Derleme / Review 1 DO I: 10.5472/MMJ.2011.02064.1 Pediatri Perspektifinden Çocuklarda Konuşma ve Dil Gecikmesine Yaklaşım Approach to Speech and Language Delay in Children from the Perspective of Pediatrics Sinan Mahir KAYIRAN 1, Seda Atilla ŞAHİN 1, Sena CURE 2 1 Pediatri Kliniği, Amerikan Hastanesi, İstanbul, Türkiye 2 Psikoloji Anabilim Dalı, İnsani Bilimler ve Edebiyat Fakültesi, Koç Üniversitesi, İstanbul, Türkiye Özet Sağlam çocuk vizitlerinde, genellikle pediatristler fiziksel incelemeye odaklandığından, konuşma ve dil gecikmesi ihmal edilebilmektedir. Konuşma ve dil gecikmesi genetik, emosyonel, nöropsikiyatrik nedenlerle ya da idiopatik olabilir. Ülkemizdeki prevelans bilimsel çalışmalarla ortaya konulmamıştır. Konuşma ve dil gecikmesinden şüphelenildiğinde, pediatrist bu durumu aile ile tartışmalı ve gerekli gördüğünde bir konuşma terapistine yönlendirmelidir. Bu derlemede, konu pediatri perspektifinden, bir pediatristin bilmesi gerekenler yönüyle tartışılmıştır. (Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi 2012;25:1-4) Anah tar Ke li me ler: Konuşma, Dil, Gecikme, Çocuk Abstract During well-child visits, as pediatricians generally focus on physical examination, speech and language delay may be ignored. Speech and language delay is associated with genetic, emotional, neuropsychiatric or idiopathic causes. The prevelance in our country has not been established. When speech and language delay is suspected, the pediatrician should discuss this concern with the family and, if required, refer the child to a speech-language therapist. In this review, the issue is discussed from the perspective of pediatrics and what a pediatrician needs to know. (Marmara Medical Journal 2012;25:1-4) Key Words: Speech, Language, Delay, Child Gi riş Sağlam çocuk izleminde pediatristler genellikle fiziksel sorunlar üzerine yoğunlaştığından, dil ve konuşma bozuklukları aile tarafından bir yakınma olmadıkça çoğunlukla atlanabilmektedir. Ülkemizde nasılsa konuşur, babası da geç konuşmuştu gibi pek de önemsenmeyen bu sorun esasında son zamanlarda ayrı bir dal olarak kendini gösteren gelişimsel pediatrinin ana konularından birisini teşkil etmektedir. Dil ve konuşma gecikmesi idiopatik, nörolojik, genetik, duyusal veya nöropsikiyatrik nedenler sonucu da görülebilir. Ülkemizde dil ve konuşma gecikmesi prevelansı bilinmemektedir. Ancak dünyanın farklı ülkelerinde 2-7 yaş arasındaki çocuklarda prevelans %2-9 olarak bildirilmektedir 1-6. Dil ve konuşma gecikmesinin uzun dönemde akademik performansı etkilediği bilinmektedir. Erken dönem dil ve konuşma terapisi çocukların gelişim eğrisini değiştirebilmektedir. Bu derlemede, dil ve konuşma gecikmesi ile ilgili sorunlara pediatri perspektifinden yaklaşılmıştır. Normal Gelişim Dil ve konuşma birbirinden farklı iki olgudur. Dil kendi içinde algı ve ifade olarak ikiye ayrılır. Algı söylenenlerin ve yazılanların anlamlandırılması ile ilgilidir. İfade ise duygu ve düşüncelerin sözel ve yazılı aktarımı için hedef kelimelerin seçilmesini, dilbilgisi kurallarına uyulmasını içerir. Ayrıca, uygun pragmatik öğelerin kullanımı da (göz kontağı, sohbet sırasına uyulması vs.) dilin bir parçasıdır. İletişim/Correspondence to: Dr. Sinan Mahir Kayıran, Pediatri Kliniği, Amerikan Hastanesi, Nişantaşı, İstanbul, Türkiye E-pos ta: sinanmahir@gmail.com Başvuru Tarihi/Submitted: 19.09.2011 Ka bul Ta ri hi/ac cep ted: 17.11.2011 Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Der gi si, Ga le nos Ya yı ne vi ta ra fın dan ba sıl mış tır. / Marmara Medical Journal, Pub lis hed by Ga le nos Pub lis hing.

2 Kayıran ve ark. Çocuklarda Konuşma ve Dil Gecikmesi Marmara Medical Journal 2012;25:1-4 Konuşma, fiziksel olarak sözel ifade eylemini kapsar. Konuşma ilgili organların koordinasyonu ile gerçekleşir. Seslerin artiküle edilmesi, ses kalitesi, ve akıcılık konuşma ile ilgili kavramlardır 7,8. Dil gelişimi belli gelişim basamaklarını takip eder (Tablo I). Algı ve ifadeye zaman geçtikçe yeni kazanımlar eklenir. Altı aylık bebeklerin gözleri ile sesleri takip etmeleri beklenirken, dokuz aylık bebeklerin seslere dönüp bakmaları, kendileri ile konuşulduğunda dinlemeleri ve sık kullanılan nesnelerin isimlerini tanımaları beklenir. Birinci yaşına girmiş bebeklerin tek kademeli yönergeleri yerine getirmeleri beklenmektedir. On sekiz aylık bebeklerin, sorulduğunda en az bir vücut kısmına işaret edebilmeleri beklenir. Yirmi dört ayını tamamlamış çocukların ise Tablo I. Dil ve Konuşma Gelişim Basamakları Yaş Algı İfade 6 ay Sesleri gözü ile takip eder Güler. Agular. Babıldar-aynı heceleri biraraya getirir ma-ma, ba-ba gibi. Memnuniyet ve memnuniyetsizliğini sesi ile ifade eder. 9 ay Seslere dönüp bakar Babıldar kısa ve uzun Kendisi ile konuşulduğunda heceleri biraraya getirir dinler. Sık kullanilan nesnelerin isimlerini tanır (kitap, bardak vs.) ta-ta, di-di-di gibi. Beden dilini kullanır (parmakla işaret etmek gibi). El sallar. 12 ay Tek kademeli yönergeleri Babıldar. yerine getirir Sesleri taklit eder. Cok net olmasa da bir veya birkaç kelime söyleyebilir. El sallar. 18 ay Sorulduğunda en az bir 3-20 kelimesi vardır. vücut kısmına işaret edebilir Kelime dağarcığı isimlerden oluşur. Sesleri biraraya getirerek jest ve mimiklerle iletişim kurabilir. 2 yaş Basit yönergeleri Iki kelimeyi biraraya ipucu, jest, mimik olmadan getirebilir (anne, su vs.) yerine getirir Sesleri ve sözcükleri Kitaptaki resimleri taklit eder. sorulduğunda gösterebilir Basit hikayeleri, şarkıları dinler Sorulduğunda birkaç vücut kısmına işaret edebilir 3 yaş- Basit kim, ne, Aile dışındaki kişiler de 4 yaş nerede ve neden konuşmasını anlayabilir. sorularını cevaplayabilir Dört veya daha fazla kelimeden oluşan cümleler kurabilir. basit yönergeleri yerine getirmeleri, kitaptaki resimleri sorulduğunda gösterebilmeleri, basit hikayeleri, şarkıları dinlemeleri ve birkaç vücut kısmını gösterebilmeleri beklenir. Üçdört yaş arası çocukların ise kim, ne, nerede ve neden sorularını cevaplayabilmeleri beklenir 9-11. İfade de algı gibi belli basamakların takip edilmesi ile gelişir. Altı aylıkken bebeklerin gülmeleri, agulamaları, babıldamaya başlamaları (aynı heceleri biraraya getirmeleri ma-ma, ba-ba gibi), memnuniyet ve memnuniyetsizliklerini sesleri ile ifade etmeleri beklenir. Dokuzuncu ayda babıldamanın çeşitlenmesi (uzun, kısa ve farklı hecelerin biraraya gelmesi gibi) ve beden dili kullanımı gözlenir. Birinci yaşın dolması ile, babıldamanın, sesleri taklit etmeye çalışmanın, net olmasa da bir veya birkaç kelime söylemenin ve beden dili kullanımının gözlenmesi beklenir. Bir buçuk yaşında ise 3-20 kelimenin dağarcığa eklenmiş olması, kelimelerin çoğunun isimlerden oluşması ve jest ile mimiklere sesleri katarak iletişim kurulması beklenir. İki yaşındaki çocukların iki kelimeyi biraraya getiriyor olmaları ve ses ile sözcükleri taklit ediyor olmaları gerekir. Üç-dört yaşları arasında konuşmanın aile dışındaki kişiler tarafından da anlaşılır olması, dört ve daha fazla kelimeden oluşan cümleler kuruyor olmaları beklenir 6,9-11. Gecikmenin Nedenleri Yukarıda bahsedilen dil ve konuşma gelişim basamaklarının takip edilemediği durumlarda kapsamlı bir değerlendirme yapılması gereklidir 8. Dil ve konuşma gecikmesinin genetik (Down sendromu, yarık damak, Fragile-X vs.), işitsel, nörolojik (çocukluk apraksisi, serebral palsi, dizartri vs.) veya nöropsikiyatrik (otizm) gibi sebepleri olabilir. Bu gibi nedenlerden ötürü görülen dil ve konuşma gecikmesine ikincil dil ve konuşma problemleri denilmektedir 2. Bu tür hastalıklar farklı zamanlarda teşhis edilebilirler. Örneğin, sağırlık ve belirgin fiziksel özellikler içeren sendromlar (Down sendromu gibi) daha erken teşhis edilebilir. Ancak semptomları daha geç ortaya çıkan bozukluklar (otizm gibi) daha geç teşhis edilebilir 12. Düşük gelirli ailelerde bu bozuklukların teşhis edilmesi daha da geç olabilir 13. Dil ve konuşma gecikmesi genetik, işitsel, nörolojik veya nöropsikiyatrik bir bozukluğun sonucu olabileceği gibi, herhangi bir nedene bağlı olmaksızın da ortaya çıkabilir. Primer dil ve konuşma problemlerinin nedeni konusunda fikir birliğine varılmamış olsa da, bazı risk faktörleri belirtilmiştir. Cinsiyet, bir risk faktörü olarak bilinmektedir 6,14. Erkeklerde kızlara oranla dil ve konuşma gecikmesi görülmesi riski üç kat fazladır. Ayrıca, ailede konuşma gecikmesi yaşamış bireylerin olması bu riski iki katına çıkarmaktadır 15. Bir diğer risk faktörü ise düşük doğum ağırlığı ve erken doğum olarak belirlenmiştir. İdeal doğum ağırlıklarının %85 inden daha düşük ağırlıkla doğan çocuklarda veya 37 getsyonel haftadan erken doğan çocuklarda dil ve konuşma gecikmesi riski iki kat fazladır 16. Dil ve konuşma gelişiminde gecikmeye sebep olan bir diğer faktör ise elektronik medyadır. Televizyon, bilgisayar, internet, playstation vb. teknolojilerin yoğunlaştığı elektronik ortamda yetişen çocuklar, gerek kendi yaşıtları gerekse aile içi iletişimin azalmasına bağlı olarak giderek daha geç konuşmaya başlamaktadırlar 17. Özellikle iki yaş öncesi çocukların dil ve konuşma gelişimini olumsuz etkilediği için televizyon izlemeleri önerilmemektedir 18.

Marmara Medical Journal 2012;25:1-4 Kayıran ve ark. Çocuklarda Konuşma ve Dil Gecikmesi 3 İşitme veya nörolojik bozukluğu olan sendromik çocuklarda dil ve konuşma gecikmesi beklentisi olduğundan erken dönemde uygun yaklaşım yapılabilir. Ancak, yukarıda da bahsedildiği gibi, herhangi bir sendrom veya anomali olmaksızın da dil ve konuşma gecikmesi gözlenebilir. Böyle durumlarda, çocuk gelişim basamaklarına ulaşamadıkça ailede endişe başlar; bilgi toplama, başkaları ile konuşma, kendiliğinden geçmesini bekleme ya da çevresel öneriler dikkate alınarak konuşma gecikmesinin teşhisi ve gerekli tedavinin başlatılması ötelenebilmektedir 19. Gecikmenin Temel Belirtileri Nelerdir? Ne zaman konuşma terapistine yönlendirilmelidir? Dil gelişim aşamasında dil ve konuşma değerlendirmesi gerektiren bazı işaretlere dikkat etmek gerekir (Tablo II). Dokuz aylık bebeklerde babıldama olmaması, sessiz harflerin kısıtlı kullanılması ve ağırlıklı olarak sesli harfler ile babıldamanın gerçekleşmesi bir risk faktörüdür. On iki aylık bebeklerde işaret etme ve jestlerin görülmemesi de değerlendirme gerektiğine işarettir. On beş aylıkken en az üç kelimenin olmaması ve ebeveyn sorduğunda 5-10 nesneye veya kişiye bakılmaması da bir risk faktörüdür. On sekiz aylıkken anne, baba ve başka isimler kullanılmıyorsa ve tek kademeli basit yönergeler yerine getirilmiyorsa değerlendirme gerekmektedir. İki yaşındaki bir Tablo I. Dil ve Konuşma Değerlendirmesi Gerektiren İşaretler Yaş Algı İfade 9 ay Babıldama yok veya sessiz harfler kısıtlı sesli harflerle babıldama. 12 ay İşaret etme yok, jest yok. 15 ay Ebeveynin sorduğu 5-10 En az üç kelimesi yok. nesneye veya kişiye bakmıyor. 18 ay Tek kademeli yönergeleri Anne, Baba ve yerine getirmiyor. başka isimler yok. 2 yaş İstek üzerine resimlere veya En az 25 kelimesi yok vücut kısımlarına işaret etmiyor. Beden dili ile iletişim kuruyor, buna ses eşlik etmiyor 2,5 yaş Sorulara söz ile veya baş Iki kelimeyi biraraya sallama yoluyla yanıt vermiyor. getirmiyor. İsim ve yüklem kombinasyonları yapmıyor. 3 yaş Edat ve yüklemleri anlamıyor. En az 200 kelimesi yok. İki kademeli yönergeleri İsteklerini isimleri yerine getirmiyor ile belirtmiyor. Sorulara cevap olarak birkaç sözcükten oluşan ifadeleri tekrarlıyor (ekolali). Herhangi Kazanımlarını bir yaşta kaybediyor, geriye gidiş gözleniyor. çocuğun en az 25 kelimesi yok ise, beden dili ile kurduğu iletişime sesi ile eşlik etmiyorsa ve istek üzerine resimlere veya vücut kısımlarına işaret etmiyorsa bir dil ve konuşma terapistinin görüşüne başvurulmalıdır. İki buçuk yaşında iki kelimeyi biraraya getirip özne ve yüklem kombinasyonları yapmıyorsa ve sorulara söz veya baş sallama yolu ile yanıt vermiyorsa da değerlendirmeye başvurulmalıdır. Üç yaşındayken en az 200 kelime kullanmıyor, isteklerini isimleri ile ifade etmiyor, sorulara yanıt olarak birkaç sözcükten oluşan kalıpları tekrarlıyor (ekolali), edat ve yüklemleri anlamıyor ve iki kademeli yönergeleri yerine getiremiyorsa, herhangi bir yaşta kazanımlar kaybediliyor ve geriye gidiş gözleniyorsa da zaman geçirmeden dil ve konuşma tearapistine yönlendirilmelidir 20,21. Çift dilli yetişen çocuklarda iki dilin birbirine karıştırılması gözlenebilir ama bu durum dil gelişimi arttıkça azalır. Çift dilli çocukların tek dille yetişenlere oranla kavramsal esneklik açısından daha avantajlı olduğu düşünülmektedir 22. Çift dilli çocukların aynı anlama gelen farklı kelimeler kullandığı göz önüne alındığında, çift dilli ve tek dilli çocukların toplam kelime dağarcığının benzer olduğu gözlenir 23. Çift dilli çocuklar genellikle beş yaş civarında her iki dilde de yetkin olurlar 24. Çift dillilik primer dilde zorluk gözlenmiyor ise genellikle değerlendirme için bir neden değildir 8,25. Dil gecikmesi gözlendiğinde kendiliğinden geçmesini beklemek erken müdahalenin katkılarını önleyebilir. Dil gecikmesi yaşayan çocuklar okul çağında da dil bozuklukları yaşama riskine sahiptir 26,27. Araştırmalar iki beş yaş arası dil bozukluğu yaşayan cocukların okul çağında okuma ile ilgili zorluklarla karşılaştıklarını göstermektedir 28,29. Özellikle ailede dil gecikmesi olanlar, hem algıda hem ifadede gecikmesi olanlar ile jest ve mimikleri sınırlı veya hiç kullanmayan çocuklar ileride olası dil bozuklukları için (okuma, yazma, işitsel algı ve sözel ifade) risk altındadır 30. Dil ve konuşma gecikmesi yaşayan çocukların uzun dönemli izlemlerinde, yedi yaşındaki çocukların dil ve konuşma gecikmesi yaşamamış akranlarına oranla kelime dağarcığı, sözdizim ve dilbilgisi açısından daha düşük performans sergiledikleri ortaya çıkmıştır 31. Bir diğer araştırma sonucuna göre, sekiz ve dokuz yaşlarında bu çocukların akranları ile kıyaslandığında kelime dağarcığı, dilbilgisi, sözel hafıza, betimleme ve okuma algısı gibi alanlarda onlardan geri kaldıkları gözlenmiştir 32. Dil ve konuşma gecikmesi yaşayan çocukların daha uzun dönem takibini yapan araştırmalar da vardır. Örneğin, 17 yaşındaki çocukların karşılaştırılması yapıldığında, dil ve konuşma geriliği yaşayan çocukların kelime dağarcığı, dilbilgisi ve işitsel hafızalarında düşüklük izlenmiştir 33. Bu bilgilerin ışığında, erken dönem dil ve konuşma gecikmesinin, uzun dönemde akademik performansı etkilediği çıkarımı yapılabilir 34. Yukarıda belirtilen uzun dönemli sonuçlar da dil ve konuşma terapisinin gerekliliğini göstermektedir. Dil ve konuşma terapisi alan çocuklar ile terapi almayan çocuklar karşılaştırıldığında kelime dağarcığında artış, bir söylemde çıkan kelime dizisinde artış, konuşma anlaşılabilirliğinde artışın yanı sıra, sosyalleşme becerilerinde düzelme ve ebeveynlerin endişelerinin azalması gibi farklar belirlenmiştir 35. Dil ve konuşma gecikmesi yaşayan çocukların ebeveynleri ve pediatristleri, 24-36 ay arasında konuşmaya başlayan çocuklar ile

4 Kayıran ve ark. Çocuklarda Konuşma ve Dil Gecikmesi Marmara Medical Journal 2012;25:1-4 karşılaştıklarında, 3 yaşa gelene kadar değerlendirme ve tedavi yoluna gitmeyebilirler. Ancak, yapılan araştırmalara göre, 2 yaşında konuşma geriliği olan çocuklar 3 veya 4 yaşına geldiklerinde hala yaşıtlarının performansını yakalamamış olabilirler 36. Erken müdahale sayesinde ise (3 yaş öncesi başlayan tedavi) çocuğun gelişimsel eğrisini değiştirmek mümkündür. Erken müdahalenin hem dil ve konuşma hem de eşlik edebilen başka bozukluklar için faydalı olduğu belirlenmiştir 37. Dil gecikmesi için yapılan değerlendirme sonunda dil ve konuşma terapisti aileye çocuklarının dil gelişimini desteklemek için neler yapmaları gerektiğini öğretir. Bu sayede günlük rutinler içinde hedef stratejiler anne ve baba tarafından uygulanır. Araştırmalara göre uygun yaklaşımın dil ve konuşma terapisti tarafından yapılmasıyla onun eğittiği ebeveyn tarafından uygulanması arasında edinilen kazanımlar göz önüne alındığında fark yoktur. Bu yaklaşım çocuklarda dil ve konuşma gelişimini olumlu olarak desteklemektedir 38. Ülkemizde Anadolu Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü bünyesinde Dil ve Konuşma terapisti Anabilimdalı kurulmuş olup lisansüstü düzeyde eğitim programı uygulamaktadır ve terapist yetiştirilmektedir. Kaynaklar 1. Burden V, Stott CM, Forge J, Goodyer I. The Cambridge Language and Speech Project (CLASP). I. Detection of language difficulties at 36 to 39 months. Dev Med Child Neurol 1996;38:613-31. doi: 10.1111/j.1469-8749.1996.tb12126 2. Stevenson J, Richman N. The prevalence of language delay in a population of three-year-old children and its association with general retardation. Dev Med Child Neurol 1976;18:431-41. doi: 10.1111/j.1469-8749.1976.tb03682 3. Silva PA, McGee R, Williams SM. Developmental language delay from three to seven years and its significance for low intelligence and reading difficulties at age seven. Dev Med Child Neurol 1983;25:783-93. doi: 10.1111/j.1469-8749.1983.tb13847 4. Rescorla L. The Language Development Survey: a screening tool for delayed language in toddlers. J Speech Hear Disord 1989;54:587-99. 5. Wong V, Lee PW, Lieh-Mak F, et al. Language screening in preschool Chinese children. Eur J Disord Commun 1992;27:247-64. doi: 10.3109/13682829209029424 6. Boyle J. Speech and language delays in preschool children. BMJ 2011;343:d5181. doi: 10.1136/bmj.d5181. 7. Paul R, (editor). Language disorders from infancy through adolescence: assessment and intervention. New York: Mosby Elsevier, 2006. 8. McLaughlin, M. Speech and language delay in children. Am Fam Physician 2011;83:1183-8. 9. American Speech-Language-Hearing Association. How does your child hear and talk? http://www.asha.org/public/speech/development/chart.htm Accessed June 1, 2011. 10. Green M, Palfrey JS, (editors). Bright Futures: Guidelines for Health Supervision of Infants, Children, and Adolescents. 2nd ed., revised. Arlington, Va.: National Center for Education in Maternal and Child Health; 2002. 11. Coplan J. Evaluation of the child with delayed speech and language. Pediatr Ann 1985;14:203-8. 12. Charman T, Baird G. Practitioner review: Diagnosis of autism spectrum disorder in 2- and 3-year-old children. J Child Psychol and Psychiatry 2002;43:289 305. doi: 10.1111/1469-7610.00022 13. Mandell DS, Listerud J, Levy SE, Pino-Martin JA. Race differences in the age at diagnosis among medicaid-eligible children with autism. J Am Acad Child and Adolesc Psychiatry 2002;41:1447-53. doi:10.1097/00004583-200212000-00016 14. Huttenlocher J, Haight W, Bryk A, Seltzer M, Lyons T. Early vocabulary growth: Relation to language input and gender. Dev Psychol 1991;27:236 48. doi: 10.1037//0012-1649.27.2.236 15. Feldman HM, Dale PS, Campbell TF, Colborn DK, Kurs-Lasky M, Rockette HE. Concurrent and predictive validity of parent reports of child language at ages 2 and 3 years. Child Dev 2005;76:856-68. doi: 10.1111/j.1467-8624.2005.00882 16. Zubrick SR, Taylor CL, Rice ML, Slegers DW. Late language emergence at 24 months: An epidemiological study of prevalence, predictors and covariates. J Speech, Lang Hear Res 2007;50:1562 92. doi:10.1044/1092-4388(2007/106) 17. Vandewater EA, Rideout VJ, Wartella EA, Huang X, Lee JH, Shim MS. Digital childhood: electronic media and technology use among infants, toddlers, and preschoolers. Pediatrics 2007;119:e1006-15. doi: 10.1542/peds.2006-1804 18. American Academy of Pediatrics: Children, adolescents and television. Commitee on Public Education. Pediatrics 2001;107:423-6. doi: 10.1542/peds.107.2.423 19. Scarborough AA, Hebbeler KM, Spiker D, Simeonsson RJ. Dimensions of behavior of toddlers entering early intervention: child and family correlates. Infant Behav Dev 2007 ;30:466-78. doi:10.1016/j.infbeh.2006.12.003 20. Northwest Center Child Development Program. Red flags for language development. http://www.nwcenterkids.org/images/redflags_language.pdf Accessed June 3, 2011. 21. Schum RL. Language screening in the pediatric office setting. Pediatr Clin North Am 2007;54:425-36. doi:10.1016/j.pcl.2007.02.010 22. Maura RM. Speech and Language Delay in Children. Am Fam Physician 2011;83:1183-8. 23. Patterson JL. Comparing bilingual and monolingual toddlers expressive vocabulary size: Revisiting Rescorla and Achenbach 2002. J Speech Lang Hear Res 2004;47:1216-7. doi:10.1044/1092-4388(2004/089) 24. Redlinger WE, Park TZ. Language mixing in young bilinguals. J Child Lang 1980;7:337-52. doi: 10.1017/S030500090000266X 25. Leung AK, Kao CP. Evaluation and management of the child with speech delay. Am Fam Physician 1999;59:3121-8. 26. Catts HW, Fey ME, Tomblin JB, Zhang X. A longitudinal investigation of reading outcomes im children with language impairments. J Speech Lang Hear Res 2002;45:1142-57. 27. Oğuz Tanrıdağ. Speech and language disturbances in neurology practice. Türk Nörol Derg 2009;15:155-60. 28. Silva PA, Williams S, McGee R. A longitudinal study of children with developmental language delay at age three: later intelligence, reading and behaviour problems. Dev Med Child Neurol 1987;29:630-40. doi: 10.1111/j.1469-8749.1987.tb08505.x 29. Scarborough HS, Dobrich W. Development of children with early language delay. J Speech Hear Res 1990;33:70-83. 30. Weiner PS. A language delayed child at adolescence. J Speech Hear Disord 1974;39:202-12. 31. Rice ML, Taylor CL, Zubrick SR. Language outcomes of 7-year-old children with or without a history of late language emergence at 24 months. J Speech Lang Hear Res 2008;51:394 407. doi:10.1044/1092-4388(2008/029) 32. Rescorla, L. Language and reading outcomes to age 9 in late-talking toddlers. J Speech Lang Hear Res 2002;45:360 71. doi:10.1044/1092-4388(2002/028) 33. Rescorla, L. Age 17 language and reading outcomes in late-talking toddlers: Support for a dimensional perspective on language delay. J Speech Lang Hear Res 2009;52:16 30. doi:10.1044/1092-4388 34. McRae KM, Vickar E. Simple developmental speech delay: a followup study. Dev Med Child Neurol 1991;33:868-74. doi: 10.1111/j.1469-8749.1991.tb14795.x 35. Robertson S, Weismer S. Effects of treatment on linguistic and social skills in toddlers with delayed language development. J Speech Lang Hear Res 1999;42:1234 48. 36. Rescorla L, Alley A. Validation of the language development survey (LDS): a parent report tool for identifying language delay in toddlers. J Speech Lang Hear Res 2001;44:434 45. doi:10.1044/1092-4388(2001/035) 37. Guralnick MJ, (editor). The developmental systems approach to early intervention. Baltimore: Brookes, 2005. doi: 10.1002/icd.453. 38. Pepper J, Weitzman E, (editors). It Takes Two to Talk: A practical guide for parents of children with language delays. Toronto: The Hanen Centre, 2004.

Derleme / Review 5 DO I: 10.5472/MMJ.2011.01922.1 İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücreler ve Uygulamaları Induced Pluripotent Stem Cells and Their Applications Handan SEVİM, Özer Aylin GÜRPINAR Biyoloji Anabilim Dalı, Fen Fakültesi, Hacettepe Üniversitesi, Ankara, Türkiye Özet Pluripotent özellik, organizmanın bütün dokularındaki hücreleri oluşturabilme özelliğidir ve sadece embriyonik kök hücre (EKH) ler bu özelliğe sahiptir. İlk olarak 2006 yılında Takahashi ve Yamanaka isimli araştırmacıların çalışmaları ile somatik bir hücreye gen aktarılması sonucu pluripotent özellikte hücreler elde edilmiştir ve bu hücrelere indüklenmiş pluripotent kök hücre (İPKH) adı verilmiştir. İPKH ler oluşturulurken pluripotent özelliği sağlamak amacıyla c-myc, Sox-2, Oct ¾ ve Klf-4 genleri transfeksiyonla somatik hücrelere aktarılmaktadır. Gen aktarımı işlemi sonucunda aktif genleri içeren hücre kolonilerinin seçimi ile İPKH ler elde edilmektedir. Pluripotent özellikteki EKH lerde karakteristik olan; kültür ortamındaki gelişim evreleri, DNA metilasyon modeli, teratom oluşturabilme yeteneği, üç germ tabakasına ait hücrelere farklılaşabilme potansiyeli ve kimerik canlılar oluşturabilme özellikleri İPKH lerde de bulunmaktadır. Bunun yanında, etik olarak çalışılmasında sorunlar yaşanan EKH ler yerine kullanılabilecek tek kaynaktır. Organizmadaki bütün hücrelere farklılaşabilme özellikleri ile geri dönüşümsüz hücre hasarlarının oluştuğu bütün hastalık modellerinde hücresel tedavi amaçlı kullanılabilir. Ayrıca bu hücreler elde edildiği organizmaya otolog implante edilebilme şansına da sahiptir ve böylece implantasyonlarda yaşanan immun cevap riski ortadan kalkmaktadır. Bu nedenle, İPKH ile hücresel tedaviler, ilaç araştırmaları ve hastalık modellerinin araştırılmasına olanak sağlayabilecek en uygun kaynaktır. Bu derlemede, günümüzde yeni bir araştırma alanı olan İPKH Lerin elde edilmesi ve kullanım alanları ile ilgili yakın zamanda yapılan araştırmalar hakkında bilgi verilmesi amaçlanmıştır. (Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi 2012;25:5-9) Anah tar Ke li me ler: Pluripotent kök hücre, Embriyonik kök hücre, Doku tedavisi, Transfeksiyon, Oktamer transkripsiyon faktörü-3, SoxB1 transkripsiyon faktörleri. Abstract Pluripotency is a property of a cell that allows it to develop as any of the cell types of the body. Embryonic stem cells (ESCs) are unique cells in the organism and they have a pluripotent capacity. Induced pluripotent stem cells (IPSCs) is a term that describes somatic cells having a pluripotent capacity induced by the viral transfection of special genes. This term was firstly used in 2006 by Takahashi and Yamanaka in their experimental work. c-myc, Sox-2, Oct ¾ and Klf-4 genes are used for the transfection of somatic cells in order to obtain IPSCs. IPSC colonies are produced by using a successful transfection process. IPSCs have pluripotent stem cell specialities like growing potential in a culture system, having a DNA methylation pattern, an ability to form teratomas, to generate three germ line components and to generate chimeric organisms which pluripotent ESCs have. Concerning the ethical problems of working with the ESCs, IPSCs can be a unique source for pluripotency studies. IPSCs with their pluripotent capacity can be used for cell therapies in diseases which have irreversible cell defects. IPSCs can also be used to form autologus implants with no immune response. Therefore, IPSCs can be used for cell therapies, drug research or disease models. In this review, we give some information about obtaining IPSCs and today s research areas that have been opened by the use of these cells. (Marmara Medical Journal 2012;25:5-9) Key Words: Pluripotent stem cell, Embryonic stem cell, Tissue therapy, Transfection, Octamer transcription factor-3, SOXB1 transcription factors. Gi riş İndüklenmiş pluripotent kök hücre (İPKH), tanım olarak pluripotent özellik kazanmış somatik hücrelere denir. Bu terim ilk olarak 2006 yılında Takahashi ve Yamanaka isimli bilim adamlarının çalışmaları ile gündeme gelmiştir 1. Pluripotent özellik organizmadaki üç germ tabakasından köken alan bütün hücreleri oluşturabilme özelliğidir ve embriyonik kök hücre (EKH) ler bu İletişim/Correspondence to: Dr. Handan Sevim, Biyoloji Anabilim Dalı, Fen Fakültesi, Hacettepe Üniversitesi, Çankaya, Ankara, Türkiye E-pos ta: sevimh@hacettepe.edu.tr Başvuru Tarihi/Submitted: 13.08.2011 Ka bul Ta ri hi/ac cep ted: 31.10.2011 Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Der gi si, Ga le nos Ya yı ne vi ta ra fın dan ba sıl mış tır. / Marmara Medical Journal, Pub lis hed by Ga le nos Pub lis hing.

6 Sevim ve ark. İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücreler ve Uygulamaları Marmara Medical Journal 2012;25:5-9 özelliğe sahiptir. EKH ler blastosist aşamasındaki embriyonun iç hücre kitlesinden elde edilir. Hücre kültürlerinde uygun koşullarda üretilen EKH ler, kalp hücresinden yağ hücresine vücuttaki bütün hücreleri oluşturabilme yeteneğindedir 2,3. EKH ler, bilimsel çalışmalar için istenilen hücre tipinin elde edilmesi ve geri dönüşümsüz hücresel hasarların oluştuğu hastalıklarda hücresel tedavi için kaynak olarak kullanılmaları açısından oldukça önemlidir 4. Ancak EKH ler elde edilirken blastosiste müdahale edilmesi, insan kaynaklı çalışmaların yapılmasında etik sorunları ortaya çıkarmıştır. Geçerli olan etik kurallar dahilinde kök hücre transplantasyonu ile ilgili hematopoietik kök hücrelerin otolog olarak tedaviye yönelik kullanımı olmasına rağmen EKH ler ile yapılan çalışmalar etik sorunlar nedeniyle yapılamamaktadır Ülkemizde 2006 yılı itibari ile Sağlık Bakanlığı tarafından alınan kararla EKH ler ile yapılacak çalışmalar durdurulmuştur 5,6. Bu nedenle İPKH ler blastosiste müdahale edilmeden elde edilebilen pluripotent kök hücreler olarak kullanılmasında sorun yaşanan EKH ler için tasarlanan bilimsel çalışmaların gerçekleştirilmesine yönelik yeni bir fırsat oluşturmaktadır. İPKH lerin Oluşturulmasında Seçilen Hücre Tipleri ve Genler İPKH lerin eldesinde somatik hücrenin yeniden programlanarak pluripotent özellikte bir hücreye dönüşmesi söz konusudur 1,7,8. Hücrelerin yeniden programlanması çeşitli yollarla olmaktadır. Bunlar; hücre füzyonu, somatik hücre çekirdek aktarımı ve gen aktarımıdır İPKH ler oluşturulurken somatik hücreye pluripotent özellik sağlayan genler aktarılmaktadır. Somatik hücre kaynağı olarak seçilen hücreler genellikle fibroblast kökenli hücreler olmaktadır. Fare hücrelerinden İPKH ler elde edilirken kaynak olarak kullanılan hücreler; dermal fibroblastlar, dermal papilla hücreleri, pankreas β hücreleri, ince barsak epitelyum hücreleri, kuyruk kökü fibroblastları, nöral kök hücreler, kemik iliği kök hücreleri, B lenfositler ve mononükleer hücrelerden başarılı olarak İPKH ler elde edilmiştir 1,9-16. İnsan çalışmalarında, dermal fibroblastlar, amniyotik sıvıdan elde edilen hücreler, embriyo kökenli fibroblastlar, hematopoietik oldukları tespit edilmiş CD34 pozitif kan hücreleri 17, mezenşimal kök hücreler, yağ doku kök hücreleri ve oral mukoza hücrelerinden İPKH ler üretilmiştir 16-23. Seçilen somatik hücrelerin programlanması amacıyla Takahashi ve Yamanaka tarafından yapılan çalışmada, öncelikle pluripotent özelliği sağlayan 24 adet gen tanımlamış ve bu genler içinde 4 adet genin pluripotent özelliklerin sağlanmasında yeterli olduğu gösterilmiştir. Oct ¾, Sox2, c-myc ve Klf4 genlerini bu amaçla seçilip kullanılmıştır1. Ayrıca Takahashi ve Yamanaka nın çalışmasından bir yıl sonra Yu ve arkadaşları Oct ¾, Sox2, Nanog ve Lin28 genlerini indüklenmiş pluripotent kök hücre eldesinde kullanmışlardır 24. Oct ¾ ; DNA da ATTTGCAT oktomerini tanıma özelliği olan oktomer bağlanma transkripsiyon faktörüdür. İlk olarak döllenmemiş yumurtada bulunan bir protein olarak tanımlanmıştır 25. Embriyonun iç hücre kitlesi hücrelerinin gelişimi için ifade olması gerekmektedir. Ayrıca embriyonik kök hücrelerin gelişiminde bu faktörün seviyesinin 3 önemli etkisi gözlemlenmekte; düşük seviyede ifade edildiğinde hücreler pluripotent özellikte kalmakta ve farklılaşma olmamakta; ifadesindeki 2 kat artış hücrelerin primitif endoderm ve mezoderm yönünde farklılaşmasına; ifadesinin baskılanması durumunda ise hücrelerin pluripotent özelliğini kaybedip tropoekdoderm yönünde farklılaşmasına neden olmaktadır 8,26. Sox2; SRY ilişkili, DNA da küçük oluğa bağlanan transkripsiyon faktörleri ailesindendir. EKH ler in kendi kendini yenileme özelliği için gereklidir. Erken embriyoda, germ hücrelerinde ve epiblastta ifade edilir. İfadesinin baskılanması durumunda embriyo gelişiminde epiblast oluşumunda sorun oluştuğundan embriyolar yok olur. Sox2 nin önemli görevlerinden birisi de Oct ¾ ifadesini düzenlemesidir. Yapılan araştırmalarda Sox2 ve Oct ¾ birbirinin ifadesini etkileyerek kök hücrelerin pluripotent özelliğini etkiledikleri gösterilmiştir 27. c-myc; tümörlerde yüksek aktivasyona sahip bir onkogendir. Histon asetilasyonunda rol adığı için kromatin yapısının düzenlenmesinde etkilidir 28. Hücre döngüsü, apoptoz, sinyal iletimi, transkripsiyonel ve posttranskripsiyonel düzenleme mekanizmaları, kök hücre biyolojisi ve kanser moleküler biyolojisinde önemli olan faktörlerdendir 29,30. EKH ler de kendi kendini yenileme ve pluripotent özelliğin devamı için gerekli bir faktördür. Klf4; yapısı Drosophiladaki Krüppel proteninin yapısına benzediği için Krüppel benzeri faktör 4 (Klf4) adını alan, epitelden bağırsağa, böbrek ve deriye kadar bir çok dokuda bulunan bir transkripsiyon faktörüdür. Etkilediği gen ve ürünlerin durumuna göre transkripsiyonu aktive edebilir ya da baskılayabilir. Ayrıca yüksek seviyede ifade edildiğinde hücre bölünmesini baskılar ve hücrenin G1-S fazında kalmasını sağlar 31. EKH lerin kendi kendini yenileme özelliği için gerekli bir faktördür. Nanog ve Lin-28; İPKH ler programlanmasında kullanılan diğer transkripsiyon faktörleridir. Nanog EKH lerde kök hücre olarak kalma özelliğini ve plurpotent özelliğini etkileyen önemli bir faktördür. Yapılan çalışmalarda Nanog geni hasarlı EKH lerin kendi kendini yenileme özelliğini kaybettiği ve ektraembriyonik doku hücrelerine farklılaştığı görülmüştür 32. Lin-28 erken embriyonik dönemde ifade edilen proteindir ve EKH lerin işaretleyicisi olarak da kullanılmaktadır. Bütün bu transkripsiyon faktörleri bir hücrenin pluripotent özelliğe sahip olması için yeterli olan faktörlerdir1. Fibroblast gibi somatik bir hücrenin bu genleri ifade etmesi pluripotent hücre yönünde programlandığını göstermektedir. Ayrıca c-myc nin bir onkogen olması nedeniyle bazı çalışmalarda c-myc geni aktarılmadan hücrelerin farklılaştırılması yönünde çalışmalar da yapılmıştır 33. İPKH lerin Elde Edilmesi Hücrelere gen aktarımı amacıyla retrovirüsler ve adenovirüsler gibi vektör sistemleri kullanılmaktadır 1,34. Virüsler kullanılarak yapılan gen aktarımında viral vektörün genetik materyaline aktarılmak istenen gen bölgesi yerleştirilir ayrıca gen aktarımının doğru yapıldığının anlaşılmasını sağlayan özel bölgeler, antibiyotik direnç özelliği gibi, viral genetik materyale eklenir. Gen aktarımı

Marmara Medical Journal 2012;25:5-9 Sevim ve ark. İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücreler ve Uygulamaları 7 işlemi gerçekleştiğinde viral genetik materyal hücrenin DNA sına entegre olur ve devam eden hücre bölünmeleri süresince hücre DNA sı ile bölünür. Virüs genetik materyalinde seçilim sağlayan bölgelerin özellikleri kullanılarak genetik olarak istenilen özellikteki hücrelerin seçilimi yapılır. Vektör sistemlerinin yanı sıra proteinlerin hücrelerin içine hedeflenmesi yöntemi yani protein transdüksiyonu ile hücrelerin yeniden programlanması için çalışmalar devam etmektedir 35. İPKH lerin Karakterizasyonu Gen aktarımı ile elde edilen İPKH lerin, pluripotent hücre özelliklerine sahip olduğunu analiz etmek için çeşitli testler uygulanmaktadır. Bu analizlerde hedeflenen İPKH lerin pluripotent özellikteki hücreler olan EKH lere benzerliğinin gösterilmesidir. Analizlerde İPKH lerin hücre kültür sistemlerinde EKH lere benzer gelişim göstermesi, EKH lerde olan aktif gen profiline sahip olması, hücre kültüründe embriyoid cisimcikleri oluşturabilmesi, hücre kültüründe üç germ tabakasına ait hücreleri oluşturabilmesi, in vivo deneylerde teratom oluşturabilmesi ve son olarak da gelişmekte olan embriyoya aktarıldıklarında kimerik canlılar oluşturabilmeleri araştırılmıştır. Araştırmalarda İPKH ler, hücre kültüründe EKH ler ile paralel olarak takip edilmiş ve hücrelerin büyüme eğrilerinin benzerlikleri görülmüştür. İPKH lere eş zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (Real-Time PCR) analizi yapılarak EKH lere özgü genleri ifade ettikleri gösterilmiştir. İPKH lerin immün sistemi baskılanmış hayvanlara implantasyonu sonucu oluşan teratomlar histolojik olarak incelenmiş ve üç germ tabakasına ait hücreler histolojik boyamalarla gösterilmiştir. Histolojik yönteme ek olarak İPKH ler, immunofloresan yöntemlerle de analiz edilmiştir. Ayrıca İPKH lerin epigenetik olarak da EKH lere olan benzerlikleri de araştırılmıştır. Bu amaçla telomeraz aktiviteleri, DNA metilasyon modelleri ve histon asetilasyonları analizleri yapılmıştır. Elde edilen sonuçlar ile İPKH lerin bütün bu testlerde EKH lere benzer sonuçlar verdiği görülmüş ve böylece bu hücrelerin pluripotent özellikte olduğu gösterilmiştir 1,7,36. İPKH lerin Farklılaştırılması ve Kullanım Alanları İPKH lerin elde edilmesindeki amaç; otolog pluripotent kök hücrelerin hastalıkların tedavisinde kullanılmasına olanak sağlamak, hasta kişilerin İPKH leri ile hastalığın genetik alt yapısını ve gelişimini incelemektir. Bu amaçlarla İPKH ler çeşitli hastalık modellerinin tedavisine yönelik araştırmalarda, in vitro ve in vivo deneylerde, kullanılmıştır (Şekil 1) 34. Son zamanlarda İPKH lerin kullanıldığı çalışmalar Parkinson hastalığından karaciğer yetmezliğine, orak hücreli anemiden kalp kası hasarlarına kadar geniş bir alanda devam etmektedir 11,15,37,39,45,47-49. İleri düzeydeki karaciğer hastalıklarının tedavisinde son çare karaciğer transplantasyonudur. Ancak verici azlığı ve doku reddi söz konusu olduğundan alternatif tedavi yöntemleri araştırılmaktadır. İPKH lerin hepatositlere farklılaşması amacıyla ilk olarak Sullivan ve arkadaşları tarafından yapılan çalışmada, dişi ve erkek bireylerden elde edilen İPKH lerin hepatosit benzeri hücrelere farklılaşması %70 ve %90 oranında gerçekleşmiştir. Ayrıca elde edilen bu hücrelerin hepatosit morfolojisinde olduğu, alfa-fetoprotein, albumin hepatik proteinleri ürettikleri, gilkojen depolama ve üre oluşturma özelliklerinin de olduğu gösterilmiştir 15,37,38. Farklılaşan hücreler sadece morfolojik olarak değil fonksiyonel olarak da hepatosit hücresi özellikleri taşıdığından elde edilen hücreler; yapay organ oluşumu, doku mühendisliği çalışmaları, hepatik hastalık modelleri ve in vitro deneyler için oldukça iyi bir kaynak oluşturmaktadır 38. Parkinson ve ALS (amyotrophic lateral sclerosis) gibi geri dönüşümsüz hücresel hasarların oluştuğu sinir sistemi hastalıklarının tedavisinde hastalığın ilerlemesini önlemenin yanında kaybedilen hücrelerin telafisi amacıyla hücresel tedavi çalışmaları yapılmaktadır. Parkinson hastalığında hücresel tedavi ile amaç in vitro ortamda elde edilen dopaminerjik nöronların hasarlı alana transplantasyonu ile hasarlı alandaki dopaminerjik nöron sayısının arttırılmasıdır. Bu amaçlarla İPKH lerden dopaminerjik hücreler, motor nöronlar, oligodendrositler gibi nöronal hücrelerinin farklılaşması gerçekleştirilmiştir 39-43. Parkinson hastalığı ile ilgili yapılan bir çalışmada Parkinson hastalıklı hayvan modelinden elde edilen fibroblastlardan İPKH ler oluşturulmuş ve bu hücreler dopaminerjik nöronlara farklılaştırılmıştır. Nöronlara farklılaşan İPKH ler yetişkin fare beynine transplante edilmiş ve bu hücrelerin hasarlı alana entegre oldukları ve fonksiyonel olarak yetişkin nöronların özeliklerine sahip oldukları görülmüştür40. 82 yaşındaki bir ALS hastasının hücrelerinden elde edilen İPKH lerle yapılan bir çalışmada ise İPKH lerin motor nöronlara farklılaşması gerçekleşmiş ve bu motor nöronların ALS hastalarının genetik yapılarının ve hücresel patolojilerinin araştırılmasında büyük olanaklar sağlayacağı gösterilmiştir 39. Kalp krizi ve musküler distrofi gibi kas hücresi kaybının olduğu hastalıklarda kullanılmak üzere İPKH lerden kas hücresi farklılaşmasına yönelik olarak da çeşitli çalışmalar yapılmıştır 44-46. Kalp krizi sonucu oluşan kaybedilen kalp kası hücrelerinin yeniden Sağlıklı ya da hasta birey Yapay organlar Somatik hücreler Doku mühendisliği çalışmaları Sox-2 Oct3/4 c-myc Klf-4 Viral tansfeksiyonla hücrelerin yeniden progralanması Farklılışan Hücreler İn vitro denemeleri ve analizleri Transfeksiyonla oluşan İPKH lerin seçilimi Güvenli İPKH lerin farklı tip hücrelere farklılaştırılması Hastalık modellerinin araştırılması ve transplantasyon Şekil 1. İndüklenmiş pluripotent kök hücrelerin oluşturulması ve kullanım alanları. Asgari S, Pournasr B, Salekdeh GH, Ghodsizadeh A, Ott M, Baharvand H. Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology. J Hepatol 2010;53:738-51 den değiştirilerek şematize edilmiştir

8 Sevim ve ark. İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücreler ve Uygulamaları Marmara Medical Journal 2012;25:5-9 elde edilmesine yönelik yapılan çalışmalarda İPKH lerden kalp kası hücrelerinin farklılaşması gerçekleştirilmiştir 45,46. İPKH lerden farklılaşan kalp kası hücrelerin %55 i spontan olarak kasılıp gevşemekte ve bu hücrelerin gen ifadeleri incelendiğinde embriyonik dönemden itibaren ifade edilen kardiyak özgül faktörleri ifade edebilmektedir 45. Zhang ve arkadaşları tarafından yapılan çalışmalarda ise İPKH lerden farklılaşan kalp kası hücrelerinin aksiyon potansiyeli karakterizasyonlarına göre atriyal ve ventriküler hücrelerle benzer özelliklerde oldukları ve elektrofizyolojik ölçümlerinin de bu bulguları desteklediği görülmüştür 46. Musküler distrofide oluşan kas kaybını telafi etmek amacıyla İPKH ler iskelet kası hücreleri farklılaştırılmıştır. Elde edilen bu hücreler musküler distrofili fare modeline intramusküler olarak transplante edilmiştir. 24 haftalık takipte yetişkin miyojenik hücreler hasarlı alanda tespit edilmiş, uzun dönemde kas sisteminin desteklendiği yeni kas yıkımının olmadığı görülmüştür 44. Genetik hasar nedeniyle oluşan kan hastalıklarının tedavisine yönelik çalışmalarda da İPKH lerin kullanılmasına yönelik çalışmalar yapılmaktadır. Bu çalışmalarda hastanın kendi hücrelerinin genetik hasarının düzeltilerek hastaya verilmesi ile doku reddi mekanizmasının engellenmesi ve hasta kişiden elde edilen hücrelerle hastalığın gelişimi, ilaç etkileşimlerinin incelenmesine yönelik deneyler yapılmaktadır 9,47,49. İPKH lerden T lenfositlerin farklılaştırılması Lei ve arkadaşları tarafından gerçekleştirilmiştir. Farklılaşan T lenfositlerin interlökin-2 ve Interferon gamma salgıladığı ve bu hücrelerin genetik olarak ımmün sistemi hasarlı fareye intravenöz olarak verilmesi sonucu farelerdeki T lenfosit havuzunun yenilendiği gösterilmiştir 47. Orak hücreli anemi ve Falkoni anemisi üzerinde yapılan çalışmalarda ise anemik kişilere ait İPKH lerden hematopoietik öncül hücreler elde edilmiştir 10,48. Orak hücre anemili hastadan elde edilen İPKH lerde hasarlı gen düzeltilerek hematopoietik hücreler farklılaştırılmıştır. Farklılaşan hematopoietik hücreler hasarlı orak hücre anemili fare modeline transplante edilmiştir. Transplantasyon sonrasında farede hematolojik bulgularda kontrollere göre iyileşme olduğu gösterilmiştir9. Falkoni anemisi ile ilgili Raya ve arkadaşları tarafından yapılan çalışmalarda ise Falkon anemili hastadan elde edilen İPKH lerden miyeloid ve eritroit kökenli fenotipik olarak normal öncül hücrelerin farklılaşması gerçekleştirilmiştir 48. Sonuç olarak, İPKH ler hücresel tedaviler için çok yeni bir kaynak olarak günümüzde popülerliğini korumaktadır. İPKH lerin elde edilmesi şuanki çalışmalar için öncelik teşkil etmekle beraber devam eden aşamalarda virüslerden faydalanmadan ve onkogenler kullanılmadan İPKH lerin elde edilmesine denemeler yapılmaya devam edilmektedir 32,34,49. Kişiye özgü pluripotent özellikte hücre elde edilmesine olanak sağlayan bu yöntem sayesinde doku reddi olmadan hücresel tedaviler gerçekleşebilecektir. Ayrıca çeşitli genetik hastalık modeline sahip hücrelerden de İPKH lerin elde edilmesi ile genetik hastalıklarının gelişiminin ve dokulara özgü hücresel mekanizmaların takibi gerçekleşebilecektir 50. Bütün bunların yanında EKH lerin insandan elde edilmesinde yaşanan etik sorunlar düşünüldüğünde, İPKH ler günümüzde pluripotent hücrelerle yapılacak in vitro ve in vivo çalışmalar için tek kaynaktır. Bu nedenlerle günümüz araştırmacıları için İPKH lerin elde edilmesi ve farklılaşması geniş bir araştırma alanı oluşturmaktadır.. Kaynaklar 1. Takahashi K, Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 2006;126:663 76. doi 10.1016/j.cell.2006.07.024 2. Keller GM. In vitro differentiation of embryonic stem cells. Curr. Opin. Cell Biol. 1995;7:862 9. 3. Gardner RL, Brook FA. Reflections on the biology of embryonic stem cells. Int J Dev Biol 1997;41:235 43. 4. Özel HB, Ozan E, Dabak DÖ. Embriyonik kök Hücreler. Review. Turkiye Klinikleri 2008, 28:333-41. 5. Can A. A concise review on the classification and nomenclature of stem cells. Turk J Hematol 2008;25: 57-9. 6. Kaygusuz I, Kantarcıoğlu B, Toptaş T, et al. Factors Affecting Stem Cell Mobilization in Patients Treated With Hematopoietic Peripheral Stem Cell Transplantation, Marmara Med J 2011; 24 :31-7. doi:10.5472/mmj.2010.01763.1 7. Wernig M, Meissner A, Foreman R, et al. In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotent ES-cell-like state. Nature 2007 ;448:260-2. doi:10.1038/nature05944. 8. Saigal S, Bhargava A. Stem Cell - Is There Any Role in Tumorigenic Activity, Turk Patoloji Derg. Cilt/Vol. 27,2011; Sayfa/Page 93-97. doi: 10.5146/tjpath.2011.01055. 9. Aoi T, Yae K, Nakagawa M, et al. Generation of pluripotent stem cells from adult mouse liver and stomach cells. Science 2008;321:699 702. doi:10.1126/science.1154884 10. Hanna J, Markoulaki S, Schorderet P, et al. Direct reprogramming of terminally differentiated mature B lymphocytes to pluripotency. Cell 2008;133:250 64. doi 10.1016/j.cell.2008.03.028 11. Stadtfeld M, Brennand K, Hochedlinger K. Reprogramming of pancreatic beta cells into induced pluripotent stem cells. Curr Biol 2008;18:890 4. doi 10.1016/j.cub.2008.05.010 12. Kim JB, Sebastiano V, Wu G, et al. Oct4-induced pluripotency in adult neural stem cells. Cell 2009;136:411 9. doi 10.1016/j.cell.2009.01.023 13. Kunisato A, Wakatsuki M, Kodama Y, et al. Generation of induced pluripotent stem (ips) cells by efficient reprogramming of adult bone marrow cells. Stem Cells Dev 2010;19:229 38. doi:10.1089/scd.2009.0149. 14. Tsai S-Y, Clavel C, Kim S, et al. Oct4 and Klf4 reprogram dermal papilla cells into induced pluripotent stem cells. Stem Cells 2010;28:221 8. doi: 10.1002/stem.281 15. Sancho-Bru P, Roelandt P, Narain N, et al. Directed differentiation of murine-induced pluripotent stem cells to functional hepatocyte-like cells. J Hepatol. 2011;54:98-107. doi:10.1016/j.jhep.2010.06.014 16. Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 2007;131:861 72. doi:10.1016/j.cell.2007.11.019 17. Yanıkkaya Demirel G, Budak-Alpdoğan T, Aktaş S, Bayık M. Kısıtlı dilüsyon yöntemi ile CD34+ kordon kanı hücrelerinden uzun dönemli kültür-başlatan hücreler (UDK-BH) üretimi. Turk J Hematol 2010; 24: 234-41. doi: 10.5152/tjh.2010.44 18. Park IH, Arora N, Huo H, et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell 2008;134:877 86. doi:10.1016/j.cell.2008.07.041 19. Li C, Zhou J, Shi G, et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Hum Mol Genet 2009;18:4340 9. doi:10.1093/hmg/ddp386 20. Loh YH, Agarwal S, Park IH, et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human blood. Blood 2009;113:5476 9. doi:10.1182/blood-2009-02-204800 21. Sun N, Panetta NJ, Gupta DM, et al. Feeder-free derivation of induced pluripotent stem cells from adult human adipose stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 2009;106:15720 5. doi:10.1073/pnas.0908450106 22. Miyoshi K, Tsuji D, Kudoh K,et al. Generation of human induced pluripotent stem cells from oral mucosa. J Biosci Bioeng 2010;110: 345 50. doi:10.1016/j.jbiosc.2010.03.004 23. Yan X, Qin H, Qu C,et al. ips cells reprogrammed from human mesenchymal-like stem/progenitor cells of dental tissue origin. Stem Cells Dev 2010;19:469 80. doi:10.1089/scd.2009.0314. 24. Yu J, Vodyanik MA, Smuga-Otto K, et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science 2007;318:1917-20. doi:10.1126/science.1151526

Marmara Medical Journal 2012;25:5-9 Sevim ve ark. İndüklenmiş Pluripotent Kök Hücreler ve Uygulamaları 9 25. Schöler HR, Hatzopoulos AK, Balling R, Suzuki N, Gruss P. A family octomer-specific prteins present during Mouse embryogenesis; evidence for germline-specific expression of an Oct factor. EMBO J 1989;8:2543-50. 26. Amabile G, Meissner A. Induced pluripotent stem cells: current progress and potentials for regenerative medicine. Trends Mol Med. 2009;15:59-68. doi:10.1016/j.molmed.2008.12.003 27. Rizzino A. Sox2 and Oct-3/4: A versatile pair of master regulators that orchestrate the self-renewal and pluripotency of embryonic stem cells. Wiley Interdiscip Rev Syst Biol Med. 2009;1:228-36. doi:10.1002/wsbm.12 28. Zeller KI, Jegga AG, Aronow BJ, O'Donnell KA, Dang CV: An integrated database of genes responsive to the Myc oncogenic transcription factor: identification of direct genomic targets. Genome Biol. 2003;4 :Article R69. doi:10.1186/gb-2003-4-10-r69 29. Dang CV. c-myc Target Genes Involved in Cell Growth, Apoptosis, and Metabolism. Molecular And Cellular Bıology 1999;19:1 11. 30. Köse O, Özdoğan S. Epidermal Kök Hücreler ve Klinik Kullanımları, Turkiye Klinikleri J Dermatol 2010;20:74-80 31. Zhao W, Hisamuddin IF, Nandan MO, et al. Identification of Kruppellike factor 4 as a potential tumor suppressorgene in colorectal cancer: Oncogene 2004;23:395 402. doi:10.1038/sj.onc.1207067 32. Chambers I, Colby D, Robertson M, et al. Functional expression cloning of Nanog, a pluripotency sustaining factor in embryonic stem cells. Cell 2003;113:643-55. doi:10.1016/s0092-8674(03)00392-1 33. Nakagawa M, Koyanagi M, Tanabe K, et al. Generation of induced pluripotent stem cells without Myc from mouse and human fibroblasts. Nat Biotechnol 2008;26:101-6. doi:10.1038/nbt1374 34. Asgari S, Pournasr B, Salekdeh GH, et al. Induced pluripotent stem cells: a new era for hepatology. J Hepatol 2010;53:738-51. doi:10.1016/j.jhep.2010.05.009 35. Zhou H, Wu S, Joo JY, et al. Generation of induced pluripotent stem cells using recombinant proteins. Cell Stem Cell. 2000;4:581-4. doi:10.1016/j.stem.2009.04.005 36. Maherali N, Sridharan R, Xie W, et al. Directly reprogrammed fibroblasts show global epigenetic remodeling and widespread tissue contribution. Cell Stem Cell. 2007;1:367-8. doi:10.1016/j.stem.2007.05.014 37. Sullivan GJ, Hay DC, Park IH, et al. Generation of functional human hepatic endoderm from human induced pluripotent stem cells. Hepatology 2010; 51:329 35. doi:10.1002/hep.23335 38. Gallicano IG, Mishra L. Hepatocytes from induced pluripotent stem cells: a giant leap forward for hepatology. Hepatology 2010;51:20-2. doi:10.1002/hep.23474. 39. Dimos JT, Rodolfa KT, Niakan KK, et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science 2008;321:1169-70. doi:10.1126/science.1158799 40. Wernig M, Zha JP, Pruszak J, et al. Neurons derived from reprogrammed fibroblasts functionally integrate into the fetal brain and improve symptoms of rats with Parkinson s disease. Proc Natl Acad Sci 2008;105:5856 61. doi:10.1073/pnas.0801677105 41. Tokumoto Y, Ogawa S, Nagamune T, Miyake J. Comparison of efficiency of terminal differentiation of oligodendrocytes from induced pluripotent stem cells versus embryonic stem cells in vitro. J Biosci Bioeng 2010;109: 622 8. doi:10.1016/j.jbiosc.2009.11.013 42. Sasaki N, Hirano T, Kobayashi K, et al. Chemical inhibition of sulfation accelerates neural differentiation of mouse embryonic stem cells and human induced pluripotent stem cells. Biochem Biophys Res Commun. 2010;401:480 6. doi:10.1016/j.bbrc.2010.09.085 43. Onorati M, Camnasio S, Binetti M, Jung CB, Moretti A, Cattaneo E. Neuropotent self-renewing neural stem (NS) cells derived from mouse induced pluripotent stem (ips) cells. Mol Cell Neurosci 2010;43:287-95. doi:10.1016/j.mcn.2009.12.002 44. Mizuno Y, Chang H, Umeda K, et al. Generation of skeletal muscle stem/progenitor cells from murine induced pluripotent stem cells. FASEB J 2010; 24:2245-53. doi:10.1096/fj.09-137174 45. Mauritz C, Schwanke K, Reppel M, et al. Generation of functional murine cardiac myocytes from induced pluripotent stem cells. Circulation 2008;118:472-5. doi:10.1161/circulationaha.108.778795 46. Zhang J, Wilson GF, Soerens AG, et al. Functional cardiomyocytes derived from human induced pluripotent stem cells. Circ Res. 2009;104:e30-41. doi:10.1161/circresaha.108.192237 47. Lei F, Haque R, Weiler L, Vrana KE, Song J. T lineage differentiation from induced pluripotent stem cells:, Cell Immunol. 2009;260:1 5. doi:10.1016/j.cellimm.2009.09.005 48. Raya A, Rodriguez-Piza I, Guenechea G, et al. Disease-corrected haematopoietic progenitors from Fanconi anaemia induced pluripotent stem cells. Nature 2009;460:53 9. doi:10.1038/nature08129 49. Soldner F, Hockemeyer D, Beard C, et al. Parkinson s disease patientderived induced pluripotent stem cells free of viral reprogramming factors, Cell 2009;136:964 77. doi:10.1016/j.cell.2009.02.013. 50. Park IH, Zhao R, West JA, et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors: Nature 2008;451:141 6. doi:10.1038/nature06534.

10 Ori gi nal Ar tic le / Özgün Araştırma DO I: 10.5472/MMJ.2011.02168.1 The Persistence and Clearance Rate of Human Papilloma Virus Genotypes in Urban Turkish Women after One Year Bir Yıl Sonunda Şehirde Yaşayan Türk Kadınındaki Human Papilloma Virus Persistans ve Klereansı Tevfik YOLDEMİR 1, Funda EREN 2, Mithat ERENUS 1 1 Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine,Marmara Univesity, İstanbul, Turkey 2 Department of Pathology, School of Medicine, Marmara University, İstanbul, Turkey Abstract Objective: To evaluate the persistence of the different human papillomavirus (HPV) genotypes in women detected positive for HPV at Marmara University Hospital gynecologic outpatient clinics. Patients and Methods: Forty out of 79 women who had been tested positive for HPV DNA in our initial prevalance study were re-assessed after one year. HPV types were identified by polymerase chain reaction (PCR) and hybridization using a microarray. Results: One year after the initial assessment, 52.5% of the women had their initial HPV infection resolved and 35% of the women had acquired another HPV infection. The HPV DNA persistence was detected in 17.5% of the 40 women. Nine women had acquisition of HPV genotype by the same phylogenetic clade. 43.33% of high risk (HR) HPV type and 80% of the low risk (LR) HPV type infection had resolved. Conclusions: The persistence rate was increased in women with HR HPV types. Multiple and mixed HPV infections have an important impact on the persistence of HPV genotype. (Marmara Medical Journal 2012;25:10-5) Key Words: Cervical cytology, HPV genotype, HPV persistence, HPV clearance Özet Amaç: Marmara Üniversitesi Hastanesi kadın hastalıkları polikliniğinde human papilloma virüs (HPV) pozitif saptanan kadınlarda değişik HPV genotiplerinin persistansını değerlendirmek. Hastalar ve Yöntem: İlk prevalans çalışmasında HPV DNA testi pozitif saptanan 79 kadından 40 ı bir yıl sonra tekrar değerlendirildi. HPV tipleri polymerase chain reaction (PCR) ve mikroarray hibridizasyon teknikleri ile tanımlandı. Bulgular: İlk değerlendirmenin bir yıl sonrasında kadınların %52,5 nin HPV enfeksiyonunun ortadan kalktığı; %35 inin yeni bir HPV enfeksiyonu edindiği saptandı. 40 kadının %17,5 inde HPV DNA persistansı saptandı. Dokuz kadın aynı filogenetik ağaçtan HPV genotipi edinmişti. Yüksek riskli (YR) HPV tipi enfeksiyonun %43,33 ü ve düşük riskli (DR) HPV tipi enfeksiyonun %80 i ortadan kalkmıştı. Sonuç: Yüksek riskli HPV tipleri saptanan kadınlarda persistans oranı artmıştı. Çok sayıda ve karışık tipte HPV enfeksiyonları HPV genotipinin persistansında önemli etkiye sahiptir. (Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi 2012;25:10-5) Anahtar Kelimeler: Servikal sitoloji, HPV genotipi, HPV persistansı, HPV kliransı Introduction Human papillomavirus (HPV) is the most common sexually transmitted infection in the United States 1. Nearly 76% of new infections occur in individuals aged 15 to 25 years 2. By age 50, an estimated 80% of unvaccinated women are infected. The virus causes cervical and other cancers and diseases, as well as genital warts. A cross sectional evaluation of the HPV DNA prevalence in 13 countries estimated that 6.6% of women in the age range 15 74 years with normal cytology are carriers of HPV DNA, with marked variation within and between world regions (range 1.4-25.6%) 3. The prevalance of HPV DNA in our population was recently found as 13.68% 4. Most HPV infections are transient: approximately 70% are no longer evident within a year, and up to 91% are cleared within 2 years 5,6. Low-risk (LR) HPV infections are cleared equally well and probably faster than high-risk (HR) types 5,7. Studies in 22 countries identified HPV DNA in almost all (99.7%) cases of cervical cancer 8. Approximately 40 distinct HPV types are known to infect the genital Correspondence to/iletişim: Tevfik Yoldemir, M.D., Department of Obstetrics and Gynecology, School of Medicine, Marmara University Hospital, Pendik, 34899 İstanbul, Turkey E-mail: dr_yoldemir@hotmail.com Submitted/Başvuru Tarihi: 17.10.2011 Ac cep ted/kabul Tarihi: 27.11.2011 Marmara Medical Journal, Pub lis hed by Ga le nos Pub lis hing. / Marmara Üniversitesi Tıp Fakültesi Der gi si, Ga le nos Ya yı ne vi ta ra fın dan ba sıl mış tır.

Marmara Medical Journal 2012;25:10-5 Yoldemir et al. The Increased Persistence rate with High Risk HPV types 11 tract and epidemiological studies to date suggest that at least 14 of these, called oncogenic or HR types, are significantly associated with progression to invasive cervical cancer 9. Persistent cervical infection with HR HPV significantly increases the risk of a women developing atypical cervical cytology 6,10. More importantly persistent infection with the same genotype strongly increases the risk of developing high grade pre-invasive disease 11 and the progression to invasive disease 12. Specific genotyping data is particularly important because clinical progression only occurs in the presence of a persistent infection with HR HPV 13-15. A few cohort studies indicate that HPV infection is mostly a transient or intermittent phenomenon; only a small proportion of those positive for a given HPV type tend to harbor the same type in subsequent specimens 16. In addition, prospective epidemiologic studies show that the risk of subsequent cervical intraepithelial neoplasia seems to be proportional to the number of specimens testing positive for HPV 17, which suggests that only persistent infections may trigger carcinogenic development. In an attempt to investigate the persistence of HPV genotype after one year, we have re-assessed women who had previously been detected positive for HPV DNA in a prevalance study in our center 4. Patients and Methods After approval by the Scientific Ethical Committee of Marmara University Medical School, 79 women seen at the outpatient gynecologic clinics of the Marmara University and Academic Hospitals, an affiliated private institution, were included for the follow-up phase of the cohort study. Women who had high grade cytology or treatment for CIN at the time of the prevalence study were not included in this study. Two patients who had had hysterectomies were excluded. Seventy nine women who had been tested positive for HPV DNA in our initial prevelance study, were called by phone and invited for reassessment of HPV in our center. All recruited women received detailed information regarding the objective of this follow-up study, consented to participate, and were invited to give their samples which were obtained using a cytobrush between September 1, 2009 and April 30, 2010. The BD SurePath Pap test kit (BD Diagnostics TriPath, Burlington, NC, USA) was used for liquid-based cytology testing and the Clinical Arrays Papillomavirus kit (Genomica, Madrid, Spain) was used for HPV genotype identification, as previously described 4. The phylogenetic grouping was based on the L1 sequences of HPV, the region that encodes the major capsid protein and associates with humoral immune responses to HPV infection 18. Accordingly, types 16, 31, 33, 35, 52, and 58 (all belonging to clade A9); 18, 39, 45, 59, 68, and 70 (clade A7); 26, 51, and 82 (clade A5); and 53, 56, and 66 (clade A6) were phylogenetically classified as HR HPV types. In contrast, types 6, 11, and 44 (clade A10); 34 and 73 (clade A11); 40 and 43 (clade A8); 42 (clade A1); 61, 72, 81, 83, 84, and CP6108 (clade A3); 57 (clade A4) and were classified as LR HPV types. Women were defined as having: a resolved infection if HPV DNA was detected in the first but not in the second sample(clearence); a persistent infection if the same HPV DNA was detected in both samples; acquired infection if HPV DNA was detected at the first visit (e.g. HPV18) which has resolved and another HPV detected at the second visit (e.g. HPV52); and acquisition if HPV DNA detected at the second visit was a member of the same phylogenetic clade of the HPV DNA detected in the first visit. The χ 2 and Fischer exact tests were used to compare variables and P<0.05 was considered significant. Results Since our institute is a tertiary center we receive many patients from different cities of the country. Thirtynine (49%) women unfortunately refused to come for re-assessment mostly because of living far from our center. A total of 40 women (50.63%) agreed to participate. Specific HPV typing was done in 40 women after one year of the initial HPV positivity. Twenty-one women (52.5%) had their initial HPV infection cleared. Twelve women (30%) had lost their initial HPV genotypes and acquired another HPV infection. Seven women (17.5%) had the same HR genotype detected in both the initial and control samples. Among women with HPV genotype persistence, two women had HPV16, one had HPV58, one had HPV51, two had HPV53 and one had HPV66 persistence. HPV16 and HPV58 belong to the same phylogenetic group A9. HPV53 and HPV66 are in the group A6. Nine women out of the 40 women had acquisition of HPV genotype by the same phylogenetic clade in the follow-up tests. When HPV genotype persistent women (n:7) were compared with those without, except the marital status all demographic parameters were alike (Table I). All HPV persistent women after one year were single. When the drop out women were compared Table I. Patient demographics of positive HPV tested patients who came for follow-up control HPV clearance (n=21) HPV acquired (n=12) HPV genotype persistence (n=7) P value Age 34.81±9.39 33.25±6.71 30.86±6.06 0.31 Married 12 5 0 0.02 University graduate 10 9 5 0.51 Normal cytology in 2008 19 11 5 0.24 High risk HPV infection 2008 13 9 7 0.14 Mono-infection in 2008 18 8 4 0.23 Normal cytology in 2010 21 11 5 0.07 High risk HPV infection 2010-9 7 0.15 Mono-infection in 2010-8 5 0.83

12 Yoldemir et al. The Increased Persistence rate with High Risk HPV types Marmara Medical Journal 2012;25:10-5 Table II. Participant characteristics between study group and drop-out or no show-up group Study group (n=40) Drop-out + No show-up group (n=39) P value Age 33.65±8.11 36.51±12.22 0.22 High school graduate 10 7 0.42 University graduate 24 19 0.31 Single 20 16 0.93 Normal cytology in 2008 35 29 0.17 HPV 6 in 2008 4 4 0.97 HPV 16 in 2008 12 8 0.33 HPV 35 in 2008 4 2 0.41 HPV 53 in 2008 4 1 0.18 HPV 56 in 2008 1 2 0.54 HPV 66 in 2008 3 1 0.32 High risk HPV in 2008 30 29 0.85 with the follow-up group in terms of demographic characteristics, all of the parameters were similar between the groups (Table II). Since 40 patients of the initial 79 women attended the follow-up examinations, the drop-out rate was 49%. Thirty subjects (75%) from the initial analysis were women with HR HPV types. Thirteen out of these HR HPV types had cleared (43.33%). Seven of the initial HR HPV types persisted. Twelve women acquired new infections, nine had HR and three had LR HPV infections. Eight (80%) out of ten of the LR HPV type infection had resolved. One had a new HR and the other a LR HPV infection (Table III). Of the 40 samples that were HPV DNA positive at baseline, 30 (75%) were mono-infections and 10 were multiple infections. Three (30%) of the initially multiple HPV infections had cleared; whereas, eighteen (60%) of the initial mono-hpv infections had cleared in the follow-up tests. Nine of the 12 mono-infections which persisted were all HR HPV types both initially and in the follow-up test. Two had acquired LR HPV infections after being cleared from HR HPV types. One case was initially a LR HPV type and acquired another LR during the followup period. Seven of the multiple HPV infected cases were all HR types both in enrollment and at the follow-up tests (Table II). The cervical cytology was normal in 35 women (87.5%) at the initial assesment. Twentysix of these women (74.28%) had HR HPV genotyes. Thirtyseven women (92.5%) had normal cervical cytology at the follow up visit and 13 (35.13%) of those had HR HPV genotypes. Five of these 12 women had HPV genotype persistence with normal initial and follow-up smears. Seven of these 12 patients had another HPV type from the same phylogenetic clade of the HPV DNA detected in the first visit. Five patients with initial abnormal pap smear result (2 atypical squamus cells of undetermined significance (ASC-US), 1 atypical squamous cells, cannot exclude high-grade intrepithelial lesion (ASC-H), 2 low-grade squamous intrepithelial lesion (LGSIL)) had normal cytologic findings in the follow-up. Of these five women, four had HR HPV type in the first test and two of these persisted in the follow-up period. Three patients with previous normal pap smear results but later had abnormal findings (2 LGSIL and 1 ASC- US) had HR HPV type at the initial assesment. Two of these 3 women had HPV genotype persistence. Thirty-two patients had normal smear results both in the first and the follow-up visits (80%). Discussion In our study 52.5% of the women resolved their HPV infection within one year. This indicated that those HR HPV infections were of a transient nature. The duration of a transient HPV infection was previously stated as 8 13 months 6,19. Molano M et al. (20) reported the clearance rate as highest in the first 6 months of follow-up. In their study, 23% of HPV infections were still present at 1 year and 7 % at 5 years. Clearance rates were lower for HPV 16 than for low-risk HPV types. HPV types related phylogenetically to HPV 16 (types 31, 33, 35, 52, 58) had intermediate clearance rates and other HR types did not show evidence of slower clearance compared with LR types. They also showed that clearance of HPV infection occurred in the 2 years after HPV was first detected. Franco (21) showed that 12-month clearance was higher for lowrisk HPV types (12.2%) than for high-risk HPV types (9.5 %). HR- HPV infections tend to last longer than those of LR-HPV types 19,22. In the cohort study of Brisson et al. HPV 16, 18, 31/33/35 appeared more persistent than other types 23. In our study 43.33% of HR HPV types and 80% of LR HPV types cleared after one year. Thomas et al. found that the risk of acquiring a specific HPV type was not substantially decreased among those with prior infection with a phylogenetically related type (HPV: 16 and 31; 18 and 45; 6 and 11) 24. An association between persistent HPV infection and the presence of multiple types has been documented 3,25. Nevertheless Liaw KL et al 26 and Molano M et al. 20 demonstrated that the clearance of a type-specific HPV infection seems to be independent of the presence of a coinfection with other types. Fourteen different HPV genotypes were detected in the follow-up women in our study. Thirty (75%) of the 40 women had mono HPV infections at the first visit; whereas, thirteen (68.4%) of the 19 women had mono HPV infection at the second visit. In our study 60% of the initially mono-infected and 30% of the multiple-infected women had HPV clearance during the follow-up. Ho et al. 6 and Perrons et al. 25

Marmara Medical Journal 2012;25:10-5 Yoldemir et al. The Increased Persistence rate with High Risk HPV types 13 Table III. Longitudinal detection of HPV by DNA genotyping in a cohort of individuals tested at enrolment and during follow-up Case no HPV DNA at Cytology at HPV DNA Cytology HPV DNA HPV enrolment enrolment at follow-up at follow-up persistence acquisition 1 70 normal negative normal - - 2 6,16,18,31,33,83 normal 58 normal - + 3 35 normal 6,61 normal - - 4 58 normal 58 normal + + 5 66 normal negative normal - - 6 66 normal 51 LGSIL - - 7 53 normal negative normal - - 8 18 normal negative normal - - 9 53, 66, 85 normal negative normal - - 10 16 normal negative normal - - 11 51 ADAS 51 normal + + 12 16 normal negative normal - - 13 16 normal negative normal - - 14 45, 59 normal negative normal - - 15 61 normal negative normal - - 16 70 normal 61 normal - - 17 53 normal 53 ASCUS + + 18 16 normal 53 normal - - 19 16 normal 6 normal - - 20 16, 53, 59 normal 51 normal - - 21 52 normal negative normal - - 22 85 normal 53 normal - - 23 35,62 ASC-H negative normal - - 24 59, 84 ASCUS 16,53 normal - - 25 62 normal negative normal - - 26 16 normal 18,53,66 normal - - 27 6 normal negative normal - - 28 33 normal negative normal - - 29 83 normal negative normal - - 30 66 LGSIL 66 normal + + 31 16 normal 33 normal - + 32 83 normal negative normal - - 33 16,35 normal 16,35,66 normal + + 34 16, 56, 59, 66,85 normal 6,16,31,51,58 LGSIL + + 35 18, 53 normal 52,58,61,82 normal - - 36 6 normal negative normal - - 37 16 normal negative normal - - 38 35 normal negative normal - - 39 6 LGSIL negative normal - - 40 53,58 normal 53 normal + +

14 Yoldemir et al. The Increased Persistence rate with High Risk HPV types Marmara Medical Journal 2012;25:10-5 found that infection with multiple types of HPV was associated with persistent HPV infection. Rousseau et al. observed that persistence of HPV infection was independent of coinfection with other HPV types 27. Liaw et al. found that the presence of HPV16 was associated with an excess risk for acquisition of other types without affecting the persistence of the episodes with the additional types 26. We have detected that three women (30%) with multiple infections and four women (13.3%) with monoinfections at the initial visit had persistent genotype infection at reassesment after one year. Zielinski et al. 28 demonstrated the presence of the same HPV type in undisputable normal and subsequent abnormal smears until diagnosis of cervical cancer, and thus showed that high-risk HPV detection precedes the development of abnormal cytology. It was suggested that high HPV DNA copy number was associated with cytologic abnormalities and that HPV-positive women with normal cytology were at minimal risk of subsequent progression to cancer while having very low viral loads 29,30. Many crosssectional studies reported an increase in viral load with increasing disease severity, others found either no association, or a higher viral load in women with low-grade squamous intraepithelial lesion (LSIL) than in those with high-grade squamous intraepithelial lesion high-grade squamous intraepithelial lesion (HSIL) 31-34. Longitudinal studies have also failed to find a consistent association between a baseline measurement of viral load and duration of infection, clearance of disease, and subsequent risk of acquisition or progression of disease 35-37. In our study, five patients with initial abnormal pap smear results ( 2 ASC- US, 1 ASC-H, 2 LGSIL) had normal cytologic findings in the followup. Four out of these five women had high risk HPV type at enrollment. Two of these women had HPV genotype persistence while two had clearance. Conversely three patients with previous normal pap smear and HR HPV at the initial assessment had abnormal cytologic findings (1 ASCUS, 2 LGSIL) during the follow up visit. Two of these 3 women had HPV genotype persistence. Hence genotypic persistence after one year per se may not predict cytologic abnormality. Longer duration follow-up might be necessary. Nevertheless viral load and HPV persistence may have a complimentary impact on the consequent cytologic changes. Koshiol J et al 38 stated that the strength of the association between HPV persistence and cervical neoplasia increased with increasing grade of cervical disease. The magnitude of effect for HPV persistence in predicting CIN2-3/HSILs varied widely and was partially dependent on the HPV referent group. Persistent HPV infection resulted in an approximately one extra CIN2-3/HSILs case in every 60 women followed for about 5 years as compared with HPV-negative women. In the present study 35% of the subjects acquired another HPV genotype infection during followup. 27.5% of these patients had HR HPV. The acquired HR new infections could be misinterpreted as persistence of HPV when the assessment is dependent only on the presence of HR HPV instead of genotyping. Kovacic et al. 39 showed that the proportions of mono-infected women exhibiting cytologic abnormalities were analogous to women in the <35 and 35- to 54-year-old age groups but significantly lower in the >54-year-old age group. Viral load was not consistently related to age for all women or stratified by level of cytologic abnormality. However, Molano 20 did not confirm any unfavorable effect of age on clearance. Similarly we did not find any impact of age either on persistency of HPV or cytological abnormalities. Nielssen et al. 40 observed a strong association between marital status and infection with high-risk HPV types among women aged 20 to 29 years. In our study, HPV genotype persistence was significantly less prevalent among married women. The limitation of our study is the high drop out rate (49%). Despite the invitation of all 79 women with positive HPV at the initial assesment only 40 women were available for reassesment of HPV after one year. Nevertheless when the similar demographic characteristics of the women who drop out and who came for follow up were analysed, we could speculate that our results could be representative of the whole group of 79 women who were HPV positive at the initial assesment. In conclusion the persistence of HPV genotype was 17.5% after one year in our population. The persistence rate was increased in women with HR HPV types. Multiple and mixed HPV infections have an important impact on persistence of HPV genotype. Future studies with larger groups will shed more light on the influence of viral load and the persistence of HPV infections on developing preinvasive and cervical lesions. Acknowledgement The authors declare that they have no conflict of interest References 1. CDC. Epidemiology and Prevention of Vaccine-Preventable Diseases. Atkinson W, Wolfe S, Hambrosky J, et al, eds. 11th ed. Washington, DC: Public Health Foundation; 2009. 2. Baseman J, Koutsky L. The epidomiology of human papillomavirus infections. J Clin Virol 2005;32(Suppl 1):S16 24. doi 10.1016/j.jcv.2004.12.008 3. Clifford GM, Gallus S, Herrero R, et al. Worldwide distribution of human papillomavirus types in cytologically normal women in the International Agency for Research on Cancer HPV prevalence surveys: a pooled analysis. Lancet 2005; 366: 991 8. doi 10.1016/S0140-6736(05)67069-9 4. Eren F, Erenus M, Bas E, et al. Prevalence of HPV infection by cytologic diagnosis and HPV DNA extraction and prevalence of the HPV genotypes detected in urban Turkish women, Int J Gynecol Obstet 2010;109: 235-8. doi 10.1016/j.ijgo.2010.01.007 5. Hildesheim A, Schiffman MH,Gravitt PE, et al. Persistence of typespecific human papillomavirus infection among cytologically normal women. J Infect Dis 1994;169:235 40. 6. Ho GY, Bierman R, Beardsley L, et al. Natural history of cervicovaginal papillomavirus infection in young women. N Engl J Med 1998;338:423 8. doi 10.1056/NEJM199802123380703 7. Elfgren K, Kalantari M, Moberger B, et al. A population based five-year follow-up study of cervical human papillomavirus infection. Am J Obstet Gynecol 2000;183:561 7. doi 10.1067/mob.2000.106749 8. Walboomers JM, Jacobs MV, Manos MM, et al. Human papillomavirus is a necessary cause of invasive cervical cancer worldwide. J Pathol 1999; 189: 12 19. doi 10.1002/(SICI)1096-9896(199909)189:1<12::AID- PATH431>3.0.CO;2-F 9. Bosch FX, Manos MM, Munoz N, et al. Prevalence of human papillomavirus in cervical cancer: a worldwide perspective. International biological study on cervical cancer (IBSCC study group). J Natl Cancer Inst 1995; 87:796 802.