Kullanım Talimatları SAS-3 İdrar Analizi Katalog No: 300400
KULLANIM AMACI SAS-3 İdrar Analiz Kiti agaroz jel elektroforez ile konsantre edilmemiş idrar numunelerinin taraması için tasarlanmıştır. Üriner proteinler böbrekte filtre edilen plazma proteinlerinden oluşur. İdrarda anormal plazma proteinler renal fonksiyon değerlendirmesinde büyük değere sahiptir. Proteinüri ile ilgili çalışmalar atılmış proteinlerin miktar ve türünün kantitatif ve kalitatif değerlendirmesini içermelidir 1-5. İmmuno çökme ile spesifik protein türlerinin tespiti ile çiftleşmiş idrar proteinlerinin elektroforetik ayrışım kombinasyonu, Dysglobulinaemias 1-5 ile ilişkili proteinüri-fizyolojik, Glomerüler (seçici ve seçici olmayan), Boru ve proteinüri in çeşitli türlerinin farklılaşmasına olanak sağlar. SAS 3 İdrar Analizi kiti bir agaroz jelde yüklere göre idrarda proteinleri ayırır. Proteinler daha sonra kantitatif veya kalitatif yorum ve görüntüleme için boyanır. Kitte kullanılan yüksek duyarlılıklı boya konsantrasyonsuz test edilecek olan çoğu idrar örneklerin boyanmasını sağlar. İdrar Protein İç Standart ın kullanımı densitometre olarak belirlenecek olan protein konsantrasyonunun tek tek bant ya da idrar total protein yaklaşımına olanak sağlar. UYARILAR VE ÖNLEMLER Tüm kitler yalnızca in-vitro diyagnostikte kullanım içindir. Herhangi bir kit bileşenini ağzınızla pipetlemeyin yada yutmayın. Tüm kit bileşenlerinin işlemi sırasında eldiven giyin. Risk, güvenlik koşulları ve atım bilgisi için ürün güvenlik kağıdına başvurun. BİLEŞENLER 1. SAS-3 İdrar Analiz Jel (x10) Agaroz koruyucu olarak sodyum azid ve thimersal ile bir Tris/Barbital buffer içerir. Paket içindeki jel kullanım için hazırdır. 2. Konsantre Mor Asid Boya(1x75ml) Konsantre mor asid boya içerir. Şişe içeriği 700ml saf su ile dilüe edin. Kullanım öncesi karıştırılır ve filtre edilir. İyi kapatılmış bir şişede saklanır. 3. Konsantre Boya Arındırıcı Solüsyon (2x 10g Destain A, 2x 40ml Destain B) Boya arındırıcı A içeriği 2 litre saf su ile dilüe edin. Sonra Boya Arındırıcı B içeriğini ekleyin ve ilaveten 3 litre saf su yavaşça ekleyin. 4. Yıkama Solüsyonu (2x50ml) Konsantre Yıkama Solüsyonu içerir. Şişe içeriğini 5 liter saline solüsyon ile dilüe edin. 5. Diğer Kit Bileşenleri Her kit kullanım için talimatlar ve 10 jeli tamamlamak için yeterli miktarda C,D kurutma kağıtları ve kurutma tarağı içerir. SAKLAMA VE RAF ÖMRÜ 1. SAS-3 İdrar Analiz Jel Jeller 15-30 derecede saklanmalıdır ve paket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. DOLABA KOYMAYIN VEYA DONDURMAYIN. Jelin bozulması : 1) jelin dondurulması kristal görünümü belirtir, 2) jelin kuruması, 1
çatlama ve kuruluğu veya 3) bakteriyal ya da fungal kaynaklı agarozun kontaminasyonunu belirtir. 2 - Mor Asit Boya Konsantre boya 15-30 derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Dilüe boya solüsyonu 15-30 derecede 6 ay stabildir. Boya kapasitesinin azalmasını önlemek için derhal kullanılan boyanın çıkarılması tavsiye edilir. Zayıf boyama performansı, boya solüsyonunun bozulduğunu belirtebilir. 3 - Boya Arındırıcı Solüsyon Konsantre boya arındırıcı solüsyon 15-30 derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Dilüe boyadan arındırıcı solusyon 15-30 derecede 6 ay stabildir. 4 -Yıkama Solüsyonu Konsantre yıkama solüsyonu 15-30 derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Dilüe yıkama solüsyonu 15-30 derecede 6 ay stabildir. Bulanıklık yıkama solüsyonunu bozukluğunu belirtebilir. SAĞLANMAYAN FAKAT GEREKSİNİLEN ÖĞELER Kat. No. 310200 Sample Applicator Blades (1 x 10) Kat. No. 310300 Sample Applicator Blades (5 x 10) Kat. No. 210100 Disposable sample cups (100) Kat. No. 310210 SPIFE Urine Protein Accessory kit Kat. No. 3380 SPIFE Urine IFE Allignment Guide Kat. No. 3100 REP Prep Saline solusyonu (%85 NaCl) Aşağıdaki öğeler standart idrar analizi için gerekli değildir ancak İdrar IFE ve daha fazla araştırma için gerekli olabilir: Kat. No. 320100 Antiserum to Human Urine Total Protein (5ml) Kat. No. 320200 Antiserum to Human Urine Micro Proteins (5ml) Kat. No. 320300 Antiserum to Human Urine Macro Proteins (5ml) Kat. No. 320400 Antiserum to Human GAM Proteins (5ml) Kat. No. 320700 Antiserum to Human Free & Bound Kappa Light Chain (5ml) Kat. No. 320800 Antiserum to Human Free & Bound Lambda Light Chain (5ml) Kat. No. 320500 Antiserum to Human Free Kappa Light Chain (5ml) Kat. No. 320600 Antiserum to Human Free Lambda Light Chain (5ml) Kat. No. 320900 Antiserum to Human Urine Pentavalent/Albumin (5ml) Kat. No. 321000 Antiserum to Human Urine Pentavalent (5ml) Kat. No. 9249 Antiserum to Human IgD Kat. No. 9250 Antiserum to Human IgE NUMUNE TOPLANMASI VE HAZIRLANMASI Tercih edilen numune taze toplanan idrardır. Numuneler 2...6 C de 72 saate kadar ya da -20 C de 2 haftaya kadar buzdolabında saklanmalıdır. Total protein 1000mg/L ın üstünde olmazsa numuneler konsantrasyon veya dilüsyon olmadan başlangıçta kullanılmamalıdır. 2
ADIM-ADIM PROSEDÜR 1. Cihaza aşağıdaki parametreleri programlayın: (SPIFE COMBO /SPIFE 2000 kullanıcıları ileri elektroforez adımına sadece programlanmalıdır) Adım Zaman(dk:sn) Sıcaklık(derece) Voltaj Diğer Numune Yükleme 00:30 21 Hız 1 Numune Uygulama 00:30 21 Hız 1* Tekrar testleri 10 uygulama için load sample, apply sample. Elektroforez 06:30 21 650 Kurutma 08:00 54* *1 SPIFE 3000 / SAS-3 için pozisyon 2 kullanılır. *2 Eğer immunfiksasyon protokolune devam edilicekse, Dry adımını dahil etmeyin. 2. Sadece SPIFE 3000 / SAS-3 kullanıcıları: Aplikatör ucunu cihaz üzerindeki pozisyonuna yerleştirin: NOT: İdrar Tarama için: 1-20, 21-40 ve 41-60 pozisyonları kullanılabilir. Immunofiksasyon için: 7, 14, 27, 34, 47 ve 54 pozisyonlarını örnek ile yüklenmez. 3. SPIFE 3000 / SAS-3 kullanıcıları: Tek kullanımlık uygun numune kaplarına 35μl numune pipetleyin. Buharlaşmadan numuneleri koruyun. 4. Jeli paketinden çıkarın ve kaplamasını atın. 5. Jelin yüzeyi kurutma kağıdı C ile kurutulur, kurutma kağıdı alınır. 6. SPIFE Combo / SPIFE 2000 kullanıcıları: SPIFE Urine IFE Alignment Guide üzerine jeli koyun ve hizayıcı pimleri kullanarak jel üzerine templaytı koyun. Templaytın üzerine kurutucu A koyun ve iyi temas ettiğinden emin olmak için parmağınızla yarıkları ovun. Kurutucuyu çıkarın ve 8. adımda kullanmak üzere saklayın. Jeli çıkarın. 7. 2ml REP Prep i bölmenin sol tarafına boşaltın ve dikkatlice bölme içine jeli koyun, bölme içindeki iğneler ile jel bağlarındaki delikleri hizalayın ve jelin altında kabarcık oluşturmamaya dikkat edin. Elektrot kollarına elektrotlar eklenir böylece jel blokları ile temasa ederler. 8. SPIFE Combo / SPIFE 2000 kullanıcıları: Uygun yarığa 3μl örnek uygulayın ve 10 dakika için emmesini bekleyin. Örnek emildikten sonra, 6 adımda ayrılmış kurutucuyu A ile temaplayti kurutun ve her kurutucuyu hem de templaytı çıkarın. 9. Urine Analysis test programını seçin ve ardından elektroforez yapmak ve jeli kurutmak için komutları seşin. ( SPIFE 3000 / SAS-3 kullanıcıları için: örnekleri uygulayın). 10. Elektroforezin ardından, elektrotları ve Gel Block Remover kullanarak her iki jek bloklarını çıkarın. 3
NOT: Kuru jeller numunede tüm proteinlerin bulunduğunu göstermek için boyanabilir (bkz. Boyama protokol). Islak jelleri ilgili proteinleri göstermek için spesifik antiserumlar ile inkübe edebilir (bkz. immunofiksajyon protokol). BOYAMA PROTOKOL 11. Cihaza aşağıdaki parametreleri programlayın: 12. Boyama tank tutucusuna jeli koyun. 13. Boyama biriminde Urine Analysis test programı seçilir ve ardından jele boyama ve kurutma komutu verilir. 14. Boyama işleminin sonunda, boyama alanından jeli alın. Jel şimdi incelenmek için hazırdır. IMMUNOFIKASYON PROTOKOLU 11. Cihazda aşağıdaki parametreleri programlayın. 12. Jel üzerine antiserum uygulama templaytını yerleştirin. NOT: İşlenmiş antiserum kanalları jel üzerine uygun yere yerleştirilir. 13. Immunoglobin hatlarının deliğine 2 damla (veya 60μl) uygun antiserum/ sabitleştirici uygulayın. Antiserumların tamamen kanallarının doldurduğuna emin olun. 14.Jeli inkübe edin. 15.İnkübasyon sonrası antiserum templayt delikleri içine kurutucu bir tarak yerleştirin. Fazla antiserumun emilmesi için 2dk bekletin, sonra tarakları ve templaytı jel yüzeyinden alın. 4
16. Jelin yüzeyine bir kurutucu D yerleştirin, 10 saniye bırakın ve geri alın. 17. Kurutucu D yi alın ve jeli kurutun. Not: Kullanımdan hemen sonra, antiserum templaytı biyosidal deterjan ile temizleyin. Eğer mümkün ise, tüp fırçası veya küçük test tüp yıkayıcısı ile dip kısımları temizlenir. Antiserum templaytı kuruması için bırakın. Antiserum uygulama adımı boyunca templaytın yüzeyindeki antiserumun birikmesi hava kabarcığı olmasına neden olacaktır. Deliklerde su kalması, sonraki kullanım için antiserum uygulamasını engelleyecektir. Hava sirkülasyonunu arttırmak için templayt baş-aşağı saklanır. 18. Boyama tankı tutucusuna jeli koyun. 19. Boyama biriminde IFE test programı seçin ve ardından jele boyama ve kurutma komutu verilir. 20. Boyama siklusunun sonunda, boyama alanından jeli alın. Jel şimdi incelenmek için hazırdır. SONUÇLARIN YORUMLANMASI Monoklonal proteinlerin çoğunluğu protein paternin gama bölgesine katotik alana göç eder fakat anormal doğasından dolayı protein elektroforezinde globulin bölgesinde herhangi bir yere de göç edebilir. İmmünofiksasyon paternde monoklonal protein bant serum protein paterni üzerinde anormal bant gibi aynı şekil ve pozisyonda oluşur. Anormal protein reaksiyon verdiği antiserum tipi ile tanımlandırılır. Anormal proteinin düşük konsantrasyonları varsa, anormal bant normal poliklonal immünoglobulin içinde bir bant gibi görülebilir. Ayrıca bir bant, bir büyük poliklonal immünoglobulin varsa bir poliklonal arka planında görülebilir. İstek üzerine Helena BioSciences den, Monoklonal Gammopatilerin tanımlandırılması için İmmünofiksasyon yayınına ulaşılabilir. İdrar immunofiksasyonu: Proteinuria nın tipi Jelde görülen bantlar Mevcut proteinler Normal ürin küçük albumin band albumin Glomerular Albumin, alfa-1, beta, gama albumin, alfa-1 antitripsin, transferrin, gama globulinler Tubüler alfa-1, alfa-2, beta Retinol bağlayıcı Protein, beta2-mikroglobulin, alfa-2 mikroglobulin Taşan gama veya çeşitli immunoglobulins, Serbest hafif zincirleri KALİTE KONTROL Normal bir serum örneği (serum fizyolojikte 1:100 oranında dilue edilmiş) her bir bandın pozisyonunu belirlemek için kullanılabilir. 5
SINIRLAMALAR 1. Antijen fazlalığı Presipitasyon alanında antijen fazlalığı, eğer antikor miktarı az veya antijen/antikor eşitsizliği varsa meydana gelecektir. IFE de antijen fazlalığı genellikle hasta numunesindeki immünoglobulin fazlalığına dayanır. Antijen fazlalığı prozoning ile karakterize edilir (kenarlarının etrafının boyanması ile immunofixed protein bandının merkezinde boyanmamış alanlar). Numunenin yüksek dilüsyonu immünoglobulin konsantrasyonunu optimize etmek için kullanılmalıdır. 2. IFE antiserumu ile reaksiyon göstermeyen gama bölgesindeki Katodik bant. C reaktif protein (CRP), akut inflamatuar yanıt sonucu hastada tespit edilebilir. CRP, serum protein paterninin katodik sonuna yakın bir bant olarak görülür. CRP nin destekleyici kanıtları, yükseltilmiş alfa 1-Anttripsin ve haptoglobulindir. CRP bantlı hastalar, muhtemelen CRP için test edildiği zaman yüksek seviyeye sahip olacaktır. 3.Kappa ve Lambda antiserumları ile reaksiyon vermez. Genellikle bir numune ağır zincir antiserumu ile reaksiyon verir fakat belli hafif zincir reaksiyonu vermez. Bu durumda, aşağıdaki durumlar ihtimal dışı bırakılır; a)ağır zincir hastalığı, b)hafif zincirlerin çok yüksek konsantrasyonları sonucu antijen fazlalığı, c)hafif zincirinin düşük konsantrasyonları, d)antiserum ile reaksiyon vermeyen atipik hafif zincir molekülü, e)saklı hafif zincir determinantları ile hafif zincirleri ( IgA ve IgD ile genellikle görülür) Kesin sonuçlar almak için, test çalışması; a) antikor/antijen eşitliliği sağlamak için çok yüksek veya düşük numune dilüsyonu, b) atipik immünoglobulinlerin tespiti için bir üreticiden daha fazla gelen antiserum, c) reveal hafif zincirler için beta-2-merkaptoethanol ile numune işlemi içerir. PERFORMANS ÖZELLİKLERİ a) Hassasiyet Tamamlanan jelde bir ayrık bant gibi görünen proteinin en düşük konsantrasyonu 20mg/L olarak belirlenmiştir. b)doğrusallık Metodun doğrusallığı, jel performansı için densitometre özelliğinin bir fonksiyonudur. Laboratuarda kullanılan densitometreye dayalı metodun doğrusallığının belirlenmesi her müşteriye tavsiye edilir. BİBLİYOGRAFİ 1. Fauchier, P. and Catalan, F. Interpretive Guide to Clinical Electrophoresis Alfred Fournier Institute, Paris, France, 1988. 2. Killingsworth, L.M., Cooney, S.K. and Tyllia, M.M. Finding Clues to Disease in Urine Diagnostic Medicine, 1980 ; May/June : 69-75. 3. Umbreit, A. and Wiedemann, G. Determination of Urinary Protein Fractions. A Comparison With Different Electrophoretic Methods and Quantitatively Determined Protein Concentrations Clin. Chim. Acta., 2000; 297 : 163-172. 4. Wiedemann, G. and Umbreit, A. Determination of Urinary Protein Fractions by Different Electrophoretic Methods, Clin. Lab.; 1999, 45 : 257-262. 6
5. Wong, W.K., Wieringa, G.E., Stec, Z., Russell, J., Cooke, S., Keevil, B.G. and Lockhart, S. A Comparison of Three Procedures for the Detection of Bence-Jones Proteinuria Ann. Clin. Biochem., 1997, 34 : 371-374. 6. Alper, C.A and Johnson, A.M., Immunofixation Electrophoresis: A Technique for the Study of Protein Polymorphism, Vox. Sang., 1969; 17 : 445-452. 7. Alper, C.A., Genetic Polymorphism of Complement Components as a Probe of Structure and Function, Progress in Immunology. First International Congress of Immunology. 1971 : 609-624, Academic Press, New York. 7