CIP1/WAF1 protein ekspresyonuna etkisi p21 (% of βactin) ** 10% FCS DEP (μg/ml) % FCS p21 CIP1/WAF1 * β-actin *P<0.05 and **P<0.01 vs 0μg/ml DEP

39 DEP (10μg/ml) ile 48 saat inkübasyonun A549 hücre p21 CIP1/WAF1 mrna ekspresyonuna etkisi p21 mrna (% GAPDH) *P<0.05 vs SF * DEP(μg/ml)

41 Primer Hücreler-Avantajlar İn vivo ortamdaki hücrelerle genotipik ve fenotipik benzerlik Çeşitli patolojilerde, hastalardan direkt olarak elde edilebilirler

42 Primer Hücre Kültürü- Dezavantajlar Elde edilmeleri daha zor Tekrar tekrar çoğaltılıp kullanılamazlar Etik sorunlar

43 Doku - Hücre Kaynağı Cerrahi eksplant Pnömonektomi, Lobektomi Transplant akciğeri Biyopsi Fırçalama (epitel hücreler) Enzimatik digestion, Disseksiyon Hazır, ticari olarak

44 Akciğerin Primer Hücre Kültürleri Düz kas hücreleri Fibroblast kültürleri Alveolar epitel hücreleri Bronş epitel hücreleri

45 Primer Bronş Epitel Hücre Kültürleri Fırçalama, Enzimatik digestion, Disseksiyon

46 Bronş Epitelyumunun Disseksiyonu

47 Kültür Vasatı Medium 199 Foetal bovine serum (2.5ml) 1ml bovine pancreatic insulin (2.5 μg/ml) 1ml human transferrin (2.5 μg/ml) 1ml epidermal growth factor (20μg/ml) 1ml hydrocortisone (0.36 μg/ml) 1ml L-glutamine (0.02mg/ml) 1ml antibiyotik/antimikotik solüsyon 100ml tamamlanır ve 0.2μm por çap filtreden geçirilir

48 Kültür Kapları 6cm çaplı, Falcon Primaria plastik kültür kapı (Becton Dickinson,UK) 9mm çaplı 24 gözlü, 0.45μm por çaplı hücre kültür insert diagramı

49 24-Kuyucuklu Plate

50 1. Hafta 3. Hafta (Hoffman Modulation Contrast Işık Mikroskopu, x300)

51 Hücrelerin DEP ile İnkübasyon

52 Silya Titreşim Frekansının Ölçülmesi

53 DEP nin bronş epitel hücre silya titreşim frekansına etkisi Bayram H, et al. Am J Respir Cell Mol Biol 1998.

54 Normal kültür ortamında astmatik ve non-astmatik bronş epitel hücrelerinden inflamatuar mediatör salınımı pg/μg selüler protein 1000 (log.) p< p<0.002 Non-ast. p<0.003 Ast. 1 0,1 0,01 YK IL-8 GM-CSF RANTES sicam-1 Bayram H, et al. J Allergy Clin Immunol 1998.

55 İn vitro Ozon NO 2 Maruziyet Düzeneği %5 CO 2 İn Air NO 2

56 Kültürlerin Elektriksel Direncinin Ölçüm Düzeneği

57 Ozon ve NO 2 e 2-6s maruziyetin atopik astmatik bronş epitel hücre kültürlerinin elektrik direncine etkisi Bayram H, et al. Clin Exp Allergy 2002.

59 Özet Bir araştırma laboratuarı kurmakla başlanmalı İn vitro yöntemler çok çeşitli araştırmalarda kullanılabilirler Akciğer hücre dizi ve primer hücre kültürleri yapılabilir Solunum yolu hücrelerinin Fizyolojik Biyokimyasal özelliklerinin belirlenmesi Çeşitli patolojilerdeki rollerinin aydınlatılmasında kullanılabilir

60 Yorum Bütün dünyada yaygın olarak kullanılan in vitro araştırma yöntemlerinden yararlanmalıyız

61 Sabrınız İçin Teşekkür Ederim