INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2

INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 KOD: FRI92473 80346 INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 28723 v2 2017-02-02 p 1/13 Türkçe Üretici: Fujirebio Europe N.V. Technologiepark 6 9052 Gent Belgium Tel. +32 9 329 13 29 BTW BE 0427.550.660 RPR Gent Dağıtıcı: Fujirebio Europe N.V. Tel. +32 9 329 13 29 Fax +32 9 329 19 11 customer.support@fujirebio-europe.com Fujirebio Germany GmbH Tel. +49 511 857 3931 Fax +49 511 857 3921 germany@fujirebio-europe.com Fujirebio France SARL Tel. +33 1 69 07 48 34 Fax +33 1 69 07 45 00 france@fujirebio-europe.com Fujirebio Italia S.r.l. Tel. +39 06 965 28 700 Fax +39 06 965 28 765 italy@fujirebio-europe.com Fujirebio Iberia S.L. Tel. +34 93 270 53 00 Fax +34 93 270 53 17 spain@fujirebio-europe.com Vurgulanan değişiklikleri not edin. www.e-labeling.eu/fri92473 AVRUPA +800 135 79 135 GR 00 800 161 220 577 99 IS 800 8996 LT 880 030 728 RO 0800 895 084 SK 0800 606 287 TR 0800 142 064 866 LI +31 20 796 5692 MT +31 20 796 5693 EE 0800 0100 567 AVRUPA -dışı +31 20 794 7071 US +1 855 236 0910 CA +1 855 805 8539 AR, BR, CO, UY, AU, NZ, RU +800 135 79 135 8:00 17:00 GMT+1 M T W T F S S Fujirebio Europe N.V

80346 INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 / 28723 v2 /KOD: FRI92473 p 2/13 İÇİNDEKİLER Kullanım amacı... 3 Test Prensibi... 3 Reaktifler... 3 Açıklama, kullanıma hazırlık ve önerilen saklama koşulları.... 3 Gerekli ama sağlanmayan malzemeler... 4 Güvenlik ve Çevre Koşulları... 5 Örnekler... 6 Uyarılar ve önlemler... 6 Test prosedürü... 7 Prosedür notları... 7 Numuneler... 8 Hibridizasyon... 8 Stringent wash... 8 Renk gelişimi... 9 Otomatik test prosedürü:... 9 Sonuçlar... 9 Okuma... 9 Kalite Kontrol... 10 Sonuçların yorumlanması... 10 Prosedür sınırlamaları... 11 Test performansı... 11 Lisanslar... 12 Ticari markalar... 12 Yorumlama Tablosu... 13 Kullanılan Semboller Üretici In vitro diagnostik medikal ürün Parti kodu Katalog numarası Tarafından kullanım Kullanım talimatlarına bakın Sıcaklık sınırlaması <n> testleri için yeterli içerik Conjugate 100x Conjugate diluent Denaturation solution Hybridization solution Rinse solution 5x Stringent wash solution

80346 INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 / 28723 v2 /KOD: FRI92473 p 3/13 Kullanım amacı Stripler Substrat BCIP/NBT 100x Substrate buffer Tehlike Uyarı Line Probe Assay INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 testi, in vitro kullanım için 16S-23S ribozomal RNA (rrna) spacer bölgesindeki nükleotid farklılıklarını esas alan, sıvı ve katı kültürden 16 farklı mikobakteriyel tür ve Mycobacterium cinsinin saptanması ve tanımlanması için tasarlanmış bir DNA prob testidir. Test Prensibi INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2, ters hibridizasyon prensibine dayanmaktadır. Biyotinli DNA materyali, membran-bazlı striplerde paralel çizgiler halinde sabitlenen spesifik oligonükleotid problar ile hibridize edilir. Hibridizasyon sonrasında, alkalin fosfataz ile etiketlenmiş streptavidin eklenir ve önceden oluşturulmuş herhangi bir biyotinli hibrid'e bağlanır. 5.-bromo-4-chloro-3-indolyl fosfat ve nitroblue tetrazolyum (BCIP / NBT) kromojen ile yapılan inkübasyon, mor / kahverengi bir çökelti ile sonuçlanır INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 tahlilini yapmak için, 16S-23S ribozomal rrna spacer bölgesinin amplifikasyonu yapılmalıdır (bkz. INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 Amp kullanma talimatları). Amplifikasyon ürünleri daha sonra, 22 paralel DNA probu çizgisi ve 2 kontrol çizgisinde sabitlenmiş, 1 tiplendirme stribi kullanılarak (Şekil 1).hibridize edilir. INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2: İlgili adımlar Adım 1 Mycobacterium türlerinin 16S-23S rrna spacer bölgesinin amplifikasyonu (INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 Amp). Adım 2 Strip üzerinde sabit spesifik problarla amplifiye 16S-23S-23SrRNA spacer bölgesinin hibridizasyonu ve stringent wash. Adım 3 Renk gelişimi. Adım 4 Sinyal şablonunun yorumlaması. Reaktifler Açıklama, kullanıma hazırlık ve önerilen saklama koşulları. - 2-8 C de saklandığında, kaplı test stripleri de dahil olmak üzere tüm test reaktifleri, kitin son kullanma tarihine kadar stabildir. Reaktifleri dondurmayın. Son kullanma tarihinden sonra kitleri kullanmayın. - Bu kit kontamine DNA nın herhangi kaynağından, özellikle amplifiye DNA ürünlerinden ayrı saklanmalıdır. - Tüm reaktifler ve plastik tüp içindeki stripler, kullanımdan yaklaşık 30 dakika önce oda sıcaklığına (20-25 C) getirilmeli ve kullanımdan hemen sonra buzdolabına kaldırılmalıdır.

80346 INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 / 28723 v2 /KOD: FRI92473 p 4/13 - Striplerin kullanımdan önce kıvrılma ihtimalini en aza indirmek için, tüpün yatay olarak saklanması önerilir. Sağlanan Reaktifler: Bileşen Miktar Ref. Açıklama Stripler 1x 20 57218 INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 için 20 strip içerir. Conjugate 100x 0.8 ml 60685 Protein stabilizatörleri ve koruyucular içeren bir tamponda alkalin fosfataz etiketli streptavidin, kullanılmadan önce dilüenti ile 1/100 oranında dilüe edilir. Her bir test oluğu için 2 ml konjugat çalışma solüsyonu hazırlayın (+2 ml fazla olacak şekilde). Hazırlama sonrası, Konjugat çalışma solüsyonu karanlıkta saklandığında oda sıcaklığında (20-25 C) 24 saat stabildir. Conjugate diluent 80 ml 56951 NaCl, Triton, protein stabilizatörleri ve koruyucu olarak 0.01% MIT/<0.1% CAA içeren fosfat tamponu. Denaturation solution (Denatürasyon Solüsyonu) Hybridization solution (Hibridizasyon Solüsyonu) Stringent wash solution Rinse solution 5x (Rinse Solüsyonu) Substrate BCIP/NBT 100x Substrate buffer (Substrat tamponu) Incubation trays (İnkübasyon tepsileri) Okuma kartı Veri raporlama kağıdı 1 ml 56718 EDTA içeren alkali solüsyon Dikkat!!! Denatürasyon solüsyonu içeren şişenin kapağı kullanımdan hemen sonra kapatılmalıdır; bu solüsyonun havaya uzun süre maruz kalması, içeriğin hızla bozulmasına sebep olur. 80 ml 57219 Koruyucu ve deterjanlı SSC-tamponu içerir. 200 ml 57220 Koruyucu ve deterjanlı SSC-tamponu içerir. 80 ml 56721 NaCl, Triton ve koruyucu olarak 0.05% MIT/0.48% CAA içeren posfat tamponu; kullanılmadan önce distile ya da deiyonize su içinde 1/5 (1 kısım+4 kısım) dilüe edilir. Her test oluğu için 8 ml rinse çalışma solüsyonu hazırlayın (+ 10 ml fazladan). Rinse çalışma solüsyonu 2-8 C de 2 hafta stabildir. 0.8 ml 56954 Dimetilformamid içinde 5-Bromo-4-kloro-3-indolil fosfat p- Toluidin tuzu ve 4-Nitro-mavi tetrazolyum; kullanılmadan önce substrat tamponunda 1/100 oranında dilüe edilir. Her test oluğu için 2 ml Substrat çalışma solüsyonu hazırlayın (+ 2 ml fazla olacak şekilde) (Substrat çalışma solüsyonu konjugat inkübasyonu esnasında hazırlanabilir). Substrat çalışma solüsyonu karanlıkta ve oda sıcaklığında (20-25 C) saklandığında, 8 saat stabildir. 180 ml 56953 NaCl, MgCl2 ve koruyucu olarak 0.01% MIT/<0.1% CAA içeren Tris tamponu. 3 - Her biri sekiz oluk içerir. 1 2 Gerekli ama sağlanmayan malzemeler - - Pozitif probların tanımlanması için. Renklenen striplerin saklanması için. - Çalkalayıcı platformlu su banyosu (80 rpm; eğimli kapaklı; sıcaklığı 62 C ± 0.5 C ye ayarlanabilen). - Aspirasyon aparatları. - Kalibre edilmiş termometre.

80346 INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 / 28723 v2 /KOD: FRI92473 p 5/13 - Distile veya deiyonize su. - Tek kullanımlık eldiven. - Tek kullanımlık steril pipet uçları (tercihen pamuk filtreli). - Strip çalışması için forsepsler. - Dereceli silindirler (10, 25, 50, ve 100 ml). - Orbital, karşılıklı veya sallanan platform çalkalayıcı Öneriler: Orbital çalkalayıcı için: Dairesel hareket çapı 13 mm 'ye eşit ya da daha üst olmalıdır 13-mm dairesel hareket için önerilen hız 160 rpm dir Karşılıklı çalkalayıcı için: İleri geri hareket için önerilen hız dakikada 80 harekettir. Sallanan platform çalkalayıcı için: Sallama açısı, sıvının dökülmesini önlemek amacıyla,13 'yi geçmemelidir. Önerilen hız 50 rpm dir. - 1-20 µl, 20-200 µl, ve 200-1000 µl dağıtımı için ayarlanabilir pipetler. - Dispensing Multipette (Eppendorf, optsiyonel). - Zamanlayıcı, 2 saat (± 1 dakika). - Vorteks mikser veya eşdeğeri. Güvenlik ve Çevre Koşulları Potansiyel olarak tehlikeli bileşenler hakkında bilgi için lütfen Güvenlik Bilgi Formuna (SDS) ve ürün etiketine bakın. En yeni SDS versiyonu www.fujirebioeurope.com te mevcuttur. Tehlike Uyarı Tehlike Tehlike İfadeleri H312 H314 H317 H319 H332 H360D Önlem ifadeleri P201 P260 Sodyum hidroksit içerir H314 P260 P280 P303+P361+P353 P305+P351+P338 P310 P363 2-kloroasetamid içerir H317 P280 P261 P362+P364 P333+P313 P302+P352 N,N-Dimethylformamide, 5,5'-diphenyl-3,3'-bis (4-nitrophenyl)-2,2'-(3,3'-dimethoxybiphenyl-4,4'-ylene)ditetrazolium dichloride ve metanol içerir H312 H332 H319 H360D P261 P280 P201 P303+P361+P353 P305+P351+P338 P308+P313 Cilt ile teması zararlıdır. Ciddi derecede deri yanıklarına ve göz hasarına neden olur. Allerjik deri reaksiyonuna neden olabilir. Ciddi derecede göz tahrişine neden olur. Solunması halinde zararlıdır. Fetüse zarar verebilir. Kullanmadan önce özel talimatları edinin. Duman/buhar/spreyi solumayın.

80346 INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 / 28723 v2 /KOD: FRI92473 p 6/13 P261 Duman/buhar/spreyi solumaktan kaçının. P280 Koruyucu eldiven / koruyucu giysi / göz koruması / yüz koruması kullanın. P302+P352 CİLT İLE TEMAS HALİNDE: Bol su ile yıkayın/... P303+P361+P353 CİLT (ya da saç) İLE TEMAS HALİNDE Kontamine olan tüm giysileri derhal çıkarın. Cildi su / duş ile yıkayın. P305+P351+P338 TEMAS HALİNDE Birkaç dakika su ile dikkatlice yıkayın. Varsa ve kolayca çıkarılabiliyorsa, kontakt lensleri çıkarın. Yıkamaya devam edin. P308+P313 Maruz kaldığınızda veya endişelendiğinizde: Tıbbi yardım/destek alın. P310 Hemen bir ZEHİR MERKEZİ / Doktor /.. a başvurun. P333+P313 Ciltte tahriş veya kızarıklık meydana gelirse: Tıbbi yardım/destek alın. P362+P364 kontamine giysileri çıkartın ve tekrar kullanmadan önce yıkayın. P363 Kontamine giysileri tekrar kullanmadan önce yıkayın. - Testin yalnızca yeterli eğitilmiş almış personel tarafından yapılmasına izin verilmelidir. - Numuneler her zaman potansiyel bulaşıcı olarak ele alınmalıdır. Bu nedenle, tüm kan bileşenlerinin ve biyolojik materyallerin potansiyel olarak bulaşıcı olduğu düşünülmeli ve bu şekilde ele alınmalıdır. - Tüm kan bileşenleri ve biyolojik materyaller, belirlenmiş emniyet prosedürlerine uygun olarak atılmalıdır. 121 C de minimum 15 dakika otoklavlanmalıdır. Tek kullanımlık malzemeleri yakınız. Sıvı atığı, son konsantrasyon ±% 1 sodyum hipokloritl olacak şekilde, sodyum hipoklorit ile karıştırın. Atmadan önce bir gece bekletin. DİKKAT: Sodyum hipoklorit eklemeden önce asit içeren sıvı atığı nötralize edin. - Kişisel koruyucu ekipmanların kullanılması gereklidir: Tehlikeli veya bulaşıcı ajanlar ile çalışılırken, eldiven ve koruyucu gözlük kullanılmalıdır. - Atık, kurumun atık imha etme esaslarına göre işleme tabii tutulmalıdır. Ayrıca tüm federal, eyalet ve yerel çevresel düzenlemeler de dikkate alınmalıdır. Örnekler Bu test biyotinli amplifiye DNA materyali kullanır. Biyotinlenmiş oligonükleotid primerleri kullanan bir amplifikasyon kiti, örnekten Mycobacterium türlerinin (INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 Amp) 16S-23S rrna spacer bölgesinin amplifiye edilmesine yardım eder; tamamen kültürde yetiştirilen numuneler (sıvı veya katı kültür), örneğin balgam. Bu amplifiye materyali, Mycobacterium cinsini ve aşağıdaki Mycobacterium türlerini tespit etmek için INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 de kullanılır: M. tuberculosis complex, M. kansasii, M. xenopi, M. gordonae, M. genavense, M. simiae, M. marinum vem. ulcerans, M. celatum, MAIS, M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum, M. haemophilum, M. chelonae complex, M. fortuitum complex ve M. smegmatis. Uyarılar ve önlemler - Farklı lot numarasındaki reaktifleri birbirleriyle karıştırmayınız. - Reaktiflerin mikrobiyal kontaminasyonundan kaçının.

80346 INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 / 28723 v2 /KOD: FRI92473 p 7/13 - Stripleri tutmak için cımbız kullanın. Ellerinizdeki yağlar hibridizasyon ve renk gelişimini olumsuz etkileyebilir, elinizle striplere dokunmayın. - Striplerin üzerinde yazmak için yalnızca kurşun kalem kullanın. Tahlil reaktifleri striplerdeki mürekkebi çıkarabilir. - Test striplerinin, kaplı membranı taşıyan kenar yukarı bakacak şekilde oluklar içine yerleştirildiğinden emin olun (bu kenar işaretlenmiştir). - Stripler sadece bir kez kullanılmak üzere tasarlanmıştır! - Konjugat ve Substrat çalışma solüsyonları hazırlamak için kullanılan tüm araçlar iyice temizlenmeli ve distile su ile durulanmalıdır. - Her numune için yeni steril pipet ucu kullanın (pamuk-filtreli). - PCR kontaminasyonunu önlemek için, amplifikasyon öncesi ve sonrası aşamaların fiziksel ayrımını en üst düzeye çıkarın. Numuneleri, ekipmanları ve reaktifleri önceki adımın yapıldığı bölgeye/alana geri döndürmeyin. Bir önceki çalışma alanına dönülmesi gerekiyorsa, öncelikle uygun dekontaminasyon adımları gerçekleştirin. - Olukları tekrar kullanmayın. Test prosedürü Teste başlamadan önce lütfen uyarıları ve önlemleri okuyun. NOT: - Farklı inkübasyon adımları boyunca, test stripleri hep aynı oluk içinde kalmalıdır. - İnkübasyon öncesinde kalibre edilmiş bir termometre kullanarak su banyosunun sıcaklığını kontrol edin ve gerekliyse sıcaklığı tepsiyi su banyosuna yerleştirmeden önce ayarlayın. Kapağı her zaman kapalı tutun. Prosedür notları - Hibridizasyon, sıkı yıkama ve tam olarak 62 C ± 0.5 C de inkübasyon yanlış pozitif (sıcaklık çok düşük) veya yanlış negatif/çok zayıf sinyallerden (sıcaklık çok yüksek) kaçınmak için en önemli aşamalardır. Kapalı kapaklı bir su banyosu (80 dev / dak), sıcaklık değişimlerinin iyi kontrol edilmesini sağlar. Sıcaklık kontrolü mutlaka kalibre edilmiş bir termometre ile yapılmalıdır. - Stripler üzerinde solüsyonların çalkalanması maksimum hassasiyet ve homojen boyama sağlamak için kritik önem taşır. Çalkalama sırasında, strip yüzeyi tamamen sıvı içinde olmalıdır. Sıcak hava çalkalayıcısı kullanmayın. - Çalkalama su banyosu (hibridizasyon prosedürü) ve orbital, karşılıklı çalkalayıcı veya sallama platformu (renk gelişim prosedürü) tarafından meydana gelen hareketin genliği, maksimum hassasiyet ve homojen boyama sağlamak için kritik önem taşır. Genlik mümkün olduğu kadar yüksek olmalıdır. Bununla birlikte, olukların kenarlarına sıvı dökülmesinden kaçınılmalıdır! - Hibridizasyon ve stringent wash, için oluklar su banyosunun sallanan platformuna yerleştirilmelidir. Su seviyesini,oluk yüksekliğin üçte birine veya yarısına gelecek şekilde ayarlayın. Olukların su üstünde olmadığından emin olun. Su oluklar ile doğrudan temas halinde olmalıdır. - Stiplerin inkübasyonu sırasında çalkalama işlemi, hem sıvı hem de test striplerinin, oluk kenarından sıvı dökülmeden, olukta ileri geri hareket edecek şekilde gerçekleştirilmelidir. - İnkübasyon esnasında su banyosunun kapağını her zaman kapalı tutunuz. - Tepsiyi kapatmayın.

80346 INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 / 28723 v2 /KOD: FRI92473 p 8/13 - Sıvı oluktan, tercihen vakum aspiratörüne bağlı bir pipet ile aspire edilir. Tepsi, tüm sıvının oluğun bir ucuna akmasına izin verecek bir açıyla tutulur. Her oluğa uygun solüsyondan 2 ml ekleyin ve protokolu izleyin. Bu aşamayı test prosedüründe belirtildiği kadar tekrarlayın (dağıtım için Multipipet (Eppendorf) kullanışlıdır). NOT: Yıkama adımları arasında striplerin kurumasına izin vermeyin. Aspire ederken striplerin yüzeyine zarar vermeyin. Tercihen, sıvıyı stribin üst kısmındaki işaret çizgisinin üstünde aspire edin. Solüsyon içine tamamen daldırarak, tüm stribin iyice yıkandığından emin olun. Gerekirse çalkalayıcının hızını değiştirin. Numuneler 1. Mycobacterial 16S-23S rrna spacer amplifiye ürün (10 μl kullanın). 2. Boş amplifiye kontrol örneği (Negatif Kontrol) (10 μl kullanın). Hibridizasyon 1. Çalkalayıcılı su banyosunu 62 C ± 0.5 C ye ısıtın. Sıcaklığı kalibre edilmiş bir termometre ile kontrol edin ve gerekirse ayarlayın. Hibridizasyon Solüsyonu ve stringent wash Solüsyonunu en az 37 C ye ön ısıtma yapın ve 62 C yi aşmayın. Kullanmadan önce karıştırın. Bütün kristaller çözünmüş olmalıdır. 2. Forseps kullanarak, tüpten gerekli sayıdaki INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 stribini çıkartın (örnek başına 1 strip) ve stripin mavi işaret çizgisi üstüne kurşun kalemle bir kimlik numarası yazın. Negatif Kontrol örneği (DNA eklenmeden) için daima bir strip dahil edin. 3. Gerekli sayıda test oluğu alın ve tepsiye yerleştirin ( her strip için bir oluk). 4. Her oluğun üst köşesine 10 µl Denaturation Solution pipetleyin. NOT: Kullandıktan sonra şişenin kapağını derhal kapatın. 5. 10 µl amplifiye edilen biyotinli ürünü ya da 10 µl negatif kontrol numunesini denatürasyon solüsyonuna ekleyin ve aşağı yukarı opipetleyerek dikkatlice karıştırın. Her zaman steril pamuk fitreli pipet ucu kullanın. Denatürasyonun oda sıcaklığında 5 dakika devam etmesine izin verin (20-25 C). 6. Önceden ısıtılmış Hibridizasyon solüsyonunu çalkalayın ve her oluğa denatüre olmuş amplifiye ürüne yavaşca 2 ml ekleyin. Pipetleme sırasında komşu oluklarıı kontamine etmemeye özen gösterin. 7. Stribi mebranın işaretli tarafı (mavi işaret çizgisi) yukarı bakacak şekilde hemen oluğun içine yerleştirin. Stripler solüsyona tamamen batırılmış olmalıdır. NOT: Tek kullanımlık eldiven giyin, forseps kullanın. 8. Tepsiyi 62 C ± 0.5 C çalkalayıcılı su banyosuna yerleştirin (yaklaşık 80 rpm; Bkz. Yöntemsel Notlar ), kapağı kapatın ve 30 ± 3 dakika inkübe edin. Stringent wash 1. Hibridizasyonun ardından tepsiyi su banyosundan çıkarın. 2. Tepsiyi düşük açıda tutun ve sıvıyı tercihen vakum aspiratöre bağlı bir pipetle oluktan aspire edin. Her oluğa 2 ml önceden ısıtılan wash solution solüsyonu ekleyin ve oda sıcaklığında 60 ± 30 saniye tepsiyi sallayarak durulayın. Her oluktan solüsyonu aspire edin. 3. Yıkama adımını bir kez tekrarlayın, ayrıca Yöntemsel notlara bakın.

80346 INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 / 28723 v2 /KOD: FRI92473 p 9/13 4. Son olarak, solüsyonu aspire edin ve her bir stribi, 2 ± 0 C ± 0,5 C'de 10 ± 2 dakika süreyle sallayan su banyosunda, 2 ml önceden ısıtılmış stringent wash solüsyonuyla inkübe edin. Su banyosun kapağını kapatın. İnkübasyondan önce kalibre edilmiş bir termometre kullanarak su banyosunun sıcaklığını kontrol edin, gerekli ise sıcaklığı ayarlayın. Kapağı her zaman kapalı tutun. NOT: Stringent wash inkübasyonu sırasında rinse çalışma solüsyonunu ve konjugat çalışma solüsyonunu hazırlayın. Renk gelişimi Sonraki bütün inkübasyonlar çalkalayıcıda 20-25 C de gerçekleştirilir. İnkübasyonlar sırasında oluklardaki sıvı ve stripler homojen bir boyama için ileri geri hareket etmelidir. 1. Her bir stribi, 2 ml rinse çalışma solüsyonuyla 60-90 saniye boyunca iki kez yıkayın (bkz. "Prosedür Notları"). Aspire edin. 2. Her oluğa 2 ml Substrate Solution ekleyin ve çalkalayarak 30 ± 3 dakika inkübe edin. Aspire edin. NOT: Konjugat inkübasyonunun bitmesine yaklaşık on dakika kala Substrat çalışma solüsyonu hazırlayın. 3. Her stribi 2 ml dilüe Rinse Solution kullanarak 60-90 saniye boyunca iki kez yıkayın ve 2 ml Substrat Buffer kullanarak bir kez daha yıkayın. Aspire edin. 4. Her oluğa 2 ml Substrate Solution ekleyin ve çalkalayarak 30 ± 3 dakika inkübe edin. Aspire edin. 5. Stipleri en az 3 dakika çalkalarkalayarak, 2 ml distile su içinde iki kez yıkayarak renk gelişimini durdurun. 6. Forseps kullanarak, stripleri oluklardan çıkarın ve kuruytma kağıdı üzerine koyun. Sonuçları okumadan önce stripleri tamamen kurutun. Renklenmiş ve kurumuş stripleri karanlıkta saklayın. Otomatik test prosedürü: Dökümanlar ve ilişkili protokoller Fujirebio Avrupa N.V. den edinilebilir (Bkz. www.fujirebio-europe.com/automation). Sonuçlar Okuma Şekil 1 INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 stribinde faklı oligonükleotid problarının pozisyonunu gösterir. Test prosedürünün sonunda net bir mor / kahverengi bant göründüğünde,bu bant/çizgi pozitif olarak kabul edilir. Şekil 1: INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 stribinde farklı probların konumu. Oryantasyonlar için striplerin üstüne mavi bir çizgi çizilir

80346 INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 / 28723 v2 /KOD: FRI92473 p 10/13 Kalite Kontrol - En üstteki mavi çizgi, işaret çizgisidir. Bu çizgi plastik okuma kartının konumlandırmasını kontrol eder. - İlk pozitif çizgi Konjugat Kontrol çizgisidir. Bu çizgi tespit prosedürü sırasında Konjugat reaktifinin ve Substrat solüsyonu eklenip eklenmediğini kontrol eder. Aynı test çalışmasındaki her strip yaklaşık olarak aynı yoğunlukta ve pozitif olmalıdır. - İkinci çizgi test örneğindeki Mycobacterium'un varlığını saptayan Mycobacterium cinsi prob çizgisi (okuma kartı ve veri raporlama sayfasındaki MYC cinsi) 'dir ve diğer pozitif çizgilerin yoğunluğunun bu çizginin yoğunluğu ile karşılaştırılması gerektiğinden, hibridleşme için uygun miktarda amplifiye malzemenin eklenip eklenmediğini gösterir. - Negatif kontrol, konjugat kontrol ç,zgisi haricinde boş bırakılmalıdır. Bu, kontaminasyon oluşmadığını gösterir. Sonuçların yorumlanması Belirgin bir çizginin olması pozitif reaksiyon olarak kabul edilir. INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 şeridinde pozitif olan tüm satır numaralarını belirleyin ve INNO- LiPA MYCOBACTERIA v2 yorum çizelgesini kullanarak Mycobacterium türlerini saptayın. Çizgi Prob Prob ile reaksiyona giren taxa 2 MYC cinsi Test numunesinde Mycobacterium varlığı 3 *MTB M tuberculosis kompleksi: M. tuberculosis, M. bovis, M. microti, M. africanum 4 *MKA-1 M. kansasii (grup I) 5 *MKA-2 M. kansasii (grup II) 6 *MKA-3 M. kansasii (group III, V) M. kansasii (group IV), M. gastri 7 MXE M. xenopi 8 *MGO M. gordonae 9 MGV M. genavense 10 MSI M. simiae 11 *MMU M. marinum + M. ulcerans 12 MCE M. celatum 13 *MAIS M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum, MAC, M. malmoense 14 MAV M. avium, M. paratuberculosis, M. silvaticum 15 *MIN-1 M. intracellulare (sequevars Min-A, -B, -C and -D) 16 *MIN-2 M. intracellulare (sequevar Mac-A) 17 MSC M. scrofulaceum 18 MML M. malmoense 19 MHP M. haemophilum 20 *MCH-1 M. chelonae complex (group I, II, III, IV, M. abscessus) 21 *MCH-2 M. chelonae complex (group III, M. abscessus) 22 *MCH-3 M. kansasii (group I) 23 *MFO M. fortuitum - M. peregrinum complex 24 MSM M. smegmatis * Açıklamalar: - Çizgi 3: Prob çizgisi 3 (MTB) M. tuberculosis, M. bovis, M. microti, M. Africanum ile pozitif reaksiyonu gösterir. - Çizgi 4-6: M. kansasii'nin 5 gruba ayrılması, 16S-23S rrna spacer nucleoticle sekanslarından türetilen verilere dayanmaktadır.

80346 INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 / 28723 v2 /KOD: FRI92473 p 11/13 - Çizgi 8: Prob çizgisi 8 (MGO) M. Gordonae ile pozitif reaksiyona girer. M. simiae izolatlarında zayıf bir yanlış pozitif reaksiyon görülebileceğini dikkate alın. - Çizgi 11: Prob çizgisi 11 (MMU) M. ulcerans ve M. Marinum türleri ile reaksiyona girer. Her iki Mycobacterium türü de aynı spacer sekanslarını paylaşır. - Çizgi 13: Prop çizgisi 13 (MAIS) tüm M. Avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum, ve MAC izolatları için pozitif reaksiyon sergiler M. malmoense de bu prop ile raksiyona girer. Bu propla ile M. 19 hematopoit izolatları için zayıf bir pozitif reaksiyon gözlemlenebilir; bu,19 çizgi üzerinde pozitif bir MHP probu ile tanımlanır. - Çizgi 15 ve 16: Prob çizgisi 15 (MIN-1), M. intracellulare sekansları Min-A, -B, -C ve -D için pozitif bir reaksiyon gösterir.min-2 probu (çizgi 16), M. intracellulare sequevar Mac-A ile reaksiyona girer. - Çizgi 20-22: 16S-23S rrna nükleotid sekanslarına göre, M. chelonae kompleks izolatları (= M. chelonae ve M. abscessus) küme I, II, III ve IV olmak üzere dört genotipik kümeye bölünebilir; M. abscessus, küme III'e dahil edilmiştir. Probe MCH- 1, dört kümenin tümünü (M. abessus dahil) tespit eden genel bir M. chelonaekompleks probudur. Probe MCH-2, özellikle M. abscessus'u kapsayan III kümesiyle reaksiyona girer. Probe MCH-3, özellikle ağırlıklı olarak insan örneklerinden izole edilen küme I izolatlarıyla tepkimeye girer. M. xenopi izolatları ile çizgi 20'de (MCH-I) zayıf bir yalnış pozitif reaksiyonun görülebileceğini unutmayın. - Çizgi 23: Prob çizgisi 23 (MFO) M. fortuitum - M. peregrinum kompleksine ait izolatlar için pozitif reaksiyon gösterir. M. smegmatis de bu prob ile pozitif tepki verir, ancak çizgi 24 için pozitif olan MSM probu ile bu kompleksden kolauca ayırt edilir. Prosedür sınırlamaları - Bu ürün sadece amplifikasyon ve hibridizasyon tekniklerinde iyi eğitilmiş personel tarafından kullanılmalıdır. - Belirtilen prosedürlerin dikkatli bir şekilde uygulanmasının yanı sıra iyi bir laboratuar uygulaması, spesifik bir amplifikasyonun yapılmasını sağlar. - Polimeraz inhibisyonu, testin tamamen hatalı olmasına sebep olabilir! - Tek kullanımlık eldivenden gelebilecek pudra ve sodyum hipokloritin amplifikasyon üzerinde inhibe edici etkisi vardır. - Nadiren de olsa, hedef bölgedeki bir polimorfizm, prob çizgilerinden birinin yanlış pozitif veya negatif reaksiyonuna neden olabilir. Test performansı INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2, bir Belçikalı merkezde (Antwerp) ve çoğunlukla INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2'ye prob eklenen veya geliştirilen türleri temsil eden seçilmiş bir örnek popülasyonunda dahili olarak değerlendirildi. Toplam 73 mycobacterium, 21 non-mycobacterium ve 25 media merkezde test edildi. 73 Mycobacterium suşunun tamamı, Mycobacterium cinsi (MYC) prob ile reaksiyona girmitir. Bu izolatların 66 sı başlangıç testinden sonra referans yöntemiyle uyumlu sonuçlar verdi, uyuşmazlık testi sonrası ise 73 izolatın 71 i uyumluydu. Kalan 2 uyumsuz örnek MAIS kompleksinin üyeleri olarak doğru şekilde sınıflandırılmış M. intracellulare 2 izolatlarıydı.

80346 INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 / 28723 v2 /KOD: FRI92473 p 12/13 Kurum içi test edilen 11 mycobacterial türün hepsi Mycobacterium genus (MYC) probu ile reaksiyona girmiş ve bu suşların 10'u, referans yöntemle uyumlu, yorumlanabilir bir LiPA sonucunu vermiştir. Genel olarak tanısal duyarlılık %98.8di. Kesinlik başlangıç testinden sonra % 91.6, tutarsızlık testşnden sonra ise % 97.6 idi. Amplifikasyon, 21 non-mycobacterial türden 20'sinde elde edilmiş ve amplifiye materyallerin hiçbiri Mycobacterium genus (MYC) probu ile reaksiyona girmemiştir (% 100 özgüllük). 25 medium numunesi, konjugat kontrol çizgisi hariç strip üzerinde negatifti. Lisanslar Bu ürünün satın alınması, alıcının insan in vitro teşhislerinde, teşhisin gerçekleştirilmesi için kullanıma olanak sağlar. Satın alma yoluyla kullanıma ilişkin bu özel kullanım hakkı dışındaki herhangi bir genel patent veya başka herhangi bir lisans verilmemektedir. Ticari markalar INNO-LiPA, ve Auto-LiPA, ABD ve diğer ülkelerde kayıtlı, Fujirebio Europe N.V. ticari markalarıdır.

80346 INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 / 28723 v2 /KOD: FRI92473 p 13/13 Yorumlama Tablosu