Östrustaki Sığır Serumu

Transkript

1 T.C. ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ KESİN RAPORU Proje Başlığı Östrustaki Sığır Serumu ve Fetuin in Sığır Oositlerinin İn Vitro Maturasyonu Üzerine Etkileri Proje Yürütücüsünün İsmi Prof. Dr. Hakkı İZGÜR Proje Numarası Başlama Tarihi Östrustaki Sığır Serumu ve Fetuin in Bitiş Tarihi Sığır Oositlerinin İn Vitro Rapor Tarihi Maturasyonu Üzerine Etkileri

2 T.C. ANKARA ÜNİVERSİTESİ BİLİMSEL ARAŞTIRMA PROJESİ KESİN RAPORU Proje Başlığı Östrustaki Sığır Serumu ve Fetuin in Sığır Oositlerinin İn Vitro Maturasyonu Üzerine Etkileri Proje Yürütücüsünün İsmi Prof. Dr. Hakkı İZGÜR Proje Numarası Başlama Tarihi Bitiş Tarihi Rapor Tarihi Ankara Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Ankara - " 2004 "

3 I. Projenin Türkçe ve İngilizce Adı ve Özetleri Östrustaki Sığır Serumu (Estrous Cow Serum-ECS) ve Fetuinin Sığır Oositlerinin in vitro Maturasyonu Üzerine Etkileri Sunulan çalışmada östrustaki sığır serumu (Estrous Cow Serum-ECS) ve fetuinin mezbahadan toplanan ovaryumlardan aspire edilen sığır oositlerinin in vitro maturasyonu üzerine etkilerinin fertilizasyon başarısı ile ilişkilendirilerek ortaya konması amaçlanmıştır. Çalışmada materyal olarak, Ankara İli Çubuk İlçesi belediye mezbahasında kesilen hayvanlardan toplanan 167 ovaryumdan aspire edilmiş 600 oosit (300 -I and 300 II) kullanıldı. Ovaryumlar, içerisine penisilin (100 IU/ml), dihidrostreptomisin (50 mg/ml) ve amphotericin-b (50 mg/ml) katılan ve ortalama 30 C sıcaklıktaki serum fizyolojik içinde laboratuvara ulaştırıldıktan sonra yıkandı. Ovaryumların üzerlerindeki yüzeysel folliküller çaplarına göre (2-7 mm-grup I ve >7-10 mm-grup II) sayıldı. Tüm folliküllerin 18 G luk iğne ile punksiyonları yapılarak oositler aspire edildi. Aspire edilen cumulus-oosit kompleksleri morfolojilerine (<4 kat cumulus hücre katmanı ve kumlu ooplazma görüntüsü I. kalite, 3-4 kat cumulus hücresi ve hafif kumlu ooplazma görüntüsü II. kalite, 1-2 kat cumulus hücresi ve homojen ooplazma görüntüsü III. kalite ve çıplak oositler IV. kalite) göre sınıflandırıldı. Çalışmada oositler üç ayrı maturasyon vasatına (TCM-199+%0.6 (m/v) BSA-Grup I, TCM-199+%0.6 (m/v) BSA+ 1 mg/ml Fetuin-Grup II and TCM- 199+%0.6 (m/v) BSA+%20 (v/v) ECS-Grup III) yerleştirildi ve inkubasyon 39 C sıcaklıkta %5 CO2 atmosferinde saatte gerçekleştirildi. Maturasyon sonunda oositler cumulus ekspansiyonunun derecesi (CE0-ekspansiyon yok, CE1- hafif ekspanse ya da CE2-tamamen ekspanse) ve I. kutup hücresinin atılması yönünden (PB0 ya da PB1) incelenerek CE ve PB gruplandırmasına göre ayrı ayrı fertilizasyon vasatına (Tyrode nin Albumin Laktat Piruvat vasatı- TALP) konuldu. Kapasitasyon ajanı olarak Heparin (10 μg/ml) kullanıldı. İn vitro fertilizasyon 39 C sıcaklıkta %5 CO2 atmosferinde saatte gerçekleştirildi. Fertilizasyon sonrası her iki gamete ait pronukleusların görülmesi ile fertilizasyon

4 belirlendi. Çalışmanın her basamağına ait veriler kaydedilerek Student s T testi ile istatistiki değerlendirmesi yapıldı. Çalışma sonucunda, oositlerde gözlenen cumulus ekspansiyon derecelerinin sırasıyla (CE0, CE1, ve CE2), Grup I de 42 (%21), 63 (%31.5) ve 95 (%47.5), Grup II de 37 (%18,5), 65 (%32.5) ve 98 (%49) ve Grup III de 36 (%18), 59 (%29,5) ve 105 (%52,5) olduğu ve Grup III deki değerlerin diğer gruplardan belirgin ölçüde yüksek olduğu tespit edildi. Gruplardaki kutup hücresi atım oranlarının ise sırasıyla, Grup I de %67,5 (135/200), %66,5 (131/200) ve Grup III de %59 (118/200) olduğu kaydedilirken, Grup I ve II arasında bir fark belirlenemezken (p>0.05), Grup III ün diğer gruplardan istatistiki olarak düşük olduğu bulundu (p<0.01). Gruplardaki fertilizasyon oranları ise sırasıyla %45.5 (91/200), %51.5 (103/200) ve %48 (96/200) olarak bulunurken, Grup II deki fertilizasyon oranı istatiski olarak belirgin ölçüde yüksekti (p< 0.05). Sonuç olarak, fetuinin cumulus ekspansiyonunu arttırmamasına rağmen fertilizasyon oranlarını belirgin ölçüde yükselttiği, bunun aksine ECS nin cumulus ekspansiyonu derecesini arttırırken, kontrol ve fetuin ile kıyaslandığında fertilizasyon başarısını etkilemediği ve cumulus ekspansiyon derecesinin ya da kutup hücresi atımı kriterlerinin maturasyonun ortaya konmasında tek başına kullanılamayağı sonucuna varıldı. The Effects of Estrous Cow Serum (ECS) and Fetuin on in vitro Maturation of Bovine Oocytes The aim of this study was to determine the effects of Estrous Cow Serum (ECS) and fetuin on in vitro maturation of bovine oocytes aspirated from slaugthered ovaries in relation with the fertilization competence. A number of 600 good-quality (300 Grade I and 300 Grade II) oocytes aspirated from 167 ovaries collected from the slaugthered cows at the Municipal slaugterhouse of Çubuk, Ankara were used as the material. Ovaries were pooled and carried to laboratory in a thermos filled with antibiotic (peniciline -100 IU/ml, dihydrostreptomicine-50 mg/ml and amphotericine-b-50 mg/ml) added, app. 30 C -heat saline and washed with fresh saline. All follicles were punctured with an 18 G needle hold on a 5 ml syringe and aspirated cumulus-oocyte complexes were

5 classified in regard to their morphological apperance (>4 cumulus layers and sandy ooplazm vision Grade I, 3-4 cumulus layers and slightly sandy ooplazm vision Grade II, 1-2 cumulus layers and homogen ooplazma vision Grade III and naked oocytes Grade IV). Only Grade I and II oocytes were used in maturation process. In experimental design, oocytes (200 each) were placed in three different maturation media (TCM % (m/v) BSA-Group I, TCM % (m/v) BSA+ 1 mg/ml Fetuin-Group II and TCM % (m/v) BSA+20% (v/v) ECS- Group III) and incubated under an atmosphere of %5 CO 2 at 39 C for hr. At the end of the maturation period the oocytes were evaluated for the degree of cumulus expansion (CE0-no expansion, CE1-slight expansion or CE2-fully expansion) and extursion of the first polar body to the perivitelline space (PB0 or PBI) and transfered seperately for every CE and PB degree to the fertilization media (modified Tyrode s Albumine Lactate Pyruvate medium-talp) for in vitro fertilization. Heparine (10 μg/ml) was used as the capacitating agent. Incubation was held under an atmosphere of %5 CO 2 at 39 C for hr. The detection of both male and female pronucleus was defined as the sign of the fertilization. The data obtained at the all stages were recorded and statistical evaluation was done with the Student s T test. At the end of the study, when evaluated for cumulus expansion; 42 (21%), 63 (31.5%) and 95 (47.5%) in Group I, 37 (18,5%), 65 (32.5%) and 98 (49%) in Group II and 36 (18%), 59 (29,5%) and 105 oocytes (52,5%) in Group III were found CE0, CE1, and CE2, respectively, with a significiant statistical difference for Group III (p<0.05). Polar body extursion rates were 67,5% (135/200) in Group I, 66,5% (131/200) in Group II and 59% (118/200) in Group III. Group I and II did not differ statistically (p>0.05), where as Group III was significiantly low (p<0.01). Fertilization rates were found 45.5% (91/200) in Group I, 51.5% (103/200) in Group II and 48% (96/200) in Group III and Group II was significantly higher (p< 0.05). As a conclusion, although cumulus expansion rates did not improved with fetuin, fertilization rates were significiantly increased. Contrary to the high expansion rates in ECS group, fertilization rates did not differ significantly when compared with controls and fetuin group. It was also obvious that cumulus

6 expansions or polar body extursion could not be used individually in maturation detection process. II. Amaç ve Kapsam Bu projenin amacı, bilinen ve çok uygulanan bir in vitro maturasyon sistemine (TCM-199 ve % 0.6 BSA) vasat katkısı olarak Östrustaki Sığır Serumu ve Fötal Buzağı Serumundan liyofilize edilen fetuin ilave edilerek, mezbahadan toplanan ovaryumlardan aspire edilen sığır oositlerinin mature edilmesi, bu katkı maddelerinin etkilerinin araştırılması ve bu tekniğin değerlendirilmesidir. III. Materyal ve Yöntem Ovaryum Toplanması Ankara ili Çubuk İlçesi Belediye mezbahasında kesilen hayvanlardan toplanan 167 ovaryum üzerinde bulunan 1274 adet 2-10 mm lik foliküllerden laboratuvar ortamında aspire edilen toplam 1256 adet cumulus oosit kompleksinden, I. ve II. kalite olduğu tespit edilen 600 adedi çalışmada materyal olarak kullanıldı. Ovaryumlar hayvanların kesiminden hemen sonra alınarak, içinde taşıma vasatı bulunan termoslara toplanarak, en çok 5 saat içinde laboratuvara ulaştırıldı. Taşıma vasatı olarak içerisine, penisilin ( IU/ml) ve dihidrostreptomisin sülfat ( μg/ml) ve amphotericine-b (50 μg/ml ) katılmış (A5955, Sigma Co., EU), C ye ısıtılmış %0.9 luk steril serum fizyolojik kullanıldı. Taşıma vasatları kullanım günü, mezbahaya gitmeden hemen önce taze olarak hazırlandı. Oosit Aspirasyonu ve Oositlerin Seleksiyonu Periferal folliküllerin punksiyonları, ucuna 18 Gauge luk steril iğne takılmış ve ml gruba özgü maturasyon vasatı çekilmiş 5 ml lik steril plastik enjektörlerle gerçekleştirildi. Elde edilen folliküler sıvı ve cumulus-oosit

7 kompleksleri, çökmeleri için 39 C deki etüvde 5 dakika bekletildikten sonra, 10 dakika 1000 devirde santrifüj edildi. Çöküntü, taze vasatla sulandırıldı ve oosit seleksiyonu için 35X10 luk petri kutularına ( FLC-HKUL , İnterlab, Ankara, Türkiye) aktarıldı. Cumulus oosit komplekslerinin morfolojik seleksiyonu Brackett ve Zuelke (1993) nin tarif ettiği yönteme göre yapıldı. Çeperleri >4 cumulus hücre katmanı ile sıkıca çevrili, zona pellucidası sağlam, kumlu bir ooplazma görüntüsüne sahip oositler I, 3-4 kat cumulus hücre katmanı ile çevrili, zona pellucidası sağlam, hafif kumlu bir ooplazma görüntüsüne sahip oositler II olarak kalitelerine göre ayrı ayrı 4 gözlü özel petrilere (FAL353654) aktarıldı. İn vitro Oosit Maturasyonu (IVM) Standart ve kontrol grubu maturasyon vasatı olarak Yang ve ark. (1993) ve Farin ve ark. (1997) bildirdiği şekilde, Doku Kültürü Vasatı-199 (TCM-199) (M2520, Sigma Co., EU) kullanıldı ve vasata protein katkısı olarak 6 mg/ml Sığır Serum Albumini (Bovine Serum Albumin-BSA, A1933, Sigma Co. EU) katıldı. Bu standart vasata Grup II de %20 (v/v) Östrustaki Sığır Serumu (ECS-Estrous Cow Serum) ve Grup III de ise 1 mg/ml Fetuin (F2379, Sigma Co., EU) katıldı. Bunlara ek olarak tüm vasatlara, kontaminasyonun engellenmesi amacıyla antibiyotik (100 IU/ml penisilin, 100 μg/ml streptomisin ve 0.25 μg/ml amfoterisin-b- A5955, Sigma Co., EU) eklendi. Maturasyonda kullanılacak vasat, oositlerin aktarılmasından en az 3 saat önce petrilere konularak %5 CO 2 ve hava atmosferinde, 39 C de inkübe edilerek ekilibrasyon sağlandı (Gordon, 1994). Oositler 0.8 ml lik vasata adet oosit gelecek populasyonda petrilere konuldu ve üzerileri birkaç damla embriyo testi yapılmış, toksik olmayan mineral yağ (Sigma- M8410) damlatılarak kapatıldı. Maturasyon işlemi 39 C inkübatörde, %5 CO 2 atmosferinde, maksimum nemde, 24 saatte gerçekleştirildi. Maturasyon kültürü sonunda, oositler HEPES katkılı modifiye Tyrode nin Albumin Laktat Piruvat Vasatı (HEPES-mTALP) (Tablo III.VI) ile yıkandı. Yıkama işleminden önce 5 ml HEPES-mTALP içeren petriler kapakları kapalı

8 şekilde, 39 C, %5 CO 2 li ortamda 3 saat bekletildi. Yıkamadan sonra çalışma gruplarında vasata eklenen maturasyon destekleyicisi maddelerin etkinliğinin ortaya konabilmesi için maturasyon, aşağıda sunulan kriterlere göre değerlendirildi ve değerlendirme sonrası herbir gruba ait oositler Tablo III.III deki sınıflandırmaya göre ayrı ayrı petrilere aktarıldı. a) Cumulus Ekspansiyonu (CE) Maturasyon kültürü sonrası cumulus ekspansiyonu Tablo III.I de verildiği şekilde derecelendirildi. Tablo III.I. Cumulus ekspansiyonu derecelendirmesi Genişleme yok CE0 1-2 katta genişleme CE1 Tam genişleme CE2 b) Kutup Hücresinin Görülmesi (PB) Maturasyon kültürü sonrası kutup hücresinin atılması aşağıda tabloda verildiği şekilde derecelendirildi. Tablo III.II. Kutup hücresinin derecelendirmesi Kutup hücresinin görülmemesi Kutup hücresinin görülmesi PB0 PB1 Tablo III.III. Maturasyonun değerlendirmesini takiben ayrı ayrı petrilere aktarılan oositlerin sınıflandırılma şekilleri I.kalite CE0 PB0 II.kalite CE0 PB0 I.kalite CE0 PB1 II.kalite CE0 PB1 I.kalite CE1 PB0 II.kalite CE1 PB0 I.kalite CE1 PB1 II.kalite CE1 PB1 I.kalite CE2 PB0 II.kalite CE2 PB0 I.kalite CE2 PB1 II.kalite CE2 PB1

9 İn vitro Fertilizasyon İn Vitro Fertilizasyon İşleminde Kullanılan Vasatların Hazırlanması İn vitro fertilizasyon prosedüründe, modifiye Tyrode nin Albumin Laktat Piruvat Vasatı (mtalp), Hansen (2002) nin tarif ettiği metoda uygun olarak, kullanım amacına göre; fertilizasyona alınacak oositlerin yıkanması için HEPES katkılı mtalp (HEPES TALP), sperma seleksiyonu için sperm mtalp (Sp-TALP) ve fertilizasyon amacıyla IVF-mTALP (IVF-TALP) olarak hazırlandı (Tablo III.IV, III.V ve III.VI). Modifiye Tyrode nin Albumin Laktat Piruvat Vasatları hazırlanma işleminde ilk adım olarak Hansen (2002) nin tarifine göre stok solüsyonları hazırlandı (Tablo III.IV). Tablo III.IV. Stok solüsyonlarının hazırlanması ve saklanması Stok no Stok ismi Hazırlanma şekli Saklanma koşulları Stok 1 Na-laktat %60 lık şurup 4 C Stok 2 Na-piruvat gr 100 distile suda çözdürüldü 4 C, 1 ay Stok 7 Heparin 20 mg 10 ml distile suda 1.5 ml lik godelerde 300 çözdürüldü μl lik volümlerle -20 C, sonsuz Stok 17 NaCl g, 50 ml distile suda 4 C çözdürüldü Stok 18 KCl g, 50 ml distile suda 4 C çözdürüldü Stok 19 NaHCO g, 50 ml distile suda 4 C, 1 hafta çözdürüldü Stok 20 PO g NaH 2 PO 4 +H 2 O, 50 4 C ml distile suda çözdürüldü Stok 21 1 M HEPES 119 g, 400 ml distile suda 4 C çözdürüldü, ph 7 ye ayarlandı, volüm 500 ml ye tamamlandı Stok 22 CaCl g CaCl 2 +2H 2 O, 50 ml 4 C distile suda çözdürüldü Stok 23 MgCl G MgCl 2 +6H 2 O, 50 ml distile suda çözdürüldü 4 C Stok solüsyonları hazırlandıktan sonra, Tablo III.V de tarif edildiği gibi karıştırılarak ön vasatlar (TL) hazırlandı.

10 Tablo III.V. Modifiye TALP vasatlarının ön karışımlarının (TL) hazırlanması İçerik Sp-TL (ml) HEPES-TL (ml) IVF-TL (ml) Distile su Stok Stok Stok Stok Stok Stok Stok Stok ph Ön vasatların hazırlanmasından sonra HEPES TALP, Sp-TALP ve IVF- TALP vasatlarının hazırlanması işlemine geçildi (Tablo III.VI). Tablo III.VI. Modifiye HEPES TALP, Sp-TALP ve IVF-TALP vasatlarının hazırlanması İçerik Sp-TALP HEPES-TALP IVF-TALP TL (ml) BSA (mg) Stok 2 (ml) Stok 7 (μl) Sperma Kaynağı İn vitro fertilizasyonda kullanılmak üzere Lalahan Zootekni Araştırma Enstitüsünden alınan ve içeriğinde 20x10 6 motil spermatozoa/ml bulunan 0.25 ml lik ticari payetlerdeki dondurulmuş/çözdürülmüş boğa sperması kullanıldı. Motil Spermatozoaların Seleksiyonu Kapasitasyon işlemi öncesi motil spermatozoaların seçilmesi amacıyla Hansen (2002) nin tarif ettiği şekilde yüzdürme deneyi (swim-up deneyi) modifiye edilerek uygulandı. Deney öncesi 4 adet konik santrifüj tüpünün içerisine 1 er ml, 1 adet tüpün içerisine de 5 ml Sp-TALP (Tablo III.IV) konuldu ve 39 C de 3 saat bekletildi. 6-8 adet payet önce 37 C lik su banyosunda saniye tutularak çözdürme işlemi yapıldı. Ardından, kapalı uçları kesilerek içerisindeki sperma, 5 ml vasat içeren tüp içerisine yavaşça bırakıldı. 38 C lik etüvde 5 dakika bekletilen karışım, 500 devirde 10 dak. santrifüj işlemine tabi tutuldu. Santrifüj sonrası alt

11 kısımdan alınan 1 ml, her birinde 1 ml Sp-TALP bulunan 4 ayrı konik santrifüj tüpünün altında tabaka oluşturacak şekilde 0.25 ml lik hacimler halinde bölündü. Tüpler 45 lik bir açı ile standlara yerleştirildi ve 60 dak. 38 C lik etüvde inkübe edildi. İnkubasyon sonrası her tüpteki süpernatanttan 800 μl toplandı ve toplanan süpernatant (4 ayrı tüpten toplam 3,2 ml) tekrar 1000 devirde 5 dak. santrifüj işlemine tabi tutuldu. Son olarak süpernatantın üst kısmından 2,7 ml lik kısım atıldı ve dipte kalan 500 μl lik kısım, in vitro fertilizasyonda 20 oosit için 20 μl lik hacimler halinde kullanıldı. Spermatozoon Kapasitasyonu Kapasitasyon, fertilizasyon vasatına (IVF-TALP) katılan %1 (v/m) heparin (H3144, Sigma Co., EU) ile sağlandı. İn vitro Fertilizasyon Tekniği Fertilizasyon vasatı olarak IVF-TALP (Tablo III.VI) kullanıldı. Vasat, fertilizasyon öncesi 0.8 ml miktarlarda 4 gözlü özel petrilere (FAL353654) aktarılıp, petrinin kapakları açık bir şekilde konularak %5 CO 2 ve hava atmosferinde, 39 C de equilibre edildi. Fertilizasyon işlemi için, heparin katkılı vasata, 20 oosit için 20 μl final sperma solüsyonu konularak, 39 C de %5 CO 2 atmosferinde ve maksimum nemde saat inkübasyon gerçekleştirildi. Fertilizasyonun gerçekleştiği, inkübasyonun sonunda erkek ve dişi pronukleusların görülmesiyle doğrulandı. Deney Düzeneği Çalışmada maturasyon vasat katkılarına göre üç grup belirlenerek, gruplar; Grup I (Kontrol, n=200 oosit), Grup II (Fetuin, n=200 oosit) ve Grup III (ECS, n=200 oosit) olarak düzenlendi. Her üç çalışma grubundaki oositlere de aspirasyon sonrası aynı in vitro maturasyon ve fertilizasyon protokolleri uygulandı.

12 İstatistiki Değerlendirme Çalışma gruplarında elde edilen maturasyon ve fertilizasyon bulgularının istatistiki değerlendirmesi Student s T testiyle yapıldı. Test sonucu elde edilen ortalama değerler yüzde (%) ile ifade edilirken, standart sapma değerleri anlamlı değerler için p< 0.01 ve p< 0.05 alındı ve standart sapma, nokta sonrası iki hane ile değerlendirildi. Çalışma Sonuçlarının Görüntülenmesi Çalışmada gerçekleştirilen tüm mikroskopik görüntülemeler faz kontrast mikroskoba adapte edilmiş Nikon-DC112 marka fotoğraf makinası ile 10X2.5 inchx5 büyütmede, 100 ASA da 0.1 sn. ayarlarda, renkli film ile gerçekleştirildi. IV. Analiz ve Bulgular Çalışmada, mezbahadan toplanan 167 ovaryum üzerindeki 2-7 mm çapındaki toplam 1274 adet yüzeysel follikülün aspirasyonu ile 1256 cumulus-oosit kompleksi %98,5 lik bir başarıyla aspire edilirken, bu oositlerin 600 adetinin I. ve II. kalite (Şekil IV.I) olduğu belirlenerek, in vitro maturasyon işlemine alındı. Aspire edilen tüm cumulus-oosit komplekslerinin kalitelerine göre dağılımları Tablo IV.I de verilmiştir. Tablo IV.I. Aspire edilen cumulus-oosit komplekslerinin kalitelerine göre dağılımları. Oosit si Cumulus-Oosit Kompleksi Sayısı I. 300 (%23,8) a II. III. IV. (Çıplak) 300 (%23,8) a 344 (%27,3) b 312 (%24.8) b Toplam 1256 Aynı sütünda farklı harflerle işaretlenmiş satırlar birbirinden istatistiki olarak farklıdır (a,b p>0.05).

13 KALİTE I KALİTE II Şekil IV.I Değişik kalitelerdeki cumulus oosit komplekslerinin morfolojileri İn Vitro Oosit Maturasyonu Bulguları Cumulus Ekspansiyonu (CE) Çalışma (Grup II ve III) ve kontrol grubunda (Grup I) maturasyona alınan oositlerde inkubasyon sonrası gözlenen cumulus ekspansiyon (CE0, CE1 ve CE2) (Şekil IV.II) dereceleri gruplara göre sırasıyla; Grup I de CE0 %21 (42/200), CE1 %31.5 (63/200) ve CE2 %47.5 (95/200); Grup II de CE0 %18,5 (37/200), CE1 %32,5 (65/200) ve CE2 %49 (98/200) ve Grup III de CE0 %18 (36/200), CE1 %29,5 (59/200) ve CE2 %52,5 (105/200) olarak bulundu (Tablo IV.II). Cumulus ekspansiyonları yönünden incelendiğinde Grup I ve Grup II arasında istatistiki bir fark belirlenemezken (p>0.1), Grup III de cumulus ekspansiyon başarısının diğer gruplara oranla belirgin ölçüde yüksek olduğu görüldü (p<0.05). Kontrol ve çalışma gruplarındaki cumulus ekspansiyonu başarıları gruplardaki cumulus-oosit komplekslerinin morfolojisine göre incelendiğinde ise hiçbir grupta, grup içerisinde I. ve II. kalite oositlerdeki cumulus ekspansiyonları açısından istatistiki bir fark belirlenememiştir (p>0,05) (Tablo IV.II ve Şekil IV.III, IV.IV ve IV.V).

14 Tablo IV.II. Kontrol (Gup I) ve çalışma gruplarında (Grup II ve III) elde edilen cumulus ekspansiyonu dereceleri. CUMULUS EKSPANSİ YONU I Grup I (n) Grup II (n) Grup III (n) II Toplam I II Toplam I II Toplam CE0 21 c 21 d 42 a,x 18 e 19 f 37 a,y 18 g 18 h 36 b CE1 31 c 32 d 63 a,x 31 e 34 f 65 a,y 27 g 32 h 59 b CE2 48 c 47 d 95 a,x 51 e 47 f 98 a,y 55 g 50 h 105 b Toplam Aynı satırda farklı harflerle işaretlenmiş sütunlar birbirinden istatistiki olarak farklıdır (a,b p< 0,05; x,y p>0.1; c,d,e,f,g,h p>0.05) (CE0: genişleme yok, CE1: 1-2 katta genişleme ve CE2: tam genişleme). CE0 CE1 CE2 Şekil IV.II. Değişik cumulus ekspansiyon (CE) dereceleri

15 % I II 0 Grup I Grup II Grup III Şekil IV.III. Kontrol (Grup I) ve çalışma gruplarında (Grup II ve III) oosit kalitesi ile cumulus ekspansiyonu arasındaki ilişki (CEO) % I II 20 0 Grup I Grup II Grup III Şekil IV.IV. Kontrol (Grup I) ve çalışma gruplarında (Grup II ve III) oosit kalitesi ile cumulus ekspansiyonu arasındaki ilişki (CE1) % I II 0 Grup I Grup II Grup III Şekil IV.V. Kontrol (Grup I) ve çalışma gruplarında (Grup II ve III) oosit kalitesi ile cumulus ekspansiyonu arasındaki ilişki (CE2) Kutup Hücresinin Atılması (PB) Kontrol grubunda (Grup I) ve çalışma gruplarında (Grup II ve III) in vitro maturasyon işlemi sonrasında perivitellin boşlukta I. kutup hücresinin görülme (PB1) (Şekil IV.VI) oranları gruplara göre sırasıyla; Grup I de %67,5 (135/200),

16 Grup II de %66,5 (131/200) ve Grup III de %59 (118/200) olarak bulundu (Tablo IV.III). Kutup hücresinin atılması yönünden incelendiğinde Grup I ve Grup II arasında istatistiki bir fark belirlenemezken (p>0.05), Grup III de kutup hücresinin atılma başarısının diğer gruplara oranla belirgin ölçüde düşük olduğu görüldü (p<0.05). Kontrol ve çalışma gruplarındaki kutup hücresi atımı başarıları gruplardaki cumulus-oosit komplekslerinin morfolojisine göre incelendiğinde ise hiçbir grupta, grup içerisinde I. ve II. kalite oositlerdeki kutup hücrelerinin atılma başarılarında istatistiki bir fark belirlenememiştir (p>0,05) (Tablo IV.III ve Şekil IV.VII). Tablo IV.III. Kontrol (Grup I) ve çalışma gruplarında (Grup II ve III) elde edilen kutup hücresi görülme oranları. KUTUP HÜCRESİNİN ATILMASI I Grup I (n) Grup II (n) Grup III (n) II Toplam I II Toplam I II Toplam PB0 34 c 31 d 65 a,x 35 e 34 f 69 a,y 40 g 42 h 82 b PB1 66 c 69 d 135 a,x 65 e 66 f 131 a,y 60 g 58 h 118 b Toplam Aynı satırda farklı harflerle işaretlenmiş sütunlar birbirinden istatistiki olarak farklıdır (a,b p< 0,05; x,y p>0.05; c,d,e,f,g,h p>0.05) (PB0: kutup hücresinin görülmemesi, PB1: kutup hücresinin görülmesi). Şekil IV.VI. Kutup hücresinin perivitellin boşlukta görülmesi

17 % I II 0 Grup I Grup II Grup III Şekil IV.VII Kontrol (Grup I) ve çalışma gruplarında (Grup II ve III) oosit kalitesi ile kutup hücresinin atılması arasındaki ilişki. İn Vitro Fertilizasyon Bulguları Çalışmada gruplarda yer alan ve maturasyon kriterlerine bakılmaksızın tamamı fertilizasyon işlemine alınan 600 oositin gruplara göre fertilizasyon (Şekil IV.VIII) oranları (PN1) sırasıyla Grup I de %45.5 (91/200), Grup II de %51.5 (103/200) ve Grup III de %48 (96/200) olarak bulundu. Gruplarda elde edilen sonuçların istatistiki incelemesi sonucunda ise Grup I ve III arasında bir fark gözlenmezken (p>0.5), Grup II de elde edilen fertilizasyon başarısı daha yüksek bulundu (p< 0.01) (Tablo IV.IV). Gruplarda elde edilen fertilizasyon oranları cumulus-oosit morfolojisi yönünden incelendiğinde ise gruplar içinde kalite ile fertilizasyon arasında pozitif bir ilişki bulunamadı (p> 0.5) (Tablo IV.IV. ve Şekil IV.IX). Tablo IV.IV. Kontrol (Grup I) ve çalışma gruplarında (Grup II ve III) elde edilen fertilizasyon oranları. KUTUP HÜCRESİNİN ATILMASI I Grup I (n) Grup II (n) Grup III (n) II Toplam I II Toplam I II Toplam PN0 53 c 56 d 109 a,x 49 e 48 f 97 b 50 g 54 h 104 a,y PN1 47 c 44 d 91 a,x 51 e 52 f 103 b 50 g 46 h 96 a,y Toplam Aynı satırda farklı harflerle işaretlenmiş sütunlar birbirinden istatistiki olarak farklıdır (a,b p< 0,01; x,y p>0.5; c,d,e,f,g,h p>0.5) (PN0: fertilizasyon yok, PN1: fertilizasyon var).

18 Şekil IV.VIII Fertilize oosit (Oklar pronukleusları gösteriyor) % I II 20 0 Grup I Grup II Grup III Şekil IV.IX. Kontrol (Grup I) ve çalışma gruplarında (Grup II ve III) oosit kalitesi ile fertilizasyon arasındaki ilişki. Maturasyonun Ortaya Konmasında Tüm Kriterlerin Beraber İncelenmesi Kontrol (Grup I) ve çalışma gruplarındaki (Grup II ve III) oositlerin morfolojik kaliteleri, cumulus ekspansiyonu dereceleri ve I. kutup hücresinin atılması başarıları beraber incelendiğinde, bahsedilen üç parametre ile maturasyon arasındaki ilişki gruplara göre Tablo IV.V, IV.VI ve IV.VII de verilmiştir.

19 Tablo IV.V. Grup I de (Kontrol Grubu) oositlerin morfolojik kaliteleri, cumulus ekspansiyonu dereceleri ve I. kutup hücresinin atılması başarıları ile fertilizasyon oranları arasındaki ilişki Grup I (Kontrol Grubu) (n=200) I (n=100) II (n=100) Cumulus Ekspansiyonu CE0 CE1 CE2 CE0 CE1 CE Kutup Hücresinin Atılması PB0 PB1 PB0 PB1 PB0 PB1 PB0 PB1 PB0 PB1 PB0 PB Fertilizasyon Tablo IV.VI. Grup II de (Fetuin Grubu) oositlerin morfolojik kaliteleri, cumulus ekspansiyonu dereceleri ve I. kutup hücresinin atılması başarıları ile fertilizasyon oranları arasındaki ilişki Grup II (Fetuin Grubu) (n=200) I (n=100) II (n=100) Cumulus Ekspansiyonu CE0 CE1 CE2 CE0 CE1 CE Kutup Hücresinin Atılması PB0 PB1 PB0 PB1 PB0 PB1 PB0 PB1 PB0 PB1 PB0 PB Fertilizasyon

20 Tablo IV.VII. Grup III de (ECS Grubu) oositlerin morfolojik kaliteleri, cumulus ekspansiyonu dereceleri ve I. kutup hücresinin atılması başarıları ile fertilizasyon oranları arasındaki ilişki Grup III (ECS Grubu) (n=200) I (n=100) II (n=100) Cumulus Ekspansiyonu CE0 CE1 CE2 CE0 CE1 CE Kutup Hücresinin Atılması PB0 PB1 PB0 PB1 PB0 PB1 PB0 PB1 PB0 PB1 PB0 PB Fertilizasyon Kontrol grubunda (Grup I) ve Çalışma gruplarında (Grup II ve III) sırasıyla 29/42 (%69,1), 29/37 (%78,3) ve 21/36 (%58,3) oositte cumulus ekspansiyonu ve kutup hücresinin atılması izlenmemiştir. Buna ek olarak bu düşeyde yeralan oositlerin hiçbirinde fertilizasyon belirlenememiştir (Şekil IV.X). (n) Grup I Grup II Grup III CE0 CE0-PB0-Fert (-) I II Şekil IV.X. CE0-PB0-Fertilizasyon Kontrol grubunda (Grup I) ve Çalışma gruplarında (Grup II ve III) sırasıyla 13/42 (%30.9), 8/37 (%21,6) ve 15/36 (%41,6) oositte maturasyonun ilk belirtisi olan cumulus ekspansiyonu görülmemesine rağmen kutup hücresinin atıldığı ve Grup III deki sonucun diğer gruplardan istatistiki olarak yüksek olduğu belirlenmiştir (p<0.05). Cumulus-oosit kompleksinin kalitesi gözönüne

21 alındığında II. kalite oositlerde cumulus ekspansiyonu gözükmemesine rağmen kutup hücresi atımı daha yüksek bulundu (p<0.05). Bu iki parametrenin beraber incelemesine fertilizasyon sonuçları da katıldığında anılan oositlerden, Grup I de 4 tanesinin (%30.7), Grup II de 4 (%50) ve Grup III de 2 tanesinin (%13,3) fertilize olduğu görüldü (Şekil IV.XI). (n) Grup I Grup II Grup III CE0 CE0-PB1 I II Fert (+) Şekil IV.XI. CE0-PB1-Fertilizasyon Kontrol grubunda (Grup I) ve Çalışma gruplarında (Grup II ve III) sırasıyla 21/95 (%22,1), 20/98 (%20,4) ve 44/105 (%41,9) oositte maturasyonun ilk belirtisi olan cumulus ekspansiyonu ileri düzeyde görülmesine rağmen, kutup hücresinin atılmadığı ve Grup III deki sonucun diğer gruplardan istatistiki olarak yüksek olduğu belirlenmiştir (p<0.05). Cumulus-oosit kompleksinin kalitesi gözönüne alındığında, gruplar içinde istatistiki bir fark izlenmedi (p>0.5). Fertilizasyon parametresi de katıldığında ise, ileri derecede ekspanse ancak kutup hücresini atmayan oositlerden Grup I de 4 adetinde (%19), Grup II de 5 adetinde (%25) ve Grup III de 15 adetinde (%14,2) fertilizasyon tespit edilmiştir (Şekil IV.XII).

22 Grup I Grup II Grup III CE2 CE2-PB0 I II Fert (+) Şekil IV.XII. CE2-PB0-Fertilizasyon Kontrol grubunda (Grup I) ve Çalışma gruplarında (Grup II ve III) sırasıyla 24/95 (%25,2), 20/98 (%20,4) ve 16/105 (%15,2) oositte cumulus ekspansiyonu ileri düzeyde olmasına ve kutup hücresi atılmasına rağmen fertilizasyon şekillenmemiş (Şekil IV.XIII) ve Grup I deki sonucun diğer gruplardan istatistiki olarak yüksek olduğu belirlenmiştir (p<0.05) Grup I Grup II Grup III CE2 CE2-PB1-Fert (-) I II Şekil IV.XIII CE2-PB1-Fertilizasyon (-) V. Sonuç ve Öneriler Çalışmada elde edilen verilerin ışığında aşağıdaki sonuçlara ulaşılmıştır: V.I. Mezbahadan toplanan ovaryumlardan aspire edilen oositlerin in vitro maturasyon işlemi öncesi, cumulus-oosit kompleksi morfolojileri yönünden bir seleksiyona tabi tutulmalarının in vitro fertilizasyon sonucu ulaşılan fertilizasyon yüzdelerini arttırabileceği,

23 V.II. İn vitro fertilizasyon işleminde I. ve II. kalite oositlerin başarıyla kullanılabileceği, V.III. Oositte maturasyonun ortaya konmasında kutup cisimciğinin atılması ya da cumulus hücrelerinin ekspansiyonunun tek başlarına kullanılmalarının hem pozitif hem de negatif yanılmalara sebep olabileceği, zira bu kriterlere göre mature kabul edilen oositlerin fertilize olamadığı, aksine maturasyonun şekillenmediği oositlerin fertilize olabildiği ve gerçek maturasyon kriterinin fertilizasyon olabileceği, V.IV. Grup II de in vitro maturasyon vasatına katılan fetuinin, cumulus hücrelerinde ekspansiyonu uyarmamasına rağmen fertilizasyon oranlarını kontrol grubuna ve Grup III e oranla belirgin ölçüde arttırdığı, V.V. Grup III de in vitro maturasyon vasatına katılan östrustaki sığır serumunun cumulus hücrelerinde ekspansiyonu uyarmasına rağmen fertilizasyon oranlarını kontrol grubuna göre belirgin ölçüde arttırmadığı, V.VI. Çalışmada kullanılan ph nın, fertilizasyon sonuçlarına olumlu etki gösterdiğini, ancak ileride yapılacak çalışmalarda ph nın yükseltilmesi ile daha iyi fertilizasyon sonuçlarına ulaşılabileceği, V.VII. İlerdeki çalışmalarda tanımlanmış vasatların eldesi amacıyla maturasyon vasatından yanlızca serumun çıkarılmasının yeterli olmadığı, buna ek olarak sığır serum albuminin yerine geçebilecek bir bileşen için araştırmalar yapılması gerektiği, V.VIII. İn vitro maturasyonda kullanılan tekniklerin içerdiği canlı kaynaklı bileşenler (BSA, hormonlar v.b.) üzerinde detaylı çalışmalar gerektiği görüşüne ulaşılmıştır.

24 VI. Kaynaklar 1.ARLOTTO T., SCHWARTZ J.L., FIRST N.L., LEIBFRIED-RUTLEDGE M.L. (1996). Aspects of follicle and oocyte stage that affect in vitro maturation and development of bovine oocytes. Theriogenology, 45: ARMSTRONG D.T. (2001). Effects of maternal age on oocyte developmental competence. Therigenology, 55: AVERY, B., MELSTED, J.K., GREVE, T. (2000). A novel approach for in vitro production of bovine embryos:use of the oxoid atmosphere generating system. Theriogenology. 54: AZAMBUJA R.M., KRAEMER D.C., WESTHUSIN M.E. (1998). Effects of low temperatures on in vitro matured bovine oocytes. Therigenology, 49: AZAMBUJA DE R.M., MORENO J.F., KRAEMER D., WESTHUSIN M. (1993). Effect of gas atmosphere on in vitro maturation of bovine oocytes. Theriogenology. 39: BEKER F., COLENBRANDER B., BEVERS M.M. (2002). Effect of 17β-estradiol on the in vitro maturation of bovine oocytes. Therigenology, 58: BECKER F., KANITZ W., NÜRNBERG G., KURTH J., SPITCHAK M. (1996). Comparison of repeated transvaginal ovum pick up in heifers by ultrasonographic and endoscopic instruments. Therigenology, 46: BEEBE D., WHEELER M., ZERINGUE H., WALTERS E., RATY S. (2002). Microfludic technology for assisted reproduction. Therigenology, 57: BERG U., BREM G. (1990). Developmental rates of in vitro produced IVM-IVF bovine oocytes in different cell co-culture systems. Therigenology, 33: BOERJAN M.L., DAAS DEN J.H.G., DIELEMAN S.J. (2000). Embryonic origins of helth:long term effects of IVF in human and livestock. Theriogenology. 53: BOONE W.R., SHAPIRO S.S. (1990). Quality control in the in vitro fertilization laboratory. Therigenology, 33: BORMANN C., ONGERI E.M., KRISHER R.L. (2003). The effect of vitamins during maturation of caprine oocytes on subsequent developmental potential in vitro. Theriogenology, 59: BRACKETT B.G., ZUELKE K.A. (1993). Analysis of factors involved in the in vitro production of bovine embryos. Therigenology, 43:

25 14. BROGLIATTI G.M., ADAMS G.P. (1996). Ultrasound-guided transvaginal oocyte collection in prepubertal calves. Therigenology, 45: CHOI Y.H., CARNEVALE E.M., SEIDEL G.E., SQUIRES E.L. (2001). Effects of gonadotropins on bovine oocytes maturated in TCM-199. Therigenology, 56: CHOI Y.H., TAKAGI M., KAMISHITA H., WIJAYAGUNAWARDANE M.P.B., ACOSTA T.J., MIYAZAWA K., SATO K. (1998). Effects of follicular fluid on fertilization and embryonic development of bovine oocytes in vitro. Theriogenology, 49: COX J.F., HORMAZABAL J., MARIA A.S. (1993). Effects of the cumulus on in vitro fertilization of bovine maturated oocytes. Therigenology, 40: CUPPS P.T. (1991). Reproduction in Domestic Animals. Ed.: Cupps P.T., 4. Edition, Academic Press Inc., Oxford, UK. 19. DALVIT G.C., CETICA P.D., BECONI M.T. (1998). Effects of α-tocopherol and ascorbic acid on bovine in vitro fertilization. Therigenology, 49: DELL AQUILA M.E., DE FELICI M., MASSARI S., MARITATO F., MINOIA P. (1999). Effects of fetuin on zona pellucida hardening and fertilizability of equine oocytes in vitro. Biol. Reprod., 61: DIXON P. (1995). The Genetic Revolution. ( books/ genesintro. htm). Erişim tarihi: DOWNS S.M., SCHROEDER A.C., EPPIG J.J. (1986). Serum maintains the fertilizability of mouse oocytes maturated in vitro by preventing hardening of the zona pellucida. Gam. Res., 15: DURAN D.H. (2000). Technical aspect of in vitro embryo production. ( Erişim tarihi: FABER D.C., MOLINA, J.A., OHLRICHS, C.L., VANDER ZWAAG, D.F., FERRE, L.B. (2003). Commercialization of animal biotechnology. Theriogenology. 59: FARIN C.E., HASLER J.F., MARTUS N.S., STOKES J.E. (1997). A comparison of Menezo s B2 and Tissue culture medium-199 for in vitro production of bovine blastocysts. Theriogenology, 48: FATEHI A.N., ZEINSTRA E.C., KOOIJ R.V., COLENBRANDER B., BEVERS M.M. (2002). Effect of cumulus cell removal of in vitro matured bovine oocytes prior to in vitro fertilization on subsequent cleavage rate. Therigenology, 57:

26 27. FRY R.C., NIALL E.M., SIMPSON T.L., SQUIRES T.J., REYNOLDS J. (1997). The collection of oocytes from bovine ovaries. Therigenology, 47: FUKUI Y., KIKUCHI Y., KONDO H., MIZUSHIMA S. (2000). Fertilizability and developmental capacity of individually cultured bovine oocytes. Therigenology, 53: GALLI C., CROTTI G., NOTARI C., TURINI P., DUCHI R., LAZZARI G. (2001). Embryo production by ovum pick up from live donors. Therigenology, 55: GALLI C., DUCHİ R., CROTTİ G., TURINI P., PONDERATO N., COLLEONI S., LAGUTINA I., LAZZARİ G. (2003). Bovine embryo technologies. Theriogenology. 59: GARCIA A., SALAHAEDDINE M. (1998). Effects of repeated ultrasound-guided transvaginal follicular aspiration on bovine oocyte recovery and subsequent follicular development. Theriogenology, 50: GLIEDT D.W., ROSENKRANS C.F., RORIE R.W., MUNYON A.L., PIERSON J.N., MILLER G.F., RAKES J.M. (1996). Effects of media, serum, oviductal cells and hormones during maturation on bovine embryo development in vitro. J. Dairy Sci., 79: GOFF A.K., YANG Z., CORTVRINDT R., SMITZ J., MIRON P. (2001). Protein synthesis during maturation of bovine oocytes, effect of epidermal growth factor. Reprod. Dom. Anim., 36: GORDON, I. (1994). Laboratory Production of Cattle Embryos. Cab international co., Wallingford UK. 35. GORDON I., LU K.H. (1990). Production of embryos in vitro and its impact on livestock production. Therigenology, 33: GREVE, T., MADISON, V. (1991). In vitro fertilization in cattle: a review. Reprod. Nutr. Dev., 31: GREVE T., MADISON V., AVERY B., CALLESEN H., HYTELL P. (1993). In vitro production of bovine embryos: a progress report and the consequences on the genetic upgrading of cattle populations. Anim. Reprod. Sci., 33: GUTIERREZ-ADAN A., LONERGAN P., RIZOS D., WARD F.A., BOLAND M.P., PINTADO B., FUENTE DE LA J. (2001). Effect of the in vitro culture system on the kinetics of blastocyst development and sex ratio of bovine embryos. Theriogenology, 55: HAFEZ E.S.E. (1993). Reproduction in Farm Animals. Ed.: Hafez E.S.E., 6. Edition. Lea&Febiger, Philadelphia, USA.

27 40. HAMANO S., KUWAYAMA M. (1993). In vitro fertilization and development of bovine oocytes recovered from the ovaries of individual donors: a comparison between the cutting and aspiration method. Theriogenology, 39: HANSEN P.J. (2002). Procedures for in vitro production of bovine embryos. (www. animal.ufl.edu/hansen/ivf). Erişim Tarihi: HASHIMOTO S., SAEKI K., NAGAO Y., MINAMI N., YAMADA M., UTSUMI K. (1998). Effects of cumulus cell density during in vitro maturation on the developmental competence of bovine oocytes. Therigenology, 49: HASHIMOTO S., TAKAKURA R., KISHI M., SUDO T., MINAMI N., YAMADA M. (1999). Ultrasound-guided follicle aspiration: the collection of bovine cumulus-oocyte complexes from ovaries of slaughtered or live cows. Theriogenology, 51: HASHIMOTO S., TAKAKURA R., MINAMI N., YAMADA M. (1999). Ultrasoundguided follicle aspiration: effect of the frequency of a linear transvaginal probe on the collection of bovine oocytes. Theriogenology, 52: HENDRIKSEN P.J.M., VOS P.L.A.M., STEENWEG W.N.M., BEVERS M.M., DIELEMAN S.J. (2000). Bovine follicular development and its effect on the in vitro competence of oocytes. Theriogenology, 53: HOSHI, H. (2003). In vitro production of bovine embryos and their application for embryo transfer. Theriogenology, 59: HφYER P.E., TERKELSEN O.B.F., BYSKOV A.G., NIELSEN H. (2001). Fetuin and fetuin messanger RNA in granulosa cells of the rat ovary. Biol. Reprod., 65: HUNTER A.G., MOORE R.M. (1987). Stage dependent effects of inhibiting ribonucleic acids and protein synthesis on meiotic maturation of bovine oocytes in vitro. J. Dairy Sci., 70: HYTELL P., FAIR T., CALLESEN H., GREVE T. (1997). Oocyte growth, capacitation and final maturation in cattle. Therigenology, 47: JAAKMA Ü., ZHANG B.R., LARSSON B., NIWA K., RODRİGUEZ-MARTINEZ H. (1997). Effects of sperm treatments on the in vitro development of bovine oocytes in semidefined and defined media. Theriogenology, 48: KALAB P., SCHULTZ R.M., KOPF G.S. (1993). Modifications of the mouse zona pellucida during oocyte maturation: inhibitory effects of follicular fluid, fetuin and α 2 -HS-glycoprotein. Biol. Reprod., 49: KATSKA L., KAUFFOLD P., SMORAG Z., DUSCINSKI U., TORNER H., KANITZ V. (1989). Influence of hardening of the zona pellucida on in vitro fertilization of bovine oocytes. Therigenology, 32:

28 53. KIM K.S., MITSUMIZO N., FUJITA K., UTSUMI K. (1996). The effects of follicular fluid on in vitro maturation, oocyte fertilization and the development of bovine embryos. Therigenology, 45: KING W.A., BOUSQUET D., GREVE T., GOFF A.K. (1986). Meiosis in bovine oocytes maturated in vitro and in vivo. Acta Vet. Scand., 27: KONISHI M., AOYAGI Y., TAKEDOMI T., ITAKURA H., ITOH T., YAZAWA S. (1996). Presence of granulosa cells during oocyte maturation improved in vitro development of IVM-IVF bovine oocytes that were collected by ultrasound-guided transvaginal aspiration. Therigenology, 45: KRUIP T.A.M, BEVERS M.M., KEMP B. (2000). Environment of oocyte and embryo determines helth of IVP offspring. Theriogenology, 53: KÜPLÜLÜ, Ş., ÜN, M. (2000). Mezbahadan elde edilen sığır ovaryumlarından yüzeysel follikül potansiyelinin belirlenmesi ve oosit aspirasyonu. Ankara Üniversitesi Vet. Fak. Derg., 47: KÜPLÜLÜ, Ş., ÜN, M. (2001). Sığırlarda follikül büyüklüğünün oositlerin in vitro maturasyonu üzerine etkisi. Ankara Üniversitesi Vet. Fak. Derg., 48: LANDIM-ALVARENGA F.C., BOYAZOGLU S.E.A., CARVALHO L.R., CHOI Y.H., SQIRES E.L., SEIDEL G.E. (2002). Effects of fetuin on zona pellucida hardening, fertilization and embryo development in cattle. Anim. Reprod. Sci., 22: LANE M. (2001). Mechanisms for managing cellular and hemostatic stress in vitro. Theriogenology, 55: LECHNIAK D., SWITONSKI M., SOSNOWSKI M. (1996). The incidence of bovine diploid oocytes maturated in vitro. Theriogenology, 46: LEIBFRIED-RUTLEDGE M.L. (1999) Factors determining competence of in vitro produced cattle embryos. Theriogenology, 51: LEIBFRIED-RUTLEDGE M.L., CRITSER E.S., PARRISH J.J., FIRST N.L. (1989). In vitro maturation and fertilization of bovine oocytes. Therigenology, 31: LONERGAN P., MONAGHAN P., RIZOS D., BOLAND M.P., GORDON I. (1994). Effect of follicle size on bovine oocyte quality and developmental competence following maturation, fertilization and culture in vitro. Mol. Reprod. Dev., 37: LONERGAN P., RIZOS D., WARD F., BOLAND M.P. (2001). Factors influencing oocyte and embriyo quality in cattle. Reprod. Nutr. Dev., 41:

29 66. LOOS F.A.M., BEVERS M.M., DIELEMAN S.J., KRUIP TH. A.M. (1991). Morphology of preovulatory bovine follicles as related to oocyte maturation. Therigenology, 35: MACCALLUM, C., SALAMONE, D., PALASZ, A.T. (1997). Effect of maturation medium supplements on bovine oocyte fertilization and embryo developmenty. Theriogenology, 47: MACHATKOVA M., JOKESOVA E., PETELIKOVA J., DVORACEK V. (1996). Developmental competence of bovine embryos derived from oocytes collected at various stages of the estrous cycle. Therigenology, 45: MAJERUS V., ROOVER DE R., ETIENNE D., KAIDI S., MASSIP A., DESSY F., DONNAY I. (1999). Embryo production by ovum pick-up in unstimulated calves before and after puberty. Theriogenology, 52: MARQUES C.C., PEREIRA R.M., BAPTISTA M.C., VASQUES M.I., HORTA A.E.M. (1994). Neomycin disturbs bovine oocyte maturation and delays embryo development in vitro. Therigenology, supp: MAYES M.A., SIRARD M.A. (2001). The influence of cumulus-oocyte complex morphology and meiotic inhibitors on the kinetics of nuclear maturation in cattle. Theriogenology, 55: MENDES JR.J.O.B., BURNS P.D., DE LA TORRE-SANCHEZ J.F., SEIDEL JR.G.E. (2003). Effect of heparin on cleavage rates and embryo production with four bovine sperm preparation protocols. Therigenology, 60: MERMILLOD P., WILS C., MASSIP A., DESSY F. (1992). Collection of oocytes and production of blastocysts in vitro from individual, slaughtered cows. J. Reprod. Fert., 96: MERTON J.S., ROOS DE A.P.W., MULLAART E., RUIGH DE L., KAAL L., VOS P.L.A.M. DIELEMAN S.J. (2003). Factors effecting oocyte quality and quantity in commercial application of embryo technologies in the cattle breeding industry. Theriogenology, 59: MIYANO T. (2003). Bringing up small oocytes to eggs in pigs and cows. Theriogenology, 59: MUSTAFA G., ANZAR M., ARSLAN M. (1998). Seperation of motile spermatozoa from frozen-thawed buffalo semen: swim-up vs filtration procedures. Therigenology, 50: MUYAN, M. (1984). Memelilerde fertilizasyon. Doğa bilim dergisi, 8: NAGAI T. (2001). The improvement of in vitro maturation systems for bovine and porcine oocytes. Therigenology, 55:

30 79. NANDI S., RAVINDRANATHA B.M., GUPTA P.S.P., SARMA P.V. (2002). Timing of sequential changes in cumulus cells and first polar body extursion during in vitro maturation of buffalo oocytes. Theriogenology, 57: NEGLIA G., GASPARRINI B., BRIENZA V.G., DI PALO R., CAMPANILE G., PRESICCE A., ZICARELLI L. (2003). Bovine and buffalo in vitro embryo production using oocytes derived from abbatoir ovaries or collected by transvaginal follicle aspiration. Theriogenology, 59: NELSON L.D., NELSON C.F. (2001). Handling and culture of bovine embryos: survey of media used by 26 embryo transfer companies in the USA. Theriogenology, 56: OCANA-QUERO J.M., PINEDO-MERLIN M., MORENO-MILLAN M. (1999a). Influence of follicule size, medium, temperature and time on the incidence of diploid bovine oocytes matured in vitro. Theriogenology, 51: OCANA-QUERO J.M., PINEDO-MERLIN M., ORTEGA-MARISCAL M., MORENO- MILLAN M. (1999b). The effect of different sera and bovine serum albumen fraction (BSA) on in vitro maturation of immature bovine oocytes. Arch. Zootec., 48: PARK K.W., IGA K., NIWA K. (1997). Exposure of bovine oocytes to EGF during maturation allows them to develop to blastocysts in a chemicallydefined medium. Therigenology, 48: PARRISH J.J., SUSKO- PARRISH J.L., GRAHAM J.K. (1999). In vitro capacitation of bovine spermatozoa: role of intracellular calcium. Theriogenology, 51: PEREIRA R.J.T.A., TULI R.K., WALLENHORST S., HOLTZ W. (2000). The effect of heparine, caffeine and calcium ionophore A on in vitro induction of the acrosome reaction in frozen- thawed bovine and caprine spermatozoa. Therigenology, 54: PETERSON A.J., LEE R.S.F. (2003). Improving successful pregnancies after embryo transfer. Theriogenology, 59: PETYIM S., BAGE R., HALLAP T., BERGQVIST A.S., RODRIGUEZ-MARTINEZ, H., LARSSON, B. (2003). Two different schemes of twice-weekly ovum pick-up in dairy heifers:effect on oocyte recovery and ovarian function. Theriogenology, 60: REKKAS C.A., BESENFELDER U., HAVLICEK V., VAINAS E., BREM G. (2002). Plasminogen activator activity in cortical granules of bovine oocytes during in vitro maturation. Therigenology, 57: SAEKI K., NAGAO Y., HOSHI M., NAGAI M. (1995). Effects of heparin, sperm concentration and bull variation on in vitro fertilization of bovine oocytes in a protein-free medium. Theriogenology, 43:

31 91. SAKAGUCHI M., DOMINKO T., LEIBFRIED-RUTLEDGE M.L., NAGAI T., FIRST, N.L. (2000). A combination of EGF and IGF-I accelerates the progression of meiosis in bovine follicular oocytes in vitro and fetal calf serum neutralizes acceleration effect. Theriogenology, 54: SANBUISSHO A., THRELFALL W.R. (1989). The effects of estrous cow serum on the in vitro maturation and fertilization of the bovine follicular oocyte. Therigenology, 31: SCHELLANDER K., FUHRER F., BRACKETT B.G., KORB H., SCHLEGER W. (1990). In vitro fertilization and cleavage of bovine oocytes maturated in medium supplemented with estrous cow serum. Therigenology, 33: SCHROEDER A.C., SCHULTZ R.M., KOPF G.S., TAYLOR F.R., BECKER R.B., EPPIG J.J. (1990). Fetuin inhibits zona pellucida hardening and conversion of ZP2 to ZP2 f during spontaneous mouse oocyte maturation in vitro in the absence of serum. Biol. Reprod., 43: SHAMSUDDIN M., LARSSON B., GUSTAFSSON H., RODRIGUEZ-MARTINEZ H. (1993a). In vitro development up to hatching of bovine in vitro-matured and fertilized oocytes with or without support from somatic cells. Theriogenology, 39: SHAMSUDDIN M., LARSSON B., RODRIGUEZ-MARTINEZ H. (1993b). Maturation-related changes in bovine oocytes under different culture conditions. Anim. Reprod. Sci., 31: SHI D.S., AVERY B., GREVE T. (1998). Effects of temperature gradients on in vitro maturation of bovine oocytes. Theriogenology. 50: SHIOYA Y., KUWAYAMA M., FUKUSHIMA M., IWASAKI S., HANADA A. (1988). In vitro fertilization and cleavage capability of bovine follikular oocytes classified by cumulus cells and matured in vitro. Theriogenology, 30: SIRARD M.A. (2001). Resumption of meiosis: mechanism involved in meiotic proression and its relation with developmental competence. Therigenology, 55: SIRARD M.A., BLONDIN P. (1996). Oocyte maturation and IVF in cattle. Anim. Reprod. Sci., 42: SIRARD M.A., COENEN K., BILODEAU S. (1992). Effect of fresh or cultured follicular fractions on meiotic resumption in bovine oocytes. Therigenology, 37: SIRARD M.-A., RICHARD F., MAYES M. (1998). Controlling meiotic resumption in bovine oocytes: a review. Theriogenology, 49:

32 103. SUSS U., MADISON V. (1983). Morphology and meiotic development of bovine oocytes cultured in vitro. Arch. Andr., 11: TAKAGI Y., MORI K., TAKAHASHI T., SUGAWARA, S., MASAKI J. (1992). Differences in development of bovine oocytes recovered by aspiration or by mincing. J. Anim. Sci., 70: TANGHE S., SOOM A.V., MEHRZAD J., MAES D., DUCHTEAU L., KRUIF A.D. (2003). Cumulus contributions during bovine fertilization in vitro. Therigenology, 60: TELFER E.E. (1998). In vitro models for oocyte development. Therigenology, 49: THIBAULT C., SZOLLOSI D., GERARD M. (1987). Mammalian oocyte maturation. Reprod. Nutr. Develop., 27: THOMPSON J.G. (1997). Comparison between in vivo derived and in vitro produced pre-elongation embryos from domestic ruminants. Reprod. Fertil. Dev., 9: THOMPSON J.G. (2000). In vitro culture and embryo metabolism of cattle and sheep embryos- a decade of achievement. Anim. Reprod. Sci., 60-61: TRIPP M.W., JU J.C., HOAGLAND T.A., RIESEN J.W., YANG X., ZINN S.A. (2000). Influence of somatotropin and nutrition on bovine oocyte retrieval and in vitro development. Therigenology, 53: ÜN, M. (2002). Mezbahadan toplanan ovaryumlardan elde edilen sığır oositlerinin in vitro maturasyonu ve fertilizasyonu. Doktora Tezi, Ankara XU K.P., GREVE T. (1988). A detailed analysis of early events during in vitro fertilization of bovine follicular oocytes. J. Reprod. Fert., 82: XU, K.P., GREVE, T., CALLESEN, H., HYTELL, P. (1987). Pregnancy resulting from cattle oocytes matured and fertilized in vitro. J. Reprod. Fert. 81: XU K.P., GREVE T., SMITH S., HYTELL P. (1986). Chronological changes of bovine follicular oocyte maturation in vitro. Acta Vet. Scand., 27: WARD F., ENRIGHT B., RIZOS D., BOLAND M., LONERGAN P. (2002). Optimization of in vitro bovine embryo production: effect of duration of maturation, length of gamete co-incubation, sperm concentration and sire. Therigenology, 57: WARD F., LONERGAN P., ENRIGHT B., BOLAND M. (2000). Factors affecting recovery and quality of oocytes for bovine embryo production in vitro using ovum pick-up technology. Therigenology, 54: