GÜVENLİ VE ETKİN LABORATUVAR UYGULAMALARI 111-546 ELEKTROFOREZ Doç. Dr. Hilâl Özdağ Elektroforez Yüklü moleküllerin bir elektrik alanı içinde yürütülerek ayrıştırılması tekniğine elektroforez denir. DNA, RNA ve Protein molekülleri ile yapılan çalışmaların öncelikle basamakları arasında yer alır. 1
Temel Kurallar Jel tankında işlem yapmadan önce güç kaynağını kapattığınızdan emin olun. Yükleme ve yürütme yapmadan önce jelinizin iyice polimerleştiğinden emin olun. Neyi hangi sırayla yüklediğinizi hemen kaydedin: Bunun için yüklediğiniz örneklerin tüplerini tüplüğün üzerinde yükleme sırasıyla deney bitip siz bunların sırasını kaydedinceye dek muhafaza edin. EtBr veya toz akrilamid kalıntılarına karşı muhakkak eldiven giyin. Temel Kurallar Jelinizi erittikten sonra EtBr ekleyin. EtBr eklenmiş jel solüsyonunu eritip kaynatmayın. Kullanılmış jelinizi jel tankının içinde bırakmayın. Kullanılmış jelleri jel atık çöpüne atın. Jel tankının içindeki tampon çözelti defalarca kullanılabilir. Ancak bu tamponun kullanım sıklığına bağlı olarak birkaç günde bir boşaltılıp karıştırılması ve buharlaşan kısmı kadarının taze tamponla doldurulması gerekir. Jel tankının en az haftada bir boşaltılıp yıkanması ve distile sudan geçirilmesi tankın platin tellerinin uzun ömürlü olması açısından gereklidir. Zira yıkanmadığı takdirde zaman içinde tamponun için tuz platin teller üzerinde birikecektir. 2
Temel Kurallar Jelinizi yürütmeye başlamadan önce kutupların doğru bağlandığından emin olun. En doğrusu jeli yürütmeye başladıktan sonra 0.5-1 dak bekleyip yürümenin doğru yönde olduğundan, akımın geçtiğinden emin olmaktır. Örnek hazırlama Örnekler yükleme solüsyonu ile jele yüklenirler. Yükleme solüsyonunun içinde örneğin kuyulara oturmasını sağlayan ağır bir molekül (sukroz, ficoll, gliserol) ile yürümeyi takip etmeyi mümkün kılan indikatör bir boya(bfb, XC) bulunur. Yüklemesolüsyonuuzundönemiçin-20 o C debölünereksaklanmalıdır. Kullanımdaki yükleme solüsyonu oda ısısında kararlılığını uzun süre muhafaza edecektir. 3
Standartlar/Belirteçler Moleküler ağırlık belirteçleri muhakkak jele dahil edilmelidir. Bunların jele yüklenmesi hem jelin ve elektroforezin kalitesini standardize edecek hem de örneklerin yorumlanmasını mümkün kılacaktır. Yüklenecek belirteç analiz edilecek örneklere uygun olarak seçilmelidir. Moleküler ağırlık belirtecinin yürüme profili belirtecin kullanım kılavuzundan alınarak lab defterine, jel dokümantasyon sisteminin yanına konmalı, gerektiğinde kolayca kontrol edilebilmelidir. Gerektiğinde ve mümkün olduğunda jele pozitif ve negatif kontroller yüklenmelidir. Elektroforez Tipleri Agaroz jeller genellikle yatay iken akrilamid jeller dikey olarak yürütülür. Jeller farklı ebatta olabilir. Dizileme jelleri büyük olmak zorundadır ancak tarama ve transfer için kullanılan jeller mini veya midi boyutta tercih edilir. Kapiller elektroforezde ince kapillerler için DNA, RNA, proteinleri otomatik olarak yüksek verimde ayrıştırılırlar. Ayrışma kromatografide olduğu gibi tespit ve analizle beraber gerçekleşir. 4
Jel Tipleri Agaroz ve akrilamid her ikisi de porlu yapıdadır. Yüzdeleri ne kadar yüksekse por çapı o kadar küçülür. Gerekli ayarlamalar yapıldığında her ikisinde de DNA, RNA ve Protein incelenebilir. Düşük konsantrasyondaki akrilamid jelleri manipüle etmek zordur. Düşük konsantrasyondaki agaroz jellerin manipülasyonu daha kolaydır. Jel konsantrasyonunun ilgilenilen fragmentin boyutuna uygun olması gerekir. Önceden dökülmüş hazır akrilamid jeller birçok firma tarafından üretilmektedir. Bu jeller buzdolabında aylarca bozulmadan kalabilir. Yürütme Tamponları Yürütme tamponları konsantre olarak (5X veya 10X) hazırlanır. 0.5X veya 1X konsantrasyonda kullanılır. Her tamponun belirli bir amperde belirli bir voltajı vardır. Kullandığınız tamponun özelliklerini farkedin, öğrenin ki problem oluştuğunda teşhis edin. 5
Güç Kaynağı Güç kaynağının çıkışı sabit voltaj (mv), sabit akım (amps) veya sabit güç (W) şeklinde olabilir. Birçok güç kaynağı modelinde bu modlar arasında otomatik değişimler mümkündür. Her güç kaynağı sizin için uygun olmayabilir. Deneyiniz için gerekli olan amper veya voltu öğrenin ve buna uygun güç kaynağını seçin. Dizileme jelleri yüksek wattlı, elektroforetik transferler yüksek akımlı ve agaroz veya akrilamid jel elektroforezleri geniş voltaj aralıklı güç kaynaklarına ihtiyaç duyar. DNA, RNA ve protein jellerinde örnekler eksiden artıya yürürler. Eksi (katod) siyaha, artı(anod) kırmızıya bağlanmalıdır. Güç Kaynağı Güç kaynağının zaman ayarı varsa mutlaka kullanın yoksa jelinizi yürütmeye başladıktan sonra kronometrenizi ayarlayın. Özellikle küçük fragmentleri unutup fazla yürütüp jelden kaybetmeniz mümkündür. Güç kaynağını kapatmadan jel tankına müdahale etmeyin! 6
Fiksasyon Boyanacak jellerin boyamadan önce fikse edilmesi gerekmekdir. Fiksasyon jellerin şişmesini engellediği gibi örneklerin denatürasyonunda da etkindir. Kurutma Jeller jel kurutucuda ısı ve vakum altında kurutulur. Otoradyografide daha keskin bant verir. Jellerin uzun yıllar saklanmasına imkan verir(gümüş Boyama) 7
Kurutma Jeller jel kurutucuda ısı ve vakum altında kurutulur. Otoradyografide daha keskin bant verir. Jellerin uzun yıllar saklanmasına imkan verir(gümüş Boyama) Boyama Agaroz jel içine EtBr eklenerek DNA ve RNA jellerinin boyanması sağlanır. DNA yürütülen poliakrilamid jelleri yürütme sonrasında jelin ebadına göre EtBR veya gümüş nitrat ile boyanır. Protein jelleri de elektroforez sonrası gümüş nitrat veya coomasie mavisi ile boyanır. 8
Belgeleme Poloroid fotoğraf Dijital dokümantasyon: Lazer yazıcı veya termal yazıcı. Termal yazıcı çıktısının rezolüsyonu çok daha yüksektir. Otoradyografi veya kemilüminesens sonuçları X-Ray film üzerine alınabilir. Belgeleme Poloroid fotoğraf Dijital dokümantasyon: Lazer yazıcı veya termal yazıcı. Termal yazıcı çıktısının rezolüsyonu çok daha yüksektir. Otoradyografi veya kemilüminesens sonuçları X-Ray film üzerine alınabilir. 9
DNA Jelleri http://a32.lehman.cuny.edu/molbio_course/gelel.gif DNA Jelleri 6X yükleme solüsyonu: %30 (V/V) gliserol, %0.25 (W/V) BFB, %0.25 XC distile su içinde hazırlanır. 10
DNA Jelleri DNA Jelleri 11
DNA JELLERİ Agaroz Jel Elektroforezi Denatüre edici olmayan (Native) Denatüre edici (Formaldehitli) Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE) Denatüre edici olmayan (Native) Denatüre edici (Üreli) Kapiller Elektroforez (CE) Denatüre edici olmayan (Native) Denatüre edici ELEKTROFOREZ Elektroforezde nükleik asitler boy ve konformasyonlarına göre yürür. Denatüre edici olmayan (native) ortamda DNA ve RNA daha ziyade konformasyonlarına bağlı olarak yürür. Denatüre edici ortamda ise bu moleküller ikincil yapı oluşturamayacakları için moleküler ağırlıklarına göre yürürler. 12
ELEKTROFOREZ Agaroz Jel Elektroforezi Denatüre edici olmayan(native) Büyük moleküler ağırlıklı DNA yürütülecekse (genomik DNA gibi)%0.8-1 arası jel hazırlanmalıdır. PCR örneklerinin kontrolünde (100 bç- birkaç kb arası) %2 lik jele ihtiyaç vardır. RFLP benzeri uygulamalarda birbirinden 10-20 bç farklı fragmentleri ayırmak için NuSieve benzeri agaroz türevleri ile rezolüsyon arttırılabilir. Metaphor agaroz ile 3-4 bç farkı ayırmak mümkündür. ELEKTROFOREZ Agaroz Jel Elektroforezi Agaroz jeller TBE (Tris Borik asit EDTA) veya TAE (Tris Asetik asit EDTA) ile hazırlanır. DNA düşük voltajda uzun yürütmek gerektiğinde (RE ile kesilmiş genomik DNA yı Southern öncesi yürütmek gibi) TAE tamponu uygundur. Kısa süreli yüksek voltajda yürütmek için TBE seçilmelidir. 13
ELEKTROFOREZ Agaroz Jel Elektroforezi TBE 5X veya 10X konsantrasyonda hazırlanıp 1X konsantrasyonda kullanılır. Uzun süre beklediğinde çökelti oluşturur. TAE 50X konsantrasyonda hazırlanabilir. TAE nin hazırlama maliyeti TBE ye göre daha düşüktür. ELEKTROFOREZ Agaroz Jel Elektroforezi Denatüre edici (Formaldehitli) RNA analizlerinde kullanılır. Özellikle Northern blot analizi yapılacaksa jeli bu şekilde hazırlamak şarttır. Ancak yalnızca RNA nın varlığına/yokluğuna ve bütünlüğüne bakılacaksa rutin agaroz hazırlanabilir. Her durumda RNA analizlerinde jelin RNaz sız ortama uygun şekilde hazırlanması gerekmektedir. 14
ELEKTROFOREZ Poliakrilamid Jel Elektroforezi Akrilamid ve bisakrilamid molekülleri arasında Amonyum Persülfat (APS) aracılığıyla TEMED in katalizörlüğünde çapraz bağların oluşması ile polimerleşen bir jeldir. APS her defasında taze hazırlanmalıdır. ELEKTROFOREZ Poliakrilamid Jel Elektroforezi Akrilamid ve bisakrilamid tampon çözeltide karıştırılarak çözüldükten sonra filtreden geçirilerek süzülmelidir. Akrilamid ve bisakrilamid polimerleşinceye dek nörotoksiktir. Akrilamid ve bisakrilamid arasındaki oran çapraz bağlarla oluşan porların çapını dolayısıyla jelin rezolüsyonununu belirler; 19:1/29:1/39:1 gibi MDE(Mutation Detection Enhancement) Jel 15
ELEKTROFOREZ Kapiller Elektroforez Donmayan akrilamid bazlı özel polimerler kullanılır. Bu polimerlerin nativ veya denatüre edici özellikte olanları mevcuttur. PROTEİN JELLERİ SDS-PAGE Örneklerin içine 2-mercaptoethanol veya dithiothreitol indirgeyici ajan olarak konulur. Böylece disülfid bağları indirgenmiş olur ve proteinler random coil konfigürasyonlarını koruyarak moleküler ağırlıklarına göre yürürler. İndirgeyici ajanların stokları çeker ocak altında açılıp çalışılır. Yüklemesolüsyonu-20 o C desaklanmalıdır. Örnekler yüklenmeden önce 95 o C de ısıtılır veya kaynatılır. Örnekler kaynatıldıktan sonra buz üzerinde bekletilmelidir. Kaynatılan tüplerin kapağı basınçla açılıp etrafa saçılabilir. Bunu önlemek için plastik kapak kilitleri kullanılmalıdır. 16
PROTEİN JELLERİ Standartlar Standartlar yüksek, düşük ve geniş aralıkta olabilir. Boyasız veya boyalı versiyonları mevcuttur. Boyalı olanlar daha kullanışlıdır. Aksi belirtilmediği sürece -20 o C de saklanmalıdır. Gökkuşağı standartları çok kullanışlı ancak pahalıdır. Boyaları kovalent bağlı boyalar bantları göçlerinde varyasyon yaratabilir. Kesin moleküler ağırlık belirlenmesinde kalibre standartlar kullanılmalıdır. MEMBRANA TRANSFER Southern blot: Membran üzerindeki DNA DNA ile problanır. Northern blot: Membran üzerindeki RNA DNA veya RNA ile problanır. Western blot: Membran üzerindeki protein antikor ile problanır. Southwestern blot: Membran üzerindeki DNA protein ile problanır. Middle eastern blot: PoliU türevli membran mrna ile problanır. 17
MEMBRANA TRANSFER Kapiller Transfer MEMBRANA TRANSFER Vakum Transfer 18
MEMBRANA TRANSFER Elektroforetik Transfer MEMBRAN Membranlar rulo veya değişik ebatta kesilmiş olarak satılır. Tek boy jel kullanılmadığı sürece rulo olarak satın almakta fayda vardır. Membranlara çıplak elle asla dokunulmaz. Membranları almak için temiz bir forseps kullanmak gerekir. Naylon membran nükleik asit için en uygun olanıdır. Dayanıklıdır. Soyulup yeniden defalarca problanabilir. Yüksek konsantrasyonda bloklayıcı ajanla muamele etmek gerekir geriplan boyanmayı engellemek için. Nitroselüloz bazı proteinler için en iyi seçimdir. Nükleik asitler elektroforetik olarak nitroselüloza transfer edilemezler. 19