KIRKAĞAÇ 637 ve VEDRANTAİS KAVUN GENOTİPLERİNE VAT GENİNİN AKTARILMASI. Transformation of Vat Gene to Genotype of Kırkağaç 637 and Vedrantais

Transkript

1 KIRKAĞAÇ 637 ve VEDRANTAİS KAVUN GENOTİPLERİNE VAT GENİNİN AKTARILMASI Transformation of Vat Gene to Genotype of Kırkağaç 637 and Vedrantais Ceren Ünek Biyoteknoloji Anabilim Dalı Yeşim Yalçın Mendi Biyoteknoloji Anabilim Dalı ÖZET Bu çalışmada Kırkağaç ve Vedrantais kavun genotiplerinde, Agrobacterium aracılığı ile gen aktarma tekniği araştırılmıştır. Yapılan çalışmalarda rejenerasyon ortamı olarak 1.12 mg/l BA mg/l IAA mg/l ABA eklenen MS kullanılmıştır. Rejenerasyon protokolü uygulanan bitkilerde, Agrobacterium un C58C1-pmp90 ve C58C1-pch32 ırkları ile vat bölgesi ve 2,5 kb lik 5 ve 3 regülatör dizinlerini taşıyan pbin19 binary vektörü kullanılmıştır. Gen aktarımı olan bitkilerden DNA izolasyonu, PCR, jel elektroforezi sonucunda elde edilen bantlara UVP jel dökümantasyon sistemiyle bakılmış, istenilen bölgelerde bantlar görülmüştür. Anahtar Kelimeler: Kavun, transformasyon, rejenerasyon, Agrobacterium tumefaciens, Aphis gossypii ABSTRACT Agrobacterium mediated gene transformation in the two different melon Kırkağaç 637 and Vedrantais has been developed in this study. Regeneration result was obtained from MS medium supplemented 1.12 mg/l BA+0.88 mg/l IAA mg/l ABA. Regeneration protocol has been achively applied to obtain transformed plants, using Agrobacterium tumefaciens strain C58C1-pmp90 and C58C1-pch32 which is harboring a binary vector pbin19 carring Vat coding region, 2,5 kb of 5 and 3 regulatory sequences. Transformed plants were detected by PCR, Gel Electrophores and UV documantation system. Bands are seen in the intended region. Key Words: Melon, transformation, regeneration, Agrobacterium tumefaciens, Aphis gossypii Giriş Genetik mühendisliği ya da Rekombinant-DNA teknikleri ile bitkilere gen transferinde; transgenik hücrelerin in vitro koşullarda uygun besi ortamlarında rejenere olması ve bunlardan bitki elde edilmesi son derece önemlidir. Farklı genotiplerin ve farklı eksplantların farklı düzeylerde rejenere olduğu kavunda bu konu özellikle dikkat çekecek düzeydedir (Çürük, 1999). Yüksek Lisans Tezi- MSc Thesis

2 Kavun ıslahında genellikle, Agrobacterium tumefaciens aracılığı ile gen aktarma yöntemi kullanılmaktadır. Bu yöntemin çalışma prensibi kısaca özetlenecek olursa; A.tumefaciens bakterisini, hücre genomu ile bütünleşen ve Tiplasmidi üzerinde bulunan bir T-DNA bölgesi bulundurmaktadır. Bu T-DNA üzerinde bulunan genlerin bir kısmı (ilk ve son 25 baz çifti) hücre genomu ile bütünleşmeyi sağlayan genlerdir. Bu genlerden üçü oksin ve sitokinin biyosentezinde rol oynayan enzimlerin sentezlenmesinden sorumludur. Bu genler çıkartılır ve yerine istenilen özellikleri karakterize eden gen veya genler yerleştirilir ve bitki hücresi yeni oluşturulan A. tumefaciens ile bulaştırılırsa, sözü edilen gen veya genlerin hücre genomuna aktarılmış olacağı kabul edilmektedir (Hinchee ve ark., 1994). Kabakgil familyası sebzelerinde üretimi sınırlandıran en önemli faktörlerin başında hastalıklar ve zararlılar gelmektedir. Hastalık ve zararlılar, birim alandan alınan verimin azalmasına, bazı çeşitlerimizin kaybolma tehlikesi ile karşı karşıya kalmasına, ürün ve kalitenin kaybolmasına neden olmaktadır. Bunlar içerisinde de doğrudan mücadelesi olmadığı için virüs hastalıkları önemli bir yere sahiptir. Virüs hastalıklarının şiddeti yıldan yıla, virüs, konukçu vektör ve çevre faktörlerinin bireysel veya kompleks etkisine göre değişebilmektedir (Sarı ve ark., 1994). Bu çalışmada, Kırkağaç 637 ve Vedrantais genotiplerinde direkt organogenesis ile bitki eldesi ve Agrobacterium tumefaciens aracılığı ile Vat (Aphis gossypii ye dayanıklılık) geni aktarılarak, afit saldırılarına karşı dayanıklılık ve dolayısı ile virüs taşınımını engellemek amaçlanmıştır. Materyal ve Metot Materyal Araştırmada, Ege Tarımsal Araştırma Enstitüsü nden temin edilmiş olan Kırkağaç 637 tohumları ile INRA (Ulusal Tarımsal Araştırma Enstitüsü) Araştırma Kuruluşundan temin edilmiş olan Vedrantais kavun genotipi ve INRA Araştırma Kuruluşunda pozisyonal klonlama yöntemi ile izole edilmiş ve farklı Agrobacterium suşlarına yerleştirilmiş olan Vat geni (VatB1.3 ve Vat B1.1) kullanılmıştır. VatB1.3: Agrobacterium tumefaciens C58C1-pmp90 (Goodner et al. Science, 294 (5550), ) ırkı pbin19 plasmidini (Bevan et al, Nucleic Acids Res 12: ,1984) içermekte ve bu plasmid içerisinde de 2.5 Kb uzunluğunda vat regülatör dizinleri içeren 11 Kb lik kavun genomik DNA sı, NPTII (Kanamisin e dayanıklılık geni) ve promotır dizini bulunmaktadır. VatB1.1: Agrobacterium tumefaciens C58C1-pch32 (Goodner et al, Science, 294 (5550), ) ırkı pbin19 plasmidini (Bevan et al, Nucleic Acids Res 12: ,1984) içermekte ve bu plasmid içerisinde de 2.5 Kb uzunluğunda vat regülatör dizinleri içeren 11 Kb lik kavun genomik DNA sı, NPTII (Kanamisin e dayanıklılık geni) ve promotır dizini bulunmaktadır. (Şekil 1 de Vat geninin şematik yapısı gösterilmiştir.)

3 Şekil 1. Vat geninin şematik yapısı (Materyal anlaşma formu) Metot Rejenerasyon ve Transformasyon Uygulamaları Transformasyonda, apikal meristemi alınmış olan kotiledonların proksimal kısmı eksplant olarak kullanılmıştır Transformasyonda. Eksplantlar bir gün önce hazırlanmış olan Agrobacterium içeriğinde 15 dakika bekletilmiştir. Bakteri döküldükten sonra, eksplantlar steril kurutma kağıtları ile kurutulup, M1ortamına yerleştirilip 3-4 gün bekletilmiştir. Ko-kültivasyon ortamı olarak, M1 (4.4 g /l MS bazal ortamı, 30 g/l sukroz, 0.88 mg/l IAA, 1.12 mg/l BAP, 0.26 mg/l ABA, 8.0 g/l agar, ph.5.8), geliştirme ve seçici seleksiyon ortamı olarak ise M2 (M1 ortamı ile birlikte 750 mg/l sefuroksim sodyum) ve M3 (M1 ile birlikte 750 mg/l sefuroksim sodyum ve 200 mg/l kanamisin) ortamları kullanılmıştır. Tüm rejenerasyon seçim uygulamaları C de 16 h fotoperiyotda (30. μ mol. m-2 s-1 floresan beyaz ışık) invitro da kültüre alınmıştır. Rejenerasyon seçimini takiben sürgün geliştirme ortamı olarak MSG (4.4 g/l MS bazal ortamı, 30 g/l sukroz, 0.67 mg/l BAP, 8.0g/l agar, ph:5,8), köklendirme aşamasında ise MSR ortamları (4.4 g/l MS bazal ortamı, 30 g/l sukroz, 0.01 mg NAA, 8.0 agar, ph:5.8) 750 mg/l sefuroksim sodyum ile birlikte kullanılmıştır. (Yalçın Mendi ve ark., 2004 ) DNA izolasyonu ve PCR Analizleri DNA izolasyonları sonucu elde edilen DNA ların konsantrasyonları ve saflıkları spektrofotometrede (Nanodrop) 260 ve 280 nm de okuma yapılarak belirlenmiştir. İzolasyonu gerçekleştirilen genotipler ve sentetik olarak hazırlanmış primerler kullanılarak PCR reaksiyonları gerçekleştirilmiştir. PCR reaksiyonlarında kullanılan primer kombinasyonları Çizelge1. de gösterilmiştir Uygulanan PCR protokolü Çizelge 3 de gösterilmiştir.(çizelge 2. de primer uzunlukları gösterilmiştir.)

4 Çizelge 1. Primer dizinleri Primer Sekans (5' 3') TM V551R (forward) GAAGAAGGTGACGAGAGAGATGC 64 C C V588 (reverse) CAACAGGCTCAACAGTGTATTCGG 62 C LRR1R (forward) GTTGTTGAGAGCAATAGTGTACCC 61 C LRR915 (reverse) AACAATTAGAACCATCTCCCAGC 61 C V1276F (forward) TGTCACAAACTGAACTTTTAAGGA 58 C V1276R (reverse) CTGTTCAACTAACAGAACCAATTC 57 C Çizelge 2. Primer uzunlukları Primer Pozisyon Uzunluk (Vat) PCR bant PI161(Dayanıklı) Vedrantais (Duyarlı) V551R (forward) Vat Promotor 1684 bp 1684 bp Vat Tek bant 1300 bp V588 Ekzon 1 (reverse) LRR1R (forward) Ekzon bp 1549 bp Vat 1372 bp Vat benzeri 4 bant 1300, 1100, 900 ve 750 bp LRR915 (reverse) Ekzon 3 V1276F (forward) V1276R (reverse) İntron bp 1276bp Vat 1266 bp Vat benzeri İntron 2 Tek bant 1650 bp

5 Çizelge 3. PCR reaksiyonlarında uygulanan protokol PCR Master Mix μl Primer (Forward) 1.25 μl 10 μm Primer (Reverse) 1.25 μl 10 μm MgCI ddh2o Taq Polimeraz 1.25 μl 3 μl μl Araştırma Bulguları ve Tartışma Çalışmada transgenik olduğu düşünülen Kırkağaç 637 genotipinden 17 ve Vedrantais genotipinden 5 bitki DNA izolsayonu ve PCR yapılmıştır. Yapılan PCR çalışmalarında elde edilen agaroz jel görüntüleri Şekil 4., 5. ve 6. da gösterilmiştir. Şekillerde L harfiyle kodlanmış bantlar 1 kb Standart DNA ya (Nei ve Li., 1979) aittir. 1 kb Standart DNA ait bant büyüklükleri Şekil3. de gösterilmiştir. Agaroz jel görüntüleri üzerinde C harfiyle kodlanmış bantlar ise transformasyon yapılmamış Kırkağaç genotiplerini göstermektedir. S harfiyle kodlanmış bölüm ise amplifikasyonunu beklemediğimiz su ve PCR solüsyonlarını içeren bölgelerdir. Agaroz Jel görüntüleri üzerinde B harfi ile kodlanmış bölgeler çalışmada kullanılan Agrobacterium tumefaciens bakterisinin iki farklı suşuna ait DNA bantlarını göstermektedir. Çalışmada kullanılan bu suşlar VatB1.1 ve Vat B1.3 tür. 17 adet Kırkağaç 637 genotipi ve Kontrol olarak Kırkağaç 637 genotipinden bir örnek, ayrıca 5 Vedrantais genotipine ait örnek test edilmiştir. PCR analizleri sonucunda elde edilen agaroz jel görüntülerinde VatB1.1 suşu tüm primerlerde amplifikasyon vermiştir. Ancak VatB1.3 suşu ile ilgili primerlerde amplifikasyon görülmemiştir. Yapılan çalışmalarda elde edilen bitkilerde genin varlığını saptamak amacı ile yapılan PCR uygulamalarında V55IR (forward), V588 (reverse) primeri, LRRIR (forward), LRR915 (reverse) primeri ve V1276F (forward), V1276R (reverse) primerleri kullanılmış ve bantlar elde edilmiştir. V55IR (forward), V588 (reverse) primeri kullanarak yapılan çalışmada istenilen bölgelerde Kırkağaç 637 genotipine ait bitkilerde bantlar gözlenmiş, Vedrantais genotipine ait bitkilerde bantlar görülmemiştir. LRRIR (forward), LRR915 (reverse) primeri kullanılarak yapılan (reverse) çalışmalarda Yine Kırkağaç 637 genotipine ait bitkilerde istenilen bölgelerde bant görülmüştür. V55IR (forward), V588 (reverse) primleri ile yapılan çalışmalarda bantların istenilen bölgeler ile birlikte istenmeyen bölgelerde de görüldükleri saptanmıştır

6 Şekil 3.1 Kb Standart DNA Bant Büyüklükleri (Nei ve Li, 1979) 1684 bp Şekil 4. V551R (Forward) ve V588 (reverse) primerine ait agaroz jel görüntüsü

7 1549 bp Şekil 5. LRR1R (Forward) ve LRR915 (reverse) primerine ait agaroz jel görüntüsü 1276 bp Şekil 6. V1276F (Forward) ve V1276R (reverse) primerine ait agaroz jel Görüntüsü

8 Sonuç Araştırma bulguları ve tartışmalarda belirtilen sonuçlar, Kırkağaç ve Vedrantais genotiplerinin transgenik olma ihtimallerinin olabileceğini, fakat kesinlik kazandırmak amacı ile farklı primerlerin kullanılması gerektiğini göstermiştir. Yapılan transformasyon çalışmalarında genin tamamının aktarılmış olabileceği gibi bir kısmının aktarılmamış olma ihtimalide bulunmaktadır. Bu amaçla kanamisin primerleri kullanılarak bantlar elde edilmeli, ayrıca gen ekspresyonunun sağlanıp sağlanmadığını saptamak amacı ile Southern Bloth analizleri ile genlerin bitkilerde ifade olup olmadığı saptanmalıdır. Kaynaklar ÇÜRÜK, S., Bazı Kavun (Cucumis melo L.) Çeşitlerinde In vitro Rejenerasyon ve Genetik Transformasyon Üzerine Araştırmalar. Ç.Ü.Fen Bilimleri Enstit.Doktora Tezi, Adana, 271s. EDWARD K, JOHNSTONE C, THOMPSON C A simple and Rapid method for the preparartion of plant genomic DNA for PCR analysis. Nuc. Acids Res. 19(6):1349. HINCHEE, M.A.W., CORBIN, D.R., ARMSTRONG, CH.L., FRY, J.E., SATO, S.S., DEBEOER, D.L., PETERSEN, W.L., ARSTRONG, T.A., CONNOWARD, D.V., LAYTON, J.G, HORSCH, R.B., Plant Transformation. I.K., Vasıl and T.A., Thorpe (Eds.), Plant Cell and Tissue Culture, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht-Netherlands, MURASHIGE, T., SKOOG, F., A Revised Medium for Rapid Growth and Bio Assay with Tobacco Tissue Culture.Physiologia Plantarum, 15, NEI, M., LI, W., Mathematical Model for Studying Genetic Variance in Terms of Restriction Endonukleases. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: SARI, N., PITRAT, M., ABAK, K. ve YÜCEL, S., Türkiye de Yaygın Olarak Yetiştirilen Karpuz ve Kavun Çeşitlerinin Bazı Fungal Hastalıklara ve Virüslere Karşı Reaksiyonları. Ç.Ü. Ziraat Fakültesi, 25. Kuruluş Yılı Özel Sayısı, YALÇIN-MENDİ Y.,.İPEK M., SERBEST-KOBANER S., CURUK S., AKA KACAR Y., CETİNER S., GABA V., GRUMET R., 2004 Agrobacterium-Mediated Transformation of Kırkagac 637 a Recalcitrant Melon (Cucumis melo L.) Cultivar with ZYMV Coat Protein Encoding Gene. Europ. J Hort.Sci