ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ Gonca Gül ÇAYHAN DOĞU AKDENİZ DEN AVLANAN KEFAL (Mugil cephalus Linnaeus, 1758) BALIĞININ AROMA-AKTİF BİLEŞİKLERİ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI ADANA, 2009

2 T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DOĞU AKDENİZ DEN AVLANAN KEFAL (Mugil cephalus Linnaeus, 1758) BALIĞININ AROMA-AKTİF BİLEŞİKLERİ Gonca Gül ÇAYHAN YÜKSEK LİSANS TEZİ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI Bu tez../../.. Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oybirliği/Çokluğu İle Kabul Edilmiştir. İmza.... İmza... İmza..... Doç. Dr. Serkan SELLİ Prof. Dr. Ahmet CANBAŞ Doç. Dr. Yasemen YANAR DANIŞMAN ÜYE ÜYE Bu tez Enstitümüz Gıda Mühendisliği Anabilim Dalında hazırlanmıştır. Kod No : Prof. Dr. Aziz ERTUNÇ Enstitü Müdürü Bu Çalışma Çukurova Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi Tarafından Desteklenmiştir. Proje No: ZF.2004.YL.46 Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ DOĞU AKDENİZ DEN AVLANAN KEFAL (Mugil cephalus Linnaeus, 1758) BALIĞININ AROMA-AKTİF BİLEŞİKLERİ Gonca Gül ÇAYHAN ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI Danışman : Doç. Dr. Serkan SELLİ Yıl : 2009, Sayfa: 53 Jüri : Doç. Dr. Serkan SELLİ Prof. Dr. Ahmet CANBAŞ Doç.Dr. Yasemen YANAR Bu çalışmada avcılık yoluyla elde edilen kefal balıklarının aroma ve aromaaktif bileşikleri gaz kromatografisi-kütle spektrometresi-olfaktotmeri cihazıyla belirlenmiştir. Aroma maddelerinin ekstraksiyonunda diklorometan çözgeniyle buharlı damıtma ekstraksiyon yöntemi kullanılmıştır. Duyusal analiz sonuçlarına göre buharlı damıtma ekstraksiyon yöntemiyle elde edilen aromatik ekstrakt balık kokusuna oldukça benzer bulunmuştur. Kefal balığında toplam 59 adet aroma maddesi tanımlanmıştır. Bu bileşikler içerisinde aldehitler sayı ve miktar olarak en fazla bulunmuştur. Aroma-aktif bileşiklerin belirlenmesinde aroma ekstrakt seyreltme analizi kullanılmıştır. Gaz kromatografi-olfaktometri analiz sonuçlarına göre kefal balığında 29 adet aroma-aktif bileşik belirlenmiş ve bunlardan 24 adedi tanımlanmıştır. Flavor seyreltme faktörlerine göre tanımlanan aroma-aktif bileşikler içerisinde (Z)-heptenal (pişmiş balık) ve nonanal (yeşil bitki-meyvemsi) en güçlü aroma-altif bileşiklerdir. Anahtar Kelimeler: Kefal, Mugil cephalus, aroma maddeleri, aroma-aktif bileşikler, GC-MS-O I

4 ABSTRACT MSc THESIS AROMA-ACTIVE COMPOUNDS OF GREY MULLET (Mugil cephalus Linnaeus, 1758) CATCH IN THE EASTERN MEDITERRANEAN Gonca Gül ÇAYHAN DEPARTMENT OF FOOD ENDINERING INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES UNIVERSITY OF ÇUKUROVA Supervisor : Assoc. Prof. Serkan SELLİ Year : 2009, Pages: 53 Jury : Assoc. Prof. Dr. Serkan SELLİ Prof. Dr. Ahmet CANBAŞ Assoc. Prof. Dr. Yasemen YANAR In this study, aroma and aroma-active compounds of wild grey mullet (Mugil cephalus) were analyzed gas chromatography-mass spectrometry-olfactometry. Simultaneous distillation and extraction (SDE) with dichloromethane was used for extraction of volatile components. According to sensory analysis, the aromatic extract obtained by SDE was representative of grey mullet odour. A total of 59 aroma compounds were identified and quantified in grey mullet. Aldehydes were qualitatively and quantitatively the most dominant volatiles in grey mullet. Aroma extract dilution analysis was used for the determination of aroma-active compounds of fish sample. The results of the gas chromatography-olfactometry analysis showed that 29 odorous compounds were perceived by panelists. Of these, 24 were identified. Basen on the flavor dilution factor, the most powerful aroma active compounds identified in the extract were (Z)-4 heptenal and nonanal which were described as the strong cooked fish and green-fruity odour, respectively. Key Words : Grey mullet, Mugil cephalus, aroma compounds, aroma-active compounds, GC-MS-O II

5 TEŞEKKÜR Bu konuda bana çalışma olanağı sağlayan, araştırmalarım ve tezimin yazımı süresince yol gösteren ve desteğini esirgemeyen danışmanım Doç. Dr. Serkan SELLİ ye, jüri üyesi olarak tezimi değerlendiren sayın hocam Prof. Dr. Ahmet Canbaş a ve sayın Doç.Dr. Yasemen Yanar a, tez çalışmam süresince yardımlarını esirgemeyen Arş. Gör. Haşim Kelebek e, Arş. Gör. Kemal Şen e ve tüm öğrenim hayatım boyunca maddî, manevî büyük fedakarlıklar yaparak benim bu noktaya gelmemi sağlayan anneme, babama ve ağabeyime sonsuz teşekkürlerimi sunarım. III

6 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ... I ABSTRACT... II TEŞEKKÜR... III İÇİNDEKİLER... IV SİMGELER VE KISALTMALAR... V ÇİZELGELER DİZİNİ... VI ŞEKİLLER DİZİNİ... VII 1. GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR MATERYAL VE METOT Materyal Yöntem Aroma Maddeleri Analizleri Balıklarda Antioksidan Kapasitenin Belirlenmesi Balıklar Üzerinde Yapılan Diğer Analizler Sonuçların Değerlendirilmesi ve İstatistiksel Analizler ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA Kefal Balığının Genel Bileşimi ve Antioksidan Kapasitesi Genel bileşimi Antioksidan kapasitesi Temsili (representative) Test Yöntemiyle Aroma Ekstraksiyonunda Kullanılan Çözgenin Seçimi Kefal Balığının Aroma Maddeleri Kefal Balığının Aroma Aktif Bileşikleri SONUÇ VE ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ IV

7 SİMGELER VE KISALTMALAR FID GC MS GC-MS-O AESA FS : Alev İyonizasyon Dedektörü : Gaz Kromatografisi : Kütle Spektrometresi :Gaz Kromatografisi- Kütle Spektrometresi-Olfactometri : Aroma ekstrakt seyreltme analizi : Flavor seyreltme faktörü V

8 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 4.1 Balık örneğinin genel bileşimi Çizelge 4.2. Aroma ekstraktlarının benzerlik ve aroma yoğunluk testi sonuçları Çizelge 4.3. Kefal balığının (Mugil cephalus) aroma maddeleri bileşimi Çizelge 4.4. Kefal balığının aroma-aktif bileşikleri VI

9 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 3.1. Likens-Nickerson ekstraksiyon düzeneği Şekil 3.2. Benzerlik testinde kullanılan skala Şekil 3.3. Aroma yoğunluk testinde kullanılan skala Şekil 4.1. Balık örneğinin DPPH reaktifi ile gösterdiği antioksidan aktivite değişimi Şekil 4.2. Kefal balığının GC de elde edilen aroma maddeleri kromatogramı VII

10 RESİMLER DİZİNİ SAYFA Resim 3.1. Analizlerde kullanılan kefal balığı Resim 3.2. Balık örneğinin analizlere hazırlanması Resim 3.3. Aroma maddeleri ekstraksiyon düzeneği Resim 3.4. Ekstraktın Vigreux düzeneğinde konsantre edilmesi Resim 3.5. Ekstraktın mikro konsantrasyon düzeneğinde konsantre edilmesi Resim 3.6. Analizlerde kullanılan GC-MS-Olfaktometri sistemi Resim 3.7. Duyusal analizlerde kullanılan kağıt koklama çubukları Resim 3.8. Duyusal analizlerde kullanılan kahverengi cam şişeler Resim 4.1. DPPH radikali ile balık örneğinden elde edilen ekstraktın reaksiyonu...29 VIII

11 1. GİRİŞ Gonca Gül ÇAYHAN 1. GİRİŞ Su ürünleri dünya besin gereksinimin önemli bir kısmını karşılayan temel bir gıda endüstrisidir ve bu sektör dünyada en hızlı büyüyen gıda sektörüdür yılında dünyada toplam su ürünleri üretimi milyon ton dur. Bunun 93.3 milyon tonu avcılık ve 48.1 milyon tonu ise kültür balıkçılığı (yetiştiricilik) ile sağlanmıştır. Üretimin büyük bir oranı avcılık yoluyla gerçekleşmesine rağmen, kültür balıkçılığının su ürünleri içerisindeki payı yıldan yıla artmaktadır. Bu sektörde üretim miktarı 1980 yılında 7.4 milyon tondan, 1990 yılında 16.8 milyon tona ve 2005 yılında ise 48.1 milyon tona ulaşmıştır (FAO, 2006). Doğal koşulları birbirinden farklı denizlerle çevrili, çok sayıda gölleri ve akarsuları olan ülkemiz su ürünleri üretimi bakımından Avrupa ülkeleri arasında 6. sırada bulunmaktadır. Ülkemizde de son yıllarda deniz balığı yetiştiriciliği oldukça büyük bir gelişme göstermiştir. Su ürünleri üretimi potansiyeli açısından özellikle iç sular zenginliğimiz yanında deniz ürünleri yetiştiriciliği alanında son yıllarda sağlanan gelişmeler sonucu ihracat konusunda Türkiye önemli bir düzeyde gelişmiştir. Son yıllarda su ürünleri ihracatı konusunda istikrarlı bir büyüme gösteren Türkiye de, Yunanistan, İtalya ve Japonya olmak üzere bir çok ülkeye satılan su ürünlerinden 325 milyon dolar ihracat geliri sağlanmaktadır. Öte yandan, Türkiye de su ürünlerinin hayvansal ürünler ihracatında en büyük paya sahip ürün grubunu oluşturduğunun da altı önemle çizilmektedir yılında kültür balıkçılığı yoluyla bin ton balık yetiştirilmiş ve bu miktar toplam balıkçılığımızın % 27.9 nu karşılamaktadır. Aynı yıl ülkemizde denizlerden sağlanan balık miktarı bin ton dur (FAO, 2006). Ülkemizde deniz balıkları yetiştiriciliğinde sağlanan büyük gelişmelere rağmen, yetiştiriciliği yapılan ve aynı zamanda avcılık yoluyla sağlanan balık türlerinde aroma maddeleri konusunda ayrıntılı bir çalışma bulunmamaktadır. Aroma maddeleri gıdalarda kaliteyi oluşturan ve tüketici tercihini etkileyen en önemli unsurlardan birisidir. Çeşitli maddelerden oluşan aroma, balıkların duyusal özelliklerini belirleyen önemli bir kalite ölçütüdür. Balıklarda 300 ün üzerinde aroma maddesi belirlenmiştir. Bu bileşikler enzimatik reaksiyonlar, lipid oto-oksidasyonu, 1

12 1. GİRİŞ Gonca Gül ÇAYHAN mikroorganizma faaliyeti ve çevresel faktörlerden oluşmaktadır (Baek ve Cadwallader, 1997). Bu bileşikler içerisinde lipidlerden, uzun zincirli çok doymamış yağ asitlerinden lipoksigenaz enziminin aktivitesi sonucunda oluşan, aroma maddeleri taze balık aromasının oluşumunda en önemli rolü oynamaktadır (Kawai, 1996). Miktarları nanogram ve miligram arasında değişen aroma maddelerinin en önemli özellikleri çok düşük konsantrasyonlarda bile duyusal olarak algılanmaları ve kalite üzerinde belirleyici rol oynamalarıdır. Aroma maddelerinin miktarlarının belirlenmesinde gaz kromatografisi (GC) tanımlanmaların da ise GC-kütle spektrometresi (MS) kullanılmaktadır. Gıdaları karakterize eden yani kendisine has kokuları oluşturan aroma aktif bileşikler ise GC-Olfaktometri (GC-O) tekniği ile belirlenmektedir. Tüketici taleplerini balıklarda sadece dış görünüşü etkilememektedir. Dış görünüş yanında balığın tadı ve aroması da tüketici taleplerini etkileyen önemli unsurlardır. Önemli bir kalite kriteri olmasına rağmen balık çeşitlerimizin aroma maddeleri ve her balık çeşidinin kendine özgü yani o balık çeşidini karakterize eden aroma aktif bileşikler üzerinde bugüne kadar herhangi bir çalışma yapılmamıştır. Ülkemizde balık ve diğer deniz ürünleri üzerinde yapılan bilimsel çalışmalar, bu ürünlerin iz ve ağır metal içerikleri ve yağ asitleri kompozisyonu konusunda yoğunlaşmıştır. Aroma maddeleri konusunda çalışmalar yok denecek kadar azdır. Kefal (Mugil cephalus) tropik ve ılıman denizlerde yaşayan Mugilidae familyasından bir balık türüdür. Ortalama cm boyunda, bazı türlerde ise boyu 70 cm kadar olabilmektedir. Kafası yassı, vücudu dolgundur ve iki adet üçgen şekilli sırt yüzgeçleri vardır. Sırtı koyu gri ile yeşilimsi bir renk arası değişir. Karın kısmı gümüş beyazdır. Mugil cephalus diğer kefaller gibi ürkek ve çevik bir tür olup açık denizle sahiller arasında gidip gelirler. Soğuk sular dışındaki ekolojik koşullara (tuzluluk ve oksijen gibi) çok dayanıklı balıklardır. Yaz aylarında beslenmek için sahil sularına göç ederler ve bol miktarda besin bulunan küçük körfez ve limanlara girerler, kış aylarında ise derin sulara sürüler halinde göç ederler. Deniz dibi bitkileri, algler ve yumuşakçalarla beslenirler (Şengör ve ark. 2003). Yaz aylarında üreyip milyon yumurta verirler. Bu dönem kefal havyarı üretimi için uygun bir 2

13 1. GİRİŞ Gonca Gül ÇAYHAN dönemdir (Balık ve ark., 1992). Beyaz etinin lezzeti ve mumlanarak pazarlanan havyar yumurtasıyla ekonomik değeri çok yüksek bir balıktır. Öte yandan, kefal lezzetli yağlı ete sahip olmasına rağmen, bazı durumlarda tükettiği besinlerden kaynaklanan istenmeyen kötü koku bileşenlerini absorbe etmesi nedeniyle tüketiciler tarafından hoş olmayan bir kokuya sahip olduğu bildirilmiştir (Collins, 1985). Bu çalışma, Adana ilinin Akdeniz kıyısında bulunan Karataş ilçesinden avlanma yolu ile elde edilen kefal (Mugil cephalus) balıklarının aroma maddeleri ve bu balıkları karakterize eden aroma aktif bileşiklerin GC-MS-O teknikleri kullanılarak, belirlenmesi amacıyla ele alınmıştır. 3

14 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Gonca Gül ÇAYHAN 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Su ürünleri sahip olduğu yüksek besin değeri ile insan beslenmesinde çok önemli gıda maddeleridir. Ülkemizde su ürünlerinin % 80 inden fazlası insan gıdası olarak tüketilmektedir. % 20 ye yakın bir kısmı ise balık unu balık yağı ve katkı maddesi gibi diğer bazı amaçlarla kullanılmaktadır. Ülkemiz önemli bir balık potansiyeline sahip olmasına rağmen, kişi başına su ürünleri tüketimi miktarı oldukça düşük seviyededir. Türkiye de kişi başına yıllık balık tüketimi 2002 yılı verilerine göre 6.7 kg dır. Bu değer Avrupa ülkelerinde 28.3 kg/yıl dır (Çolakoğlu ve ark., 2006). Ülkemiz deniz ve iç su balıkları açısından oldukça iyi durumdadır yılında su ürünleri üretimimiz yaklaşık ton dur. Bu miktarın %61.2 sini deniz balıkları, %8.4 ünü tatlı su türleri, %21.62 sini kültür balıkları ve %8.8 ini diğer deniz ürünleri oluşturmaktadır (Kutlu ve Mısır, 2007). Balıklarda ve diğer su ürünlerinde kaliteyi etkileyen birçok faktör bulunmaktadır. Bu faktörler içerisinde uçucu bileşenlerin yani aromanın önemli bir yeri vardır. Çeşitli maddelerden oluşan aroma, balıkların duyusal özelliklerini belirleyen önemli bir kalite ölçütüdür. Aroma maddelerinin iz miktarlarda bulunması, bunların belirlenmesinde güvenilir ve çok duyarlı analiz yöntemlerinin kullanılmasını gerektirir. Aroma maddeleri analizlerinde ilk aşama, aroma maddelerinin üründen uygun bir ekstraksiyon yöntemiyle alınmasıdır. Daha sonra elde edilen çözgen ve aroma maddeleri karışımındaki çözgenin, hassas bir konsantrasyon yöntemiyle, yani aroma maddeleri kayıpları olmadan ekstraktan mümkün olduğunca uzaklaştırılmasıdır. Bu yüzden aroma maddelerinin analizinde özellikle ekstraksiyon yönteminin seçimi en hassas noktadır (Vila ve ark., 1999; Ebeler ve ark., 2000). Bir ekstraksiyon yöntemi seçiminde analizi yapılacak örnekte herhangi bir aroma maddesi kaybının engellenmesi, analiz hassasiyetinin yükseltilmesi, safsızlık maddelerinin uzaklaştırılması, analizin kısa sürede tamamlanması ve elde edilen aromatik ekstraktın mümkün olduğunca elde edildiği ürüne benzemesi amaçlanır (Etievant ve Maarse, 1986; Morita, Kubota ve Aishima, 2003). 4

15 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Gonca Gül ÇAYHAN Balıklarda ve diğer deniz ürünlerinde aroma maddeleri ekstraksiyonunda çok farklı teknikler kullanılmaktadır. En çok kullanılan yöntemler vakum altında buharlı damıtma (Serot ve ark. 2001; Selli ve ark., 2006), dinamik tepe boşluğu yöntemi (Le Pape ve ark., 2004; Hallier ve ark., 2004), Likens-Nickerson damıtma düzeneğiyle, buharlı-damıtma ekstraksiyon ve katı faz mikro ekstraksiyon (SPME) (Morita, ve ark., 2002; Varlet ve ark., 2006) dır. Bir gıda maddesinde yüzlerde aroma maddeleri bulunmasına rağmen, bunlardan çok az bir kısmı o gıdanın karakteristik aromasının oluşumunda rol oynamaktadır. Karakteristik aromanın oluşumundan sorumlu bileşiklere aroma-aktif bileşikler denir. Aroma-aktif bileşiklerin belirlenmesinde çok hassas bir enstrümantal cihaz olan GC-Olfaktometri kullanılır. Olfaktometrik analizlerinde en hassas ve kritik aşama aroma ekstraktların elde edildiği en uygun ekstraksiyon yönteminin seçimidir. Ekstraksiyon sonucu elde edilen ekstraktların aromasının mümkün olduğunca elde edildiği gıdanın aromasına yakın olması gerekir. Bu amaçla öncelikle duyusal bir analiz olan temsili (representative) test teknikleri kullanılarak en uygun ekstraksiyon yöntemi belirlenir (Le Guen ve ark., 2000; Selli ve ark., 2006). Aroma ekstraktlarının değerlendirilmesinde çok farklı temsili testler kullanılabilir. Bunlar içerisinde üçlü test, karşılaştırma testi, benzerlik testi ve yoğunluk testi en sık kullanılan testlerdir (Etiévant ve ark, 1994). Bu konu ile ilgili olarak Mehinagic ve arkadaşları 2003 yılında elmadan vakum altında buharlı damıtma yöntemiyle elde ettikleri aroma ekstraktlarında, farklı temsili testler (üçlü test, benzerlik testi, yoğunluk testi) uyguladıktan sonra aroma aktif bileşikleri GC-O tekniği ile saptamışlardır ve 2009 yıllarında yapılan çalışmalarda Selli ve arkadaşları gökkuşağı alabalığında benzer testlerle elde ettikleri en uygun aromatik ekstraktta, aroma aktif bileşikleri GC-MS-Olfaktometri tekniği ile belirlemişlerdir. Gaz kromatografisi olfaktometri (GC-O) analizi insan burnunun duyarlılğı ve seçiciliğiyle gaz kromatografisinin ayırma gücünün birleştiği tek tekniktir (Pollien ve ark. 1997). Bu yöntem besinlerdeki uçucu aroma bileşenleri içerisinde aroma-aktif olanları belirlemede yoğun bir şekilde kullanılmaktadır. (Acree ve ark. 1984; Marsili, 2000). Gıdalarda, yüzlerce aroma maddesi bulunmasına rağmen, bu bileşiklerden sadece çok az bir kısmı gıdanın genel kokusunu oluşturmaktadır. Bu nedenle bu 5

16 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Gonca Gül ÇAYHAN etkili aroma bileşiklerinin belirlenmesi aroma çalışmalarında çok önemli bir konudur ten bu yana Acree ve ark. (1984) charm analizi denilen bir teknikle aroma-aktif bileşiklerin belirlenmesine olanak sağlamışlardır. Bu teknik, koku aktivite değeri (odoractivity value) yüksek olan bileşiklerin belirlenmesi üzerine yoğunlaşmıştır. Diğer bir yöntem ise aroma ekstrakt seyreltme faktörü (AEDA; aroma extract dilution analysis) denilen bir tekniktir. Bu teknik flavor seyreltme (FD; flavor dilution) faktörü ile ifade edilir. Yöntem, aromatik ekstrakt aşama aşama seyreltilerek gaz kromatografisi-olfaktometri analizinde koku hissedilmeyinceye kadar koklanarak uygulanır. FD değeri en yüksek aroma bileşiği o gıdada en güçlü aroma-aktif bileşik olarak ifade edilir (Grosch, 2001). Gaz kromatografisi-olfaktometri tekniği temel olarak 3 farklı yöntemle gerçekleştirilir. Bunlar; 1- Aroma maddesinin algılanma konsantrasyonunun belirlenmesi (AEDA ve CHARM teknikleri). 2- Aroma maddesinin belirlenme sıklığının saptanması ve 3- Yoğunluğun ifade edilmesidir. Bu yöntemler içerisinde algılama konsantrasyonu yöntemlerinden biri olan aroma ekstrakt seyreltme tekniği olfaktometrik analizlerde en sık kullanılan yöntemdir. Uygulanması basit olan bu yöntemin en büyük avantajı olfaktometrik analizlere katılan panalist sayısının diğer yöntemlere göre düşük olmasıdır (Ferreira ve ark., 2002). Josephson ve ark. (1991) Pasifik okyanusundan ve büyük göllerden avlanan somon (Oncorhynchus sp.) balıklarında olgunluk durumunun uçucu aroma bileşenleri üzerindeki etkisini araştırmışlardır. Her iki ortamdan avlanan genç ve üreme olgunluğuna erişmiş somon balıklarının uçucu aroma analizleri sonucunda1- okten-3-ol, 1,5-oktadien-3-on, 1-okten-3-on, 1,5-oktadien-3-ol, 2-okten-1-ol ve 2,5- oktadien-1-ol gibi uçucu bileşenler belirlenmiştir. Olgun somon balıklarında uçucu aroma bileşenlerinden 8 karbon atomu bulunduran (E)-2-nonenal, (E)-2-(Z)-6- nonadienal, 6-nonen-1-ol ve 3,6-nonadien-1-ol ül salatalık ve şekerimsi kokular verdiği bildirilmiştir. 6

17 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Gonca Gül ÇAYHAN Milo ve Grosh (1993) pişmiş alabalık (Salmo faria) larının aroma-aktif bileşiklerini, aroma ekstrakt seyreltme analizi (AEDA; aroma extract dilution analysis) yapmışlardır. Balıklarda 24 adet aroma-aktif bileşik belirlenmiş ve bunlarda 19 adedi tanımlanmıştır. Bu bileşikler içerisinde 1-okten-3-on (mantar kokusu), (Z)- 1,5-oktadien-3-on (jeranium kokusu), (E,Z)-2,6-nonadienal (salatalık kokusu) ve (E)- 2-nonenal (yeşil-çamur kokusu) en güçlü aroma-aktif bileşikler olduğu vurgulanmıştır. Öte yandan araştırmacılar, (Z)-3-hekzanalin pişmiş alabalığa kötü kokular kazandıran bir aroma maddesi olduğunu bildirmişlerdir. Chung ve Cadwallader (1994) mavi yengeçlerde (Callinectes sapidus) iki farklı ekstraksiyon yöntemi kullanarak elde ettikleri ekstraktlarda GC-Olfaktometri tekniği ile toplam 14 adet aroma aktif bileşik belirlemişlerdir. Aroma aktif bileşikler içerisinde, 2,3-bütandion, (Z)-4-heptenal, 2-asetil-1-pirrolidon ve 3-(metilthio)- propanal ın mavi yengeçlerin kendilerine has aromalarının oluşumundan sorumlu temel uçucu bileşikler olduğunu saptamışlardır. Olafsdöttir ve Fleurence (1998) balık kokularını bazı temel gruplar halinde sınıflandırmışlardır. Bu gruplar taze balık kokusu, mikrobiyal bozulma sonucunda oluşmuş kokular, oksidasyon sonucu oluşan kokular, çevreden kazanılmış kokular ve işleme esnasında oluşmuş kokulardır. Taze balık kokusu balığın avlanmasından sonra birkaç gün sürdüğü bildirilmiştir. Daha sonra oksidasyon ürünleri ve mikrobiyal metabolitlerin balığın aromasına hakim olduğunu saptamışlardır Taze balık kokusundan sorumlu olan bileşikler lipoksigenaz aktivitesiyle balığın doymamış yağ asitlerinden oluşan 6-, 8- ve 9- karbonlu aldehitler, ketonlar ve alkollerdir. 6- karbonlu bileşikler (hekzanal, (E)-2-hekzanal, (Z)-3-hekzanal) yeşil bitki ve ot benzeri kokuların oluşumundan sorumludurlar. Prost ve ark. (1998) GC-Olfaktometri tekniğiyle kalkan balığının aroma-aktif bileşiklerini belirlemişlerdir. Araştırmacılar kalkan balığında toplam 34 adet aroma aktif bileşik saptamışlardır. Bu bileşikler arasında trimetilamin (balık kokusu), 2,3- bütanedion (tereyağ), (Z)-4-heptenal (patates), 4-metil-2-pentanol (mantar), (E,Z)- 2,6-nonadienal (salatalık), and (E,E)-2,4-dekadienal (salatalık) in önemli aroma-aktif bileşikler olduğunu vurgulamışlardır. 7

18 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Gonca Gül ÇAYHAN Chinivasagam ve ark. (1998) 8 gün buz içinde depoladıkları tropikal karideslerin aroma bileşenlerini tepe boşluğu tekniğiyle analiz etmişlerdir. Karideslerde aroma bileşiklerinin trimetilamin, 2-metil-2-propanamin, 3-metil-butil hidroksilamin, o-2-metilpropil hidroksilamin, metil disülfit, karbon disülfit, metil metil sülfit, ve etil bütanoat tan oluştuğu bildirilmiştir. Bu bileşenlerin büyük bir çoğunluğunu karidesteki amino asitlerin ya da diğer biyolojik bileşenlerin bakteriler tarafından parçalanması sonucunda oluştuğu bildirilmiştir. Sağlık ve İmre (2001) ülkemizin 6 farklı balık örneğinin yağ asitleri kompozisyonunu gaz kromatografisi yöntemiyle belirlemişlerdir. Çalışmada balık örneklerinde baskın olarak bulunan yağ asitlerinin palmitik asit, oleik asit, eikosapentaenoik asit ve dokosahekzaenoik asit olduklarını tespit etmişlerdir. Amerikan istakozlarının (Homarus americanus) GC-Olfaktometri yöntemiyle aroma-aktif bileşiklerinin belirlenmesine yönelik bir araştırmada, istakozlardan aroma maddelerinin ekstraksiyonunda 4 farklı yöntem kullanılmıştır. Bunlar, doğrudan çözgen ekstraksiyonu, vakumlu buhar damıtma-çözgen ekstraksiyonu, statik tepe boşluğu ve dinamik tepe boşluğu ekstraksiyon yöntemleridir. Kullanılan 4 farklı ekstraksiyon yöntemleriyle örneklerde toplam 47 adet aroma-aktif bileşik belirlenmiştir. Bu bileşikler içerisinde 3-metil bütanal, 2,3-bütandion, 3-(metiltio)- propanal, 1-okten-3-on, 2-asetil-1-pirrolidon ve (E,Z)-2,6-nonadienal ın istakozların kendine has aromasından sorumlu en etkili aroma-aktif bileşikler olduğu bulunmuştur. Öte yandan araştırmada, metanthiol ve dimetil sülfit gibi çok uçucu özelliğe sahip aroma-aktif bileşiklerin ekstraksiyonunda tepe boşluğu tekniklerinin daha etkili olduğu bildirilmiştir (Lee ve ark., 2001). Chung ve ark. (2002) dondurulmuş ve kurutulmuş deniz taraklarında (Patinopecten yessoensis) aroma maddelerini inceledikleri bir çalışmada, deniz taraklarında toplam 157 adet aroma maddesi saptamışlardır. Aroma maddeleri ekstraksiyonunda Lickens-Nickerson ekstraksiyon sistemi kullanılmıştır. Aroma maddelerinin önemli bir kısmını ketonlar, alkoller ve aldehitler oluşturmuştur. Dondurulmuş ve kurutulmuş deniz taraklarında aroma maddeleri benzer olmasına rağmen, bu bileşiklerin miktarı kurutulmuş deniz taraklarında daha fazla bulunmuştur. 8

19 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Gonca Gül ÇAYHAN Japon balık sosu olan Ishiru nun uçucu bileşenlerinin tepe boşluğu tekniği ile araştırıldığı bir çalışmada Ishiru da toplam 51 adet aroma maddesi belirlenmiştir. Temel aroma maddeleri olarak aldehitler (2-metil propanol, 2-metil bütanal, 3-metil bütanal ve benzaldehit gibi), azotlu bileşikler (pirazin türevleri ve trimetil amin gibi), kükürtlü bileşikler (dimetil disülfit) ve ketonlar (2-bütanon ve 3-metil-2-bütanon gibi) saptanmıştır. Araştırmacılar, balık soslarında uçucu yağ asitlerinin oldukça iz düzeylerde olduğunu bildirmişlerdir (Michihata ve ark., 2002). Guillen ve Errecalde (2002) çiğ ve tütsülenmiş siyah mercan balığı (Brama raii) ve gökkuşağı alabalığınının (Oncorhynchus mykiss) uçucu bileşenlerini katı faz mikroekstraksiyon yöntemiyle ekstrakte edip, gaz kromatografisi kütle spektrometresinde bu bileşenleri tanımlamışlardır. Çiğ siyah mercan balığı, çiğ gökkuşağı alabalığına oranla daha fazla alkol, ester, hidrokarbon ve fenol türevlerini içermektedir. Her iki balıkta benzer miktarlarda doymuş aldehitler bulunmuştur. Tütsülenmiş her iki balık türünde tütsü kokusundan sorumlu olan temel bileşenlerin; fenol, guaiacol, ve syringol türevleri, ketonlar,asetik asit ve bazı polisilik aromatik hidrokarbonlar olduğu bildirilmiştir. Çelik ve Gökçe (2003) Çukurova Bölgesinde 5 ayrı tilapia türünün yağ asiti komposizyonlarını inceledikleri çalışmada, doğadan yakalanan tilapiaların kas dokusundaki toplam tekli doymamış, omega-3 (ω-3) ve omega-6 (ω-6) yağ asitleri, havuzda ve kafeslerde yetiştirilen diğer tilapia türlerine göre önemli düzeylerde yüksek olduğunu belirlemişlerdir. Machiels ve ark. (2003) İrlanda da iki farklı ticari sığır etinin uçucu bileşenlerinin analizini Gaz kromatografisi-olfaktometri (GC-O) analiz tekniğiyle araştırmışlardır. Analiz sonucunda sığır etinde 81 uçucu bileşen tanımlanmıştır. Öte yanda sığır etinde toplam 25 adet aroma aktif bileşik belirlenmiştir. Bu bileşikler içerisinde; metantiyol, dimetil sülfit, 2-bütanon, etil asetat, 2- ve 3-metilbütanol, 2- oktanon, dekanal ve benzothiazole, 2,3-pentanedion, 4-metil-3-penten-2-on, 2- heptanon, dimetil trisülfid ve nonanol aroma-aktif bileşikler olarak tanımlanmıştır. Depolama süresinin ringa (Clupea harengus membras) balıklarının aroma maddeleri üzerine depolama süresinin incelendiği bir çalışmada, bu balıklarda aroma maddelerinin önemli bir kısmını 2-metil bütanal, 3-metil bütanal ve hekzanal ın 9

20 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Gonca Gül ÇAYHAN oluşturduğu belirlenmiştir. 6ºC de 3 günlük depolama sonucunda, ringa balıklarındaki aroma maddelerinden 4-heptenal, 2-heptanon ve oktatrien miktarlarında önemli düzeylerde artış olduğu bildirilmiştir (Aro ve ark., 2003). Grigorakis ve ark. (2003) Yunanistan da avcılık yoluyla ve kültür ortamından elde edilen çipura balıklarının organoleptik özelliklerinin birbirinden farklı olduğunu ve avcılık yoluyla elde edilenlerin tüketiciler tarafından daha çok tercih edildiğini saptamışlardır. GC-MS ile yapılan uçucu bileşiklerin analiz sonuçları da her iki tür için oldukça farklılıklar göstermiştir. Kültür balık örneğinde 9 yüksek alkol, 8 keton, 3 terpen ve 12 aromatik hidrokarbon belirlenirken, avcılık yoluyla elde edilen örnekte ise 10 yüksek alkol, 9 keton, 7 terpen ve 13 aromatik hidrokarbon belirlenmiştir. Turchini ve ark. (2004) kahverengi alabalığının (Salmo trutta L.) uçucu koku bileşenleri üzerine yağ kaynaklı besinlerin etkilerini araştırmışlardır. Bu çalışmada yağ kaynaklı besinlerle (kontrol olarak balık yağı, kanola yağı (CO), olein yağı, kümes hayvanı yağı ve domuz yağı 70 gün süresince beslenen kahve rengi alabalıklarında oluşan uçucu koku bileşenleri belirlenmiştir. Yağ kaynağı olarak sadece balık yağı içeren balık yemiyle beslenen balıklarda tanımlanan toplam uçucu aroma bileşenleri daha yüksek bulunmuştur. Balık etinde bulunan toplam alkol ve aldehit miktarları kahverengi alabalık etinin n-3 çoklu doymamış yağ asitleri (PUFA) konsantrasyonuyla oranıyla ilgili olduğu vurgulanmıştır. Çeşitli yağ kaynaklı besinlerin kullanılması; balık etindeki yağ asidi kompozisyonun uçucu bileşenlerin toplam miktarı ve balık etinin kokusu üzerinde etkili olduğu bildirilmiştir. Yunanistan da avcılık ve yetiştiricilik yoluyla elde edilen çipura (Sparus aurata) balıklarının aroma maddeleri dinamik tepe boşluğu yöntemiyle araştırıldığı bir çalışmada, yetiştiricilik yoluyla elde edilen çipuralarda toplam 60 adet ve avcılık yoluyla elde edilenlerde ise toplam 78 adet aroma maddesi belirlenmiştir. Örneklerde aroma maddelerini aldehitler, ketonlar, terpenler, furanlar, sülfürlü bileşikler ve asitler oluşturmuştur (Alasalvar ve ark., 2005). Hallier ve ark. (2005) Avrupa ya özgü bir yayın türü olan Silurus glanis in pişmiş etinde bulunan uçucu bileşenleri üzerine yetiştirilme koşullarının etkisini araştırmışlardır. Örneklerdeki aroma maddeleri dinamik tepe boşluğu tekniğiyle 10

21 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Gonca Gül ÇAYHAN ekstrakte edilmiş ve tanımlama gaz kromatografisi- kütle spektrometresinde yapılmıştır. Aroma aktif bileşenler gaz kromatografisi-olfaktometri tekniğiyle belirlenmiştir. 60 uçucu bileşen belirlenmiş ve bunlardan 33 adedi aroma aktif bileşik olduğu saptanmıştır. Yetiştirme koşulları uçucu bileşenlerin konsantrasyonlarını ve koku özelliklerini etkilediği belirlenmiştir. Emonnot ve ark. (2005) deniz incirindeki (Microcosmus sulcatus) aroma aktif koku bileşenlerini gaz kromatografisi ve olfaktometri (GC-O) analizleriyle belirlemişlerdir. Deniz incirinin aroma aktif koku bileşenlerinin belirlemesinde OSME ve CHARM (Combined Hedonic Response Measurement) analiz teknikleri kullanılmıştır. OSME yöntemi ile 29 adet, CHARM ile 18 adet aroma-aktif bileşik saptanmıştır. Guillen ve ark. (2005) tütsülenmiş kılıç balığı (Xiphias gladus) ve marina balığının (Gadus morhua) etindeki uçucu bileşenleri sıvı faz mikroekstraksiyonu ve gaz kromatografisi-kütle spektrometresi ile belirlemişlerdir. Her iki türe ait tütsülenmiş balıkta keton, aldehit, alkol, asit, ester, hidrokarbon, eter, azot türevleri, fenol, guaiacol türevleri ve bazı klorinat kontaminantları belirlenmiştir. Selli ve ark. (2006) gökkuşağı alabalıklarının (Oncorhynchus mykiss) aroma aktif bileşiklerini GC-Olfaktometri tekniğini kullanarak belirlemişlerdir. Aroma maddelerinin ekstraksiyonunda vakumlu buhar damıtma tekniği kullanılmıştır. Araştırmacılar toplam 38 adet aroma-aktif bileşik saptamışlardır. Aroma aktif bileşikler arasında (E)-2-nonenal, 2-etil-1-hekzanol, 2-metilisoborneol, geosmin, 2- metil naftalen ve 8-heptadesen in gökkuşağı alabalıklarında kötü kokular kazandırdığını vurgulamışlardır. Aroma aktif bileşiklerin belirlenmesinde aroma yoğunluğu ve belirlenme sıklığı teknikleri kullanılmıştır. Fas ın Atlantik kıyılarında avlanan Bakalyaro (Merluccius merluccius) balıklarının karakteristik kokusunun 20 farklı aroma-aktif bileşikten oluştuğu saptanmıştır. Öte yandan, bu balık türlerinde mikrobiyolojik bozulmalar sonucunda trimetilamin ve dimetil-3-sülfit gibi aroma maddeleri oluştuğu bildirilmiştir (Triqui, 2006). Duflos ve ark. (2006) HS-MS ve SPME/GC/MS teknikleriyle morina (Merlangius merlangus) ve uskumru balığındaki (Scomber scombrus) uçucu 11

22 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Gonca Gül ÇAYHAN bileşikleri ve bu bileşiklerdeki zamana bağlı değişimlerini incelemişlerdir. HS tekniğiyle tanımlanan 20 bileşiğin depolama sonucu oluştuğunu bildirmişlerdir. Tatlı sularda yaşayan balıklarda uygulanan diyetler balıkların kimyasal ve duyusal özelliklerini etkilemektedir. Bu balıkların yetiştirilmesinde kullanılan besin maddelerinin fazla miktarda n-6 yağ asitleri içermesi, balıklarda n-6 yağ asitleri ve bu yağ asitlerinden oluşan uçucu aldehitlerin miktarında artışlara neden olduğu gözlemlenmiştir (Turchini ve ark., 2007). Edirisinghe ve ark. (2007) sarı-yüzgeçli orkinos (Thunnus albacares) balığının aroma maddeleri içeriğini katı faz mikro ekstraksiyon tekniği ile ekstrakte edip, GC-MS ile belirlemişlerdir. Araştırmacılar, aroma maddeleri içerisinde hekzanal ve 2-nonanon un miktar olarak en fazla olduğunu bildirmişlerdir. Öte yandan, depolama süresine bağlı olarak bu balıklarda 3-metil-1-bütanol ve 3- hidroksi-2-bütanon miktarında artış meydana geldiğini vurgulamışlardır. Tuzlanarak kurutulan beyaz ringa (Ilisha elongata) balıklarında GC- Olfaktometrik analizler sonucu 3-metil bütanal (badem kokusu), metantiol (sebze), dimetil-3-sülfit (samırsak, soğan) hidrojen sülfit (bozulmuş yumurta), trimetil amin (balık, balık yağı), bis(metiltio) metan (samırsak, soğan) ve (Z)-4-heptenal (yağ benzeri) in aroma aktif bileşikler olduğu bildirilmiştir. Çalışmada aroma maddeleri ekstraksiyonunda statik tepe boşluğu yöntemi kullanılmıştır (Chung ve ark., 2007). El Hattab ve ark. (2007) kahverengi alglerin (Dictyopteris membranacea) uçucu bileşiklerini buharlı damıtma, mikrodalga yardımıyla buharlı damıtma ve süper kritik akışkan yöntemi olmak üzere 3 farklı ekstraksiyon tekniği ile izole etmişler ve elde edilen sonuçları karşılaştırmışlardır. Araştırma sonucunda, C-11 hidrokarbonlar buharlı damıtma yöntemiyle, terpen bileşikleri mikrodalga yardımıyla buharlı damıtma yöntemiyle ve sülfür bileşikleri ile süper kritik akışkan yöntemiyle en uygun olarak izole edildiklerini belirlemişlerdir. Araştırmacılar ayrıca, aroma maddeleri analizlerinde ekstraksiyon yöntemi seçimi ve bu yöntemin optimizasyonunun, sonuçların güvenilirliği açısından çok önemli parametreler olduğunu vurgulamışlardır. Yanar ve ark. (2007) kültür ortamından elde edilen çipura balığının (Dicentrarchus labrax) yağ asiti kompozisyonuna pişirme tekniklerinin etkisini 12

23 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Gonca Gül ÇAYHAN araştırmışlardır. Çiğ çipura balığının yağ asitlerinin temelini, doymuş yağ asitlerinden miristik (14:0), palmitik (16:0) ve stearik (18:0); monoenlerden palmitoleik (16: 1n-7) ve oleik (18:1n-9cis) ve çoklu doymamış yağ asitlerinden linoleik (18: 2n-6cis), eikosapentanoik (C20:5n-3) ve dokosahekzaenoik asit (C22:6n-3) in oluşturduğunu bildirmişlerdir. Araştırmacılar, farklı pişirme tekniklerinin çipura balığının yağ asidi kompozisyonuna önemli derecede etkilemediğini vurgulamışlardır. Ganeko ve ark. (2008) sardalya balıklarında GC-MS ve GC-Olfaktometri cihazlarıyla aroma ve aroma-aktif bileşikleri belirlemişlerdir. Taze sardalya balıklarında aroma maddeleri katı faz mikro ekstraksiyon tekniği ile ekstrakte edilmiş ve toplam 33 adet (8 hidrokarbon, 5 keton, 1 furan, 1 kükürt bileşiği, 12 aldehit ve 6 alkol bileşiği) aroma maddesi saptanmıştır. Bu bileşikler içerisinde 2,3- pentadion, hekzanal ve 1-penten-3-ol sardalya balıklarının temel aroma maddeleri olarak saptanmıştır. GC-Olfaktometri tekniği ile balıklara 1-penten-3-ol ül boya kokusu, 2,3-pentadion un karamel kokusu, hekzanal in yeşilimsi bitki kokusu, (Z)-4- heptanal in deniz kokusu, oktanal in turunçgil kokusu, 1-okten-3-ol ün mantar kokusu kazandırdığını saptanmışlardır. Jonsdottir ve ark. (2008) tütsülenmiş somon balığındaki (Salmo salar) uçucu bileşikleri GC-MS ile tanımlamışlardır. Bu balıkta tütsülenmeden kaynaklanan furan bileşikleri, depolama sonucunda oluşan 2-bütanon, 3-metil-1-bütanol, etanol ve asetik asitin oksidasyonuyla oluşan 1-penten-3-ol, hekzanal, nonanal ve dekanalin önemli aroma maddeleri olduğunu bildirmişlerdir. Selli ve ark. (2008) alabalıklardaki (Oncorhynchus mykiss) aroma-aktif ve kötü kokulu bileşikleri mikro dalga damıtma-çözgen ekstraksiyon tekniğiyle ekstrakte edip, GC-MS-O tekniğiyle belirlemişlerdir. Çalışmada apolar (DB-5) ve polar (DB-Wax) özellikte iki farklı kapilar kolon kullanmışlardır. Belirledikleri bileşikler arasında nonanal, (E,E)-2,4-oktadienal, 2-metilizoborneol ve geosminin en önemli aroma-aktif bileşikler olduğunu saptamışlardır. Caprino ve ark. (2008) kültür ortamından elde edilen beyaz mersin balığının (Acipenser transmontanus) havyarlarında yağ asitlerinden; palmitik asit, oleik asit, dokosahekzanoik asit ve eikopentaenoik asitin baskın olduğunu bildirmişlerdir. 13

24 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Gonca Gül ÇAYHAN Buharlı-distilasyon-ekstraksiyon yöntemiyle yapılan uçucu bileşik analizinde ise, havyarlarda 33 adet aroma maddesi belirlenmiş ve bileşikler içerisinde aldehitler toplam aroma maddelerinin %60 nı oluşturmuştur. Moncheva ve ark. (2004) deniz canlılarındaki antioksidan kapasitenin balığın beslenmesi ve yaşadığı ortam ile yakından ilişkili olduğunu ve suyun bileşimine bağlı olarak canlılardaki polifenollerin ve buna bağlı olarak da antioksidan kapasitenin arttığı bildirmişlerdir. Araştırmacılar ayrıca bu durumun canlıların yaşadığı yerle ilişkiyi belirleyen bir marker olduğunu açıklamışlardır. 14

25 3. MATERYAL VE METOD Gonca Gül ÇAYHAN 3. MATERYAL VE METOD 3.1. Materyal Bu çalışmada Adana ilinin Akdeniz e kıyısı bulunan Karataş ilçesinden avcılık yoluyla elde edilen kefal (Mugil cephalus) balıkları kullanılmıştır (Resim 3.1) Nisan ayında avlanan balıklar ortalama 30 cm boyunda ve yaklaşık 200 g ağırlığındadır. Her bir aroma analizi için beş farklı balık örneği kullanılmıştır. Aynı gün avlanan balıklar buz içerisinde Ç.Ü. Gıda Mühendisliği bölümüne getirilerek aroma maddeleri analizleri ve diğer kimyasal analizleri yapılmıştır. Resim 3.1. Analizlerde kullanılan kefal balığı (Mugil cephalus) 15

26 3. MATERYAL VE METOD Gonca Gül ÇAYHAN 3.2. Metod Aroma Maddeleri Analizleri a) Balıklarda Aroma Maddelerinin Ekstraksiyonu Balıklarda aroma maddelerinin ekstraksiyonunda Likens-Nickerson buharlı distilasyon-ekstraksiyon tekniği kullanılmıştır (Şekil 3.1). Önceki çalışmalarda balık ve diğer deniz ürünlerinde bu ekstraksiyon tekniği başarılı sonuçlar vermiştir (Le Guen ve ark., 2000; Prost ve ark., 1998; Varlet ve ark., 2006). A B Şekil 3.1. Likens-Nickerson Ekstraksiyon Düzeneği 16

27 3. MATERYAL VE METOD Gonca Gül ÇAYHAN (Resim 3.2). Başlangıçta balık örneklerinin iç organları çıkarılmıştır ve kafaları ayrılmıştır Resim 3.2. Balık örneğinin analizlere hazırlanması Daha sonra örnekler mekanik parçalayıcı da ufak parçalar halinde homojenize edilmiştir. Her bir aroma ekstraksiyonu için 30 g balık örneği kullanılmıştır. Homojenize edilen 30 g balık örneği ve 60 ml % 30 luk NaCl Şekil 1 de görüldüğü gibi 1000 ml lik damıtma balonu içerisine alınmıştır ve diğer 500 ml lik damıtma balonuna ise 25 ml çözgen (başlangıçta çözgen seçiminde temsili test uygulanmıştır ve diklorometan ve dietileter çözgenlerinden balık örneğine en yakın aroma ekstraktını veren çözgen olarak diklorometan tercih edilmiştir ve aroma maddeleri analizlerinde bu çözgen kullanılmıştır) ve iç standart olarak 40 μg 4-nonanol ilave edilmiştir. Her iki balon ısıtıcıya yerleştirilmiştir ve daha sonra yaklaşık 3 saat süren ekstraksiyon işlemi başlatılmıştır (Resim 3.3). 17

28 3. MATERYAL VE METOD Gonca Gül ÇAYHAN Resim 3.3. Aroma maddeleri ekstraksiyon düzeneği Bu işlem sonucu aroma maddelerini içeren çözgen fazı alındıktan sonra "Vigreux" konsantrasyon düzeneğinde (Resim 3.4) ve mikro konsantrasyon düzeneğinde (Resim 3.5) 45 C'de 1 ml kalıncaya kadar konsantre edilmiştir. Konsantre halde elde edilmiş sıvı doğrudan GC-FID, GC-MS ve GC-O sistemlerine enjekte edilerek serbest aroma maddeleri ve aroma aktif bileşikler belirlenmiştir. Ekstraksiyonlar dört tekerrürlü yapılmıştır. 18

29 3. MATERYAL VE METOD Gonca Gül ÇAYHAN Resim 3.4. Ekstraktın Vigreux düzeneğinde konsantre edilmesi Resim 3.5. Ekstraktın mikro konsantrasyon düzeneğinde konsantre edilmesi 19

30 3. MATERYAL VE METOD Gonca Gül ÇAYHAN b) GC-FID, GC-MS ve GC-O Koşulları Aroma maddelerinin miktarı, tanımlanması ve aktif bileşiklerin belirlenmesi Agilent 6890N marka gaz kromatografisi, buna bağlı Agilent 5975B VL MSD kütle spektrometresi ve Gerstel ODP-2 marka olfaktometride eş zamanlı olarak gerçekleştirilmiştir. Bu sistemde kolon çıkışı özel bir ayırıcı (Dean switch-agilent) yardımıyla eşit olarak üçe ayrılmıştır; birinci kısım FID ye, ikinci kısım MSD ye ve üçüncü kısım olfaktometriye gitmiştir. Böylece aynı zamanda yapılan miktar tayini, tanımlama ve koklama işlemiyle analizin hassasiyeti artırılmıştır. Aroma maddelerinin miktar tayininde, Agilent 6890N marka alev iyonlaşma dedektörlü (FID) gaz kromatografisi kullanılmıştır. Aroma maddelerinin ayrımı DB-WAX kapiler kolon (60 m x 0.25 mm x 0.4 µm) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Enjektör sıcaklığı 220 o C, dedektör sıcaklığı 250 C, kolon sıcaklığı, 60 C de 3 dakika beklemeden sonra, dakikada 2 C artarak 220 C ye ve daha sonra dakikada 3 C artarak 245 C ye çıkacak ve bu sıcaklıkta 20 dakika sabit kalacak şekilde programlanmıştır. Cihaza enjekte edilecek miktar 3 µl dir. Taşıyıcı gaz olarak He kullanılmıştır. Helyumun akış hızı 1.5 ml/dakika olmuştur. Dedektör ve enjektör sıcaklıkları 250 o C olmuştur. GC-Olfaktometri analizleri Agilent 6890N marka gaz kromatografisine bağlı gerçekleştirilmiştir (Resim 3.6). Olfaktometrik analizinde Aroma Ekstrakt Seyreltme analizi (AEDA : Aroma extract dilution analysis) kullanılmıştır (Milo ve Grosch, 1993; Grosch 2001). Koklama sırasında burun içinin kurumaması için özel bir düzenek yardımıyla olfaktometri portuna nemli hava verilmiştir ve bu sayede panelistin kokulara duyarlılığı artırılmıştır. 20

31 3. MATERYAL VE METOD Gonca Gül ÇAYHAN Resim 3.6. Analizlerde kullanılan GC-MS-Olfaktometri sistemi Aroma maddelerinin tanısında yukarıda belirtilen gaz kromatografisine bağlı Agilent 5975B VL MSD marka kütle spektrometresi kullanılmıştır. Enjektör tipi ve sıcaklık programı gaz kromatografisi ile aynı koşulları taşımıştır. Taşıyıcı gaz olarak kullanılan helyumun hızı 1.5 ml/dk olmuştur. Kütle spektrometresinin iyonlaşma enerjisi 70 ev, iyon kaynağı sıcaklığı 250 C, kuadrupol sıcaklığı 120 C tutularak, 1 saniye aralıklarla kütle/yük (m/e) arasında tarama yapılmıştır. Piklerin tanısı, standardı bulunan bileşikler için standart çözelti enjekte edilerek, standardı olmayan bileşikler için kütle spektrumunun bilgisayar hafızasındaki aroma maddeleri kütüphanelerindeki (Wiley 7.0, NIST-98, ve Flavor.2L) kütle spektrumlarıyla karşılaştırılması yoluyla yapılmıştır. Piklerin tanısından sonra aroma maddelerinin konsantrasyonları iç standart yöntemiyle hesaplanmıştır (Schneider ve ark., 2001). 21

32 3. MATERYAL VE METOD Gonca Gül ÇAYHAN c) Aroma Maddelerinin Miktarlarının Hesaplanması Piklerin tanısından sonra aroma maddelerinin miktarlarını hesaplamak için, standart bileşiklerden kalibrasyon eğrileri elde edilerek ve iç standart yöntemiyle aşağıdaki formül kullanılarak miktarlar hesaplanmıştır. Hesaplamada her bir bileşiğin cevap faktörü dikkate alınmıştır. C i = (A i /A st ) x C st x RF x HF C i : Bileşiğin konsantrasyonu A i : Bileşiğin pik alanı A st : İç standartın pik alanı C st : İç standartın konsantrasyonu (40 µg/l00 ml) RF : Cevap faktörü HF : Hesaplama faktörü (örnek miktarının kg a çevrilmesi için faktör: 10). d) Duyusal Analizler (Temsili (representative) test) -Panel: Araştırmada kullanılacak balıklar ve bunlardan elde edilen aroma ekstraktlarının aroma karakteristikleri temsili (representative) test kullanılarak yapılmıştır. Duyusal değerlendirmeler Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümünde gerçekleştirilmiştir. Balık örneklerinin ve bunların ekstraktlarının duyusal analizleri 7 kişilik panelist grubu tarafından yapılmıştır. -Örneklerin hazırlanması ve panelistlere sunumu: Balık örnekleri bir mekanik parçalayıcı ile parçalandıktan sonra elde edilecek örnekten 1,5 g alınmıştır ve 25 ml lik kahverengi kapaklı cam şişeler içerisinde özel olarak kodlandıktan sonra panelistlere sunulmuştur. Balıklarda aroma maddeleri ekstraksiyonunda iki farklı çözgen (diklorometan, ve dietileter) kullanılmıştır. Bu çözgenlerle elde edilen ekstraktlar özel kağıt koklama çubuklarına (SARL H.Granger-Veyron, France) 22

33 3. MATERYAL VE METOD Gonca Gül ÇAYHAN absorbe edildikten sonra 1 dakika bekletildikten sonra çözgenlerin uçması sağlanmıştır (Resim 3.7). Daha sonra bu koklama çubukları da, balık örnekleri gibi iki farklı 25 ml lik kahverengi kapaklı cam şişeler içerisine konularak panelistlere sunulmuştur (Resim 3.8). Resim 3.7. Duyusal analizlerde kullanılan kağıt koklama çubukları Daha sonra panelistlerden temsili test ve aroma profil analizleri için balık örnekleri ve ekstraktlarının karşılaştırılması istenmiştir. Sonuçta aroma maddelerinin ekstraksiyonu ve aynı zamanda olfaktometrik analizler için de en uygun çözgen belirlenmiş olmuştur. Temsili test değerlerinin saptanmasında benzerlik testi (Şekil 3.2) ve aroma yoğunluk testi uygulanmıştır (Şekil 3.3). 23

34 3. MATERYAL VE METOD Gonca Gül ÇAYHAN Resim 3.8. Duyusal analizlerde kullanılan kahverengi cam şişeler. -Benzerlik testi: Panelistlerden bu testte, balık örnekleri ile bu örneklere ait ekstrakt kokularının birbirine ne kadar benzer olduğunu belirlemeleri istenmiştir. Bu amaçla aşağıdaki 100 mm lik bir skala kullanılmıştır. Panelistler tarafından skalanın sağına doğru işaretleme yapıldığında örnek ile ekstraktının kokusu birbirine daha çok benzemektedir (Van Ruth ve ark., 1995). Koku çok farklı Koku çok benzer Şekil 3.2. Benzerlik testinde kullanılan skala -Aroma youğunluk testi: Benzerlik testinde olduğu gibi bu kez panelistlerden balık örnekleri ile bu örneklere ait aromatik ekstrakt kokularının yoğunluklarının karşılaştırılması istenmiştir. Bu amaçla da aşağıdaki 100 mm lik bir skala kullanılmıştır. 24

35 3. MATERYAL VE METOD Gonca Gül ÇAYHAN Koku az yoğun Koku çok yoğun Şekil 3.3. Aroma yoğunluk testinde kullanılan skala Her iki testten elde edilen veriler varyans analizi ile (Statgraphics Plus Software, MD-USA) değerlendirilmiştir Balıklarda Antioksidan Kapasitenin Belirlenmesi Balık örneklerinin antioksidan aktiviteleri serbest radikalleri önleme yeteneğini ölçebilen DPPH (2,2, difenil 1-pikri hidrazil) kullanılarak ve metanol içerisinde gerçekleşen reaksiyonun zamana karşı değişiminin 515 nm de UV-Vis (Schimadzu- UV1201-Kyoto-Japan) spektrofotometredeki ölçüm sonuçlarına göre yapılmıştır (Sanchez ve ark., 1998) Balıklar Üzerinde Yapılan Diğer Analizler Balıklarda genel analizler olarak ph değeri, nem içeriği, ham kül miktarı saptanmıştır. ph değeri, homojenize edilmiş örnek 1:1 oranında distile su ile sulandırıldıktan sonra dijital bir phmetre ile ölçülmüştür. Kurumadde içeriği balık örneklerinin 103ºC de 4 saat bekletilerek ölçülmüştür ve sonuçlar 1000 g balık örneğinde g kurumadde olarak verilmiştir. Ham kül miktarı ise kül fırınında 550 ºC de 4 saat bekletilerek ölçülmüştür ve kül miktarı g/1000g olarak hesaplanmıştır (Yanar ve Fenercioğlu, 1999). 25

36 3. MATERYAL VE METOD Gonca Gül ÇAYHAN Sonuçların Değerlendirilmesi ve İstatistiksel Analizler Balıklara uygulanan analizler sonucunda elde edilen bulgular, SPSS 13.5 paket programı kullanılarak varyans analizine tabi tutularak ve önemli bulunan farklılıklar Duncan çoklu karşılaştırma testine göre değerlendirilmiştir (Özdamar, 1999). 26

37 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Gonca Gül ÇAYHAN 4. ARAŞTIRMA BULGULARI ve TARTIŞMA 4.1. Kefal Balığının Genel Bileşimi ve Antioksidan Kapasitesi Genel bileşimi Çizelge 4.1 de görüldüğü gibi kefal balığında kurumadde miktarı g/kg, ph 5.64 ve kül g/kg olarak belirlenmiştir. Yapılan araştırmalarda gökkuşağı alabalıklarındaki (Salmo gairdneri) kurumadde miktarının g/kg, ph nın 6.12 ve kül miktarının ise 13.1 g/kg olduğu bildirilmiştir (Kolsarıcı ve Özkaya, 1996). Benzer şekilde, Kılınççeker ve Küçüköner (2003) inci kefalinin (Chalcalburnus tarichi) ph nın 6.5, kül miktarının ise 18 g/kg olduğunu bildirmişlerdir. Çizelge 4.1 Kefal balığının genel bileşimi Analizler Kuru madde (g/kg) ±1.29 ph 5.64±0.05 Kül (g/kg) 14.7± Antioksidan kapasitesi Balık örneğindeki antioksidan kapasitenin belirlenmesinde DPPH metodu kullanılmıştır. DPPH metodu, lipid oksidasyonunu önleyen antioksidanlar için genel olarak kabul edilmiş bir metottur. Diğer metodlarla karşılaştırıldığında; DPPH serbest kök bağlama metodu, antioksidan aktivitelerin nisbi olarak kısa zamanda belirlenmesini sağlamaktadır. Antioksidanların DPPH serbest kökünü bağlama etkilerinin, bunların hidrojen (H) iyonu verme yeteneklerinden kaynaklandığı düşünülmektedir. DPPH serbest kök bağlama metodunda, örneklerin H iyonu verme kapasiteleri, stabil bir serbest kök DPPH kullanılarak araştırılmaktadır. H iyonu 27

38 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Gonca Gül ÇAYHAN verme yatkınlığı olan bir bileşiğin varlığında DPPH kökü indirgenir ve stabil serbest form oluşur (Wang ve ark., 1998). Balık örneğinin antioksidan aktivitesi fenol bileşenlerinin serbest radikalleri önleme yeteneğini ölçebilen DPPH (2,2, difenil 1-pikri hidrazil) kullanılarak ve metanol içerisinde gerçekleşen reaksiyonun zamana karşı değişiminin 515 nm de UV-Vis spektrofotometredeki ölçüm sonuçlarına göre yapılmıştır. Başlangıç DPPH konsantrasyonunun % 50 azaltmak için gereken örnek konsantrasyonu (EC50), antioksidan aktiviteyi saptamada sıklıkla kullanılan bir yöntemdir. Düşük EC50 değeri yüksek antioksidan aktiviteyi gösterir. TEC50 değeri ise EC50 konsantrasyonunun sabit hale gelmesi için gerekli süreyi göstermektedir. Diğer bir parametre ise anti radikal etkinlik (AE=1/EC50) veya anti radikal güçtür (ARP). Antiradikal etkinliğin yüksek olması örneklerde antioksidan aktivitenin yüksek olması anlamına gelmektedir. Resim 4.1. DPPH radikali ile balık örneğinden elde edilen ekstraktın reaksiyonu Balık örneğinin farklı konsantrasyonlarının zamana bağlı antioksidan kapasitesindeki değişim Şekil 4.1 de görülmektedir. Balık örneğinin EC 50 değeri 85 g/mg DPPH), TEC dakika ve antioksidan kapasitesi 7.00 (AEx10-5 ) olarak belirlenmiştir. Soldera ve ark. (2008) balıklarda kullanılan farklı ticari tütsü aromalarındaki toplam fenol bileşiklerinin 28

39 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Gonca Gül ÇAYHAN 3000 ile 25000mg/kg, EC50 değerinin g/g DPPH ve antiradikal etkinliğin ise (AE) x10 3 arasında değiştiğini belirlemişlerdir. Yapılan çalışmalarda deniz canlılarındaki antioksidan kapasitenin balığın beslenmesi ve yaşadığı ortam ile yakından ilişkili olduğu ve suyun bileşimine bağlı olarak canlılardaki polifenollerin ve buna bağlı olarak da antioksidan kapasitenin arttığı bildirilmiştir. Ayrıca bu durumun canlıların yaşadığı yerle ilişkisini belirleyen bir marker olduğunu açıklamışlardır (Moncheva ve ark. 2004). Şekil 4.1. Balık örneğinin DPPH reaktifi ile gösterdiği antioksidan aktivite değişimi 4.2. Temsili (representative) Test Yöntemiyle Aroma Ekstraksiyonunda Kullanılan Çözgenin Seçimi Aroma maddelerinin ekstraksiyonunda kullanılacak çözgenin seçiminde aroma benzerliği ve yoğunluğunu içeren temsili test yöntemleri kullanılmıştır. Bu testlerde iki farklı çözgenle (diklorometan ve dietil eter) elde edilen aroma ekstraktları elde edildikleri balık örneği ile panelist grubu tarafından kıyaslanmıştır. Duyusal değerlendirmeler Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Gıda Mühendisliği Bölümünde gerçekleştirilmiştir. Örneklerin duyusal analizlerine 7 kişilik bir panelist grubu katılmıştır. Temsili test yöntemiyle elde edilen sonuçlar Çizelge 4.2 de verilmiştir. 29