INNO-LiPA HLA-DPB Amplifikasyon

INNO-LiPA HLA-DPB Amplifikasyon ANAHTAR-KODU: FRI33177 80345 INNO-LiPA HLA-C Amplifikasyon 28798 v1 2015-04-24 p 1/7 Türkçe Tarafından üretildi: Fujirebio Europe N.V. Technologiepark 6 9052 Gent Belgium Tel. +32 9 329 13 29 BTW BE 0427.550.660 RPR Gent Tarafından dağıtılan: Fujirebio Europe N.V. Tel. +32 9 329 13 29 Fax +32 9 329 19 11 customer.support@fujirebio-europe.com Fujirebio Germany GmbH Tel. +49 511 857 3931 Fax +49 511 857 3921 germany@fujirebio-europe.com Fujirebio France SARL Tel. +33 1 69 07 48 34 Fax +33 1 69 07 45 00 france@fujirebio-europe.com Fujirebio Italia S.r.l. Tel. +39 06 965 28 700 Fax +39 06 965 28 765 italy@fujirebio-europe.com Fujirebio Iberia S.L. Tel. +34 93 270 53 00 Fax +34 93 270 53 17 spain@fujirebio-europe.com "Vurgulanan Not değişiklikleri" Diğer Dillere bakınız / Autres langues voir / Andere Sprachen siehe / Altre lingue vedere / Ver otros idiomas / Outras línguas ver: www.e-labeling.eu/fri33177 EUROPE +800 135 79 135 GR 00 800 161 220 577 99 IS 800 8996 LT 880 030 728 RO 0800 895 084 SK 0800 606 287 TR 0800 142 064 866 LI +31 20 796 5692 MT +31 20 796 5693 EE 0800 0100567 non-europe +31 20 794 7071 US +1 855 236 0910 CA +1 855 805 8539 AR, BR, CO, UY, AU, NZ, RU +800 135 79 135 8:00 17:00 GMT+1 M T W T F S S Fujirebio Europe N.V

80345 INNO-LiPA HLA-C Amplifikasyon / 28798 v1 / ANAHTAR KODU: FRI33177 p 2/7 İÇİNDEKİLER Kullanım amacı... 2 Test prensibi... 2 Reaktifler... 3 Açıklama, kullanım için hazırlanması ve önerilen depolama koşulları... 3 Gerekli ama sağlanmayan malzemeler... 3 Güvenlik ve Çevre Koşulları... 3 Örnek, hazırlama ve saklama... 4 DNA ekstraksiyon... 4 Uyarılar ve önlemler... 4 Test prosedürü... 5 Sonuçlar... 6 Görüntüleme... 6 Doğrulama... 6 Prosedür sınırlamaları... 6 Test performans... 7 Ticari markalar... 7 Kullanılan semboller Kullanım amacı Üretici In Vitro Diagnostic Medikal Cihaz Parti kodu Katalog numarası Tarafından Kullanılan Kullanım Talimatlarına başvurun Sıcaklık sınırlaması Amplifikasyon kiti Amplifikasyon Tampon MgCl2 Solüsyonu Birincil Karışım INNO-LiPA HLA-DPB Amplifikasyon kiti, in vitro kullanım için, insan lökosit antijeni (HLA) DPB1 lokusunun ikinci ekzonunun nükleik asit amplifikasyonu için tasarlanmıştır. Söz konusu reaksiyon, polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) vasıtasıyla gerçekleştirilir. Test prensibi PCR ile amplifiye edilecek DNA örneği fazla deoxynucleoside 5'- triphosphates (dntpler) ile buffer, biyotinli primerler ve termostabil DNA polimeraz içeren bir reaktif karışımına verilir. Primerler 'Kullanım amacında belirtilen DNA hedef dizileri amplifiye ederler.

80345 INNO-LiPA HLA-C Amplifikasyon / 28798 v1 / ANAHTAR KODU: FRI33177 p 3/7 Hedef dizileri primerlere maruz bırakmak için ısıtılmak suretiyle DNA sarmalının iki ipi birbirinden ayrılır ( denatürasyon ). Belirli bir sıcaklığa kadar soğutularak bu primerlerin dizideki tamamlayıcı bölgelere bağlanması sağlanır (primer bağlanması). Başka bir özgün sıcaklıkta, termostabil DNA polimeraz, fazla dntpleri kullanarak bağlanmış primerleri hedef şablon boyunca uzatır (uzama). Bu şekilde, bir döngüden sonra hedef dizinin iki tam biyotinile kopyası üretilmiş olur. Birçok döngüden sonra, hedef dizinin büyük miktarda biyotinile kopyası elde edilir. Reaktifler Açıklama, kullanım için hazırlanması ve önerilen depolama koşulları - Reaktifler, özellikle amplifiye edilmiş DNA ürünleri, herhangi kontamine DNA kaynağından izole edilmiş şekilde saklanmalıdır. - Amplifikasyon işlemleri için reaktifler amplifiye DNA dan arındırılmış bir odada ele alınmalıdır. Otoklavlanmış tüp ve pipet uçları (tercihen pamuk takılı) kullanılmalıdır. - Reaktifler -25 ile -15 C arasında ve orijinal şişelerinde tutulduğu sürece, kitin son kullanma tarihlerine kadar kararlıdırlar. Ancak, ilk kullanımdan sonra reaktiflerin porsiyonlanması ve -25 ile/-15 C arasında saklanması tavsiye edilir. - Kitin son kullanma tarihi geçmiş reaktifleri kullanmayın. - Kit reaktiflerin fiziksel görünümündeki değişiklikler istikrarsızlık veya bozulma belirtisine neden olabilir. Verilen Reaktifler: Bileşen Miktar Ref. Açıklama Amplifikasyon Tampon 1x 0,3 ml 56982 Tüm, dntpler ve koruyucu olarak %0.05 NaN3 içerir. Kullanmadan önce tamamen çözün. Birincil Karışım 1x 0,3 ml 57029 Biotinlenmiş primerler ve koruyucu olarak 0.05% NaN3 içerir. Kullanmadan önce tamamen çözün. MgCl2 Solüsyonu 1x 0,3 ml 55701 Koruyucu olarak 0.05% NaN3 içerir, Tamamen çözülmeye izin verin ve tamamen MgCI2 çözülmesi için kullanmadan önce 20-25 C ye getirin. Gerekli ama sağlanmayan malzemeler - DNA ekstraksiyonu için materyaller. - Tek kullanımlık eldiven. - Tek kullanımlık steril pipet uçları (tercihen pamuk filtreli). - Steril mikrotüpler. - Mikrotüp rakları. - Microtüp santrifüjü. - DNA termal döngü ve ekipmanları. - Dağıtım için ayarlanabilir pipetler 1-20 µl, 20-200 µl ve 200-1000 µl. - Otoklavlanmış distile su. - Mineral yağ (gerekirse). - Termostabil DNA Polimeraz (Taq DNA polimeraz önerilir) Güvenlik ve Çevre Koşulları

80345 INNO-LiPA HLA-C Amplifikasyon / 28798 v1 / ANAHTAR KODU: FRI33177 p 4/7 Lütfen Material Safety Data Sheet (SDS) ve potansiyel tehlikeli komponentler içeren işaretli ürün bilgilerini inceleyiniz. En son SDS versiyonu website www.fujirebio-europe.com. da mevcuttur. - Sadece yeterince eğitimli personel test prosedürünü yapmak için izinli olmalıdır. - Numuneler her zaman potansiyel bulaşıcı olarak ele alınmalıdır. - Koruyucu ekipmanın kullanımı gereklidir: tehlikeli veya bulaşıcı maddeler işlenirken eldivenler ve emniyet gözlükleri. - Atık, kurumun atık bertaraf kurallarına göre ele alınmalıdır. Tüm federal, eyalet ve yerel çevresel düzenlemeler de dikkate alınmalıdır. Örnek, hazırlama ve saklama NOT: Sağlanmayan reaktifler. DNA ekstraksiyon Genel olarak kullanılan salting-out DNA ekstraksiyon yöntemi veya spin kolonları temelli yöntemler asit sitrat dekstroz (ACD) veya etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile antikoagüle edilmiş tam kan örneğinden genomik DNA hazırlamak için kullanılabilir. DNA örneklerini -25/-15 C de saklayın. Ekstrakte edilmiş DNA nın konsantrasyonu 0.02 µg/µl olmalıdır. Saflık (A260nm/A280nm) 1.5 olmalıdır. Uyarılar ve önlemler - DNA kontaminasyonundan kaçınmak için pre ve post amplifikasyon basamakları arasında maksimum fiziksel ayırım önerilmektedir; ayrı odalar, ayrı pipetler ve diğer laboratuvar malzemeleri, ayrı laboratuvar önlükleri ve eldivenler (ve stokları) iyi laboratuvar uygulamaları için alınabilecek minimum tedbirlerdir. Kit herhangi bir kontamine edici DNA kaynağından özellikle amplifiye DNA ürünlerinden ayrı saklanmalıdır. - Reaktiflerin mikrobiyal kontaminasyonundan kaçınınız. - Post amplifikasyon odasından pre amplifikasyon odasına herhangi bir dönüşten kaçının. - Amplifikasyon işlemi için otoklavlanmış tüpler ve pipet uçları kullanılmalıdır. Pamuk tıpalı pipet uçları önerilir. - Her bir porsiyonlanmış örnek için yeni bir pipet ucu kullanın. - Çözülme sonrası, Amplifikasyon Tamponu, Primer Karışımı ve MgCl2 çözeltisini vorteksleyin ve bütün reaktifleri aşağı doğru döndürün. - Bileşenleri aynı lot numarasına sahip olmadığı sürece, farklı kitlerin reaktiflerini karıştırmayın. - Reaktiflerin mikrobiyel kontaminasyonundan kaçının.

80345 INNO-LiPA HLA-C Amplifikasyon / 28798 v1 / ANAHTAR KODU: FRI33177 p 5/7 Test prosedürü NOT: - HLA-DPB1 allelerinin 2. ekzonunun amplifikasyonu için bu protokol GeneAmp PCR tüpleri (0.5 ml) ve PE-480 termal cyclers; veya MicroAmp PCR tüpleri (0.2 ml) ve GeneAmp PCR System 9700 termal cyclers kullanılarak ve AmpliTaq DNA polimeraz kullanılarak optimum amplikasyon için tasarlanmıştır. - Bu protokol çoğu ticari termal cyclerlar için kullanılabilir ama cyclerın üreticisi tarafından yapılacak bazı modifikasyonları gerektirebilir. - Kullanımdan önce, bu protokolün laboratuvarınızda kullanımda olan thermal cycler ile uyumlu olup olmadığını belirleyin. Termal döngünün kullanımdan önce kalibre edildiğinden emin olun. - Sonucu etkileyebilecek durumlarada, Non-spesifik amplifikasyon ve primer dimer oluşumunu önlemek için gerekli önlemleri alın. Buz üzerinde ve gecikmeden pipetleme adımları uygulayın. Örnekleri yerleştirmeden önce Termal döngü ısıtma bloğu (96 C ± 0.75 C) önceden ısıtın, ve hemen döngü işlemini başlatın. 1. Her genomik DNA yı 0.02 ve 0.1 µg/µl konsantrasyonları aralığında TE tampon ile seyreltin. 2. (N) olarak hazırlanacak şişelerin sayısını belirleyin: N= DNA örneği sayısı +1(negatif kontrol, veya DNA) + 1 Pamuk filtreli pipet ucu kullanarak otoklavlanmış 1.5 ml lik tüpte bir mastermix hazırlayın: (N x 14.8 µl) otoklavlanmış distile su + (N x 10 µl) Amplifikasyon Tamponu + (N x 10 µl) Primer Karışım. + (N x 10 µl) MgCl2. + (N x 0.2 µl) Taq Polymerase 5 U/µl (N x 1 U). Bu amplifikasyon karışımının toplam hacmi şimdi (N x 45 µl dir). Hafifçe vorteksleyin ve 45 µl olmak üzere master karışımını otoklavlanmış amplifikasyon tüplerine (N-1) porsiyonlayın. NOT: Her bir bileşen eklenmiş ve doğru miktarda sağlanmalıdır. Gereğinden az veya fazla eklenen örnek veya reaktifler spesifik olmayan amplifikasyonlara veya amplifikasyon olmamasına sebep olabilir. 3. Gerekliyse her tüpe 2 damla (~ 40 µl) mineral yağ ekleyin (ör. PE-480 kullanılırken). 5 µl (0.1-0.5 µg) genomik DNA (eğer gerekliyse mineral yağın içinden) ekleyin. Negatif kontrol tüpüne 5 µl distile su ( DNA sız ) koyun. NOT: Vortekslemeyin veya karıştırmayın! Amplifikasyon karışımı tüpün tabanında mı kontrol edin! 4. Örnekleri önceden ısıtılmış ve kalibrasyonu yapılmış termal bloklara yerleştirin ( termal cyclerın üreticisi tarafından sağlanan talimatları izleyin). INNO-LiPA HLA-DPB Amplifikasyon programını başlatın.

80345 INNO-LiPA HLA-C Amplifikasyon / 28798 v1 / ANAHTAR KODU: FRI33177 p 6/7 DPB1 Multiplex amplifikasyon profili: Döngü tipi PE-480 PE-2400 PE-9600 Adım Sıcaklık Zaman Zaman 1. denatüre 96 C 5 dk 5 dk 2. denatüre 96 C 20 sn. 15 sn. 2 den 4 e basamakları, 30 defa 3. Birincil 55 C 20 sn. 20 sn. tekrarlayın sertleşme 4. Birincil uzama 72 C 30 sn. 20 sn. 5. uzatma 72 C 10 dak. 10 dak. 5. Amplifikasyondan sonra, örnekleri derhal INNO-LiPA HLA-DPB test stripleri ile kullanın veya -15/-25 C de örnekleri saklayın. NOT: Amplifiye edilmiş DNA ları kullanılmamış amplifikasyon reaktifleri ile beraber saklamayın. Sonuçlar Görüntüleme Amplifiye ürün varlığı, % 2'lik bir agaroz jeli üzerinde kontrol edilebilir. Oluk başına amplifiye edilen üründen 10 µl yükleyin. Oluk başına 10 ul amplifiye ürün yükleyin. Amplikon 280 bp uzunluğunda tek bir bant olarak gözlenmelidir. Doğrulama - Her amplifikasyon çalışmasına en az bir pozitif ve bir negatif kontrol ekleyin. Herhangi bir yeni laboratuvar prosedüründe test prosedürünün doğru bir şekilde uygulanabileceğine dair yüksek derecede güven gelişene kadar pozitif ve negatif kontrolün varlığı dikkate alınmalıdır. Ek bir pozitif kontrolün varlığına ihtiyaç duyuluyorsa, bilinen bir pozitif örnek kullanın. - Jelde negatif bir kontrol için pozitif bir bant elde edilirse çalışma dışlanmalı ve bütün test prosedürü tekrar edilmelidir. Prosedür sınırlamaları - Bu ürün sadece amplifikasyon teknikleri üzerine iyi eğitimli personel tarafından çalışılmalıdır. - Polimeraz inhibisyonu (ör. heparin, hemoglobin ile) testin tamamen başarısız olması için bir sebep olabilir! - Tek kullanımlık eldivenden gelebilecek pudra veya sodyum hipokloritin amplifikasyon üzerinde inhibe edici etkisi vardır. - DNA örneklerinin tekrarlanan dondurulup/çözülme işlemi daha az etkili bir amplifikasyona sebep olabilir. - İyi laboratuvar uygulamaları ve önceden belirtilen prosedürlerin dikkatli uygulanması spesifik amplifikasyona olanak sağlar.

80345 INNO-LiPA HLA-C Amplifikasyon / 28798 v1 / ANAHTAR KODU: FRI33177 p 7/7 Test performans INNO-LiPA HLA-DPB 12. Uluslararası Doku Uyumluluğu Çalıştayı kapsamında dünya çapında 23 doku tipleme laboratuvarlarında değerlendirilmiştir, Fransa 1996. Herhangi bir INNO-LiPA HLA-DPB spesifik amplifikasyon başarısızlığı rapor edilmemiştir. Ticari markalar - INNO-LiPA, dünya çapında bir ticari markadır örneğin ABD de. - GeneAmp ve MicroAmp Applied Biosystems, LLC tescili ticari markalarıdır.