Rekombinant DNA Teknolojisi - Özet

Transkript

1 BYM613 Genetik MühendisliM hendisliği Rekombinant DNA Teknolojisi - Özet Hacettepe Üniversitesi Biyomühendislik BölümüB Güz G z DönemiD Dr. Eda Çelik-AKDUR edacelik@hacettepe.edu.tr Ref: The Scientist, Oct 17,

2 1.Direkt onarım ya da hasarın geri d önd ür ülmesi Fotoreaktivasyon O-6-metilguanin onarımı Basit tek zincir kırıklarının ligasyonu 2.Eksizyon (kesip- çıkarma) onarımı Baz eksizyon onarımı(ber) (base excision repair) N ükleotid eksizyon onarımı(ner) (nucleotide excision repair) Mismatch (yanlışeşleşme) eksizyon onarımı(mer) 3. Rekombinasyonal Onarım 4. SOS Onarımı DNA Tamir Mekanizmaları 5. DNA Ç ift Zincir Kırıklarının Onarımı Serbest Uç ların Homolog Olmayan Bağlanması(NHEJ) Homolog Rekombinasyon (HR) Burcu Sarıkaya, BYM sunumundan Oligonükleotid Bölge Yönlendirilmiş Mutasyon Plazmid DNA dizisi *DNA sarmalı, tekli diziler oluşturmak için denature edilir. İstenen mutasyonu içeren bir oligonükleotid sentezlenir. *Sentetik oligonnükleotid hedeflenen bölgeye gelecek şekilde tavlama yapılır. *Plazmid DNA dizisi şablon olarak kullanılarak mutant oligonükleotid uzatılır. * Elde edilen DNA dizileri E.coli içine yerleştirilerek çoğalması sağlanır. Çoğalan heteroduplex yapıların yaklaşık %50sinin mutasyona uğramış, %50sinin ise mutasyoına uğramamış olduğu kabul edilir. Çeşitli yöntemler kullanılarak bu iki yapı birbirinden ayrılır. Gökçe Dicle Demir, BYM sunumundan In vitro site-specific mutagenesis- From Human Molecular Genetics, (web-books.com) 2

3 BAKTERİLER LERİN N DOĞAL GEN TRANSFER MEKANİZMALARI 1. Genetik Rekombinasyon 2. Transformasyon 3. Transdüksiyon 4. Epizomlar ve Konjugasyon 5. Transpozonlar: İç Gen Aktarımı In Vivo Homolog Rekombinasyon In vivo homolog rekombinasyon özellikle büyük DNA moloküllerinin birleştrilmesinde kullanılmaktadır. Bu method ile DNA parçası taşıyan plazmit (otonom) ile DNA parçası taşımayan plazmit (nonotonom) arasında eş-bütünleşik bir yapı oluşturularak karşılıklı genetik bilgi alış verişi amaçlanmaktadır. Fig Ref. Robert M. Q. Shanks, Nicky C. Caiazza. Saccharomyces cerevisiae-based Molecular Tool Kit for Manipulation of Genes from Gram- Negative Bacteria Ebru Doğangün, BYM sunumundan Company Logo 3

4 Transpozon Çeşitleri Handan Cebeci, BYM613- Company 2012 sunumundan Logo rdna için i in temel basamaklar Doku yada hücreden h DNA izole edilir; PCR ve/veya Restriksiyon Enzimleri kullanılarak larak spes pesifik DNA parçalar aları elde edilir. Bu parçalar, alar, taşı şıyıcı DNA (vektör) ile birleştirilir (rdna) rdna molekülü, çoğaltılmak lmak üzere konak hücreye h aktarılır. r. Klonlar izole edilir ve analizlenir. 4

5 Plasmid saflaştırılması Tek kloni LB + Antibiyotik 37 C da inkübasyon Alkalin parçalama ve kaynatma Stratejileri (yaklaşımları) CsCl ile Saflaştırma Affinite Teknikleri Ticari kitler Araz Norouz Dizaji, BYM sunumundan 9 94 C C C Temel 3 aşama döngü (cycle) tekrarlanır: 1.Denatürasyon (90-95 C): Dubleks DNA nın (çift iplikçikli DNA) yüksek sıcaklıkta tek iplikçiklere ayrılması 2.Hibridizasyon (Annealing) (50-70 C) : Primerlerin uygun sıcaklıkta hedef DNA ya bağlanması. 3.Amplifikasyon (Extension) (70-75 C) : DNA polimeraz ile primerin 3 OH grubuna nükleotitlerin eklenerek DNA nın uzatılması. 5

6 Primer tasarımı için kullanılan belli başlı yazılımlar : Primer3 PrimerZ PerlPrimer Vector NTI Advantage 10 DNASIS SmartNote Pride Primer BLAST Primer tasarımında parametreler: Boyutu Erime sıcaklığı Pürin:Pirimidin içeriği Primer-primer etkileşimi Dimer oluşumu 5 ucu RE tanıma bölgesi ule Ünal, BYM sunumundan PCR Tipleri HEDEF UYGULAMA AVANTAJ DEZAVANTAJ Klasik DNA DNA dizisinin amplifikasyonu ve araştırılmas lması En kolay uygulanan PCR tipi. Düşük k maliyetli ve az ekipman gereksinimi Amplifikasyon sonrası analiz gerektirir.daha fazla zaman,araç/gere /gereç harcanır. r. İnsan hatası ve kroskontaminasyon riski taşı şır. Elde edilen ürünün n prob hibridizasyonu veya dizileme ile doğrulanmas rulanması tercih edilir. Real Time Multiplex Nested (RT)-PCR Revers- Transkripsion DNA DNA DNA mrna, rrna, Viral RNA Hedef nükleik n asit dizisinin kopya sayısının tespiti ile quantifikasyon İki veya daha fazla sayıdaki farklı DNA dizisinin aynı anda amplifikasyonu External ve internal primer takımlar mları kullanılarak larak RNA nın amplifikasyonu ve araştırılmas lması Hızlı Bağı ğıl l veya kesin hedef dizi quantifikasyonu Genellikle amplifikasyon sonrası analize gerek duyulmaz. Prob ve melting curve (erime eğrisi) kullanıld ldığı için in daha kesin sonuç. Daha az kroskontaminasyon riski Çoklu hedef dizisinin tek bir reaksiyonda amplifikasyonu ile zaman ve araç/gere /gereç tasarrufu. Daha hassas Nonspesifik amplifikasyonun azaltılmas lması Tüm m RNA çeşitlerinin amplifikasyonu Göksu Gür, BYM sunumundan Daha pahalı ekipman ve sarf malzeme gerektirir. Primer ve prob seçimi sınırls rlıdır. r. Doğrulama analizlerine (dizileme gibi) izin vermez. Primer seçim olanakları sınırlıdır Önemli ölçüde optimizasyon gerektirir. Çoğunlukla hassasiyeti ve özgünlüğü düşüktür. İlk amplifikasyon sonrası ürünün taşı şınması nedeniyle yanlış pozitif sonuç ihtimali var. RNA nın çabuk bozunması Ek RT aşamasa aması daha fazla zaman ve para gerektirir,kontaminasyon riski taşı şır. 6

7 Yeterli miktar DNA elde edildikten sonra, Restriksiyon Enzimleri (RE) ile kesilir. Ref: Dr. M. Erayman ders notları. DNA Ligaz enzimi ile DNA parçalar aları birleştirilir (küt t uçlu u veya yapış ışkan uçlu u olabilir). Fig. Pearson Education Inc.,

8 Vektörler Plazmid klonlama vektörleri Lambda ve M13 bakteriyofaj vektörleri Kozmid vektörler Mekik vektörler BAC (Bacterial artifical chromosomes) YAC (Yeast artificial chromosomes) Agaroz, elektroforez tamponu ile % konsantrasyon aralığında, yüksek sıcaklıkta çözülerek hazırlanır. Hazırlanan agaroz çözeltisi C soğuduktan sonra boya çözeltisi (etidyum bromid) ilave edilir. Jel katılaştıktan sonra ayrımı yapılacak örnek taraklarla oluşturulmuş kuyucuklara yu klenir ve elektriksel alanda yu ruẗu lerek ayrımı yapılır. Örnekler UV ışığıaltında görüntülenir. Burcu Güven, BYM sunumundan StudentInstruction-gel/05.html 8

9 Floresan boyalar sayesinde otomatik DNA sekanslama Spektrofotometre ile DNA miktarı belirleme UV absorbansı kullanılarak DNA miktarı ve saflığı belirlenir. DNA maksimum absorbansı 260 nm Proteinler, bazı aminoasitler 280 nm En iyi sonuçlar için A 260 değerleri arasında olmalı DNA saflığı A 260 / A 280 = DNA konsantrasyonu: A = O.D. = ε.b.c 260 nm lik dalga boyu ve1 cm ışık yolu için : 1 O.D. = 50 μg/ ml DNA konsantrayonu = O.D. 260 x 50 μg/ ml x Seyreltme Faktörü İlkay Koçer, BYM sunumundan [4] [5] QIAGEN, Germany, Philippe Sauer, Markus Müller and Jie Kang, Quantitation of DNA 9

10 DNA SAKLAMA KO ULLARI Farklı saklama sıcaklıkları: Oda sıcaklığı (GenPlate TM, Sample Matrix TM ) C (sıvı azot içinde) Bu iki koşulun ortak mekanizması : DNA camsı duruma geçer, kimyasal ve proteaz bozulmasını engeller. 4 C -20 C -80 C Laboratuvar koşullarında, İyi kalite DNA için önerilen saklama koşulları : Haftaları kapsayan saklama : 4 C, Tris-EDTA Ayları kapsayan saklama : 80 C Tris-EDTA Uzun süreli saklama (yıllar) : 80 C, ethanol Çok uzun süreli saklama : -196 C [3] İlkay Koçer, BYM sunumundan KİMYASAL TRANSFORMASYON ELEKTROPORASYON sn Kaynak: Competent Cell Guide, Bioline, Third Edition Hande Günan Yücel, BYM sunumundan 10

11 İşlem 4 aşamada gerçekleşmektedir; RNAİZOLASYONU 1. Hücrelerin parçalanması: Hücre veya doku kültürü lize solüsyonu içersinde parçalanır. Bu işlem hızlı ve etkin bir biçimde soğuk ortamda gerçekleştirilmelidir. 2. Ribonüklezların inaktivasyonu: Bunun için genelde çok güçlü bir denatürant olan Guanidyum tiyosiyanat kullanılır. 3. RNA ekstrasyonu: Bu işlem RNA ya düşük ph da ekstraksiyon çözeltisi (fenol:kloroform çözeltisi) eklenip santrifüjlenmesiyle gerçekleşir. Santrifüj sonrası üst sıvı faz RNA içerir. DNA ve proteinler ise organik fazda ve ara fazda kalır. 4. RNA nın çöktürülmesi: RNA etanol:licl çözeltisi kullanılarak çöktürülür ve santrifüj edilerek ayrılır. [2] Merve Özkutlu, BYM sunumundan Teknik 1975 yılında İngiliz biyolog Sir Edwin Southern tarafından bulunmuştur. Hedeflenen bir genin ya da aranılan DNA dizisinin, DNA molekülündeki varlığının belirlenmesini sağlar. Moleküler biyoloji ve rekombinant DNA teknolojisi için önemli bir adımdır. Brown, T.A., Southern Blotting and Related DNA Detection Techniques, 2001 Gökçe Dilli, BYM sunumundan 22 11

12 Nükleik Asit Blotlaması Birbirinin tamamlayıcısıolan nükleik asit molekülleri arasındaki hibridizasyona dayanır. Western Blot: proteinler Northern Blot: James Alwine, David Kemp, George Stark RNA nın filtreye bağlandığıblotlama tekniği Eastern Blot: post-translasyonal modifikasyonlar Southern Blot: DNA Bakiye Göker, BYM sunumundan Ref: Klug, S.W., Cummings M. R., Spencer C. A., 2006, Consepts of Genetics, Pearson Education Publishing Nurşen Ziğal, BYM sunumundan 12

13 FACS ile Hücre Ayrımı Floresan işaretli hücrelerin ayrılmasında elektrostatik yükten yararlanılır. Kullanım Alanları İmmün fenotipleme DNA analizi Hücre proliferasyonu Hücre ölümü RNA ve protein içerik analizi İlaç alım ölçümü Mikroorganizma tayini Virüs ve viral ürün tayinleri Güner U., 2012, J FisheriesSciences.com, 6(1): Gökçe Kaynak, BYM sunumundan Mikroorganizmaların Moleküler Tanımlanma Yöntemleri 26 Metod Tanımlama kapasitesi Ayırma Gücü Tekrarlanabilirlik Uygulama Kolaylığı Yorumlama Kolaylığı Plazmid İyi İyi İyi Yüksek İyi analizi PFGE Yüksek Yüksek Yüksek Orta İyi PCR- İyi Orta İyi Yüksek Yüksek RFLP RAPD Yüksek Yüksek Zayıf Yüksek Yüksek AFLP Yüksek Yüksek İyi Orta Yüksek Sekans analizi Yüksek Yüksek Yüksek Orta Yüksek Buckingham, L., Flaws, M., 2007, Molecular Diagnostics Applications, Medicus Media, 462 s. Fundementals, Methods and Molecular Gamze Nur Kara, BYM sunumundan 13

14 DNA metilasyonu Gen ifadesinin Kromozomal bütünlüğün Rekombinasyonel olayların kontrolü rollerine sahip bir modifikasyondur. DNA ya bağlanabilen proteinlerin bağlanmasını engelleyerek transkripsiyonu önlemesi Zeynep Acar, BYM sunumundan Cindy D. Davis and Eric O. Uthus, DNA Methylation, Cancer Susceptibility, and Nutrient Interactions, Experimental Biology and Medicine 2004, 229: