S.pyogenes DNA İzolasyonu ve Q-PCR Tespit Kiti 500 Test engy-spyo-1201

S.pyogenes DNA İzolasyonu ve Q-PCR Tespit Kiti 500 Test engy-spyo-1201 Kullanma Kılavuzu

S.pyogenes DNA İzolasyonu ve Q-PCR Tespit Kiti 500 Test engy-spyo-1201 Kullanma Kılavuzu Kullanılan İşaretler Kitin son kullanma tarihini belirten sembol Kitin toplu üretim kodunu belirten sembol Kitin toplu üretim tarihini belirten sembol Üreticinin iletişim bilgilerini gösteren sembol Kitin katalog numarasını belirten sembol Güneş ışığına maruz bırakmayınız. Kitin saklanması gereken sıcaklık aralığını gösteren sembol Kuru yerde saklayınız. Kullanmadan önce kullanım talimatlarını okuyunuz. Steril değildir. In vitro tıbbi tanı cihazı Kısaltmalar Kit S.pyogenes AGBHS C T Tm PCR QPCR DNA ENGY S.pyogenes DNA İzolasyonu ve Q-PCR Tespit Kiti Streptococcus pyogenes A Grubu Beta Hemolitik Streptokoklar Eşik döngü sayısı Erime sıcaklığı Polimeraz zincir reaksiyonu Gerçek zamanlı kantitatif PCR Deoksiribonükleik asit

! Kullanım Amacı Kit, AGBHS farenjiti olgularının tanısına yardımcı olmak amacıyla, boğaz sürüntü numunelerinde S.pyogenes tespiti için kullanılan, kalitatif bir in vitro tıbbi tanı cihazıdır. Tespit, boğaz sürüntülerinden toplam DNA izolasyonu ve S.pyogenes genomuna özgü bir bölgenin Q-PCR ile çoğaltılması ile gerçekleştirilmektedir. Test Prensibi Kit boğaz sürüntü numunelerinde hızlı bir DNA eldesi ve ardından S. pyogenes genomuna özgü oligonükleotidler ile DNA izolatında bulunan S. pyogenes pirojenik ekzotoksin B (speb) gen bölgesinin çoğaltılması ve tespitine dayanır. İlk aşama DNA materyalinin ortaya çıkarılmasıdır. Bu da uygun tampon içerisinde ısı ile parçalama ve peptitler ile inhibitör bloklama yöntemi esas alınarak tasarlanmıştır. Özel olarak geliştirilen PCR inhibitörü bloke edici peptitler sayesinde, 10 dakika içerisinde eküvyondan Q-PCR da kullanabilecek kalitede DNA izolasyonu mümkün olmaktadır. PCR, hedef DNA molekülünün enzimatik bir şekilde, hedef DNA ya özgün oligonükleotidler kullanılarak çoğaltılmasıdır. Kitte S. pyogenes e özgü DNA ların PCR ile spesifik olarak çoğaltılması için speb genini hedefleyen oligonükleotidler kullanılmıştır. Numuneden kaynaklanan inhibisyon etkisinin tespiti için kit, pozitif kontrol DNA sı olarak speb genini de içermektedir. Q-PCR kantitatif sonuç verebilen bir PCR yöntemidir. Klasik PCR den farklı olarak, floresan boyalar yardımıyla DNA çoğalmasının eş zamanlı olarak izlenmesine olanak tanır. Kitte floresan ışıma için bir yüksek çözünürlükte erime (HRM) boyası olan EvaGreen kullanılmıştır. 35 döngü yapılan PCR sonucunda speb gen bölgesinin tespiti yüksek çözünürlükte yapılan erime eğrisi analizi ile gerçekleştirilmektedir. Kit Hakkında Teknik Bilgi Akut tonsillofarenjit yaygın ve sık görülmesi, is gücünde kayba yol açması ve akılcı olmayan antibiyotik kullanımına neden olmasından ötürü önemli bir sağlık sorunudur. 1 Akut tonsillofarenjit olgularının yaklaşık % 40 ından virüsler, %20-40 ından bakteriler ve %20-30 undan bilinmeyen etkenler sorumludur. S.pyogenes (AGBHS) ise hastalığın çocuklarda %15-30, erişkinlerde ise %5-15 oranında rastlanan en sık bakteriyel nedenidir. 2 Akut tonsillofarenjit antibiyotik tedavisine ihtiyaç duyulmadan tedavi edilebilmektedir. 3 AGBHS tespitine dayalı tanısal yaklaşımların temel amacı S.pyogenes pozitif çocuk hastalarda akut romatizmal ateş veya akut glomerülonefrit gibi komplikasyonların antibiyotik (çoğunlukla penisilin) kullanılarak önlenmesi, diğer etkenlere bağlı durumlarda ise gereksiz antibiyotik kullanımından doğan bakteriyel direnç, yüksek maliyet ve yan etkilerin önüne geçilmesidir. 4 AGBHS tespitinde altın standart olan boğaz kültürü ile sonuç en erken 24 saatte alındığı için, tonsillofarenjit teşhisi konulan hastaların ancak %3-5 ine uygulanmaktadır. Bu durum, hastalarının yaklaşık %75 ine gereksiz antibiyotik uygulanmasına neden olmaktadır. 5 Hızlı streptokok antijen testleri (HSAT) ile 5-10 dk gibi kısa sürelerde tanı konulabilmesine karşın, HSAT ın S.pyogenes farenjiti olgularında %35 e varan oranlarda yalancı negatif sonuç verdiği bildirilmiştir. 6, 7 Bu

nedenle HSAT ile elde edilen negatif sonuçların boğaz kültür ile doğrulanması gerekmektedir. DNA izolasyonu ve sonrasında S.pyogenes genomuna özgü bölgelerin çoğaltılması ve tespitine dayalı yöntemler ile yüksek hız, duyarlılık (>%93) ve özgüllük (>%95) ile AGBHS tespiti yapılabilmekte ve negatif sonuçların boğaz kültür ile daha ileri doğrulanmasına gerek kalmamaktadır. 8, 9 Bu 10, 11 yöntemler IDSA (Infectious Diseases Society of America) rehberlerine de girmiştir. DNA izolasyonu ve sonrasında S.pyogenes genomunun speb bölgesinin Q-PCR ile çoğaltılması ve tespitine dayalı ENGY S.pyogenes DNA İzolasyonu ve Q-PCR Tespit Kiti Boğaziçi Üniversitesi BUN Teknopark ta faaliyet gösteren ENGY Çevre ve Enerji Teknolojileri Biyoteknoloji Ar-Ge Ltd. Şti. tarafından, etik kurulu onaylı bir proje ile geliştirilmiştir. Kit ile boğaz sürüntü numunelerinde S.pyogenes tespiti kültüre dayalı testlere eş değer bir duyarlılık (%100, n=687), özgüllük (%97, n=687) ve maliyetle 1 saatten kısa sürede tamamlanabilmektedir. Kitin düşük maliyet ve yüksek hız, duyarlılık ve özgüllüğe sahip olması, AGBHS farenjiti olgularının Türkiye de hızlı ve rutin tespitine imkan tanımaktadır. Bu nedenle, 24 Aralık 2014 Tarihli ve 29215 Sayılı Resmî Gazete de yayınlanan Sosyal Güvenlik Kurumu Sağlık Uygulama Tebliğinde Değişiklik Yapılmasına Dair Tebliğ kapsamında SUT eki EK-2/B Listesi ne Strep.pyogenez hızlı polimeraz zincir reaksiyon testi işlemi, 908045 işlem kodu ile girmiştir. Kitin test reaktivitesi S. pyogenes ATCC 49399 ve 12344 suşları kullanılarak belirlenmiştir. Kitin bu suşlar kullanılarak tespit edilen analitik duyarlılığı 240 kob/testtir. Kitin analitik özgüllük testleri Acinetobacter baumannii, Aeromonas hydrophila, Arcanobacterium haemolyticum, Bordetella bronchiseptica, Burkholderia cepacia, Campylobacter jejuni, Candida albicans, Citrobacter freundii, Corynebacterium diphtheria, Corynebacterium pseudodiphtheriticum, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Escherichia coli, Haemophilus influenza, Homo sapiens, Klebsiella oxytoca, Klebsiella pneumoniae, Lactococcus lactis, Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes, Moraxella catarrhalis, Morganella morganii, Myxococcus stipitatus, Neisseria pharyngis, Neisseria meningitidis, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Stenotrophomonas maltophilia, Streptococcus agalactiae, Streptococcus anginosus, Streptococcus bovis, Streptococcus canis, Streptococcus dysgalactiae (subspecies equisimilis), Streptococcus equinus, Streptococcus intermedius, Streptococcus mitis, Streptococcus mutans, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus salivarius, Streptococcus suis, Streptococcus uberis, Streptococcus sp. viridans tipi organizmaları üzerinde yapılmış ve kitin özgül olarak sadece S.pyogenes i tespit ettiği gösterilmiştir. Tekrarlanabilirlik çalışmaları dört farklı Q-PCR cihazına sahip, dört farklı laboratuvarda gerçekleştirilmiştir. Çalışma kapsamında şu cihazlar kullanılmıştır: Biorad CFX Connect (Bio-Rad Laboratories, USA), LightCycler 480 (Roche Applied Science, USA), StepOne Plus (Life Technologies, USA) ve Xxpress (BJS Biotechnologies, UK). Tekrarlanabilirlik çalışmalarında laboratuvarlar %99 (59/60) uyumlu sonuçlar vermiştir. Kit ile 24 numunenin toplam analiz süresi, kullanılan Q-PCR cihazının özelliklerine bağlı olarak 39-58 dk arasında değişmektedir. Kitin klinik performansı, akut tonsillofarenjit tanısı konulan 687 çocuk (5-12 yaş) hastadan alınan çift kör örneklerde boğaz kültürü (altın standart) ve HSAT ile karşılaştırmalı olarak tespit edilmiştir. HSAT ın duyarlılık ve özgüllügü sırasıyla %69,4 ve %97 saptanırken, Q-PCR testinin duyarlılık ve özgüllüg ü sırasıyla %100 ve %96,4 olarak saptanmısţır.

! Kit canlı/ölü bakteri ayırımı yapamamaktadır. Kit AGBHS taşıyıcıları ve enfekte hastaları ayırt etmemektedir. Bu nedenle kit ile elde edilen sonuçların klinisyenler tarafından yorumlanması gerekmektedir. Kaynaklar 1. Smeesters, P. R., Campos, D., Van Melderen, L., de Aguiar, E., Vanderpas, J., Vergison, A. (2006). Pharyngitis in low-resources settings: a pragmatic clinical approach to reduce unnecessary antibiotic use. Pediatrics, 118(6), e1607-e1611. 2. Isaacs, D. (2008). Evidence-based pediatric infectious diseases. John Wiley & Sons. 3. Centor RM. 2009. Expand the pharyngitis paradigm for adolescents and young adults. Ann. Intern. Med. 151:812 815. 4. Shulman ST, Bisno AL, Clegg HW, Gerber MA, Kaplan EL, Lee G, Martin JM, Van Beneden C. 2012. Clinical practice guideline for the diagnosis and management of group A streptococcal pharyngitis: 2012 update by the Infectious Diseases Society of America. Clin. Infect. Dis. 55:e86 e102. 5. Övet, G., Balcı, Y. I., Polat, Y., Ersoy, E., & Çövüt, İ. E. (2009). Akut tonsillofarenjit tanısı alarak antibiyotik başlanan hastaların ne kadarından a grubu beta hemolitik streptokoklar sorumludur. Tıp Araştırmaları Dergisi, 7(3), 122-5. 6. Cohen, J. F., Chalumeau, M., Levy, C., Bidet, P., Thollot, F., Wollner, A.,... & Cohen, R. (2012). Spectrum and inoculum size effect of a rapid antigen detection test for group A streptococcus in children with pharyngitis. PLoS One, 7(6), e39085 7. Forward KR, Haldane D, Webster D, Mills C, Brine C, Aylward D. 2006. A comparison between the strep A rapid test device and conventional culture for the diagnosis of streptococcal pharyngitis. Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol. 17:221 223. 8. Uhl, J. R., Adamson, S. C., Vetter, E. A., Schleck, C. D., Harmsen, W. S., Iverson, L. K.,... & Cockerill, F. R. (2003). Comparison of LightCycler PCR, rapid antigen immunoassay, and culture for detection of group A streptococci from throat swabs. Journal of clinical microbiology, 41(1), 242-249. 9. Thenmozhi, R., Balaji, K., Kanagavel, M., & Karutha Pandian, S. (2010). Development of species-specific primers for detection of Streptococcus pyogenes from throat swabs. FEMS microbiology letters, 306(2), 110-116. 10. Anderson, N. W., Buchan, B. W., Mayne, D., Mortensen, J. E., Mackey, T. L. A., & Ledeboer, N. A. (2013). Multicenter clinical evaluation of the illumigene group A Streptococcus DNA amplification assay for detection of group A Streptococcus from pharyngeal swabs. Journal of clinical microbiology, 51(5), 1474-1477. 11. Henson, A. M., Carter, D., Todd, K., Shulman, S. T., & Zheng, X. (2013). Detection of Streptococcus pyogenes by Use of Illumigene Group A Streptococcus Assay. Journal of clinical microbiology, 51(12), 4207-4209. Kit Bileşenleri ve Özellikleri Kit bileşenleri, miktar ve adetleri, içerikleri, kullanım amaçları ve saklama koşulları Tablo 1 de verilmiştir. -20 C de saklanan kit bileşenleri soğuk zincirde transfer edilmelidir. Tablo 1. Kit bileşenleri, özellikleri ve saklama koşulları Tüp İsmi Miktar Adet Saklama İçerik Kullanım Amacı Oligo GAS 1 ml 11-20 C Reaksiyon Tamponu, HRM boyası, oligonükleotidler, PCR inhibitor bloklayıcısı RXN 75 µl 2-20 C 5 U/µL Rekombinant DNA Polimeraz, PZT Kontrol DNA Tamponu S.pyogenes speb geni hedefli reaksiyon tamponu Enzimatik DNA çoğaltılması 550 µl 1-20 C speb geni Pozitif kontrol DNA 250 ml 1 Oda Sıcaklığı 0,1 M Tris-HCl ph 8.0, 10mM peptit kompleksi, 12mg/ml BSA, 40 mg/ml PEG 400, %1 Tween 20 DNA İzolasyonu

Uyarılar Tüm reaktifler in vitro tıbbi tanı amaçlı kullanım içindir. Örneklerin enfeksiyöz ajanları bulaştırma riski göz önünde bulundurulmalı, + 95 C de 10 dk lık inkübasyon adımına kadar Biyogüvenlik seviye 2 (BSL-2) için iyi laboratuvar uygulamaları takip edilmelidir Oligo GAS güneş ışınlarına maruz bırakılmamalıdır Kit bileşenleri sterilize edilmemelidir Laboratuvar ortamını hedef DNA ile kontamine etmemek için, Q-PCR ı tamamlanmış Q-PCR tüpleri laboratuvarda açılmadan bertaraf edilmelidir. Risk ve Güvenlik Uyarıları Bu ürün ile ilgili bilinen bir tehlike yoktur Kitin Raf Ömrü Kitin raf ömrü 3 yıldır. Üretim tarihinden sonra 3 yıl geçmesine rağmen açılmamış olan kit bileşenleri kullanılmamalıdır. Kullanıcı Tarafından Sağlanacak Ekipman ve Sarflar Kullanıcı tarafından sağlanacak ekipman ve sarflar Tablo 2 de verilmiştir. Tablo 2 Kullanıcı tarafından sağlanacak ekipman ve sarflar Ekipman/Sarf Vorteks Mikrosantifüj Cihazı Real Time PCR cihazı Mikropipet Isıtıcı Blok Mikrosantifüj Tüpü Mikropipet ucu Mikroplate, tüp ya da kapiller Eldiven Özellik 2500 RPM'e çıkabilmelidir 14000 RPM'e kadar çıkabilmelidir 470/510 nm Ekzitasyon/Tespit Kanalına sahip olmalıdır; Ortalama "Ramp Rate"i 4 olmalıdır 100-1000 µl,10-100 µl, 0.5-10 µl hacim kapasiteli 1,5 ml santrifüj tüpleriyle uyumlu olmalı, 95 C'de çalışabilmelidir 1,5 ml hacimli, nükleaz içermeyen, steril, tercihen vida kapaklı 100-1000 µl,10-100 µl, 0.5-10 µl hacim kapasiteli, nükleaz içermeyen, steril Sahip olunan Q-PCR cihazına göre seçilmeli Lateks, pudrasız eldiven

! Uygun Numune Materyali ve Saklanması Kit, numune olarak steril pamuklu/naylon/rayon eküvyon ile alınan boğaz sürüntüleri için tasarlanmıştır. Numune alınırken boğaz sürüntü numuneleri için standart prosedür uygulanmalı, herhangi bir kontaminasyon olmamasına özen gösterilmelidir. Numune, bademcik ve arka yutağa eküvyon iyice sürtülerek alınmalıdır. Numuneler alındıktan sonra besi yeri içeren taşıma tüplerine konulmamalı, kuru olarak taşıma tüplerinde laboratuvara transfer edilmelidir. Numuneler alındıktan sonra 3 saate kadar oda sıcaklığında bekletilebilirler. Daha uzun süreli numune saklanacağı durumlarda numuneler -20 C de muhafaza edilmelidirler. Uygulama Protokolü 1- AGBHS tonsillofarenjiti şüphesi olan hastalardan numune, bademcik ve arka yutağa eküvyon iyice sürtülerek alınır. 2- Numuneler alındıktan sonra besi yeri içermeyen taşıma tüplerinde laboratuvara transfer edilir.

3- Numuneler laboratuvara teslim edilir. Laboratuvar tarafından 1 saat içerisinde sonuçların hastane bilgi sistemine yükleneceği bilgisi verilir. 4-1,5 ml mikrosantrifüj tüpünün içerisine 400 µl DNA tamponu eklenir a. DNA tamponu içeren tüpler önceden hazırlanıp, oda sıcaklığında 1 yıla kadar saklanabilir. 5- Eküvyon numune kabından çıkartılır, 1,5 ml mikrosantrifüj tüpünün içine yerleştirilir, tüpten taşan kısım kesilir, tüpün kapağı kapatılır ve 1 dk 2500 RPM de vorktekslenir.

! 6- Tüp 10 dak 95 C de inkübe edilir. a. Kullanılan mikrosantrifüj tüpleri vida kapaklı değilse, bu aşamada tüp kapaklarının basınçla açılıp tüp içindeki sıvının uçmaması için gerekli önlemler alınmalıdır. 7- Tüp 14000 RPM de 5 sn santrifüj edilir. Tüpte oluşan üst sıvı faz, bir sonraki adımda belirtilen şekilde, kalıp DNA olarak kullanılır. a. Bu tüp - 20 C de 1 ay süreyle saklanıp, tekrar analiz edilebilir. 8- Tablo 3 te belirtilen şekilde reaksiyonlar hazırlanır Tablo 3. Q-PCR ın kurulması Reaksiyon bileşeni Rxn GAS Rxn GAS + Rxn - Oligo GAS 8,9 µl 8,9 µl 8,9 µl RXN 0,1 µl 0,1 µl 0,1 µl PZT Kontrol 1 µl Kalıp DNA 1 µl 1 µl Toplam 10 µl 11 µl 9 µl a. Kontaminasyon riskini en aza indirmek için bütün pipetleme işlemleri temiz ortamda yapılması tavsiye edilmektedir. En ideal ortamlar PCR kabinleri ya da laboratuvarlarda sadece PCR işleminin yapıldığı bölümlerdir. b. - 20 C den çıkartılan reaksiyon bileşen stokları kullanılmadan önce pipet veya vorteks ile karıştırılmalıdır c. Reaksiyon bileşenlerinin ana stoklarının gereğinden fazla oda ısısında kalması ve kullanılmadığı zaman kapağının açık bırakılmasından kaçınılmalıdır. 9- Q-PCR cihazı, üretici talimatları ve kullanma kılavuzuna göre Tablo 4 te verilen şekilde programlanır.

Tablo 4. Q-PCR koşulları Program Ön İnkübasyon Döngü Sayısı Çoğalma 35 Adım Sıcaklık C Süre sn Hız C/s 1 Denatürasyon 98 60 4< Denatürasyon 95 5 Bağlanma ve uzama Erime Eğrisi 1 Erime 60 25 76 1 90 1 4< 0,5 Floresan okuma (470 / 510 nm) (Ekzitasyon / Tespit) Adım sonunda, tek okuma 76-90 C arası sürekli okuma 10- Q-PCR cihazının yazılımı kullanılarak, cihaz yazılımına özel üretici talimatlarına göre Tm değerleri hesaplanır. 11- Sonuçlar Tablo 5 e göre yorumlanır

! Tablo 5. Q-PCR sonuçlarının yorumlanması Reaksiyon Tipi 82-85 C arası Tm Sonuç Örnek 1 Rxn GAS Evet AGBHS + Rxn GAS + Rxn - Evet Hayır Örnek 2 Rxn GAS Hayır AGBHS - Rxn GAS + Rxn - Evet Hayır Örnek 3 Rxn GAS Evet DENEYİ TEKRARLA: Rxn GAS + Rxn - Evet Evet Tüm reaksiyon bileşenlerinin yeni stoklarını kullan Yeni pipet seti ve filtreli uçları kullan Örnek 4 Rxn GAS Hayır DENEYİ TEKRARLA: Rxn GAS + Rxn - Hayır Hayır Testi RXN bileşeni 0,2 µl DNA kalıbı 0,5 µl olacak şekilde tekrar et İmalatçı Bilgileri ENGY Çevre ve Enerji Teknolojileri Biyoteknoloji Ar-Ge Ltd. Şti. (ENGY), Boğaziçi Üniversitesi Kuzey Kampüs, BÜN Teknopark Bebek/İSTANBUL Üretim Yeri MyFarma İlaç Sanayi ve Ticaret Anonim Şirketi, Tuzla, İstanbul