ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Alev ÇEKER TÜRKİYE NİN BAZI BÖLGELERİNDEN TOPLANMIŞ NOHUT GENOTİPLERİNİN MOLEKÜLER KARAKTERİZASYONU BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI ADANA, 2008

2 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTİSÜ TÜRKİYE NİN BAZI BÖLGELERİNDEN TOPLANMIŞ NOHUT GENOTİPLERİNİN MOLEKÜLER KARAKTERİZASYONU Alev ÇEKER YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOTEKNOLOJİ ANABİLİM DALI Bu Tez 31/03/2008 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliğiyle Kabul Edilmiştir. İmza İmza İmza Doç.Dr.Hakan ÖZKAN Prof.Dr.A. Emin ANLARSAL Prof. Dr.Salih KAFKAS DANIŞMAN ÜYE ÜYE Bu Tez Enstitümüz Tarla Bitkileri Anabilim Dalında Hazırlanmıştır. Kod No: Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü müdürü Bu Çalışma TOVAG 104O441 no lu TUBİTAK Projelesi Tarafından Desteklenmiştir. Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ YÜKSEK LİSANS TÜRKİYE NİN BAZI BÖLGELERİNDEN TOPLANMIŞ NOHUT GENOTİPLERİNİN MOLEKÜLER KARAKTERİZASYONU Alev ÇEKER ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TARLA BİTKİLERİ ANA BİLİM DALI Danışman : Doç.Dr. Hakan ÖZKAN Yıl : 2008, Sayfa: 52 Jüri : Doç.Dr. Hakan ÖZKAN Prof.Dr. A. Emin ANLARSAL Prof.Dr. Salih KAFKAS Türkiye nin farklı bölgelerinden toplanmış 91 nohut genotipi ile 2 nohut çeşidinde genetik çeşitliliği belirlemek amacıyla yapılan çalışmada DNA markörü olarak ISSR ve SRAP moleküler markörleri kullanılmıştır. En polimorfik primer/primer kombinasyonlarını belirlemek için 65 ISSR ve 82 SRAP primer kombinasyonu 6 nohut DNA sında ön taramaya tabi tutulmuş, en polimorfik ve skorlaması en rahat olan 11 ISSR primeri ve 9 SRAP primer kombinasyonu seçilmiştir. Kullanılan her iki primer kombinasyonunda da polimorfizm oranı oldukça düşük bulunmuştur. 93 nohut genotip/çeşidin birbirine olan yakınlığı Jaccard benzerlik katsayısına göre hesaplanmıştır. Buna göre ortalama genetik bezerlik 0.90 bulunmuş olup 0.64 ile 1.00 arasında değişmiştir. Jaccard genetik benzerlik katsayısı kullanılarak yapılan UPGMA analizi sonucunda, 91 genotip ve 2 çeşit A ve B olmak üzere iki ana gruba ayrılmıştır. Dendrogramdaki A grubunun toplam 3 genotipi temsil ettiği geri kalan 90 genotipinde B grubunu oluşturduğu, aynı zamanda B grubununda kendi içinde esas olarak B1 ve B2 olarak ikiye ayrıldığı, B1 grubunun 3 genotipi içerdiği, B2 grubunun ise 87 genotipi içerdiği ve B2 grubununda kendi içinde alt gruplara ayrıldığı saptanmıştır. Bu çalışma sonucunda yerel nohut genotiplerinin genetik tabanının dar olduğu sonucuna varılmıştır. Anahtar Kelimeler: Cicer, DNA markör, ISSR, SRAP, genetik çeşitlilik I

4 ABSTRACT MSc THESIS MOLECULAR CHARACTERIZATION OF CHICKPEA GENOTYPES SAMPLED FROM DIFFERENT REGION OF TURKEY Alev ÇEKER DEPARTMENT OF FIELD CROPS INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA Supervisor : Assoc.Prof.Dr. Hakan ÖZKAN Year : 2008, Pages: 52 Jury : Assoc.Prof.Dr. Hakan ÖZKAN Prof.Dr. A. Emin ANLARSAL Prof.Dr. Salih KAFKAS The research was conducted to determinate genetic diversity among ninety-one chickpea genotypes sampled from different region of Turkey and two chickpea cultivars using Inter Simple Sequence Repeats (ISSR) and Sequenced Related Amplified Polymorphism (SRAP) DNA molecular markers. To determine best polymorphic primers for ISSR and primer combination for SRAP, sixty-five ISSR primers and eighty-two SRAP primer combinations were tested on five chickpea genotypes and two chickpea cultivars. Based on this study, eleven ISSR primers and nine SRAP primer combinations, yielding strong and reproducible polymorphic bands, were selected for further analysis.both DNA molecular marker techniques gave very low polymorphism in chickpea genotypes and cultivars. According to the Jaccard s similarity index, similarity between studied chickpea genotypes and cultivars, ranged from a minimum of 0.64 to a maximum of 1.00, with average of 0.90 UPGMA dendrograms based on Jaccard similarities obtained from two datasets separated the chickpea genotypes and cultivars into two main groups. Cluster B, divided into two main sub-clusters: B1, containing 3 chickpea genotypes, and B2, containing 85 chickpea genotypes and 2 cultivars. Cluster A has only three genotypes. The end of this study, It was found that Turkish chickpea genotypes exhibited very narrow genetic diversity at DNA level. KeyWords: Cicer, DNA markör, ISSR, SRAP, genetic diversity II

5 TEŞEKKÜR Bana bu konu üzerinde çalışma fikrini veren, laboratuar olanaklarından faydalanmamı sağlayan ve çalışmalarımın her aşamasında, bilgi, deneyim ve önerileriyle yardımcı olan sayın danışmanım Doç Dr. Hakan ÖZKAN a teşekkürlerimi bir borç bilirim. Laboratuar çalışmalarının yürütülmesi sırasında yardımlarını benden esirgemeyen Ar Gör. Sevda ALTINTAŞ, Dr. Tolga KARAKÖY ve Yrd. Doç Dr. Faruk TOKLU ya teşekkür ederim. Ayrıca benden sabır ve desteklerini esirgemeyen annem, babam ve eşime teşekkür ederim. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ I ABSTRACT II TEŞEKKÜR III İÇİNDEKİLER... IV ÇİZELGELER DİZİNİ... V ŞEKİLLER DİZİNİ.... VI 1.GİRİŞ 1 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR MATERYAL ve METOD Bitki Materyali Moleküler Analizler DNA İzolasyonu DNA Konsantrasyonunun Belirlenmesi ISSR Analizi SRAP Analizi Elektroforez Verilerin Değerlendirilmesi ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA DNA Analizi ISSR DNA Markör Analizi SRAP DNA Markör Analizi ISSR ve SRAP DNA Markör Analizlerinin Karşılaştırılması SONUÇ VE ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ IV

7 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge.3.1.Araştırmada kullanılan nohut populasyonlarına ait kayıt numarası, toplandığı il ve yöreye ilişkin bilgiler Çizelge 3.2. Araştırmada kullanılan ISSR primerleri ve DNA dizilimleri. 14 Çizelge 3.3. Araştırmada kullanılan SRAP primerleri. 16 Çizelge.4.1.Altı nohut genotipinde taranan 65 ISSR primerin adı, DNA dizilimi, yapışma sıcaklığı, toplam skorlanan bant sayısı, polimorfik bant sayısı ve % polimorfizme ait değerler 19 Çizelge.4.2.Polimorfik olan 11 ISSR primeri kullanılarak 93 nohut genotipinden elde edilen toplam bant sayısı, polimorfik bant sayısı ve polimorfizm oranı 21 Çizelge 4.3.Altı nohut genotipinde taranan 82 SRAP primerinden elde edilen toplam bant sayısı, polimorfik bant sayısı ve % polimorfizm ait değerler. 24 Çizelge 4.4.Araştırmada kullanılan primer taraması sonuçlarına göre oluşan toplam bant sayısı, polimorfik bant sayısı ve polimorfizm yüzdesine ilişkin veriler Çizelge.4.5.ISSR ve SRAP DNA analizleri kullanılarak 91 nohut populasyonu ve 2 nohut çeşidinde Jaccard (1908) göre hesaplanan benzerlik katsayı değerleri 29 V

8 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil.4.1.ISSR 808 (A), ISSR809 (B), ISSR811 (C) ISSR815 (D) ISSR818 (E) ve ISSR820 (F) primerleri kullanılarak 6 nohut genotipinde yapılan ISSR analiz sonuçları.. 18 Şekil 4.2.ISSR 823 (A), ISSR824 (B), ISSR826 (C) ISSR827 (D) ISSR829 (E) ve ISSR830 (F) primerleri kullanılarak 6 nohut genotipinde yapılan ISSR analiz sonuçları Şekil 4.3.ISSR 807 (A), ISSR810 (B), ISSR814 (C) ISSR816 (D) ISSR817 (E), ISSR819 (F) ve ISSR821 (G) primerleri kullanılarak 6 nohut genotipinde yapılan ISSR analiz sonuçları. 18 Şekil 4.4.ISSR 836 primerleri kullanılarak 92 nohut genotipinde yapılan ISSR analiz sonuçları 22 Şekil 4.5.ISSR 880 primerleri kullanılarak 92 nohut genotipinde yapılan ISSR analiz sonuçları 22 Şekil 4.6.Me7-Em4 (A) ve Me1-Em8 (B) SRAP primerleri kullanılarak 6 nohut genotipinden elde edilen sonuçlar Sekil 4.7.Me1-Em6 (A), Me1-Em7 (B), Me1-Em8 (C) ve Me1-Em9 (D) SRAP primer kombinasyonları ile 5 nohut genotipinden elde edilen sonuçlar.. 26 Sekil 4.8.Me7-Em4 SRAP primer kombinasyonu kullanılarak 6 nohut genotipinden elde edilen sonuç 27 Şekil 4.9.Me1-Em14 SRAP primer kombinasyonu kullanılarak 93 nohut genotipinden elde edilen sonuca ait bir görüntü Şekil 4.10.ISSR ve SRAP verileri kullanılarak UPGMA metoduna göre çizilen dendrogram.. 37 VI

9 1. GİRİŞ Alev ÇEKER 1.GİRİŞ Nohut (Cicer arietinum L.), Leguminosae takımında yer alan Papilionacea (kelebek çiçekliler) familyasının çok önemli türlerini kapsayan Viceae alt familyasına bağlı Cicer cinsindendir (Şehirali,1988). Nohudun orijin merkezinin; Batı Asya da muhtemelen küçük Asya nın Kafkasya bölgesine kadar uzandığı ve şimdiki Cicer arietinum un atalarının Hint Avrupası ve Akdeniz boyunca hem batıya hem de Hindistan üzerinden doğuya doğru yayılmış olduğu bilinmektedir. Tek yıllık Cicer arietinum, C. bijugum, C. echinosperum, C. pinnatifidum, ve C. reticulatum türleri ile çok yıllık olan C. montbretti, C. anatolicum ve C. floribundum türleri yanında diğer türlerle birlikte 16 nohut türünün Türkiye de bulunduğu çeşitli araştırıcılar tarafından bildirilmiştir (Davis., 1969 Ladizinsky ve Adler., 1976; Van der Maesen., 1984; Malhotra ve ark., 1987; Muehlbauer ve ark., 1990). Yapılan son araştırmalarda, Güneydoğu Anadolu bölgesinin, özellikle Diyarbakır, Şanlıurfa yöresinin, nohudun ilk kültüre alındığı bölge olduğu bildirilmiştir. Aynı zamanda bir çok araştırmada nohuttan bahsedilirken araştırıcıların Anadolu Nohudu ismini kullandıkları ve nohudun anavatanı olarak Türkiye yi gösterdikleri bildirilmiştir (Vavilov, 1951). Dünyada nohut ekim alanının en fazla olduğu ülkelerin başında Hindistan Pakistan ve Türkiye gelmektedir. Türkiye ortalama dünya nohut veriminin (78.2 kg/da) üstünde bir verime sahip olup (100 kg/da), dünya üretimindeki yeri yıllar itibariyle ikincilik ve üçüncülük arasında değişmektedir yılı verilerine göre Türkiye nohut ekim alanı hektar, nohut üretimi ise ton olduğu belirtilmiştir (FAO, 2004). Nohudun dış satım olanaklarının gelişmesi ile birlikte, ülkemizde yılları arasında nadas alanlarında nohut tarımı yaygınlaştırılıp, ekim alanlarında artış gözlenmiştir. Ancak son yıllarda ekim alanları, üretim ve ihracatta azalma eğilimi ortaya çıkmıştır. Bu azalmaların önemli bir nedeni Meksika ve Avustralya gibi gelişmiş ülkelerin nohut araştırmasına verdikleri önem ve ayırdıkları kaynaklarla geliştirdikleri üstün verimli standart irilikte çeşitlerle ülkemizin rekabet edememesidir (Şehirali ve ark. 1995). 1

10 1. GİRİŞ Alev ÇEKER Nohut dünya üzerinde Ortadoğu ve Güney-Asya ülkelerinde kuru taneleri için yaygın olarak üretilen bir yemeklik tane baklagil bitkisidir. Nohut baklagil bitkisi olması nedeniyle, kökleri atmosferin serbest azotunu toprağa bağlayabilmektedir (10-12 kg/da). Baklagiller içerisinde bulunan nohut; soğuğa ve kurağa dayanan, fakir topraklarda yetişebilen bir bitki olması nedeniyle ülkemizin kurak bölgelerinde, diğer ürünlerin yetiştirilemediği alanlarda yetiştirilme imkanı bulmaktadır. Nohut ülkemizde genellikle ilkbaharda ekilmekte ve kg/da dolaylarında tane verimi elde edilmektedir. Ancak, Çukurova gibi Akdeniz ikliminin görüldüğü yerlerde ise kışlık olarak yapılan ekimlerinde, ortalama tane verimin kg/da a kadar çıkabildiği saptanmıştır (Engin, 1989; Özdemir ve ark. 1996; Anlarsal, 1999). Bu nedenle, kıyı bölgelerimizde kışlık yetiştiriciliğe uygun, yeni çeşitlerin geliştirilmesi ve bu çeşitlerin kullanılarak kışlık nohut tarımının yaygınlaştırılması ülkemiz nohut üretimi ve ihracatının artırılmasına büyük katkıda bulunacaktır. Nohut, tarımsal ürünler içerisinde protein oranının yüksekliği, enerji, vitamin ve minarelerce zengin oluşları nedeni ile insan beslenmesinde ayrı bir öneme sahip olan bir baklagildir. Ülkemizde nohut, yemeklik kullanımının yanı sıra leblebi sanayinin hammaddesini de oluşturan ve bu anlamda ülkemizin bazı bölgeleri için sosyo-ekonomik yapıda öneme sahip bir üründür. Birçok bitkide olduğu gibi nohut üretiminde temel amaç; bol miktarda ve kaliteli tane ürünü elde etmektir. Bunu sağlayabilmek için mevcut ekolojik koşullarda optimum yetiştirme teknikleri uygulanarak verim potansiyeli yüksek çeşitler yetiştirilmelidir. Buna göre, genetik yapı ve çevre faktörleri üretimde verimi belirleyici başlıca iki unsur olmaktadır. Çevresel faktörlerden bazıları yetiştirici tarafından verimi artırıcı yönde etkilenebilir. Genetik yapıya ise ancak ıslah çalışmaları ile etkili olunabilmektedir (Akdağ ve Şehrali, 1992). Yıllardan beri farklı ekolojik bölgelerde yetiştirilmekte olan nohut çeşitleri, kendi bölgelerinde en üst düzeyde uyum sağlamış, çevresel faktörlerden en az etkilenen gen kaynaklarımızdır. Bu gen kaynaklarının korunması ve genetik yapılarının tespit edilmesi ile yüksek verimli ve kaliteli nohut çeşitlerinin geliştirilmesine olanak sağlayabilecektir. Mevcut nohut çeşitlerinin, genetik 2

11 1. GİRİŞ Alev ÇEKER potansiyellerinin ayrıntılı bir şekilde tanımlanması, arzu edilen yüksek verimli ve kaliteli nohut çeşitlerinin ıslahına olanak sağlayacaktır. Bitkisel gen kaynaklarının toplama teknikleri, muhafaza yöntemleri ve karakterizasyonunun nasıl yapılacağı bilinmektedir. Ancak bu doğal kaynakların karşı karşıya oldukları genetik aşınmanın hızı, çeşitli etmenlere karşı dayanıklılık düzeyleri ve doğal çevrelerindeki adaptasyon yeteneklerini belirleyen genetik yapıları bilinmemektedir. Çok önemli olan bu kaynakların genetik yapılarının belirlenmesi ve materyallerin kendi doğal koşulları içinde saklanarak populasyonların dinamikleri engellenmeden kullanılabilmesi için uygun tekniklerin araştırılması gerekmektedir (Cecaralli ve ark., 1992). Bitki ıslahı ve yeni çeşit geliştirme çalışmalarında taşıdığı önem nedeniyle, ülkelerin sahip olduğu genetik zenginliğin ortaya koyulması, incelenen bitki türüne ilişkin yerel populasyonların hem morfolojik hemde DNA seviyesinde tanımlanması ve bu verilere dayalı akrabalık derecelerinin ortaya koyulması oldukça önem taşımaktadır. Nohut ıslahçıları nohut köy populasyonlarını nohut ıslahında kullanılacak önemli bir genetik kaynak olarak görmektedirler. Son yıllarda gelişen DNA teknolojisi ile birlikte DNA markörleri bitki ıslahçılarının çeşitleri DNA düzeyinde tanımlanmasına imkan sağlamaktadır. Nohut türlerinin genetik düzeyde ilişkilerinin değerlendirilmesinde RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism), STMS (Sequence-tagged Microsatellite), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA), ISSR (Inter-simple-sequence-repeat), SRAP (Sequence-related Amplified Polymorphism) ve SSR (Simple Sequence Repeat) gibi DNA moleküler markörleri bir çok araştırıcı tarafından kullanılmıştır. (Budak ve ark., 2003; Backman ve Sollers, 1993; Galvàn ve ark., 2003; Sethy N.K. ve ark., 2006; Zietkiewicz ve ark., 1994). Bu çalışmanın amacı, ISSR ve SRAP DNA moleküler markör teknikleri ile nohut genotiplerinin moleküler seviyede karakterizasyonunu yapmaktır. 3

12 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Alev ÇEKER 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bernard ve ark. (1997), RAPD moleküler markörü kullanarak, Türkiye, İran ve İsrail kaynaklı toplam 20 yabani arpa (Hordeum spontaneum) populasyonuna ait 88 genotipinde genetik çeşitliliğin belirlemek için yapmış oldukları bu araştırmda, 33 RAPD primerinden 22 primerin skorlanabilir bant oluşturduğunu, primer başına 1 ile 11 arasında polimorfik bant düştüğünü, incelenen 88 genotipten 4 genotip dışında kalan diğer genotiplerin DNA parmak izlerinin birbirine benzemediğini, toplam genetik çeşitliliğin populasyon içinde % 75, populasyonlar arasında %25 olarak bulunduğunu belirtmişlerdir. Ratnaparkhe ve ark. (1998), ISSR DNA markörü kullanarak nohut ve yabani akraba türlerde genetik çeşitliliğin belirlenmesi için yapılmış olan bu araştırmada, (TG)n tekrarına sahip ISSR primerlerinin, (GA)n tekrarına sahip primerlerden daha yüksek oranda polimorfizm gösterdiğini bildirmişlerdir. Ahmad (1999), RAPD moleküler markörü kullanarak tek yıllık nohut türleri arasındaki genetik ilişkiyi saptamak amacıyla yaptığı çalışmada, 75 RAPD primerinin kullanıldığını, bu primerlerden sadece 8 inin 9 Cicer cinsinde genomik DNA yı çoğaltabildiğini ve 115 tekrarlanabilir bant elde edildiğini bildirmiştir. Tek yıllık nohut türleri arasındaki genetik ilişki değerlendirmelerinde bu verilerin kullanıldığını, dört farklı kümeleme grubunun elde edildiğini, türlerin birbirinden ayırt edilmesini sağlayan ve her türe spesifik bir bant saptandığını bildirerek, nohut filogenetik araştırmaları ile nohut çeşit geliştirme çalışmalarında RAPD moleküler markörünün kullanılabileceğini bildirmiştir. Huttel ve ark. (1999), nohutun genomik DNA sını kullanarak SSR geliştirmeye çalıştıkları bu araştırma, 39 klonun (TAA)5, 26 klonun (GA)8, 18 klonun (GT)8, 27 klonun (AT) tekrarlamaları bakımından zengin olduğunu, bununla birlikte farklı trinükleotid tekrarlarında klonlandığını, DNA dizilimi belirlenen 43 klonun mikrosattellit taşıdığını bildirmişlerdir. Bu bilgilerden hareketle, yazarlar toplam 28 SSR primeri geliştirmişler ve bunların PCR ile ürün verme yeteneklerini bir C. reticulatum ve dört C. arietinum genotipinde araştırmışlardır. Araştırmada kullanılan 28 SSR primerinin ortalama 2-4 allele sahip olduğunu bildirerek, en polimorfik SSR 4

13 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Alev ÇEKER primerlerinin CaSTMS10 ve CaSTMS15 primer çiftleri olduğunu bildirerek, geliştirilen SSR primerlerinin nohutta genetik çeşitlilik çalışmasında başarıyla kullanılabileceğini bildirmişlerdir. Doğrar ve ark. (2000), 5 kışlık makarnalık buğday çeşidi ile 7 ileri hat arasındaki genetik çeşitliliği belirlemek için 7 SSR primeri kullanarak yaptıkları bu çalışmada, kullanılan çeşitlerin hepsinde 7 SSR lokusunun homozigot olduğunu, WMS6 primerinin iki bant ürettiğini, tüm genotiplerin 7 SSR primeri kullanılarak birbirinden ayrılabildiğini, allel sayısının 5 ile 13 arasında değiştiğini, polimorfizm oranının % 61 ile % 87 arasında olduğunu, tüm genotiplerin 3 SSR primeri kullanılarak (WMS6, WMS30 VE WMS120) birbirinden ayırt edilebildiğini bildirmişlerdir. Iruela ve ark. ( 2001), Cicer cinsine ait 14 türde filogenetik ilişkileri RAPD DNA markörüyle araştırdıkları bu çalışmada, 12 RAPD primerinin kullanılmasıyla toplam olarak 234 polimorfik bant elde edildiğini, RAPD verileri kullanılarak Jaccard genetik benzerlik katsayısına göre yapılan UPGMA analizi sonucunda Cicer türlerinin coğrafik dağılıma ve büyüme şekline göre sınıflandığını rapor etmişlerdir. Liu ve Wendel (2001), ISSR polimorfizminin pamuk bitkisinde uygulanabilirliğinin saptanması için yapılan bu çalışmada, ISSR DNA markör örneklerinin kalıtım seviyesinin yüksek bulunduğunu ve pamuk bitkisinde tür içi ve türler arası genetik çeşitliliği araştırmada ISSR DNA markörünün kullanılabileceğini bildirmişlerdir. Chowdhury ve ark. (2002), 19 nohut çeşit ve hattında genetik ilişkileri saptamak amacıyla 22 RAPD ve 22 ISSR DNA markörü kullanarak yapmış oldukları araştırmada, ISSR primerlerinin RAPD primerlerine göre daha az bant oluşturduğunu ancak ISSR primerlerinin RAPD primerlerine göre daha polimorfik bulunduğunu bildirmişlerdir. Bu iki DNA markörüne göre yapılan parmak izi analizinde de incelenen nohut çeşitlerinin homojenliğinin yüksek olduğunu, aynı zamanda incelenen nohut genotiplerinin genetik tabanının dar olduğunu bildirmişlerdir. Fernandez ve ark. (2002), RAPD ve ISSR markörleri kullanarak farklı ülkelerden gelen 16 arpa çeşidinin filogenetik akrabalık ilişkilerini inceledikleri bu çalışmada, 10 RAPD ve 10 ISSR primeri kullandıklarını ve bunların sırasıyla 125 ve 5

14 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Alev ÇEKER 228 bant ürettiğini, RAPD primerlerinden S10 ile ISSR primerlerinden 811, 820, 835, 881 nolu primerlerin tüm çeşitleri birbirinden ayırabildiğini, RAPD ve ISSR markörlerinin kullanılmasıyla elde edilen dendrograma göre çeşitlerin yazlık/kışlık, başak tipine göre 6sıralı veya 2 sıralı olarak gruplandığını belirterek, RAPD ve ISSR DNA markörlerinin DNA parmak izi analiz çalışmalarında kullanılabileceğini bildirmişlerdir. Pujar ve ark. (2002), ISSR DNA markörü kullanılarak 63 tetraploid buğday genotipini tanımlamak için yapmış oldukları bu çalışmada, ilk önce seçilen 7 buğday genotipinde 100 ISSR primerı ile ön tarama yaptıklarını ve bu ön tarama sonucuna göre 15 ISSR primerinin seçildiğini, seçilen bu primerlerin 129 unun polimorfik olan 134 bant ürettiğini, primer başına elde edilen toplam bant sayısının 8.93, polimorfik bant sayısının ise 8.60 olduğunu, ISSR verilerine göre elde edilen dendrograma göre 4 farklı grubun oluştuğunu, makarnalık çeşitler içindeki genetik çeşitliliğin belirlenmesinde ISSR DNA markörünün kullanılabileceğini bildirmişlerdir. Singh ve ark. (2002), RAPD DNA markörü kullanarak 23 nohut genotipindeki genetik varyasyonunu belirlemek için yapmış oldukları bu çalışmada, 100 RAPD primeri kullandıklarını, bunların içinden 40 RAPD primerinin genotipler arasında polimorfik bulunduğunu, kullanılan bu primerlerinde genel olarak sadece bir bant bakımından polimorfik olduğunu bildirerek, nohutta genetik tabanın dar olduğunu bildirmişlerdir. Budak ve ark. (2004), Buchloe dactyloides (manda çimi) genotiplerinde SSR, ISSR, SRAP ve RAPD markörleri ile genetik çeşitliliği ortaya çıkarmak için yaptıkları araştırmada, ortalama genetik benzerliğin SSR da 0.52, ISSR da 0.51, SRAP da 0.62, ve RAPD te 0.57 olduğunu, kullanılan SSR, ISSR, SRAP ve RAPD primerlerinin birbirleri ile karşılaştırılması ile en yüksek korelasyon değerinin (r=0.73) RAPD ve SRAP markörleri arasında bulunduğunu bildirmişlerdir. Galvan ve ark. (2003), 23 ISSR primeri kullanılarak, Fransa orjinli 3 ve Arjantin orjinli 10 kültür fasulyesi arasındaki genetik ilişkinin belirlenmesi için yapılan bu çalışmada, kullanılan primerlerden 9 adetinin polimorfik olduğunu ve bu polimorfik primerlerin 75 polimorfik bant oluşturduğunu, bant büyüklüklerinin baz çifti arasında bulunduğunu, ISSR verilerine göre elde edilen dendrograma 6

15 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Alev ÇEKER göre 13 fasulye çeşidinin iki ana gruba ayrıldığını, bu gruplarında Andean ve Mesoamerican gen kaynaklarını temsil ettiğini saptayarak, kullanılan bu primerlerin fasulye çeşitlerinin genetik çeşitliliklerinin incelenmesinde kullanılabileceğini bildirmişlerdir. Tanyolaç (2003), ISSR ve RAPD DNA markörlerini kullanarak Türkiye nin batısından toplanmış 15 yabani arpa (Hordeum spontaneum) populasyonu arasında genetik ilişkileri incelemek amacıyla yapılan bu çalışmada, 55 RAPD ve 10 ISSR primeri kullandığını, bu primerlerin toplam 55 polimorfik bant ürettiğini, ISSR ve RAPD verilerine göre yapılan küme analizi sonucuna göre iki farklı grup saptandığını, genetik varyasyonun en yakın değeri ile Pınarbaşı ve Bornova populasyonları arasında bulunduğunu, en uzak ise değeri ile İçmeler ve Aydın populasyonları arasında bulunduğunu, Arpa da genetik varyasyonu saptamada RAPD ve ISSR markörlerinin kullanılabileğini bildirmiştir. El-Maati ve ark. (2004), ISSR DNA markörü kullanarak 28 ekmeklik buğday çeşidinde genetik varyasyonun belirlenmesi için yapılmış bu çalışmada; 6 adet dinukleotid tekrara sahip ISSR primeri kullandıklarını, en yüksek polimorfik bandın SN39-F2 primerinin ürettiğini, ISSR verileri ile yapılan dendrograma göre ekmeklik buğday çeşitlerinin coğrafik bölgelere göre grup oluşturduğu ve ISSR DNA markörünün buğdayda genetik varyasyonun belirlenmesi çalışmalarında kullanılabileceğini bildirmişlerdir. Sudapak (2004), nohutta tür içi ve türler arası varyasyonu ortaya çıkarmak için ISSR DNA moleküler markörünün potansiyelini araştırdığı bu çalışmada, Cicer türlerinin ISSR primerleri ile kolaylıkla tanımlanabildiğini, fakat tür içindeki varyasyonu belirlemede yetersiz kalındığını bildirmiştir. Sica ve ark (2005), ISSR moleküler markör tekniği kullanarak İtalyan orjinli Asparagus acutifolius çeşitleri arasında genetik çeşitliliği incelemek amacıyla yapılan çalışmada, 23 ISSR primeri kullanarak 228 polimorfik bant elde ettiklerini, UPGMA analizi ile çeşitlerin coğrafik orjinlere göre birbirinden ayrılabildiğini bildirmiştir. Yong-Cui Hou ve ark. (2005), ISSR ve RAPD DNA markörleri kullanılarak orjini Batı Çin olan 46 arpa çeşidinde genetik varyasyonun belirlenmesi amacıyla 7

16 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Alev ÇEKER yaptıkları bu araştırmada, ISSR ve RAPD markörlerinin her ikisininde yüksek düzeyde polimorfizm gösterdiklerini, ISSR ve RAPD markörleri için ortalama polimorfizm değerlerinin sırasıyla olarak tespit edildiğini, ISSR marköründe genetik benzerliğin ortalamayla aralığında bulunduğunu, RAPD marköründe ise ortalamayla, aralığında bulunduğunu ve ISSR ve RAPD DNA markörlerinin arpa çeşitlerinin moleküler karakterizasyonunun belirlenmesinde kullanılabileceğini bildirmişlerdir. Hang ve ark. (2006), ISSR DNA moleküler tekniği kullanılarak 17 Aegilops ve 17 Hordeum türleri arasındaki genetik çeşitliliği belirlemek için yapılmış oldukları bu çalışmada, toplam 24 adet ISSR primeri kullandıklarını, Aegilops türünde 8 adet ISSR primerinin toplam 102 adet polimorfik bant oluşturduğunu belirleyerek, ISSR DNA moleküler markör tekniğinin Aegilops ve Hordeum türleri için hem türler arası hemde tür içi genetik çeşitliliği belirleme çalışmalarında başarıyla kullanılabileceğini bildirmişlerdir. Sethy ve ark. (2006), 9 adet çok yıllık Cicer türünde C. reticulatum dan elde edilen 11 STMS markörünün potansiyelini araştırdıkları bu çalışmada, 11 STMS DNA markörünün diğer türlerde PCR ürünü verme oranının % 97 olduğunu bildirerek, bu 11 STMS DNA markörü ile nohut türlerinin kolaylıkla ayrıla bildiğini bildirmişlerdir. Motawei ve ark. (2007), 12 ekmeklik buğday hattı ile 2 ekmeklik buğday çeşidinde (Yecora Rojo ve West Bread) ISSR ve RAPD DNA markörleri kullanılarak genetik çeşitliliğin belirlenmesi için yaptıkları bu çalışmada, RAPD analizi sonucunda 31 i polimorfik olan 42 bant oluştuğunu, ISSR analiz sonuçlarına göre 19 u polimorfik olan 28 bant oluştuğunu, RAPD ve ISSR verilerine göre elde edilen kümeleme analizine göre ekmeklik buğday hat ve çeşitlerinin pedigrilerine göre gruplandığını bildirerek, buğday ıslahında ISSR ve RAPD DNA markörlerinin kullanılabileceğini bildirmişlerdir. Rana ve ark. (2007), 20 RAPD ve 10 STMS primerleri kullanılarak Hindistan orjinli 29 adet mercimek çeşit ve köy populasyonunun genetik çeşitliliğini araştırdıkları bu araştırmada, her iki moleküler markör tekniğinin kullanılmasıyla toplam olarak 97 bant elde edildiğini ve bununda % 42.3 ünün polimorfik olduğunu, 8

17 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Alev ÇEKER köy populasyonu ile çeşitler arasında genetik benzerliğin 0.89 bulunduğunu bildirmişlerdir. Bu çalışma sonucunda incelenen materyal içinde genetik çeşitliliğin düşük olduğu rapor ederek, incelenen çeşit ve köy populasyonları içinde Precoz, L830 ve L4147 ve JL3 çeşit ve/veya köy populasyonlarının diğerlerinden genetik olarak farklı bulunduğunu ve bunların mercimek ıslahında varyasyon yaratmak için kullanılabileceğini bildirmişlerdir. 9

18 3. MATERYAL VE METOD Alev ÇEKER 3. MATERYAL ve METOD 3.1. Bitki Materyali Bu araştırmada, Çukurova Tarımsal Araştırma Enstitüsü nden temin edilen, Adana, Hatay, Mersin, Osmaniye, Kahramanmaraş ve Karaman illerinden toplanmış 60 adet yerel nohut genotipi ile Dicle Üniversitesi, Ziraat Fakültesi, Tarla Bitkileri Bölümünden temin edilen Diyarbakır merkez ve ilçelerinden toplanmış olan 31 adet yerel nohut genotipi materyal olarak kullanılmıştır. Çukurova bölgesinde ticari olarak yetiştirilen Çukurova Tarımsal Araştırma Enstitüsü tarafından tescil ettirilen İnci ve Ege Tarımsal Araştırma Enstitüsü tarafından tescil ettirilen İzmir-92 nohut çeşitleri de araştırmada kullanılmış olup ayrıntılı bilgi Çizelge 3.1 de verilmiştir. 3.2 Moleküler Analizler DNA İzolasyonu Çukurova Üniversitesi, Tarla Bitkileri Bölümü, Uygulama ve Araştırma Alanında yetiştirilen nohut köy populasyonlarından, her populasyonu temsilen tesadüfen 5 bitkiden alınan genç yaprak örneklerinde DNA izolasyonu bulk olarak Özkan ve ark. (2005) göre yapılmıştır (Taylor ve ark., 1995). Laboratuvara getirilen genç yaprak örnekleri, sıvı azot yardımıyla havanda öğütülerek 2 ml lik eppendorf tüplere alınmış ve üzerine 1 ml CTAB DNA izolasyon çözeltisi eklenmiştir. Daha sonra tüpler 65 0 C de 1.5 saat su banyosunda bekletilmiştir. Tüpler su banyosunda iken her 10 dk da bir nazikçe çalkalanmıştır. Su banyosundan çıkarılan tüpler oda sıcaklığında soğumaya bırakılmış (yaklaşık dk) ve daha sonra bu tüplere 0.5 ml kloroform:isoamil alkol karışımı (24:1) eklenmiş ve yine elde nazikçe 15 dk çalkalanmıştır. Daha sonra tüpler 10 dk süre ile rpm de santrifüj yapılmıştır. Santrifüj yapılan tüplerin üst fazları alınarak 1.5 ml lik yeni ependorf tüplere aktarılmıştır. Bu tüplerin üzerine 300 µl isopropanol eklenmiş ve yavaşça tek faz hale getirilerek DNA nın çökeltilmesi sağlanmıştır. DNA dipte 10

19 3. MATERYAL VE METOD Alev ÇEKER kalacak şekilde tüm sıvı dökülmüş ve DNA örneği iki defa içerisinde 10 mm amonyum asetat bulunan %76 lik etil alkol ile yıkanmış ve örnekler oda sıcaklığında bir gece boyunca tutularak kuruması sağlanmıştır. Kuruyan DNA örneklerine 50 µl ddh20 eklenerek çözülmesi sağlanmış ve çözülen DNA örnekleri 20 0 C de saklanmıştır DNA Konsantrasyonunun Belirlenmesi Herhangi bir DNA moleküler markör tekniği ile çalışırken bitki örneklerinden elde edilen DNA nın kalitesi ve konsantrasyonun bilinmesi çok önemlidir. Bundan dolayı DNA konsantrasyonunun çok iyi ayarlanma ve kalitesinin iyi olması gerekmektedir. Elde edilmiş DNA örneklerinde ilk önce DNA kalitesini ve elde edilen DNA örneğinin konsantrasyonunu belirlemek için 2 µl DNA örneği 0.5 ml lik eppendorf tüpüne konulmuş, bunun üzerine 4 µl 6X koşma solüsyonu ve 14 µl ddh20 eklenmiştir. Karışım vortekste iyice karıştırılmış, sonrada kısa santrifüj yapılmıştır. Hazırlanan bu örnekler içersinden alınan 10 µl örnek, 0.5X TBE solüsyonu içersinde bulunan % 0.8 lik agaroz jele yüklenmiştir. Agaroz jele yüklenen bu örnekler 90 voltta 60 dakika koşturulmuştur. Koşturmadan sonra etidiyum bromid ile boyanan agaroz jel, UV transilluminatör yardımıyla görüntülenmiştir. Örneklerin DNA kalitesini belirlemek için agaroz jellere standart olarak lamda DNA (25 ng 50 ng 100 ng -200 ng) koşulmuş ve bunlar yardımıyla DNA konsantrasyonlar belirlenmiştir ISSR Analizi Araştırmada, Çizelge 3.2 de verilen ve British Colombia Üniversitesinden temin edilen ISSR primerleri kullanılmıştır. Bu primerler kullanılarak yapılan DNA analizleri, Zietkiewicz ve ark. (1994) nın bildirdiği protokole göre yapılmıştır. Bu protokolo göre, 25 µl amplifıkasyon reaksiyon çözeltisi; 75 mm Tris-HCl, ph=8.8, 11

20 3. MATERYAL VE METOD Alev ÇEKER Çizelge 3.1. Araştırmada kullanılan nohut populasyonlarına ait kayıt numarası, toplandığı il ve yöreye ilişkin bilgiler NO KAYIT NO İL YÖRE 1 Adana 1 Adana Tufanbeyli Merkez -1 2 Adana 2 Adana Tufanbeyli Doğanbeyli-1 3 Adana 3 Adana Tufanbeyli Demiroluk 4 Adana 4 Adana Tufanbeyli Akpınar- 1 5 Adana 5 Adana Saimbeyli Karakuyu- 1 6 Adana 6 Adana Saimbeyli Yardibi- 1 7 Adana 7 Adana Pozantı Aşçıbekirli -1 8 Adana 8 Adana Pozantı Ybelemedik -2 9 Adana 9 Adana Pozantı Dağdibi 1 10 Adana 10 Adana Kamışlı Merkez 1 11 Adana 11 Adana Aladağ Dölekli 1 12 Adana 12 Adana Aladağ Dölekli 3 13 Adana 13 Adana Aladağ Yetimli 4 14 Adana 14 Adana Aladağ Büyükufuk 2 15 Adana 15 Adana Aladağ Kökez 1 16 Adana 16 Adana Aladağ Kıcak 1 17 Osmaniye 1 Osmaniye Hasanbeyli Merkez Osmaniye 2 Osmaniye Hasanbeyli Merkez Osmaniye 3 Osmaniye Hasanbeyli Yanıkışla Osmaniye 4 Osmaniye Bahçe İnderesi 1 21 Osmaniye 5 Osmaniye Bahçe Arılıkaş 1 22 Osmaniye 6 Osmaniye Bahçe Buğdacık 1 23 Osmaniye 7 Osmaniye Çelikler Bekdemirler-1 24 Mersin 1 Mersin Gülnar Kayrak 1 25 Mersin 2 Mersin Gülnar Köseçobanlı-1 26 Mersin 3 Mersin Silifke İmamlı 1 27 Mersin 4 Mersin Silifke Keflitürkmenli-1 28 Mersin 5 Mersin Silifke Uzuncaburun-1 29 Mersin6 Mersin Silifke Demircili 1 30 Mersin7 Mersin Silifke Kırovası 1 31 Hatay 1 Hatay Merkez Akcurun 1 32 Hatay 2 Hatay Merkez Gökçegöz 1 33 Hatay 3 Hatay Altınözü Mayadağlı-1 34 Hatay 4 Hatay Altınözü Yunushan Hatay 5 Hatay Altınözü Kansu 1 36 Hatay 6 Hatay Yayladağ Sebenoba-1 37 Hatay 7 Hatay Kırıkhan İncirli 2 38 Hatay 8 Hatay Belen Kıcı 1 39 Maraş 1 K.maraş Elbistan Elmalı 2 40 Maraş 2 K.maraş Elbistan Elmalı 3 41 Maraş 3 K.maraş Afşin Çomudüz 2 42 Maraş 4 K.maraş Afşin Kaşanlı 1 43 Maraş 5 K.maraş Afşin Küçüktatar 1 44 Maraş 6 K.maraş Afşin Karagöz 3 45 Maraş 7 K.maraş Afşin Buget 1 46 Maraş 8 K.maraş Afşin Buget 2 12

21 3. MATERYAL VE METOD Alev ÇEKER Çizelge 3.1 in devamı. NO KAYIT NO İL YÖRE 47 Maraş 9 K.maraş Afşin Örenli 48 Karaman 1 Karaman Merkez 2 49 Karaman 2 Karaman Ayrancı Kavaközü-1 50 Karaman 3 Karaman Ayrancı Kavaközü Karaman 4 Karaman Ayrancı Berendi-1 52 Karaman 5 Karaman Ayrancı Berendi-2 53 Karaman 6 Karaman Ayrancı Küçükkaraş 54 Karaman 7 Karaman Ayrancı Küçükkaraş-2 55 Karaman 8 Karaman Ayrancı Kıraman Karaman 9 Karaman Ermenek Sarıvadi-3 57 Karaman 10 Karaman Ermenek Tepebaşı-2 58 Karaman 11 Karaman Ermenek Tepebaşı-3 59 Karaman 12 Karaman ErmenekGökçekent-1 60 Karaman 13 Karaman Ermenek Yalındal-1 61 D.bakır 1 Diyarbakır Eğil Merkez Köy 62 D.bakır 2 Diyarbakır Kulp Merkez Köy 63 D.bakır 3 Diyarbakır Silvan Yukarıkasımlı 64 D.bakır 4 Diyarbakır Merkez Köy Gözeli 65 D.bakır 5 Diyarbakır Silvan Yolarası 66 D.bakır 6 Diyarbakır Dicle Kocaalan 67 D.bakır 7 Diyarbakır Silvan Çığıl 68 D.bakır 8 Diyarbakır Merkez Köy Çünğüş 69 D.bakır 9 Diyarbakır Silvan Yolarası 70 D.bakır 10 Diyarbakır Çınar Mollaali 71 D.bakır 11 Diyarbakır Merkez Köy Çünğüş 72 D.bakır 12 Diyarbakır Çermik Haburman 73 D.bakır 13 Diyarbakır Dicle Kocaalan 74 D.bakır 14 Diyarbakır Kulp Merkez Köy 75 D.bakır 15 Diyarbakır Silvan Yolarası 76 D.bakır 16 Diyarbakır Ergani Tümtepe 77 D.bakır 17 Diyarbakır Ergani Yükselli 78 D.bakır 18 Diyarbakır Ergani Divaneler 79 D.bakır 19 Diyarbakır Bismil Harmanlı 80 D.bakır 20 Diyarbakır Dicle Bozova 81 D.bakır 21 Diyarbakır Ergani Polat 82 D.bakır 22 Diyarbakır Bismil Belenli 83 D.bakır 23 Diyarbakır Bismil Harmanlı 84 D.bakır 24 Diyarbakır Çınar Göktepe 85 D.bakır 25 Diyarbakır Ergani Polat 86 D.bakır 26 Diyarbakır Çermik Eskibağ 87 D.bakır 27 Diyarbakır Lice Fis Ovası 88 D.bakır 28 Diyarbakır Kocaköy Aktaş 89 D.bakır 29 Diyarbakır Bismil Kemberli 90 D.bakır 30 Diyarbakır Germik 91 D.bakır 31 Diyarbakır Merkez Köy Ekinciler 92 İnci (Tescilli - Ticari çeşit 93 Çeşit) İzmir-92 (Tescilli Çeşit) - Ticari çeşit 13

22 3. MATERYAL VE METOD Alev ÇEKER Çizelge 3.2. Araştırmada kullanılan ISSR primerleri ve DNA dizilimleri Primer DNA dizilimi Primer DNA dizilimi Adı (3-5 ) Adı (3-5 ) UBC 807 (AG) 8 T UBC 846 (CA) 8 RT UBC 808 (AG) 8 C UBC 847 (CA) 8 RC UBC 809 (AG) 8 G UBC 848 (CA) 8 RG UBC 810 (GA) 8 T UBC 849 (GT) 8 YA UBC 811 (GA) 8 C UBC 851 (GT) 8 YG UBC 812 (GA) 8 A UBC 852 (TC) 8 RA UBC 813 (CT) 8 T UBC 853 (TC) 8 RT UBC 814 (CT) 8 A UBC 854 (TC) 8 RG UBC 815 (CT) 8 G UBC 855 (AC) 8 YT UBC 816 (CA) 8 T UBC 856 (AC) 8 YA UBC 817 (CA) 8 A UBC 857 (AC) 8 YG UBC 818 (CA) 8 G UBC 858 (TG) 8 RT UBC 819 (GT) 8 A UBC 859 (TG) 8 RC UBC 820 (GT) 8 C UBC 861 (AAC) 6 UBC 821 (GT) 8 T UBC 867 (GGC) 6 UBC 822 (TC) 8 A UBC 868 (GAA) 6 UBC 823 (TC) 8 C UBC 869 (GTT) 6 UBC 824 (TC) 8 G UBC 873 (GACA) 4 UBC 825 (AC) 8 T UBC 874 (CCCT) 4 UBC 826 (AC) 8 C UBC 875 (CTAG) 4 UBC 827 (AC) 8 G UBC 876 (GATA) 4 UBC 828 (TG) 8 A UBC 877 (TGCA) 4 UBC 829 (TG) 8 C UBC 878 (GGAT) 4 UBC 830 (TG) 8 G UBC 879 (CTTCA) UBC 834 (AG) 8 YT UBC 880 (GGAGA) UBC 835 (AG) 8 YC UBC 884 HBH(AG) 7 UBC 836 (AG) 8 YA UBC 885 BHB(GA) 7 UBC 840 (GA) 8 YT UBC 886 VDV(CT) 7 UBC 841 (GA) 8 YC UBC 887 DVD(TC) 7 UBC 842 (GA) 8 YG UBC 888 BDB(CA) 7 UBC 843 (CT) 8 RA UBC 890 VHV(GT) 7 UBC 844 (CT) 8 RC UBC 891 HVH(TG) 7 UBC 845 (CT) 8 RG 14

23 3. MATERYAL VE METOD Alev ÇEKER 20 mm (NH4) 2 S0 4, 2 mm MgCI 2, %0.1 Tween 20, 100 µm datp, 100 µm dttp, 100µM dgtp, 100 µm dctp, 0.2 µm primer, 1.0 ünite Taq DNA polymerase ve 10ng DNA içermektedir. Sıcaklık ve döngü koşulları olarak; 94 C'de 2 dk ön denatürasyon işleminden sonra, 35 döngü boyunca örnekler denatürasyon için 94 C'de 45 sn, primerin DNA'ya yapışması için o C'de (primere göre değişmek üzere) 1 dk, ve uzama safhası için 72 C'de 2 dk tutulmuştur. Ayrıca, örnekler son uzama safhası için 72 C'de 7 dk bekletilmişlerdir. Her reaksiyon en az iki defa tekrarlanmış, böylece sonuçların elde edilebilirliği test edilmiştir. Kullanılan ISSR primerlerinin DNA ya yapışma sıcaklığı olarak Kafkas ve ark. (2006) rının bildirmiş olduğu sıcaklık değerleri kullanılmıştır SRAP Analizi Bu çalışmada Çizelge 3.3 de verilen SRAP primerleri kullanılmıştır. SRAP protokolu olarakta Budak ve ark (2004) belirttiği yöntem kullanılmıştır. 25 µl amplifikasyon reaksiyon çözeltisi; 75 mm Tris-HCl, ph=8.8, 20 mm (NH4) 2 S0 4, 2 mm MgCI 2, 0.1% Tween 20, 100 µm datp, 100 µm dttp, 100µM dgtp, 100 µm dctp, 0.2 µm primer, 1.0 ünite Taq DNA polymerase ve 20 ng DNA içermektedir. Sıcaklık ve döngü koşulları olarak; 94 C'de 1 dk ön denatürasyon işleminden sonra, 32 döngü boyunca örnekler denatürasyon için 94 C'de 1dk, primerin DNA'ya yapışması için 35 o C'de 1 dk, ve uzama safhası için 72 C'de 1 dk tutulmuştur. Ayrıca, örnekler son uzama safhası için 72 C'de 5 dk bekletilmişlerdir. Her reaksiyon en az iki defa tekrarlanmış, böylece sonuçların elde edilebilirliği test edilmiştir Elektroforez ISSR ve SRAP DNA markör analizlerinden elde edilen PCR ürünleri % 1.8 agaroz jelde, 4.5 V/cm olacak şekilde elektroforez de 3 saat 0.5 X TBE tampon çözeltisinde koşturulmuş, jel 15 dk ethidium bromid çözeltisi ile boyandıktan sonra 15 dk saf suda yıkanmış, UV transilluminatör yardımı ile resimlerin görüntülenmesi sağlanmış ve elde edilen resimler jel görüntüleme aleti kullanılarak bilgisayara kayıt edilmiştir ve skorlama çalışmalarında kullanılmıştır. 15

24 3. MATERYAL VE METOD Alev ÇEKER Çizelge 3.3. Araştırmada kullanılan SRAP primerleri Primer Adı Forward primer (İleri) Reverse primer (Geri) Me1 TGA GTC CAA ACC GGA TA Em1 GAC TGC GTA CGA ATT AAT Me2 TGA GTC CAA ACC GGA GC Em2 GAC TGC GTA CGA ATT TGC Me3 TGA GTC CAA ACC GGA AT Em3 GAC TGC GTA CGA ATT GAC Me4 TGA GTC CAA ACC GGA CC Em4 GAC TGC GTA CGA ATT TGA Me5 TGA GTC CAA ACC GGA AG Em5 GAC TGC GTA CGA ATT AAC Me6 TGA GTC CAA ACC GGA CA Em6 GAC TGC GTA CGA ATT GCA Me7 TGA GTC CAA ACC GGA CG Em7 GAC TGC GTA CGA ATT CAA Me8 TGA GTC CAA ACC GGA CT Em8 GAC TGC GTA CGA ATT CAC Me9 TGA GTC CAA ACC GGA GG Em9 GAC TGC GTA CGA ATT CAG Me10 TGA GTC CAA ACC GGA AA Em10 GAC TGC GTA CGA ATT CAT Me11 TGA GTC CAA ACC GGA AC Em11 GAC TGC GTA CGA ATT CTA Me12 TGA GTC CAA ACC GGA GA Em12 GAC TGC GTA CGA ATT CTC Me13 TGA GTC CAA ACC GGA AG Em13 GAC TGC GTA CGA ATT CTG Em14 GAC TGC GTA CGA ATT CTT Em15 GAC TGC GTA CGA ATT GAT Em16 GAC TGC GTA CGA ATT GTC 3.3 Verilerin Değerlendirilmesi Jelde görüntülenen bantlar polimorfik olup olmamasına göre 1 (var) veya 0 (yok) olarak sınıflandırılıp matris oluşturularak genetik benzerlik katsayısı Jaccard (1908) a göre hesaplanmıştır. Kümeleme analizi ve diğer analizler NTSYS-pc-21 paket programı kullanılarak yapılmıştır. 16

25 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Alev ÇEKER 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA 4.1. DNA Analizi ISSR DNA Markör Analizi Altı-yedi nohut genotipinde polimorfik ISSR primerlerini bulmak için 65 ISSR primeri kullanılarak ön tarama yapılmış ve kullanılan primer adı, primerlerin DNA dizilimi, toplam skorlanan bant sayısı ve polimorfizm oranı Çizelge 4.1 de verilmiştir. Altı nohut genotipinde ön incelemeye tabi tutulan 65 ISSR primerinden, 58 adedinin PCR ürünü verdiği 7 adedinin ise (ISSR 852, ISSR 854, ISSR 869, ISSR 874, ISSR 875, ISSR 877 ve ISSR 878) PCR ürünü vermediği saptanmıştır (Çizelge 4.1). Ön çalışma sonucunda PCR ürünü veren 58 ISSR primeri, altı nohut genotipinde toplam olarak 242 bant üretmiş olup 16 adedi polimorfik olarak bulunmuştur. PCR ürünü veren 58 primer için primer başına ortalama bant sayısı 4,17 olarak belirlenmiştir. En fazla bant sayısı 8 adet ile UBC815 ISSR primerinden, en düşük bant sayısı ise 1 adet ile UBC 807 ve UBC 867 ISSR primerlerinden elde edilmiştir. Ortalama polimorfizm oranı % 6.6 olup % 0 ile % 60 arasında değiştiği saptanmıştır (Çizelge 4.1). Altı nohut genotipinde 65 ISSR primeri ile yapılan ön tarama sonucunda PCR ürünü veren 58 ISSR primeri içinden polimorfik olduğu tesbit edilen 11 ISSR primeri, 91 nohut yerel genotipi ile 2 ticari nohut çeşidinde moleküler karakterizasyon yapmak için kullanılmıştır. 65 ISSR primeri ile yapılan ön tarama sonuçlarına ait bazı sonuçlar Şekil 4.1, Şekil 4.2 ve Şekil 4.3 de verilmiştir. Seçilen 11 ISSR primeri kullanılarak doksan-üç nohut genotipinde elde edilen toplam bant sayısı, polimorfik bant sayısı ve polimorfizm oranı Çizelge 4.2 de verilmiştir. 11 ISSR primerinin 93 nohut genotipinde kullanılması sonucu toplam 49 bant elde edilmiş ve bunun 19 unun polimorfik olduğu belirlenmiştir. 11 ISSR primeri kendi içinde değerlendirildiğinde, primer başına toplam bant sayısı en fazla 6 adet ile UBC 876 ve UBC 844 ISSR primerlerinden elde edilirken, en az ise 2 adet ile UBC 849 ISSR primerinden elde edilmiştir. Ortalama polimorfik bant sayısı 17

26 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Alev ÇEKER A B C D E F Şekil 4.1. ISSR 808 (A), ISSR809 (B), ISSR811 (C) ISSR815 (D) ISSR818 (E) ve ISSR820 (F) primerleri kullanılarak 6 nohut genotipinde yapılan ISSR analiz sonuçları. A B C D E F Şekil 4.2. ISSR 823 (A), ISSR824 (B), ISSR826 (C) ISSR827 (D) ISSR829 (E) ve ISSR830 (F) primerleri kullanılarak 6 nohut genotipinde yapılan ISSR analiz sonuçları. A B C D E F G Şekil 4.3. ISSR 807 (A), ISSR810 (B), ISSR814 (C) ISSR816 (D) ISSR817 (E), ISSR819 (F) ve ISSR821 (G) primerleri kullanılarak 6 nohut genotipinde yapılan ISSR analiz sonuçları. 18

27 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Alev ÇEKER Çizelge 4.1. Altı nohut genotipinde taranan 65 ISSR primerin adı, DNA dizilimi, yapışma sıcaklığı, toplam skorlanan bant sayısı, polimorfik bant sayısı ve % polimorfizme ait değerler Primer DNA dizilimi Toplam skorlanan Polimorfik bant sayısı Adı (3-5 ) bant sayısı n % UBC 807 (AG) 8 T UBC 808 (AG) 8 C UBC 809 (AG) 8 G UBC 810 (GA) 8 T UBC 811 (GA) 8 C UBC 812 (GA) 8 A UBC 813 (CT) 8 T UBC 814 (CT) 8 A UBC 815 (CT) 8 G UBC 816 (CA) 8 T UBC 817 (CA) 8 A UBC 818 (CA) 8 G UBC 819 (GT) 8 A UBC 820 (GT) 8 C UBC 821 (GT) 8 T UBC 822 (TC) 8 A UBC 823 (TC) 8 C UBC 824 (TC) 8 G UBC 825 (AC) 8 T UBC 826 (AC) 8 C UBC 827 (AC) 8 G UBC 828 (TG) 8 A UBC 829 (TG) 8 C UBC 830 (TG) 8 G UBC 834 (AG) 8 YT UBC 835 (AG) 8 YC UBC 836 (AG) 8 YA UBC 840 (GA) 8 YT UBC 841 (GA) 8 YC UBC 842 (GA) 8 YG UBC 843 (CT) 8 RA UBC 844 (CT) 8 RC UBC 845 (CT) 8 RG UBC 846 (CA) 8 RT

28 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Alev ÇEKER Çizelge 4.1 in devamı Primer DNA dizilimi Toplam skorlanan Polimorfik bant sayısı Adı (3-5 ) bant sayısı n % UBC 847 (CA) 8 RC UBC 848 (CA) 8 RG UBC 849 (GT) 8 YA UBC 851 (GT) 8 YG UBC 852 (TC) 8 RA UBC 853 (TC) 8 RT UBC 854 (TC) 8 RG UBC 855 (AC) 8 YT UBC 856 (AC) 8 YA UBC 857 (AC) 8 YG UBC 858 (TG) 8 RT UBC 859 (TG) 8 RC UBC 861 (AAC) UBC 867 (GGC) UBC 868 (GAA) UBC 869 (GTT) UBC 873 (GACA) UBC 874 (CCCT) UBC 875 (CTAG) UBC 876 (GATA) UBC 877 (TGCA) UBC 878 (GGAT) UBC 879 (CTTCA) UBC 880 (GGAGA) UBC 884 HBH(AG) UBC 885 BHB(GA) UBC 886 VDV(CT) UBC 887 DVD(TC) UBC 888 BDB(CA) UBC 890 VHV(GT) UBC 891 HVH(TG) Genel Toplam/

29 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Alev ÇEKER Çizelge 4.2. Polimorfik olan 11 ISSR primeri kullanılarak 93 nohut genotipinden elde edilen toplam bant sayısı, polimorfik bant sayısı ve polimorfizm oranı Primer DNA dizilimi Toplam skorlanan Polimorfik bant sayısı Adı (3-5 ) bant sayısı n % UBC815 (CT) 8 G UBC 829 (CA) 8 G UBC 836 (AG) 8 YA UBC 842 (GA) 8 YG UBC 843 (CT) 8 RA UBC 844 HBH(AG) UBC 845 (CT) 8 RG UBC 846 (GT) 8 YA UBC 849 (TG) 8 RC UBC 876 (GATA) UBC 880 (GGAGA) Genel Toplam olup, 1 adet ile 3 arasında değişmiştir (Çizelge 4.2). Ortalama polimorfizm oranı % 38.8 olup, % 20 (UBC 846 ve UBC 880) ile % 100 (UBC 849) arasında değişmiştir. Seçilmiş ISSR primerleri kullanılarak 93 nohut genotipinden elde edilen sonuçlardan bazıları Şekil 4.4 ve Şekil 4.5 de verilmiştir SRAP DNA Markör Analizi Altı nohut genotipinde polimorfik SRAP primer kombinasyonları belirlemek için 82 SRAP primer kombinasyonu kullanılarak ön tarama yapılmış olup kullanılan primer adı, toplam skorlanan bant sayısı ve polimorfizm oranı Çizelge 4.3 de verilmiştir. Altı nohut genotipinde ön incelemeye tabi tutulan 82 SRAP primer kombinasyonunun hepsi PCR ürünü vermiş olup 12 SRAP primer kombinasyonunun polimorfik olduğu saptanmıştır. Yapılan bu ön tarama sonucunda, kullanılan 82 SRAP primer kombinasyonu altı nohut genotipinde toplam olarak 399 bant üretmiş olup 13 adedi polimorfik olarak bulunmuştur. Kullanılan 82 SRAP primer kombinasyonunda primer kombinasyonu başına ortalama bant sayısının 4.86 olduğu 21

30 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Alev ÇEKER A B Şekil 4.4. ISSR 836 primerleri kullanılarak 92 nohut genotipinde yapılan ISSR analiz sonuçları Şekil 4.5. ISSR 880 primerleri kullanılarak 92 nohut genotipinde yapılan ISSR analiz sonuçları 22

31 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Alev ÇEKER saptanmıştır. En fazla bant sayısı 9 adet ile Me1-Em6 SRAP primer kombinasyonundan elde edilirken en düşük bant sayısı ise 2 adet ile Me4-Em9, Me9- Em1 ve Me9-Em2 SRAP primer kombinasyonlarından elde edilmiştir. Ortalama polimorfizm oranı % 3.2 olup % 0 ile % 25 (Me1-Em9 ve Me7-Em4) arasında değiştiği saptanmıştır (Çizelge 4.3). Altı nohut genotipinde 82 SRAP primeri ile yapılan ön tarama sonucunda polimorfizm gösteren 12 SRAP kombinasyonu içinde skorlanabilirliğinde problem olmayan 9 polimorfik SRAP primer kombinasyonu seçilmiş ve 91 nohut yerel populasyonu ile 2 ticari nohut çeşidinde DNA seviyesinde genetik varyasyonu bulmak için kullanılmıştır. 82 SRAP primer kombinasyonu ile yapılan ön tarama sonuçlarına ait bazı sonuçlar Şekil 4.1, Şekil 4.2 ve Şekil 4.3 de verilmiştir. Seçilen 9 SRAP primer kombinasyonu kullanılarak doksan-üç nohut genotipinde elde edilen sonuçlar Çizelge 4.4 de verilmiştir. Dokuz ISSR primerinin 93 nohut genotipinde kullanılması sonucu toplam 44 bant elde edilmiş ve bunun 12 sinin polimorfik olduğu saptanmıştır. Dokuz SRAP primer kombinasyonu kendi içinde değerlendirildiğinde, primer kombinasyonu başına toplam bant sayısı en fazla Me1-Em7, Me4-Em16 ve Me5-Em12 SRAP primer kombinasyonlarında 6 adet ile elde edilirken, en az ise Me6-Em3 SRAP primer kombinasyonundan 3 adet ile elde edilmiştir. Ortalama polimorfik bant sayısı 1.33 olup, polimorfik bant sayısı 1 adet ile 2 arasında değişmiştir (Çizelge 4.4). Ortalama polimorfizm oranı % 27.2 olup, SRAP primer kombinasyonlarında % 16.6 (Me1-Em7) ile % 40 (Me4-Em14) arasında değişmiştir. Seçilmiş SRAP primer kombinasyonları kullanılarak 93 nohut genotipinden elde edilen sonuçlara bir örnek Şekil 4.4 de verilmiştir. 23

32 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Alev ÇEKER Çizelge 4.3. Altı nohut genotipinde taranan 82 SRAP primerinden elde edilen toplam bant sayısı, polimorfik bant sayısı ve % polimorfizm ait değerler Primer Toplam skorlanan Polimorfik bant sayısı Adı bant sayısı n % Me1-Em Me1-Em Me1-Em Me1-Em Me1-Em Me1-Em Me1-Em Me1-Em Me1-Em Me1-Em Me1-Em Me1-Em Me1-Em Me1-Em Me1-Em Me3-Em Me3-Em Me3-Em Me3-Em Me3-Em Me3-Em Me3-Em Me6-Em Me6-Em Me6-Em Me6-Em Me6-Em Me4-Em Me4-Em Me4-Em Me4-Em Me4-Em Me4-Em Me4-Em Me4-Em Me4-Em Me4-Em Me4-Em Me4-Em Me4-Em

33 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Alev ÇEKER Çizelge 4.3 ün Devamı Primer Toplam skorlanan Polimorfik bant sayısı Adı bant sayısı n % Me4-Em Me4-Em Me4-Em Me5-Em Me5-Em Me5-Em Me5-Em Me5-Em Me5-Em Me5-Em Me5-Em Me5-Em Me5-Em Me7-Em Me7-Em Me7-Em Me7-Em Me7-Em Me7-Em Me7-Em Me7-Em Me7-Em Me7-Em Me7-Em Me8-Em Me8-Em Me8-Em Me8-Em Me8-Em Me8-Em Me9-Em Me9-Em Me9-Em Me9-Em Me9-Em Me9-Em Me9-Em Me9-Em Genel Toplam

34 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Alev ÇEKER Çizelge 4.4. Araştırmada kullanılan primer taraması sonuçlarına göre oluşan toplam bant sayısı, polimorfik bant sayısı ve polimorfizm yüzdesine ilişkin veriler Primer Toplam skorlanan Polimorfik bant sayısı Adı bant sayısı n % Me1-Em Me1-Em Me1-Em Me6-Em Me4-Em Me4-Em Me4-Em Me5-Em Me7-Em Genel Toplam Sekil 4.6. Me7-Em4 (A) ve Me1-Em8 (B) SRAP primerleri kullanılarak 6 nohut genotipinden elde edilen sonuçlar Sekil 4.7. Me1-Em6 (A), Me1-Em7 (B), Me1-Em8 (C) ve Me1-Em9 (D) SRAP primer kombinasyonları ile 5 nohut genotipinden elde edilen sonuçlar 26

35 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Alev ÇEKER Seki l4.8.me7-em4 SRAP primer kombinasyonu kullanılarak altı nohut genotipinden elde edilen sonuç Şekil 4.9.Me1-Em14 SRAP primer kombinasyonu kullanılarak 93 nohut genotipinden elde edilen sonuca ait bir görüntü 27

36 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Alev ÇEKER ISSR ve SRAP DNA Markör Analizlerinin Karşılaştırılması ISSR ve SRAP DNA markör teknikleri kullanılarak yapılan analiz sonucunda elde edilen veriler birleştirilmiş ve 93 nohut genotipinin birbirine olan yakınlığı Jaccard (1908) bildirdiği yönteme göre hesaplanmıştır. Genetik yakınlık değerleri NTSYSpc21 (Rohlf, 2001) paket programı kullanılarak yapılmış ve Çizelge 22 de verilmiştir. Yapılan analiz sonucunda ortalama Jaccard genetik benzerlik katsayısının 0.90 olduğu, en yakın genotiplerin 1.00 değeri ile Mersin1-Adana16, Maraş7- Osmaniye1, Hatay4-Osmaniye3, Osmaniye4-Osmaniye3, Hatay4-Osmaniye4, Hatay1-Osmaniye5, Hatay2-Hatay1, Maraş7-Hatay3, Maraş7-Hatay6, Karaman6- Karaman5, İnci-DiyarbakırDiyarbakır26-Diyarbakır1, Diyarbakır9-Diyarbakır1, Diyarbakır6-Diyarbakır1, Diyarbakır5-Diyarbakır1, İzmir92-Diyarbakır2, Diyarbakır31-Diyarbakır2, Diyarbakır30-Diyarbakır2, Diyarbakır20-Diyarbakır2, Diyarbakır19-Diyarbakır2, Diyarbakır10-Diyarbakır2, Diyarbakır4-Diyarbakır2, İzmir92-Diyarbakır4, Diyarbakır31-Diyarbakır4, Diyarbakır30-Diyarbakır4, Diyarbakır20-Diyarbakır4, Diyarbakır19-Diyarbakır4, Diyarbakır10-Diyarbakır4, İnci-Diyarbakır5, Diyarbakır26-Diyarbakır5, Diyarbakır9-Diyarbakır5, Diyarbakır6- Diyarbakır5, İnci-Diyarbakır6, Diyarbakır26-Diyarbakır6, Diyarbakır9-Diyarbakır6, İnci-Diyarbakır9, Diyarbakır26-Diyarbakır9, İzmir92-Diyarbakır10, Diyarbakır31- Diyarbakır10, Diyarbakır30-Diyarbakır10, Diyarbakır20-Diyarbakır10, Diyarbakır19-Diyarbakır10, Diyarbakır22-Diyarbakır12, İzmir92-Diyarbakır19, Diyarbakır31-Diyarbakır19, Diyarbakır30-Diyarbakır19, Diyarbakır20-Diyarbakır19, İzmir92-Diyarbakır20, Diyarbakır30-Diyarbakır20, İnci-Diyarbakır26, İzmir92- Diyarbakır30, Diyarbakır31-Diyarbakır30 ve İzmir92-Diyarbakır31 arasında, genetik olarak birbirine en uzak genotiplerin ise 0.64 değeri ile Diyarbakır14-Diyarbakır7 genotipleri arasında olduğu saptanmıştır. Jaccard benzerlik katsayı kullanılarak UPGMA metoduna göre (Unweight Pair Group Method with Arithmetic mean) NTSYSpc21 paket programında çizilen dendrogram Şekil 14 de verilmiştir. Dendrogramın incelendiğinde A ve B olmak üzere iki ana grubun oluştuğu (Şekil 14), A grubunun toplam 3 genotipi temsil ettiği (Adana-1, Mersin-6, Maraş-5), geri 28