KULLANICI KILAVUZU STR-VNTR REF. 04-20A REF. 04-20R Allojenik kemik iliği transplantasyonunun aşılanmasının izlenmesi için kit. 04-20A-25_8033622781240_TR.doc
AB ANALITICA srl - Via Svizzera 16-35127 PADOVA, (ITALY) Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510 e-mail: info@abanalitica.it
1. ÜRÜN BİLGİSİ 4 2. KİT İÇERİĞİ 5 3. REAKTİF SAKLAMA KOŞULLARI 8 4. KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER 8 5. GÜVENLİK KURALLARI 9 5.1 Genel Güvenlik Kuralları 9 5.2 Kit Hakkında Güvenlik Kuralları 10 6. KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER 12 6.1 Reaktifler 12 6.2 Cihazlar 12 6.3 Materyaller 12 7. REAKTİF HAZIRLAMA 13 8. GİRİŞ 14 9. TEST PRENSİBİ 15 10. ÜRÜN TANIMI 15 10.1. Markırlar hakkında bilgi 17 11. ÖRNEK TOPLAMA, MANİPULASYON VE ÖN-MUAMELESİ 19 11.1 Taze ya da donmuş kan (periferik ve kemik iliği) 19 12. PROTOKOL 19 12.1. Periferik ya da kemik iliği kandan DNA ekstraksiyonu (taze ya da donmuş) 19 12.2. DNA amplifikasyonu 20
12.2.1. Hum ARA, Hum TH01, SE33, D1S80, 3 -HVR markırlarının amplifikasyonu 20 12.2.2. vwf1, vwf2, YNZ22 markırlarının amplifikasyonu 20 12.3. Amplifikasyon ürünlerinin görüntülenmesi 23 12.3.1. Agaroz jel elektroforezi 23 12.3.2. Jelde örnek yükleme 23 12.3.3. Sonuçların yorumlanması 24 12.3.4. Poliakrilamid jel elektroforezi 26 12.3.5. Poliakrilamid jelde örnek yükleme 27 12.3.6. Ethidium Bromide ile jel boyama 27 13. SORUN GİDERME 29 14. TEST LİMİTLERİ 31 15. TEST PERFORMANSI 31 15.1. Özgünlük 31 16. BİBLİYOGRAFİK REFERANSLAR 32 AB ANALITICA srl - Via Svizzera 16-35127 PADOVA, (ITALY) Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510 e-mail: info@abanalitica.it
1. ÜRÜN BİLGİSİ Bu kullanıcı kılavuzu aşağıdaki ürünlerin kullanımı için bilgiler içerir: STR-VNTR (kod 04-20A) Kısa Tandem Tekrarlarının (STR) amplifikasyonu ve Tandem Tekrarlarının Değişken Numaraları (VNTR) dizisi ile allojenik kemik iliği transplantasyonlarının aşılanmasının izlenmesi için kit. Kit; DNA ekstraksiyonu, amplifikasyon ve agaroz jel elektroforezi ile görüntüleme için gerekli tüm reaktifleri, örnek amplifikasyonunun internal kontrolü ve pozitif kontrol içerir. Kod Ürün Pkg 04-20A-25 STR-VNTR 25 test 04-20A-50 STR-VNTR 50 test STR-VNTR (kod 04-20R) Kısa Tandem Tekrarlarının (STR) amplifikasyonu ve Tandem Tekrarlarının Değişken Numaraları (VNTR) dizisi ile allojenik kemik iliği transplantasyonlarının aşılanmasının izlenmesi için kit. Kit; amplifikasyon için reaktifler, örnek amplifikasyonunun internal kontrolü ve pozitif kontrol içerir. Kod Ürün Pkg 04-23R-25 STR-VNTR 25 test 04-23R-50 STR-VNTR 50 test
2. KİT İÇERİĞİ NOT: Kit içeriğinde farklı kodlarda (A ve R) farklı komponentler bulunur. (kısaltma: X= kit içeriğinde bulunan komponent; 0= kit içeriğinde bulunmayan komponent) KUTU P 20 C DE SAKLANIR Kod 04-20A Kod 04-20R AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) YA DA KAPAK RENGİ 25 test 50 test X X Taq DNA polymerase termostable AB Taq 5 U/μL Kırmızı 1x150 µl 2x150 µl X X 10X Buffer 10X Buffer 1x500 µl 1x900 µl X X dntps solution dntps 1x500 µl 1x900 µl X X MgCl 2 solusyonu MgCl 2 1x150 µl 1x250 µl X X X X X X X X X X Tek-doz premiks tüpleri HUM ARA için Tek-doz premiks tüpleri TH01 için Tek-doz premiks tüpleri SE33 için Tek-doz premiks tüpleri D1S80 için Tek-doz premiks tüpleri VwF2 için X X Primer vwf1 3 X X Primer vwf1 5 X X Primer YNZ22 3 X X Primer YNZ22 5 X X Primer 3 -HVR 3 X X Primer 3 -HVR 5 Primer vwf1 3 Primer vwf1 5 Primer YNZ22 3 Primer YNZ22 5 Primer 3 -HVR 3 Primer 3 -HVR 5 Renksiz (P) 25 50 Mavi (P) 25 50 Sarı (P) 25 50 Kırmızı (P) 25 50 Yeşil (P) 25 50 Sarı 1x60 µl 1x10 µl Sarı 1x60 µl 1x110 µl Beyaz 1x60 µl 1x110 µl Beyaz 1x60 µl 1x10 µl Mor 1x60 µl 1x110 µl Mor 1x60 µl 1x110 µl X X Gliserol Gliserol 1X150 μl 1X300μL AB ANALITICA srl - Via Svizzera 16-35127 PADOVA, (ITALY) Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510 e-mail: info@abanalitica.it
KUTU F* -20 C DE SAKLANIR Kod 04-23A Kod 04-23R AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) YA DA KAPAK RENGİ 25 test 50 test X 0 APS 10% APS Mavi 8 X 600 μl 15 X 600 μl KUTU F +2 / +8 C DE SAKLANIR Kod 04-23A Kod 04-23R AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) YA DA KAPAK RENGİ 25 test 50 test X 0 X 0 Elektroforez yükleme buffer (6X solusyon) Ethidium Bromide solusyonu (2,5 mg/ml) Bromophenol blue Ethidium Bromide toksik R 2368 S 36/37 45 Mavi 1 X 1,1 ml 2 X 1,1 ml Kırmızı 1 X 600 μl 1 X 1,2 ml X 0 DNA Moleküler Ağırlık Markır (MW) HMW Markır Sarı 1 X 600 μl 1 X 1,2 ml KUTU A +15 / +25 C DE SAKLANIR Kod 04-23A Kod 04-23R AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) YA DA KAPAK RENGİ 25 test 50 test X X Mineral Yağı Mineral Yağı 1 X 2,7 ml 1 X 5 ml X 0 N,N,N,N Tetrametiletilendiammine appross. 99% TEMED 1 X 500 μl 1 X 950 μl X 0 Agarose Molecular Biology grade AGAROSE 32 g 64 g X 0 Elektroforez buffer TRIS-Borate-EDTA ph: 8,00 TBE 5X 1 X 2,2 L 1 X 4 L
KUTU Q +2 / +8 C DE SAKLANIR Kod 04-23A Kod 04-23R AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) YA DA KAPAK RENGİ 25 test 50 test X 0 Acrylamide/bis-acrylamide solusyonu (40% suda) Akrilamid toksik R 45 46 20/21 25 36/38 43 48/23/24/25 62 S 53 26 36/37 45 1 X 150 ml 1 X 300 ml AB ANALITICA srl - Via Svizzera 16-35127 PADOVA, (ITALY) Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510 e-mail: info@abanalitica.it
3. REAKTİFLERİ SAKLAMA KOŞULLARI Kitin herbir komponenti, tekli kutuların etiketlerinde belirtilen talimatlara gore saklanmalıdır. Özellikle: KUTU P KUTU F* KUTU F KUTU A -20 C de saklanır -20 C de saklanır +2 / +8 C de saklanır +15 / +25 C de saklanır (oda ısısı) Önerilen sıcaklıkta saklandığında, tüm test reaktifleri son kullanım tarihine kadar stabil kalır. 4. KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER Kit; moleküler biyoloji tekniklerini diagnostikte uygulama eğitimi almış ve tecrübesi olan araştırmacı tarafından kullanılmalıdır; Kit prosedürüne başlamadan önce kullanım kılavuzunu dikkatlice ve tamamen okuyun; Ürünleri ısı kaynağından uzakta tutun; Son kullanım tarihi geçmiş kit parçalarını kullanmayın; Saklama koşulları, kutu bütünlüğü ya da metod uygulaması ile ilgili herhangi bir şüpheniz olduğunda, AB ANALITICA teknik destek ile bağlantı kurun: laboratorio@abanalitica.it. Nükleik asitlerin amlifikasyonunda, araştırmacı aşağıdaki özel önlemleri almalıdır: Filtreli uç kullanın; Biyolojik örnekler, ekstrakte edilmiş DNA, kit içeriğindeki pozitif kontrol ve tüm amplifikasyon ürünleri, amplifikasyon reaktiflerinden farklı bir yerde saklanmalıdır.
PCR öncesi ve sonrası için farklı alanlar hazırlayın ve iki alan arasında materyal (pipetler, uçlar, tüpler, vs.) paylaşımı yapmayın. Sık sık eldiven değiştirin. Benç yüzeyini %5 sodyum hipoklorit ile temizleyin. Kullanımdan önce reaktifleri oda ısısında eritin. Taq polymerase ve ekstrakte DNA yı hızlı bir şekilde oda ısısında ve buzkalıbı üzerinde ekleyin. 5. GÜVENLİK KURALLARI 5.1 Genel Güvenlik Kuralları Reaktifler ve klinik örnekler ile çalışırken tek kullanımlık eldiven kullanın ve çalışma bitiminde ellerinizi yıkayın. Ağızla pipetleme yapmayın. Bilinen hiçbir diagnostik metod enfeksiyon ajanlarının yokolduğunun garantisini vermediğinden, herbir klinik örneğin potansiyel enfeksiyonlu olduğu göz önünde bulundurulup, bu şekilde çalışılması gereklidir. Klinik örnekler ile direk temasta olan cihazların kontaminasyonlu olduğu ve bu şekilde kullanılması gerektiği göz önüne alınmalıdır. Örneklerin kazara etrafa dökülmesi durumunda, %10 Sodyum Hipoklorit ile temizleyin. Temizlenmiş materyaller, kontamine ürünler için olan özel konteynerlere atılmalıdır. Klinik örnekler, materyaller ve kontamine ürünler aşağıdaki dekontaminasyondan sonra atılmalıdır: 30 dakika %5 Sodyum Hipoklorit (1 volüm %5 Sodyum Hipoklorit solusyonu herbir 10 volüm kontaminasyonlu sıvı için) solusyonuna batırılmalı YA DA en az 2 saat 121 C de otoklavlanmalı (NOT: Sodyum Hipoklorit içeren solusyonları otoklavlamayın!!) AB ANALITICA srl - Via Svizzera 16-35127 PADOVA, (ITALY) Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510 e-mail: info@abanalitica.it
5.2 Kit Hakkında Güvenlik Kuralları Bu kit kullanımı için riskler tekli komponentler ile ilişkilidir: Tehlikeli Komponentler: ETHIDIUM BROMIDE (Kit kod. 04-20A) 3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridiumbromide <2% (Ethidium Bromide) Risk tanımı: T (Toksik) RİSK İBARESİ VE S İBARESİ R 23 ve R 68 S 36/37 45 İnhalasyon için toksik. Geri dönülmez etkiler riski. Laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven kullanın. Kaza veya rahatsızlık durumlarında, doktora başvurun ve paket etiketini gösterin. R ve S ibareleri kit ile sağlanan konsantre ürünlere işaret etmektedir. Özellikle Ethidium Bromide için, agaroz jelde dilusyona kadar. Konsantre Ethidium Bromide uygulamasında kimyasal dağıtıcı buharlı kabin kullanın. Seyreltilmiş Ethidium solusyonu ile çalışırken daima laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven giyin. Bu ürünler genel çöplere atılamaz. Kurutucu system kullanılmamalıdır. Atılım için yasal kuralları uygulayın. Ethidium Bromide kaza ile dökülmesi durumunda Sodyum Hipoklorit ve su ile temizleyin. İstenildiğinde ürünlerin Güvenlik data sheet (MSDS) gönderilebilir.
Acrylamide/Bis-Acrylamide 29:1 (ACRYLAMIDE) (Kit kod. 04-20A) Risk tanımı: T (Toksik) RİSK İBARESİ VE S İBARESİ R 45 R 46 R 20/21 R 25 R 36/38 R 43 R48/23/24/25 R62 Kansere neden olabilir. Kalıtsal genetik değişikliklere neden olabilir. İnhalasyonu ve deri ile teması zararlıdır. Yutulursa toksiktir. Deri ve gözleri tahriş edicidir. Deri ile teması hassasiyete neden olabilir. Toksik: Uzun süre inhale edilirse, deri ile temas ederse ve yutulursa sağlık için ciddi hasarlara neden olabilir. Fertiliteyi bozacak olası risk. Ürünlerin uygulamasında kimyasal dağıtıcı buharlı kabin kullanın. Daima kimyasal ajanlara dirençli laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven kullanın. Ürünleri su geçirmez kapta tutun. Bu ürünler genel çöplere atılamaz. Kurutucu system kullanılmamalıdır. Atılım için yasal kuralları uygulayın. Kaza ile dökülmesi halinde, kişisel koruma prosedürlerinin uygulanması gerekir. Atılım için magnezyum mıkası ve kum ile absorbe edin ve kapalı bir kutuya toplayın. Ürünleri tamamen aldıktan sonra alanı havalandırın ve kontaminasyonlu bölgeyi yıkayın. İstenildiğinde Ethidium Bromide Güvenlik data sheet (MSDS) gönderilebilir. AB ANALITICA srl - Via Svizzera 16-35127 PADOVA, (ITALY) Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510 e-mail: info@abanalitica.it
6. KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER 6.1 Reaktifler DNA ekstraksiyonu için reaktifler (gerekli kod. 04-23A ve 04-23R) Steril DNase ve RNase free su; Distile su; Agaroz jelelektroforezi için reaktifler (gerekli kod. 04-23R) 6.2 Cihazlar Laminar flow kabini (kontaminasyondan korunmak için amplifikasyon premikse TAQ polymerase eklenirken kullanılması önerilir; ekstrakte DNa eklenirken başka bir laminar flow kabini kullanılması önerilebilir); Mikropipetler (aralık: 0,2-2 µl; 0,5-10 µl; 2-20 µl); Thermal cycler; Thermoblock ya da thermal banyo; Mikrosantrifüj (max 12-14.000 rpm); Tartı; Vorteks; Manyetik ısıtıcı ya da mikrodalga; Kimyasal kabin (Ethidium Bromide uygulamasında kullanılması önerilir); Agaroz minijel için yatay elektroforez haznesi; Güç kaynağı (50-150 V); UV Transilluminator; Foto kamera ya da imaj analizör. Kullanılabilecek fakat kesinlikle şart olmayan ekipmanlar: Orbital shaker, Ethidium Bromide boyaması sırasında poliakrilamid jel karıştırmak için. 6.3 Materyaller Tek kullanımlık eldivenler; Tek kullanımlık filtreli uçlar (aralık: 0,2-2 µl; 0,5-10 µl; 2-20 µl; 100-1000 µl); TBE dilusyonu için dereceli silindirler (1L); Agaroz jel hazırlamak için pyrex şişe ya da Becker; Parafilm.
Ethidium Bromide boyanması için uygun büyüklükte kutu. 7. REAKTİF HAZIRLAMA 1L 1XTBE buffer hazırlama: 200 ml 5X TBE ile 800 ml distile suyu karıştırın. AB ANALITICA srl - Via Svizzera 16-35127 PADOVA, (ITALY) Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510 e-mail: info@abanalitica.it
8. GİRİŞ İnsan genomunda, bazı partiküler yüksek polimorfik DNA bölgeleri tanımlanmıştır, bazıları DNAdizisindeki tandem tekrarlarının değişken sayısına göre polimorfizm ile karakterizedir (uzun polimorfizm). Bu diziler, tekrarlanan dizilerin uzunluğuna bağlı olarak mikrosatellitler (STR) ve minisatellitlerde (VNTR) sınıflandırılmıştır. VNTR (Tandem Tekrarlarının Değişken Sayısı) 9-100 bp uzunluğunda nukleotid dizileri iken STR (Kısa Tandem Tekrarları) 1-6 bp uzunluğundadır. Bu segmentler bir homolog kromozomdan diğerine çeşitli uzunluktadır ve kısmi bir lokusta, her birinde farklı olacak şekilde çeşitli zamanlarda tekrar ederler. Bu genomik bölgelerin uzunluk analizi bireyler arasındaki tanımlamaya ve ayırıma izin verir. İnsan kromozomlarında, VNTR tercihen ön-terminal bölgede bulunurken STR rastgele dağılır ve bu nedenle daha bilgi vericidir. İnsan genomunda STR dağılımı hem kromozomik yeniden düzenlenmede hem de genellikle lösemi ya da hematolojik bozukluklarda genetik bilgi kaybında (monozomi ya da delesyon) kimerizm belirlenmesine izin verir. Bu diziler Mendelian tarzında kalıtılır ve kodlanmayan DNA bölgelerinde bulunduğundan doğal seçilim hedefi değillerdir. Dahası, yüksek değişkenliğe sahip bunlar bireyler arasında kesin bir heterozigotluk gösterirler. AB ANALITICA STR-VNTR kiti allojenik kemik iliği transplantasyonundan sonra aşılanmanın gözlenmesi için kullanılır. Belirleme için, eğer aşılanma ya da nüksetme varsa ve tedaviye karar verildiyse, yakın ve düzenli aralıkta transplante olmuş hastaların periferik kanında donor hücrelerinin görülmesi önemlidir. (A. S. Carter ve arkadaşları, 1998). Kemik iliği transplantasyonu izlenmesi için geleneksel hematolojik metodlar (eritrositer alloantijenler ve kromozomik markırlar, izoenzimler ve sitogenetik metodların belirlemesi), düşük duyarlılık, transfüzyon idaresinin karışımı ve ilk 3-4 haftada bilgi verilememesi gibi bazı sınırlamalara sahiptir, bu nedenle erken fazda olası bir aşılanma kontrolüne sahip değildir. (M. Testi ve ark., 1999; A. de V. van der Z. ve ark., 1997; C. J. Sprecher ve ark., 1996). Günümüzde bu metodlar, ekstrakte edilmiş minimal miktarda genomik DNA örneği ile başlayan PCR gibi yüksek duyarlılıkta testler ile desteklenmektedir. STR/VNTR amplifikasyon metodu genetik olarak ilişkili kişilerin DNAları arasında ayırımı da sağlar (örneğin kardeşler ya da çocuklar ve ebeveynler gibi). Tüm genoma dağılmış yüzlerce tandem tekrarı vardır, fakat PCR tekniği ile sadece bir markır kemik iliği transplantasyonundan sonra aşılanma izlenmesi için yeterlidir (J. H. Antin ve ark., 2001; L. Ugozzoli ve ark., 1991).
STR-VNTR kit metodunda sekiz markır çalışması tüm transplant değerlendirmeleri için planlanmıştır. Markırlar mini- ve mikro-satellitler arasından seçilmiştir ve prosedür donor ve alıcı tarafından periferik kan örneği ile başlar. 9. TEST PRENSİBİ PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) literatürlerde ilk DNA amplifikasyonu metodudur. (Saiki RK ve arkadaşları, 1985). Thermostable DNA polymerase ile DNA nın spesifik bir parçasının (hedef dizi) in vitro amplifikasyon reaksiyonu olarak tanımlanabilir. Reaksiyonda üç nükleik asit segmenti bulunur: Amplifiye olması için çift iplikli DNA kalıbı (hedef DNA) ve iki tek iplikli oligonükleotid primerler kalıp DNA ya spesifik olarak dizayn edilmiştir. DNA polymerase primerler tarafından işaretlenen bölgeden sentez işlemine başlar ve solusyonda serbest olarak bulunan tamamlayıcı nükleotidlerin (dntpler) eklenmesi ve bağlanması ile orjinal çift iplikli hedef DNA bölgesi ile aynı olan yeni çift iplikli DNA molekülünü sentezler. Çeşitli sikluslardan sonra, hedef diziye uygun olan milyonlarca DNA molekülü oluşturabilir. Bu testin duyarlılığı, laboratuar tanısında uygulamaya olanak sağlar. Dahası, amplifikasyon reaksiyonu farklı biyolojik örneklerden başlayarak uygulanır ve oldukça küçük nükleik asit fragmanlarını amplifiye edebildiğinden başlangıç DNA kısmi olarak indirilebilir, formalin-fikse ve parafine gömülü dokudan görülen gibi. 10. ÜRÜN TANIMI STR-VNTR metodunda benimsenen strateji, donorden ve alıcının transplantasyondan önce (TMO-öncesi) ve transplantasyondan sonra (TMOsonrası) periferik kan ya da kemik iliğinden ekstrakte edilen DNA da 8 markırın (STR ve VNTR) amplifikasyonundan meydana gelir. Kemik iliği transplante (BMT) hastalar bazı aylarda düzenli aralıklarla izlenir. Mikro ve mini satellit tiplendirme sistemi alıcıların hücrelerinde tipik donor markırlarının görülmesini ölçmek için yararlıdır; bu yolla transplantasyon kontrolü ve elde edilen bilgiler ile her bir hasta için en uygun tedaviye karar vermek mümkündür. AB ANALITICA srl - Via Svizzera 16-35127 PADOVA, (ITALY) Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510 e-mail: info@abanalitica.it
Alıcının genomik DNAsının transplantasyon sonrası analizi aşağıdaki sonuçları verebilir: Eksiksiz kimerizm: Donorün yalnız genetik karakteri ile hücrelerin transplante hastanın kemik iliğinde görülmesi (ilk toplanan BMT-sonrası örnek). Kararlı kimerizm erken gelişen aşılanmayı işaret eder. Karışık kimerizm: Donor ve alıcı hücrelerinin benzer görülmesi: Bu sonuçlar olası nüksetme ya da hastalık tekrar etmesini gösterebilir (endojen nüfus artışı); Endojen repopulasyon: Sadece alıcı hücrelerinin görülmesi.
10.1. Markırlar hakkında bilgi Hum ARA (İnsan Androjen Reseptörü, STR): Lokalizasyon: kromozom Xcenq13 Alel numarası: 20 Eterozigozite: 90% Tekrar eden dizi uzunluğu: 3 bp PCR ürün uzunluğu: 255-315 bp Hum TH01 (TC11) (İnsan Tyrosine Hydroxylase, STR): Lokalizasyon: kromozom 11p15,5 Alel numarası: 8 Eterozigozite: 76% Tekrar eden dizi uzunluğu: 4 bp PCR ürün uzunluğu: 183-211 bp SE33 (HUMACTBP2 ya da Ac-psi-2) (STR): Lokalizasyon: kromozom 6 Alel numarası: 30 Eterozigozite: 93% Tekrar eden dizi uzunluğu: 4 bp PCR ürün uzunluğu: 234-318 bp vwf2 (von Willebrand Faktör Geni, VNTR): Lokalizasyon: kromozom 12 Alel numarası: >20 Eterozigozite: 81% Tekrar eden dizi uzunluğu: 31 bp PCR ürün uzunluğu: 100-200 bp D1S80 (pmct118) (VNTR): Lokalizasyon: kromozom 1p Alel numarası: 26 Eterozigozite: 79% Tekrar eden dizi uzunluğu: 16 bp PCR ürün uzunluğu: 430-782 bp AB ANALITICA srl - Via Svizzera 16-35127 PADOVA, (ITALY) Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510 e-mail: info@abanalitica.it
YNZ22 (D17S30 o D17S5) (VNTR): Lokalizasyon: kromozom 17p13.3 Alel numarası: >15 Eterozigozite: 84% Tekrar eden dizi uzunluğu: 70 bp PCR ürün uzunluğu: 200-700 bp vwf1 (von Willebrand Faktör Geni, VNTR): Lokalizasyon: kromozom 12 Alel numarası: >20 Eterozigozite: 82% Tekrar eden dizi uzunluğu: 31 bp PCR ürün uzunluğu: 99-150 bp 3 -HVR (D16S85) (Hiperdeğişken Bölge Globin, VNTR) Lokalizasyon: kromozom 16p13.3 Alel numarası: 12 Eterozigozite: 48% Tekrar eden dizi uzunluğu: 17 bp PCR ürün uzunluğu: 200-700 bp
11. ÖRNEK TOPLAMA, MANİPULASYON VE ÖN- MUAMELESİ 11.1 Taze ya da donmuş kan (periferik ve kemik iliği) Örnek toplama tüm genel sterilite önlemlerini takip etmelidir. Kan EDTAlı olarak alınmalıdır. Heparin gibi diğer koagülasyon ajanları TAQ polymerase ın güçlü inhibitörleridir ve bu yüzden amplifikasyon reaksiyonunun verimliliğini bozar. Taze kan kısa bir süre +2 C / +8 C de saklanabilir; eğer bu kısa sürede DNA ekstrakte edilmeyecekse örneğin 20 C de saklanması gereklidir. DNA ekstraksiyon protokolünden önce periferik ya da kemik iliği kan örneğini 1.900 rpm de 10 dakika santrifüj edin; sonra supernatantı atın ve farklı ekstraksiyon protokollerinin ilk aşamasında belirtildiği gibi pelleti alın. 12. PROTOKOL 12.1. Periferik ya da kemik iliğndeni (taze ya da donmuş) DNA ekstraksiyonu AB ANALITICA periferik ya da kemik iliği kan örneğinden DNA ekstraksiyonu için QIAMP DNA BLOOD mini kit (QIAGEN) kullanmanızı önerir. Saf ve integral DNA izolasyonu sağlayan diğer herhangi bir ekstraksiyon metodunu da kullanabilirsiniz. AB ANALITICA srl - Via Svizzera 16-35127 PADOVA, (ITALY) Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510 e-mail: info@abanalitica.it
12.2. DNA AMPLİFİKASYONU 12.2.1. Markırların amplifikasyonu: Hum ARA, Hum TH01, SE33, D1S80, vwf2. Biz beş markırın Hum ARA, Hum TH01, SE33, D1S80, vwf2 amplifikasyonu ile olan metodla başlamanızı öneririz, çünkü bunlar daha bilgi vericidir ve tanımlayıcı amplifikasyon profiline sahiptir. Sadece yorumlanamaz sonuçlar ya da yetersiz bilgi verici olduğunda vwf1, 3 -HVR ve YNZ22 markırlarının amplifikasyonu ile çalışın. Örneğin; her bir premiks tüpüne aşağıdakileri ekleyin (46,5 µl miks): 0,5 µl AB Taq 3 µl Ekstrakte DNA Kısa süre santrifüj edin. Mikrotüpleri aşağıdaki thermalcycler programına koyun: 1 cycle 94 C 2 min 30 cycles 94 C 60 C 72 C 60 sec 60 sec 60 sec 1 cycle 72 C 10 min storage 4 C Amplifikasyon ürünlerinin uzunluğu: Hum ARA: Hum TH01 SE33 D1S80 vwf2: 255-315 bp 183-211 bp 234-318 bp 430-782 bp 100-200 bp
12.2.2. Markırların amplifikasyonu: vwf1, 3 -HVR, YNZ22 Herbir markır vwf1 ve YNZ22 amplifikasyonu için aşağıdaki gibi bir reaksiyon miks hazırlayın: Reaktif miktar 10X Buffer 5 μl MgCl 2 1,5 μl dntps 5 μl 3 Primer 2 μl 5 Primer 2 μl Steril H 2 O 31 μl AB Taq 0,5 μl Markır 3 HVR amplifikasyonu için aşağıdaki gibi bir reaksiyon miks hazırlayın: Reaktif miktar 10X Buffer 5 μl MgCl 2 1,5 μl dntps 5 μl gliserol 5 μl 3 Primer 2 μl 5 Primer 2 μl Steril H 2 O 26 μl AB Taq 0,5 μl Herbir tüpe PCR miks ile beraber ekleyin: Ekstrakte DNA 3 μl AB ANALITICA srl - Via Svizzera 16-35127 PADOVA, (ITALY) Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510 e-mail: info@abanalitica.it
Kısa sure santrifüj edin, sonra mikrotüpleri aşağıdaki thermalcycler programına koyun: 1 cycle 94 C 2 min 30 cycles 94 C 55 C 72 C 60 sec 60 sec 60 sec 1 cycle 72 C 10 min storage 4 C Amplifikasyon ürünlerinin uzunluğu: YNZ22: vwf1: 3 -HVR: 200-700 bp 99-150 bp 200-700 bp
12.3. Amplifikasyon ürünlerinin görüntülenmesi: 12.3.1. Agaroz jel elektroforezi %2 agaroz jel hazırlayın: 1 g Agaroz tartın ve 50 ml 1X TBE içine dökün. Solusyonu berrak oluncaya kadar manyetik ısıtıcı ya da mikrodalga içine bırakın. Jeli el ile dokunabilecek kadar soğumaya bırakın (3-5 dakika) ve 10 µl Ethidium Bromide (2,5 mg/ml) ekleyin. NOT: Ethidium Bromide güçlü bir mutajenik ajandır: Daima eldiven kullanın ve bu reaktifle ya da içeren jel ile çalışırken tercihen kimyasal güvenlik kabini altında çalışın. Jeli tarakları ile birlikte uygun bir dökme tankına koyun ve oda ısısında soğuyana kadar bekleyin ya da jel katı hale gelene kadar buzdolabına koyun. Amplifikasyonda çok örnek bulunduğunda iki tarak kullanmanızı öneririz. Jel katılaştığında, dikkatlice tarakları çıkarın (jel kuyucuklarına zarar vermemeye dikkat edin), tankı elektroforez haznesine alın ve jelin üzerini tamamen kaplayana kadar uygun miktarda TBE buffer ekleyin (yaklaşık jel yüzeyinin 1-2mm üzerinde). 12.3.2. Jelde örnek yükleme Amplifikasyon ürünlerinin görüntülenmesi için tüpte ya da direk parafilm üzerinde aşağıdakileri karıştırın: 2 μl 6X Blue* 10 μl PCR ürünü ya da DNA Moleküler Ağırlık Markır* (HMW) NOT: 6X Blue* ve DNA Moleküler Ağırlık Markır * kit içinde bulunur. 04-20A sadece, eğer diğer yükleme buffer ya da moleküler ağırlık markırı kullanılacaksa, üreticisinin kılavuzuna bakın. Miski jel kuyucuklarına yükleyin; güç kaynağını açın ve voltajı 80-90 V arasına ayarlayın. 2 saat jeli yürütün ve sonra UV transilluminatore koyun; amplifikasyon ürünlerinin boyutunu referans AB ANALITICA srl - Via Svizzera 16-35127 PADOVA, (ITALY) Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510 e-mail: info@abanalitica.it
Moleküler Ağırlık Markırı ile karşılaştırarak analiz edin. DNA Moleküler Ağırlık Markır ( HMW, kit içinde bulunan, sadece 04-20A) DNA bantları: 1114, 900, 692, 501-489, 404, 320, 242, 190, 147, 124, 110, 67, 37, 34, 26, 19 bp NOT: %2 agaroz jelde 501-489 bp bantlar genellikle tam olarak çözülmez ve tek bir bant olarak görülür; 26 ve 34 bp bantları bazen görünmek için çok küçük olur (düşük moleküler ağırlıklarından dolayı). NOT: UV ışınları deri ve en önemlisi gözler için tehlikelidir: daima eldiven ve koruyucu gözlük kullanın ya da UV transilluminatorün koruyucu ekranını kullanın. Agaroz jel elektroforezi ile DNA amplifikasyon değerlendirmesinden sonra, sonraki adım %12 poliakrilamid jel elektroforezi sonuçların yorumlanması için gereklidir. 12.3.3. Sonuçların yorumlanması 8 markır ile amplifikasyon aşağıdaki sonuçları vermelidir: Markır Hum ARA Hum TH01 SE33 vwf2 D1S80 YNZ22 vwf1 3 -HVR DNA bandı 255-315 bp 183-211 bp 234-318 bp 100-200 bp 430-782 bp 200-700 bp 99-150 bp 200-700 bp
Sütun 1/7: DNA Moleküler Ağırlık Markır Sütun 2: HumARA markır(255-315 bp) Sütun 3: HumTH01 markır (183-211 bp) Sütun 4: SE33 markır (234-318 bp) Sütun 5: vwf2 markır (100-200 bp) Sütun 6: D1S80 markır (430-782 bp Fig. 1: Markırların amplifikasyonunu doğrulamak için 1X TBE de %2 agaroz jel elektroforezi: HumARA, HumTH01, SE33, vwf2, D1S80. Sütun 1: Sütun 2: Sütun 3: Sütun 4: DNA Moleküler Ağırlık Markır YNZ22 markır (200-700 bp) 3 -HVR markır (200-700 bp) vwf1 markır (99-150 bp) Fig. 2: Markırların amplifikasyonunu doğrulamak için %2 agaroz jel elektroforezi: YNZ22, vwf1, 3 -HVR. AB ANALITICA srl - Via Svizzera 16-35127 PADOVA, (ITALY) Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510 e-mail: info@abanalitica.it
12.3.4. Poliakrilamid jel elektroforezi Jel dökmek için elektroforez cihazında cam pleyt ve spacerları hazırlayın. Akrilamid solusyonu sızıntısını önlemek için jel kaplayıcı bant ile iki tarafın uzunluğunu ve pleytlerin tabanını kapatın. %12 akrilamid jel hazırlığı ile devam edin: 15x15 jel 0,75 mm genişlik için 50 ml tüpe aşağıdakileri ekleyin: 1X TBE Akrilamid H 2 O 10%APS 6 ml 9 ml 30 ml ye kadar 300 μl Hava kabarcığı oluşumunu önlemek için dikkatlice karıştırın. 30 μl TEMED ekleyin, karıştırın ve şırınga ile iki cam pleyt arasındaki boşluğa dökün. Uygun tarakları yerleştirin ve klips yardımıyla tutturun. Akrilamidin polimerize olmasına izin verin. Polimerizasyon tamamlandıktan sonra (polimerizasyonun tamamlandığını tüpteki akrilamid çöküntüsünü kullanarak kontrol edin), dikkatlice tarakları uzaklaştırın, akrilamid posalarını uzaklaştırmak için su ile kuyucukları yıkayın (şırınga ile). Cam tabanı (jel) en az 3-5 mm ıslatmak için elektroforez cihazına 1X TBE buffer ekleyin. Jeli elektroforez tankına ekleyin ve rezevuarı 1X TBE buffer ile doldurun, elektrodlar ile bağlantı kurun. 210 V voltajda 15-20 dakika ön-yürütme yapmanızı öneririz. Sonra aşağıda tarif edildiği gibi örnek yükleme yapın.
12.3.5. Poliakrilamid jelde örnek yükleme Test tüpünde ya da direk parafilmde aşağıdakileri karıştırın: 2 μl 6X Blue 10 μl PCR ürünü ya da DNA Moleküler Ağırlık Markır (HMW) * NOT: 6X Blue* ve DNA Moleküler Ağırlık Markır * kit içinde bulunur. 04-20A sadece, eğer diğer yükleme buffer ya da moleküler ağırlık markırı kullanılacaksa, üreticisinin kılavuzuna bakın. Jel kuyucuklarına miski yükleyin. Elktrodlar ile bağlantı kurun, güç kaynapını açın ve voltajı 210 V ayarlayın. Markır boyanın (Xylene cyanol) ikinci koyu mavi bandı jel sonuna yaklaştığında yürütmeyi durdurun. 12.3.6. Ethidium Bromide ile jel boyama Cam pleyti çıkartın ve dikkatlice jeli 1X TBE ve Ethidium Bromide (herbir 50 ml 1X TBE için 10 μl Ethidium Bromide ekleyin) içeren boyama solusyonuna batırın. Çalkalayarak yaklaşık 10-15 dakika inkübe edin. Jeli UV transilluminatore koyun; amplifikasyon ürünlerinin boyutunu referans markır (HMW) ile karşılaştırarak sonuçları analiz edin. DNA Moleküler Ağırlık Markır (HMW) * DNA fragman boyutu: 1114, 900, 692, 501-489, 404, 320, 242, 190, 147, 124, 110, 67, 37, 34, 26, 19 bp. NOT: DNA Moleküler Ağırlık Markır * kit içinde bulunan, 04-20A sadece, eğer diğer yükleme buffer ya da moleküler ağırlık markırı kullanılacaksa, üreticisinin kılavuzuna bakın. 13. SONUÇLARIN YORUMLANMASI AB ANALITICA srl - Via Svizzera 16-35127 PADOVA, (ITALY) Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510 e-mail: info@abanalitica.it
Poliakrilamid jelin çözülme gücü az bazın farklılığı ile DNA fragmanlarının ayrılmasını sağlar. Bu nedenle, donorün ve TMO-sonrası kimerizm analizi için alıcının karakteristik polimorfizminin olası analizini yapar. Alıcının genomik DNAsının transplantasyon sonrası analizi aşağıdaki sonuçları verebilir: Eksiksiz kimerizm: Donorün yalnız genetik karakteri ile hücrelerin transplante hastanın kemik iliğinde görülmesi (ilk toplanan BMT-sonrası örnek). Kararlı kimerizm erken gelişen aşılanmayı işaret eder. Karışık kimerizm: Donor ve alıcı hücrelerinin benzer görülmesi: Bu sonuçlar olası nüksetme ya da hastalık tekrar etmesini gösterebilir (endojen nüfus artışı); Endojen repopulasyon: Sadece alıcı hücrelerinin görülmesi. Sütun 1/7: DNA Moleküler Ağırlık Markır Sütun 2: HumARA markır(255-315 bp) Sütun 3: Markır HumTH01 (183-211 bp) Sütun 4: Markır SE33 (234-318 bp) Sütun 5: Markır vwf2 (100-200 bp) Sütun 6: Markır D1S80 (430-782 bp) Fig. 3: 1X TBE de %12 akrilamid jel elktroforezi: sonuç yorumlama ve kimerizm analizi.
14. SORUN GİDERME 1. Amplifikasyon ürünü olmaması Mastermiks doğru olarak hazırlanmamıştır - -Uygun volümde pipet ve uçlar kullanın (pipet aralığı 0,2-2 μl); - -Görsel olarak TAQ polymerasın premikse difüze olduğunu gözleyin: Bu basittir, çünkü enzim, yüksek bir densiteye sahip olan gliserolde çözülür; Alternative olarak, tüp duvarına konulmuş olan TAQ polymerasın görsel olarak teyit edin, sonra kısa bir süre santrifüj edin. Thermalcycler doğru olarak programlanmamıştır - Thermalcycler programının uygunluğunu ve kullanıcı kılavuzundaki sıcaklık profilini kontrol edin. Kit uygun şekilde çalışmaz - Amplifikasyon reaktiflerini -20 C de saklayın; - Reaktiflerin tekrar tekrar dondurulup/çözdürülmesinden kaçının. Ekstraksiyon aşaması sırasında olası problemler: - Ekstraksiyon kitinin kullanıcı kılavuzunu dikkatlice kontrol edin. - Ekstraksiyon kitinin kullanıcı kılavuzunun sorun giderme kısmına başvurun. - Yeni bir örnek ile doğru şekilde tekrar DNA ekstraksiyonu yapın. Bazı inhibitörler ve amplifikasyon reaksiyonu ile etkileşen diğer faktörler görülmüştür. - Elde edilen DNa solusyonu saf değildir (oran A260/A 280 düşüktür). Ekstraksiyon protokülünü doğru yaptığınızdan emin olun ve yeni bir örnek ile ekstraksiyonu tekrar edin; AB ANALITICA srl - Via Svizzera 16-35127 PADOVA, (ITALY) Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510 e-mail: info@abanalitica.it
- Elde edilen DNA solusyonunda rezidüel RNA bulunur (A260/A 280 oranı çok yüksektir), RNase ile sindirme aşamasında elimine edilebilir. 2. Poliakrilamid jel Ethidium Bromide boyamasından sonra yorumlanabilir sonuçlar vermez Elektroforetik yürütme çok kısa olmuştur - Jeli mavi boya (xylene cyanol) jelin sonuna ulaşıncaya kadar yürütün; - Jel kuyucuklarında çok fazla DNA yüklenmiştir: Poliakrilamid jele yüklemeden önce agaroz jelde amplifiye ürünlerin iyi olduğunu kontrol edin. Herhangi bir problemde AB ANALITICA teknik destek ile irtibata geçin. e-mail: laboratorio@abanalitica.it.
15. TEST LİMİTLERİ Kit performansı aşağıdaki durumlarda azalır: Klinik örnekler bu analiz için uygun değildir (heparin antikoagülant olarak kullanılan kan örnekleri uygun değildir); DNA, amplifikasyon rekasiyonunun inhibitörlerigörüldüğü için amplifiye olamaz. 16. TEST PERFORMANSI 16.1. Özgünlük En önemli bilgi bankasındaki primer dizi sıralaması spesifik olmayan dizilerin yokluğunu gösterir ve farklı STR ve VNTR markırlarının spesifik amplifikasyonunu garanti eder. AB ANALITICA srl - Via Svizzera 16-35127 PADOVA, (ITALY) Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510 e-mail: info@abanalitica.it
17. BİBLİYOGRAFİK REFERANSLAR Joseph H. A. et al., Establishment of Complete and Mixed Donor Chimerism After Allogenic Lymphohematopoietic Transplantation: Recommendations From a Workshop at the 2001, Tandem Meetings; Biology of Blood and Marrow Transplantation 7: 473-485 (2001); 2001 American Society for Blood and Marrow Transplantation; R. L. Alford et al., Rapid and Efficient Resolution of Parentage by Amplification of Short Tandem Repeats; Am. J. Hum. Genet. 55: 190-195 (1994); L. Buscemi et al., PCR typing of the locus D17S30 (YNZ22 VNTR) in an Italian population sample; Int. J. Med. 106: 200-204 (1994); P. Kopp et al., Clonal X-inactivation analysis of human tumours using the human androgen receptor gene (HumARA) polymorphism: a non-radioactive and semiquantitative strategy applicable to fresh and archival tissue; Molecular and Cellular Probes 11: 217-228 (1997); J. J. Sreenan et al., The Use of Amplified Variable Number of Tandem Repeats (VNTR) in the Detection of Chimerism Following Bone Marrow Transplantation. vol. 5, n. 8: 1857-1863 (1986); R. Wooster et al., Instability of short tandem repeats (microsatellites) in human cancer; Nature Genetics, vol. 6: 152-156 (1994); C. Gaucher et al., Von Willebrand disease family studies: comparison of three methods of analysis of the von Willebrand gene polymorphism related to a variable number tandem repeat sequence in intron 40; British Journal of Haematology, 82: 73-80 (1992); M. Testi et al., Monitoraggio molecolare dell attecchimento nel trapianto di midollo osseo mediante analisi dei polimorfismi VNTR/STR; La trasfusione del sangue, 44, n. 6: 329-332 (1999); J. M: Butler et al., Quality control of PCR primers used in multiplex STR amplification reactions; Forensic Science International, 119: 87-96 (2001); G. Martinelli et al., Early detection of bone marrow engraftment by amplification of hypervariable DNA regions; Hematologica, 82: 156-160 (1997); L. Ugozzoli et al., Amplification by the Polymerase Chain Reaction of
Hypervariable Regions of the Human Genome for Evaluation of Chimerism After Bone Marrow Transplantation; Blood, 77, n. 7: 1607-1615 (1991); de Vries-van der Zwan et al., Specific Tolerance Induction and Transplantation: a Single-Day Protocol; Blood, 89, n. 7: 2596-2601 (1997) C. J. Sprecher et al., General Approach to Analysis of Polymorphic Short Tandem Repeat Loci; BioTechniques, 20: 266-276 (1996) S. Carter et al., Detection of Microchimerism After Allogenic Blood Transfusion Using Nested Polymerase Chain Reaction Amplification With Sequence-Specific Primers (PCR-SSP): A Cautionary Tale; Blood, 92, n. 2: 683-689 (1998) AB ANALITICA srl - Via Svizzera 16-35127 PADOVA, (ITALY) Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510 e-mail: info@abanalitica.it