Otofaji. 2) Zar uzaması 3) Kaynaşma 4) Yıkım

Ebat: px

Şu sayfadan göstermeyi başlat:

Download "Otofaji. 2) Zar uzaması 3) Kaynaşma 4) Yıkım"

Bercu Öcal
8 yıl önce
İzleme sayısı:

2 Otofaji Otofagozom Otolizozom İletilen sinyal 1- Çekirdekleme/ Oluşum 2) Zar uzaması 3) Kaynaşma 4) Yıkım - Uzun ömürlü proteinlerin yıkımı - Eskiyen organellerin (mitokondriler gibi) yıkımı - Amino asit ve diğer yapıtaşlarının geridönüşümü - Açlık ve stres durumunda idame Gozuacik D and Kimchi A. Oncogene. 2004

3 Apoptoz ve Otofajik hücre ölümü: Karşılaştırma Apoptotik hücre ölümü (Tip I) - Kaspaz aktivasyonu - Kromatin yoğunlaşması - Apoptotik cisim (bodies) oluşumu - Erken fagositoz Otofajik hücre ölümü (Tip II) - Otofajik vezikül birikimi - Kaspaz-bağımsız - Kromatin yoğunlaşması az - Apoptotik cisim (bodies) yok Clarke PG et al., Anat Embryol 1990

4 Otofaji-apoptoz ilişkisi Ölüm uyaranı otofaji apoptoz Tip I hücre ölümü Ölüm uyaranı Ölüm uyaranı otofaji otofaji apoptoz Hayatta kalma Tip II hücre ölümü apoptoz Gozuacik D, Kimchi A, Oncogene 2004 Tip I hücre ölümü

5 Canlı hücreler Canlı hücreler Canlı hücreler Otofaji nin Atg6 / Bcl-2 reostat modeli ile düzenlenmesi Bcl-2 Atg6 Atg6 Bcl-2 Bcl-2 Atg6 Atg6 Bcl-2 Hücre ölümü apoptotik Düşük düzey otofaji: Strese daha duyarlı, apoptoz Denge Dengeli otofaji: Normal hücresel otofaji Hücre ölümü Otofajik Aşırı otofaji: Otofajik hücre ölümü Modified from Pattingre S. et al. Cell E.g. : Seramid tarafından uyarılan hücre ölümünde Atg6 / Beclin 1 ifade artışı (Scarlatti F. et al. JBC 2004).

6 Tümör baskılayıcı yeni bir mekanizma: Otofaji Beclin-1 ve ATG4c nakavt farelerde tümör oluşumuna yatkınlık Kontrol Beclin+/- Atg4C+/- Kontrol Yue Z et al. PNAS 2003 Marino G et al. JBC 2007 Atg protein düzeyleri tümör dokularında farklılık gösteriyor Liang XH et al. Nature 1999

7 Kanserde otofaji gen ve proteinleri

8 Otofaji, kanser ve hücre ölümü bağlantısı: DAPk (Death-associated protein kinaz): Otofajik hücre ölümünü uyaran bir tümör baskılayıcı protein

9 DAPk ve kanser: Klinik bağlantılar Table: DAPk loss in human tumors Hematological malignancies % (DAPk(-)/Total) B cell lymphoma 84% Burkit's lymphoma 100% Hodgkin's lymphoma 67% Multiple myeloma 67% Thyroid lymphoma 84% Lymphoma 75% Solid tumors % (DAPk(-)/Total) Lung cancer 25-44% Breast cancer (invasive lobular) 13-53% Colon cancer 15-55% Gastic cancer 15-34% Cervix cancer 36-61% Ovarian cancer 9% Prostate cancer 36% Urinary bladder cancer 29-58% Head and neck cancer 18-33% Nasopharyngeal cancer 76% Pituitary tumors 34% Oligodendromas 66% Ependymomas 57%

10 DAPk ve kanser- Deneysel bağlantılar Onkojenin p53 aktivasyonu Foküs oluşumu Onkojen tarafından ölüm Raveh T et al. Nature Cell Biol., 2001 Tümör oluşumu (footpad) Akciğer metastazı No DAPk DAPk-48 DAPk-28 DAPk-42 Inbal B et al. Nature, 1997 DAPk

11 DAPk protein ailesi farklı uyaranların neden olduğu hücre ölüm yollarında rol oynuyor. Gozuacik D and Kimchi A, Autophagy 2006

12 DAPk proteini farklı hücresel sistemlerde apoptoz veya otofajik hücre ölümüne yol açıyor. Luc DAPk Raveh T et al., NCB 2001 Inbal B et al., JCB 2002 Gozuacik D, Yayınlanmamış sonuçlar

13 DAPk aile üyesi ZIPk proteini de otofajik hücre ölümüne yol açıyor. ZIPk p55 Shani G, Marash L and Gozuacik D et al., Mol. Cell Biol. 2004

14 DAPk KO MICE NI S Xh K E1 N NI Wild-type P1 P2 S Xh K Neo E 1 N DT Targeting vector NI S Xh K N E Neo 1 NI Knock-out PCR +/+ -/- +/- Northern P3 P2 Western +/+ -/- +/+ -/- B L K B L K 1 kb P2/P3 P1/P2 DAPk DAPk Tubulin GAPDH Histopathology normal. Body weight, CBC, Blood Biohemistry are normal.

15 TUNEL positive nuclei/hpf Cell survival (% of control) DAPk KO farenin fibroblast ve böbrek tübül hücreleri ER stresinin yol açtığı hücre ölümüne karşı dayanıklılar. DAPk +/+ DAPk -/- * * DMSO TUN DAPk +/+ DAPk +/ * 0 UV DAPk+/+ DMSO Adriamycin Staurosporin Brefeldin A DAPk+/+ TUN Thapsigargin Tunicamycin DAPk -/- DAPk -/- DAPk-/- TUN ± 10 (n=5) p=0.007 TUNEL ± 13 (n=5) DAPI ± 0.26 (n=3) DMSO +/+ TUN +/+ TUN -/-

16 Caspaz-12 TRAF2 Procaspaz-12 PERK Ire1 ER ölüm yolları ++ Ca Ca++ Ca++ Ca++ ER eif2a P eif2a ASK1 ATF4 JNK JNK P Procaspaz ATF4 caspaz ATF4 CHOP Jun P CHOP GENİ NUCLEUS ÖLÜM GENLERİ

17 ER stres DAPk ı aktive ediyor mu? Yanıt evet ise, nasıl?

18 Cytoskel ankyrin DAPk nasıl aktive edilir? Cytoskel ankyrin Cytoskel ankyrin Ölüm Sinyali DD DD DD Fosfataz? Ca 2+ artışı KD P KD KD KD Ca 2+ CaM Oto-fosforile olmuş (inaktif) Defosforilasyon Ca 2+ /CaM Bağlanması Shohat G et al., JBC 2001

19 Tüm ekstre ER stres DAPk ın Ser308 defosforilasyonuna ve aktivasyonuna neden oluyor. Doz yanıtı IP P-Ser308 Tüm ekstre Zaman yanıtı IP P-Ser308 Tun (mg/ml): Tun (h): DAPk DAPk Tubulin Tubulin IgG IgG Fosfataz : PP2A in vitro fosfataz testi P-Ser308-DAPk DAPk PP1 PP2B

20 Chami M* and Gozuacik D*, Oncogene 2000 Chami M* and Gozuacik D*, Journal of Cell Biol * = Eşit katılımlı birinci yazarlar ER Ca +2 Dengesi, sitoplazmik [Ca +2 ] ve hücre ölümü: Küçük SERCA1 proteinleri ER Ca +2 dengesini bozarak sitoplazmik Ca +2 artışına ve hücre ölümüne neden oluyor.

21 Fura-2 fluorescence ratio (340 nm / 360 nm) Sitoplazmik [Ca +2 ] MLC phosphorylation (Arbitrary units) ER stresi sitoplazmik [Ca +2 ] artışına ve DAPk ın Ca +2 /Kalmodülin tarafından aktivasyonuna neden oluyor IN VITRO KİNAZ TESTİ DMSO TUN * * EGTA 0.1 nm CaM 1 nm CaM Tun sonrası Time zaman (h) (Saat)

22 Caspaz-12 TRAF2 Procaspaz-12 PERK Ire1 Ölüm yolları ATF4 eif2a P eif2a Ca++ ++ Ca Ca++ Ca++ JNK ASK1 JNK P PP2A P DAPk CaM Ca ++ CaM ER Procaspaz ATF4 caspaz ATF4 CHOP Jun P CHOP GENİ NUCLEUS ÖLÜM GENLERİ

23 ER stresi otofajiye yol açıyor mu?

24 Autophagic degradation (% of total proteins) Kontrol LC3 hücre içi hareketi ER stresi otofajiyi aktive ediyor Thap LC3 bant kayması Tun (h): LC3-I LC3-II Uzun ömürlü protein yıkımı Açlık Tun DMSO DMSO Tun TUN Elektron mikroskopisi GFP-LC3 transgenik fare böbreğinde otofaji Kontrol Tun

25 ER stresi aynı hücrede hem otofaji hem de apoptoza yol açıyor

26 ER stresi tarafından uyarılan apoptoz veya otofajide DAPk ın rolü var mı?

27 Caspase activity (%) LC3 Dots / mm2 DAPk ER stresi tarafından kaspaz ve otofaji aktivasyonu için gerekli. Active Caspase-3 Tubulin Kaspaz aktivitesi DAPk+/+ TUN (h): LC3-I LC3-II Tubulin Otofajik aktivite DAPk+/+ DAPk-/- DAPk-/- TUN (h): DAPk+/+ DAPk-/- DAPk-/ DAPk+/ * * * * * * Caspase-3-like DEVDase Caspase-9-like LEHDase Caspase-8-like IETDase 0 TUN : 8 H 16 H 24 H

28 ER stresi tarafından uyarılan otofaji, hücre ölümüne katkıda bulunuyor mu?

29 Survival (% of control) Survival (% of total) ER stresin yol açtığı hücre ölümü için hem apoptoz hem de otofaji gerekli * Atg-5+/+ Atg-5-/- * TUN TUN+ZVAD TUN+3MA TUN+ZVAD+3MA 5 0 sirna-hcred Atg5+/+ sirna-caspase-3 Atg5-/- sirna : C 3 C 3 ZVAD : kaspaz inhibitörü 3MA : otofaji inhibitörü Casp-3 Tubulin

30 DAPk apoptoz ile otofajinin kesişme noktasında Hücresel stres PP2A P DAPk CaM Ca ++ CaM Kaspaz aktivasyonu Otofaji

31 DAPk otofajiyi Beklin1 i fosforilleyerek aktive ediyor Zalckvar E et al, EMBO Reports 2009 Zalckvar E et al, Autophagy 2009

32 DAPk, tümör bağlantılı yolaklar ve otofaji Gozuacik D and Kimchi A, Autophagy 2006

33 ISTANBUL GOZUACIK LABORATUVARI: Devrim Gözüaçık Géraldine Mitou Özlem Oral Gözde Korkmaz Dilek Kılıç Özgür Öksüz Gökçen Gökçe Zeynep İtah Kolaboratörler: Adi Kimchi (Weizmann Enstitüsü) Reuven Agami (NKI) Levent Türkeri (Marmara Üniversite Hastanesi) Sinan Ekici (Maltepe Üniversite Hastanesi) Işın Ekici (Yeditepe Üniversite Hastanesi)

Benzer belgeler

Sabancı Üniversitesi, Biyolojik Bilimler ve Biyomühendislik Programı, İstanbul.

Otofaji Analiz Yöntemleri ve Uygulama Aşamaları Devrim GÖZÜAÇIK Sabancı Üniversitesi, Biyolojik Bilimler ve Biyomühendislik Programı, İstanbul. dgozuacik@sabanciuniv.edu TEMEL BİLGİ Otofaji Hücresel anlamda