5. Uluslararası Talasemi Yazokulu 5th International Thalassemia Summerschool -TALASEM OLGULARINDA PRE MPLANTASYON GENET K TANI (PGT) NIN YER Op. Dr. Güvenç Karlıkaya 1, Prof. Dr. Semra Kahraman 1 stanbul Memorial Hastanesi, YÜT, Üreme Endokrinolojisi ve Geneti i bölümü Piyalepa a blvd., 80270, Okmeydanı, stanbul, Türkiye 1 gguvenc@yahoo.com G R Talasemi, dünyada en sık görülen tek gen hastalıklarından biri olarak kar ımıza çıkmaktadır. Dünya nüfusunun yakla ık %3 ünün talasemik bir geni ta ıdı ı tahmin edilmektedir. Talasemi ta ıyıcısı aileler için, gebeli in erken dönemlerinde, örne in gebeli in 10. haftası civarında CVS (koryonik villüs örneklemesi) veya 16. haftası civarında amniosentez yöntemleri ile prenatal tanı mümkün olmakla beraber, e er bebek etkilenmi ise, aile gebeli in sonlandırılması riski ile ba ba a kalmaktadır. Bunun yanında, talasemi hastası çocu a sahip olan aileler, çocuklarının tedavisinde kullanılmak üzere HLA uyumlu kök hücre transplantasyonu için uygun donör aramaktadırlar. Yardımcı üreme teknikleri (YÜT) ve genetik alanlarındaki ilerlemeler genetik geçi gösteren hastalıkların tanı ve tedavisi için yeni olanaklar sa lamaktadır. Preimplantasyon genetik tanı (PGT) sadece embriyodaki genetik hastalı ın tanınmasına imkan sa lamakla kalmayıp aynı zamanda, hematopoetik kök hücre transplantasyonuna ihtiyaç duyan hasta birey için human leukocyte antigen (HLA) uyumlu embiyoların seçimine imkan sa layan alternatif bir yöntem olarak kar ımıza çıkmaktadır.(1). Günümüzde bir çok tek gen hastalı ının PGT ile tanısı mümkün olmakla birlikte en çok uygulama alanı hematopoetik sistem hastalıkları özellikle, talasemiler olmaktadır (2). Bu durum, bulundu u co rafi konum ve akraba evliliklerinin sıklı ı nedeniyle, ülkemiz için ayrıca önem kazanmaktadır (3). PGT, talasemi ta ıyıcısı veya hasta çocu a sahip olan aileler için oldukça umut veren bir tedavi yakla ımı olmaktadır. Bununla beraber, mutasyon analizi ve/veya HLA tiplemesi için yapılacak PGT uygulamalarında; HLA uyumlu ve mutasyon ta ımayan embriyo bulma zorunlulu u, yüksek sayıda oosit ve biopsi için uygun kalitede embriyo eldesi gibi ba arıyı etkileyen birçok parametre daha önceki çalı malarımızda de erlendirilmi tir (4). Bunun yanında, özellikle HLA tiplemesi yapılan olgularda, olası ileri kadın ya ı, embriyolarda anöploidi testlerinin eklenmesi gereklili ini getirmektedir (5) Bu çalı mada, stanbul Memorial Hastanesi IVF ve Genetik Tanı merkezinde, talasemi ve/veya HLA tiplemesi tanısı amacıyla YTÜ siklusuna alınan olguların de erlendirilmesi yapılmı tır. MATERYAL VE METOD 2004 2008 yılları arasında, talasemi için PGT yapılan 26 çift 35 siklus, talasemi ve HLA tiplemesi için PGT yapılan 75 çift 155 toplamda 190 siklus de erlendirilmi tir. Çiftler, 2005 ESHRE PGD Consortium da önerildi i ekilde, öncelikle, klinik genetik ve IVF uzmanı tarafından de erlendirilmi, talaseminin özellikleri, tek hücre üzerinde tanımlanabilirli i, ba arı ansları, riskler ve alternatif yöntemler hakında bilgilendirilmi ve yazılı onay formları alınmı tır (6). HLA çalı masınında yapılaca ı olgularda HLA kompleksindeki informatif markerları tespit edebilmek amacıyla, aile bireyleri (anne, baba ve hasta çocuk) için STR haplotiplemesi yapılmı tır. Yapılan bu çalı ma sonucunda, HLA kompleksi üzerinde homojen olarak da ıtabilece imiz minimum 12 STR markerı seçilmi tir. Talasemi ta ıyıcılı ı olan vakalar için ayrıca anne, baba ve hasta çocu a ait mutasyonlar da ön hazırlık çalı ması sırasında tespit edilmi ve bu sayede 61
OP. DR. GÜVENÇ KARLIKAYA, PROF. DR. SEMRA KAHRAMAN mutasyon spesifik minisequencing primerleri dizayn edilmi ve blastomer çalı ması sırasında kullanılmı tır. Mutasyon taraması için ayrıca ba lantı analizi yapılmı tır. Bunun için mutasyonun bulundu u genle ba lantı gösteren STR markerları HLA ön hazırlık çalı masında oldu u gibi çalı ılarak informatif olanlar tespit edilmi ve klinik çalı mada kullanılmı tır. Ba lantı analizi sayesinde Alelik Drop Out (ADO) ve kontaminasyon gibi riskler ekarte edilebilmektedir. Ya endikasyonu olan vakalarda (ya 37) 13, 18, 21, X ve Y kromozomlarına ait STR markerları da anöploidi tespiti için çalı maya dahil edilmi tir. (1) Kullanılan standart stimulasyon protokollerinin detayları Kahraman ve ark. 2002 yılındaki makalelerinde tarif edilmi tir. (7). Bütün sikluslarda, di er spermatozoa ve kümülüs hücrelerinin kontaminasyon riskini azaltmak için ICSI uygulanmı tır.(6). Embriyo biyopsisi, embriyo geli iminin 3. gününde yapılmı tır. Biyopsi yapılacak embriyo seçimi ve politikası, ba ka yerde ayrıntıları ile anlatılmı tır (8) Kısaca, embriyo geli iminin 72. saatinde incelenecek olan embriyolardan bir veya iki blastomer alınmı tır. Embriyo biyopsisi sonrasında, her bir blastomer, içerisinde 5 ml alkaline lysis buffer (200 mmol/l KOH, 50 mmol/l DTT) içeren 0,2 ml lik steril PCR tüplerine aktarıldı ve hücreler 65 o C de 10 dakika inkübe edilerek lysis i lemine tabi tutuldu.sonrasında 5 ml nötralizasyon solüsyonu (900 mmol/l Tris-HCl, 300 mmol/l KCl, 200 mmol/l HCl) ilave edilerek alkaline lysis buffer ın nötralizasyonu gerçekle tirildi. Seçilen tüm bölgelerin amplifikasyonu için nested multiplex PCR protokolü kullanıldı. Birinci PCR siklusunda informatif HLA STR markerlarının, mutasyonu içeren gen bölgesinin, Alel Drop Out un (ADO) tespit edilebilmesi için mutasyon bölgesiyle ba lantı gösteren STR markerlarının amplifikasyonu için gerekli harici primerler kullanıldı. Birinci PCR siklusu, 1.5 mmol/l MgCl2, 200 mmol/l her bir dntp (Roche Diagnostics), 2.5 IU AmpliTaq Polymerase (Applied Biosystems), her bir bölge için 10 pmol external primerleri içeren 50 ml lik son hacimde gerçekle tirildi. kinci PCR siklusları, içerisinde 5 ml 10X PCR Buffer II (500 mmol/l KCl, 100 mmol/l Tris±HCl, ph 8.3; Applied Biosystems), 1.5 mmol/l MgCl2, 200mmol/l her bir dntp (Roche Diagnostic), 2.5 IU AmpliTaq Gold Polymerase (Applied Biosystems), 10 pmol dahili primer ve son hacmi 50 ml ye tamamlayacak kadar ultra saf su olan 0,2 ml PCR tüplerine ilk PCR siklusu ürününden 2 ml eklenerek gerçekle tirldi (8). Floresan PCR ürünleri, otomatik DNA dizi analizi cihazı ABI Prism 3100 (Applied Biosystems) de 20 dakikalık kapiller elektroforezi yapılarak analiz edildi. Mutasyon analizi ise Minisequencing metodu kullanılarak gerçekle tirildi (9) HLA gen kompleksi ve STR markerları. 62
-TALASEM OLGULARINDA PRE MPLANTASYON GENET K TANI (PGT) NIN YER Embryo Affected Child Hasta çocukla HLA uyumlu embriyoyu gösteren fragman analizi görüntüsü Embryo Affected Child Hasta çocukla HLA uyumsuz embriyoyu gösteren fragman analizi görüntüsü. 63
OP. DR. GÜVENÇ KARLIKAYA, PROF. DR. SEMRA KAHRAMAN IVSI-I G A Normal Aleller -87 C T Mutant alel Çalı ılan IVSI-1 G/A mutasyonu için normal, -87 C/T mutasyonu için ta ıyıcı bir embriyoya ait Minisequencing analizi görüntüsü Seçilen embriyolar, 4. veya 5. Gün transfer edilmi tir. Transfer edilecek embriyo sayısına, kadın ya ı, embriyo morfolojisi, etkilenmemi ve/veya ta ıyıcı embriyo sayısına ve endike ise HLA uyumlu embriyo sayısına göre karar verilmi tir. Fazla sayıda etkilenmemi embriyo varsa dondurularak saklanması çifte önerilmi tir. Transfer sonrası, etkilenmi ve/veya dü ük kalitedeki transfer edilmemi embriyolar, sonuçların konfirmasyonu için tekrar analiz edilmi tir. Gebelik sonucu olumlu gelen çiftlere, tanıların konfirmasyonu için, klasik prenatal tanı yöntemlerine ba vurması önerilmi tir. BULGULAR Sadece mutasyon analizi yapılan grupta anne ya ı ortalaması 33±4.7 idi. Toplam 310 embriyo biopsi için uygundu ve bunların 281 inden (%90.6) sonuç alındı. 71 (%25.2), 130 (%46.3), 80 (%28.5) embriyo, sırasıyla, etkilenmemi, ta ıyıcı ve etkilenmi olarak bulundu. Bütün olgularda embriyo transferi ba arılı bir ekilde uygulandı. Bu olgulardaki ortalama transfer edilen embriyo sayısı 2.3±0.8 idi. 16 olguda (46%) gebelik gerçekle ti. Bu gebeliklerin 6 sı tekil, 3 ü ikiz, 1 tanesi ise üçüz olarak gerçekle ti. 3 gebelik spontan dü ük ile seyrederken, halen 3 gebelik daha sa lıklı olarak devam etmektedir. 64
-TALASEM OLGULARINDA PRE MPLANTASYON GENET K TANI (PGT) NIN YER Mutasyon analizi ve HLA tiplemesinin beraber yapıldı ı olgularda anne ya ı ortalaması 32±4.9 idi. 1592 embriyoya biopsi uygulandı. 1300 (%81.6) embriyodan mutasyon analizi sonucu, 1436 (%90.2) embriyodan da HLA tiplemesi sonucu elde edilebildi. Bunlardan sadece 193 embriyonun HLA açısından uygun ve sa lıklı oldu u ve 60 embriyonun ise HLA uyumlu olmasına kar ın hasta oldu u belirlendi. Sonuç olarak 34 tedavi siklusu (%22) transfer yapılamadan iptal edilmek zorunda kalınıldı. Bu gruptaki ortalama transfer edilen embriyo sayısı 1.5±0.8 idi. 111 transfer siklusunun 44 ünde (%40) gebelik elde edildi. 16 gebelik spontan dü ük ile sonuçlandı, 3 tekil gebelik ve 2 ikiz gebelik devam etmektedir. 20 tekil ve 3 ikiz do um gerçekle mi tir. Bilgilerimiz dahilinde imdiye kadar 8 olguda kordon kanından elde edilen kök hücre transplantasyonu ba arı ile gerçekle tirilmi tir. TARTI MA Günümüzde, yardımcı üreme teknikleri ve preimplantasyon genetik tanı alanındaki ilerlemeler, sadece infertil vakalarda sonuçların iyile tirilmesine yardımcı olmakla kalmayıp, genetik hastalık ta ıyıcılı ı olup bunu kendilerinden sonraki nesillere aktarma riski olan ailelerde sa lıklı çocuk veya bu türde hasta çocuklara doku uyumlu karde sahibi olmalarına imkan veren alternatif bir yöntem olarak kar ımıza çıkmaktadır (10) Merkezimize bu amaçla ba vuran çiftlerin büyük ço unlu unu talasemi nedeniyle ba vuran olgular olu turmaktadır. Gerçektede, dünyada ve ülkemizde en sık görülen tek gen hastalı ı olarak talasemiler, önemli bir sa lık sorunu olu turmaktadır. Ülkemizde bu konuyla ilgili olarak daha önce yapılan çalı malarda beta talasemi ta ıyıcılı ının ortalama %2,2 oldu unu ancak bazı bölgelerde bu oranın %11 lere çıktı ını ortaya koymaktadır (11) Genetik bölümümüzde talasemi veya ba ka çok de i ik tek gen hastalıkları nedeniyle ba vuran ailelerin genetik çalı maları ve konsültasyonları yapılmaktadır. Preklinik genetik çalı malar daha önce çalı ılmı genetik hastalıklar için ortalama 1 ila 1,5 ay kadar sürmektedir. Dünya literatürü ve bizim bulgularımız dikkatli incelendi inde, birçok sınırlayıcı faktörün bu olgulardaki ba arıyı etkiledi ini görürüz. Daha önce yayınlanan çalı malarımızda, tek hücre DNA çalı malarının zorlukları (amplifikasyon güçlü ü veya ba arısızlı ı, kontaminasyon, ADO vb.) yanında YÜT siklusunun özelliklerininde (kadın ya ı,elde edilen oosit sayısı, biyopsiye uygun embriyo sayısı, alınan blastomer sayısı, transfer günü vb.) sonuçları etkiledi i tartı ılmı tı (1,4). Daha fazla sayıda olgunun de erlendirildi i bu çalı mada, her iki grupta da kadın ya ları ortalaması farklılık göstermemekle birlikte, ileri kadın ya ı,özellikle az sayıda matür oosit elde edilen HLA olgularında, iptal oranlarının daha yüksek oldu u dikkati çekmektedir. Aynı zamanda ileri kadın ya ı olgularında embriyolarda artmı anöploidi oranlarının varlı ı tanımlamayı bu yönde de geni letmek gereklili ini getirmektedir(5). Sadece mutasyon analizi yapılan olguların mutasyon analiz sonuçlarına bakıldı ında, mutasyon ta ımayan veya heterozigot ta ıyıcı embriyo oranlarının %71,5 ile, bir resesif karakterli genetik hastalıkta teorik oran olan %75 e yakın oldu u görülmektedir. Buna kar ılık, mutasyon analizi sonuçlarına HLA uyumu da eklendi inde transfer edilebilir embriyo bulma olasılı ı teorik olarak yakla ık %18 olmakla birlikte bizim çalı mamızda bu oran %13,4 e dü mektedir. Bu oranlar daha önceki çalı malarla da uygunluk göstermektedir(12). Elde edilen sonuçlar göstermi tir ki özellikle HLA uyumununda incelenmesi gereken durumlarda biyopsi için uygun yakla ık on embriyodan sadece bir tanesi transfer için uygun bulunabilmektedir. Görüldü ü üzere her iki grup arasındaki en önemli farklılı ı tedaviye ba latılan siklusların transfer a amasına ula abilme oranları olu turmaktadır. Sadece mutasyon analizi yapılan sikluslarda, olguların hepsi transfer a amasına ula ırken, mutasyon analizi ve HLA tiplemesi yapılan olgularda, ba latılan siklusların %22 si transfer yapılamadan iptal olmu tur. Transfer yapılabilen sikluslarda ise gebelik oranlarının birbirine yakın oldu u görülmektedir, dolayısıyla özellikle HLA uyumlulu u bulunan hasta grubunda transfer için uygun embriyo bulundu unda kabul edilebilir gebelik oranlarına ula ılabilmektedir (%45,7 ve %39,6). Bu durumun ailelerle i lem öncesinde konsülte edilmesi, sonuçların tartı ılması gereklidir. 65
OP. DR. GÜVENÇ KARLIKAYA, PROF. DR. SEMRA KAHRAMAN Literatür bilgilerine göre bu çalı ma, talasemi ve HLA tiplemesi için PGT yapılan en geni seridir. Bu bilgiler ı ı ında PGT nin, talasemi hastalı ını aktarabilme riski olan aileler ve hasta çocukları için, hem sa lıklı hemde doku uyumlu karde ler elde edebilmek açısından çok önemli bir teknik oldu unu söyleyebiliriz. Bunun yanında, ileri anne ya ı ve dü ük over rezervi gibi IVF tedavisinin ba arısına etki eden faktörler, dahada önemlisi hem HLA uyumlu hemde sa lıklı embriyo bulma konusundaki kısıtlılık ve buna ba lı tedavi iptalleri riski çiftlerle tedavi öncesinde mutlaka tartı ılmalıdır. Bu konu ile ilgili jinekologlar yanında, klinik genetik uzmanları, hematoloji uzmanları, pediatri uzmanları talasemi ta ıyıcısı aileleri bu teknik konusunda bilgilendirmelidir. KAYNAKLAR 1. Fiorentino F, Biricik A, Nuccitelli A, De Palma R, Kahraman S, Iacobelli M,Trengia V, Caserta D, Bonu MA, Borini A, Baldi M. Strategies and clinical outcome of 250 cycles of Preimplantation Genetic Diagnosis for single gene disorders.hum Reprod. 2005 Nov 25 2. Sermon K, Moutou C, Harper J, Geraedts J, Scriven P, Wilton L, Magli MC,Michiels A, Viville S, De Die C. ESHRE PGD Consortium data collection IV: May-December 2001. Hum Reprod. 2005 Jan;20(1):19-34. 3. Ince HH, Ayyildiz O, Kalkanli S, Batun S, Muftuoglu E Molecular basis of beta-thalassemia mutations in Diyarbakir in the southeastern region of Turkey.Hemoglobin. 2003 Nov;27(4):275-8. 4. Kahraman S, Karlikaya G, Sertyel S, Karadayi H, Findikli N. Clinical aspects of preimplantation genetic diagnosis for single gene disorders combined with HLA typing.reprod Biomed Online. 2004 Nov;9(5):529-32. 5. S Rechitsky, A Kuliev, T Sharapova, K Laziuk, S Ozen, I Barsky, O Verlinsky, I Tur-Kaspa, Y Verlinsky HLA typing with aneuploidy testing Preimplantation Volume 12, No 1 January 2006 6. Thornhill AR, dedie-smulders CE, Geraedts JP, Harper JC, Harton GL, Lavery SA, Moutou C, Robinson MD, Schmutzler AG, Scriven PN, Sermon KD, Wilton L; ESHRE PGD Consortium. ESHRE PGD Consortium 'Best practice guidelines for clinical preimplantation genetic diagnosis (PGD) and preimplantation genetic screening (PGS)'.Hum Reprod. 2005 Jan;20(1):35-48. 7. Kahraman S, Kumtepe Y, Sertyel S, Donmez E, Benkhalifa M, Findikli N,Vanderzwalmen P. Pronuclear morphology scoring and chromosomal status of embryos in severe male infertility.hum Reprod. 2002 Dec;17(12):3193-200. 8. Fiorentino F, Biricik A, Karadayi H, Berkil H, Karlikaya G, Sertyel S, Podini D, Baldi M, Magli MC, Gianaroli L, Kahraman S. Development and clinical application of a strategy for preimplantation genetic diagnosis of single gene disorders combined with HLA matching.mol Hum Reprod. 2004 Jun;10(6):445-60. 9. Fiorentino F, Magli MC, Podini D, Ferraretti AP, Nuccitelli A, Vitale N, Baldi M, Gianaroli L. The minisequencing method: an alternative strategy for preimplantation genetic diagnosis of single gene disorders. Mol Hum Reprod. 2003 Jul;9(7):399-410. 10. Verlinsky Y, Cohen J, Munne S, Gianaroli L, Simpson JL, Ferraretti AP,Kuliev A. Over a decade of experience with preimplantation genetic diagnosis: amulticenter report.fertil Steril. 2004 Aug;82(2):292-4. 11. Tadmouri GO, Basak AN. Beta-thalassemia in Turkey: a review of the clinical, epidemiological, 12. molecular, and evolutionary aspects.hemoglobin. 2001 May;25(2):227-39. 13. Kuliev A, Verlinsky Y. Preimplantation HLA typing and stem cell transplantation: report of International Meeting, Cyprus, 27-8 March, 2004.Reprod Biomed Online. 2004 Aug;9(2):205-9. 66