ÇANAKKALE LİMAN BÖLGESİNDEKİ DENİZ SUYUNDA HALOFİLİK BAKTERİ VE MAYALARIN İZOLASYONU GRUP: EXTREM Tamer GÖK Yahya Kaptan Anadolu Lisesi Esra ŞENBABAOĞLU Özel Gebze Lisesi Hazım BOZKURT Rıza Malatyalı İlköğretim Okulu DANIŞMANLAR Prof. Dr. Turan GÜVEN Prof. Dr. Sezai TÜRKEL Prof. Dr. Ahmet AKSOY TÜBİTAK-BİDEB Fen ve Teknoloji Fizik, Kimya, Biyoloji Bilim Danışmanlığı Çalıştayı 6-16 Temmuz 2008 (ÇANAKKALE FEN LİSESİ)
PROJENİN ADI: mayaların izolasyonu Çanakkale liman bölgesindeki deniz suyunda halofilik bakteri ve GRUBUN ADI: EXTREM GRUP ÜYELERİ: Tamer GÖK, Esra ŞENBABAOĞLU, Hazım BOZKURT DANIŞMAN: Prof.Dr.Turan GÜVEN, Prof.Dr.Sezai TÜRKEL, Prof.Dr.Ahmet AKSOY PROJENİN AMACI: Bu çalışmada biyoelektronik ve biyoteknolojik uygulamalarda önemli bir yer tutan halofilik bakteri ve mayaların Çanakkale liman bölgesindeki durumunun tespiti amaçlanmaktadır. 2
ÖZET: Bu çalışmada Çanakkale liman bölgesinde deniz yüzeyi, dip çamuru ve yosunlu bölgelerden alınan örneklerde biyoteknolojik öneme sahip halofilik bakteri ve maya varlığı saptanmıştır. Bunun için zenginleştirilmiş besiyerlerinin yanında halofilik mikroorganizmaların yaşayabildiği tuzlu ortamlara ekimler yapılmıştır. Bakteri ve maya örnekleri morfolojik özelliklerine göre değerlendirildi. Analiz edilen deniz suyu örneklerinde deniz suyu zonlarında farklı miktarlarda bakteri ve maya örnekleri olduğu bulundu. En çok mikroorganizmaya dip çamurunda rastlandı. İzole edilen maya ve bakteri örneklerinin bazılarının halofililk olduğu belirlendi 3
GİRİŞ: Enzimler, hücrelerde biyokimyasal reaksiyonları katalize eden protein yapısında moleküllerdir. Hücrelerde çok önemli metabolik görevleri olan enzimler çeşitli amaçlarla kullanılmak üzere günlük ve ekonomik hayata girmiştir (Wiseman, 1987). Enzimler ile katalizlenen reaksiyonların 0 40 o C arasında reaksiyon hızı yükselir. Fakat 40 o C de enzim zarar görmeye başlar. Böylece reaksiyon yavaşlar ve 60 o C de enzim tamamen bozulur. 40 o C bu enzim için optimum ısıdır Bu noktada çözüm olarak mikroorganizmalardan elde edilen enzimler büyük ilgi çekmektedir. (Bhat, 2000). Son yıllarda yapılan çalışmalar mikrobiyal yaşamın spesifik çevrelerle sınırlı olmadığını, mikrobiyal komünitelerin yüksek sıcaklık, yüksek tuz, düşük sıcaklık, asidik ve alkali ph, yüksek basınç gibi ekstrem olarak tabir edilen çevrelerde de bulunabileceğini ortaya koymuştur. Bu ekstrem çevrelerde yaşayan mikroorganizmalar ekstremofiller olarak adlandırılırlar (Van den Burg, 2003). Ekstremofilik mikroorganizmaların, yüksek tuz konsantrasyonlarında yaşayan üyeleri halofillerdir (Horikoshi and Grant, 1998). Halofiller Kushner e göre (1978, 1993); halofilik olmayanlar (0-1M NaCl), az halofiller (0,2-2,0M NaCl), ılımlı halofiller (0,4-3,5M NaCl), ekstreme yakın halofiller(1.4-4.0 M NaCl), ekstrem halofiller(2,0-5,2m NaCl), halotolerantlar (0->1M NaCl) ve değişken halofiller (0- >3M NaCl) olarak sınıflandırılırlar. Halofilik mikroorganizmalarin yüksek tuz konsantrasyonlarinda nasıl yaşamlarını sürdürülebildikleri Halobacterium gibi model organizmalarla yapılan çalışmalarla ortaya konulmuştur. Bu tip mikroorganizmaların çevrelerindeki yüksek ozmotik basınçta yaşabilmek için temel olarak iki strateji geliştirdiği kabul edilmektedir. Bunlardan iç tuz stratejisinde hücre içinde K+ veya bazı hücrelerde Na+ akümüle edilir ve böylece tüm hücre içi sistemler dış ortamdaki yüksek tuz konsantrasyonu nedeniyle oluşan basınca karşı adapte olabilirler. İkinci strateji olan compatible solute stratejisinde hücre kendisinin ürettiği stabilite edici organik maddeler ile (ektoin, glisin, betain gibi) hücre içi sistemlerin yüksek tuz koşullarına adaptasyonu gerekmeksizin hücre ile ortamın ozmotik basıncını dengeler ve yaşamını sürdürür. (Oren, 1999). Halofilik mikroorganizmalar diğer ekstremofilik mikroorganizmalarla karşılaştırıldıklarında basit besiyerlerinde kolay üretilebilmelerinden dolayı biyoteknolojik olarak büyük bir potansiyele sahiptirler. Ancak Ekstremofilik mikroorganizmalarla ilgili alınan patent uygulamalarının sadece %20 si halofilik mikroorganizmalara aittir (Horiskoshi and Grant, 1998). 4
Bu uygulamalardan bazıları bakteriyorodopsin (biyosensör yapımı, bilgilerin holografik olarak depolanması, elektronik sanayi), halorodopsin (deniz suyunun desalinizasyonu),biyopolimerler (polihidroksialkonatlar, parçalanabilir plastik üretimi) 84 kda luk bir protein (myc onkogenin saptanması). Bunların dışında, fermente gıdaların ve gıda katkı maddelerinin hazırlanmasında, biyosürfektanlar petrol kontamineli toprak ve suların temizlenmesinde kullanılmaktadır (Margesin and Schinner, 2001). Endüstrinin hemen her alanında kullanılan enzimler genellikle mikroorganizmalardan elde edilmektedir. Bunun nedeni mikroorganizma kaynaklı enzimlerin bitkisel veya hayvansal kaynaklı enzimlere göre katalitik aktivitelerinin çok yüksek olmaları, istenmeyen yan ürün oluşturmamaları, daha stabil ve ucuz olmaları, fazla miktarda elde edilebilmeleridir (Wiseman, 1987). Ekstremofilik mikroorganizmalar; volkanların yüksek sıcaklıklarında, kutupların düşük sıcaklıklarında, çok düşük ve çok yüksek ph değerlerinde (ph 0-3 veya ph 10-12) veya çok yüksek tuz konsantrasyonlarında (%5-30) yaşamak için adapte olmuşlardır (Niehaus ve ark., 1999). Bu şekilde farklı ekolojik koşullarda yaşayan mikroorganizmalar termofilik, asidofilik, alkalifilik ve halofilik bakteriler şeklinde sınıflandırılmıştır (Zeikus, 1979). Enzim teknolojisinin giderek gelişmesi ürünlerin kullanım alanlarının çeşitliliği ve ekonomik değerinin çok yüksek olması nedeniyle biyoteknolojinin endüstriyel enzimler ile ilgili alanında yapılan çeşitli araştırmalar daha da önem kazanmaktadır. Özellikle son yıllarda stratejik alan şeklinde değerlendirilen rekombinant DNA teknolojisinden yararlanılarak enzim üretimi büyük boyutlara ulaşmış ve kullanımı giderek yaygınlaşmıştır (Gessese, 1998). Halobakterilerin plazma zarlarında bulunan bakteriyorodopsin ışığa duyarlı bir protein molekülü olup biyoelektronik ve geleceğin moleküler bilgisayarlarında kullanılmaya aday moleküllerden biridir. Buharlaşma göllerinde tuzlu su buharlaştırılır ve tuz elde edilir ki; bu durumda su azalır, bunu takiben suda çözünen oksijen suyla aynı oranda azalır, oksijen azalınca oksijenli solunum şansı ortadan kalkar ve bakteriyorodopsin sentezlenerek zara yerleştirilir. Bu pigment pembe ışık hariç görünen ışığın tüm dalga boylarını absorblar. Bunun sonucunda halofilikler mor-pembe görünürler, bu pigment sayesinde hem enerji hem de fotosentezle organik madde sentezlenmiş olur. Halobacteriales in bir çok üyesi, çözünür oksijen miktarı düşük olan tuzlu sularda oksijen ve ışık alımını arttıran ve yüzme olanağı sağlayan gaz vezikülleri içermektedirler. 5
Bunların UV ışınlarının zararlı etkilerine karşı koruyucu kalkan oldukları belirtilmiştir (DasSarma 1993, Beard et al. 1997). Şekil-1:Birinci fotoğraf bir alt paragrafta bahsedilecek olan California,San Francisco'daki Owens Gölüne ait,ikinci fotoğraf ise Owens Gölü nün ve bir tuz işletmesinin buharlaşma göllerine aittir. 6
ARAÇ VE GEREÇLER: 1.Nutrient agar besiyeri (250 gr) 2.Nutrient broth besiyeri (250 gr) 3. Steril petri kapları ( disposable, plastik) 8 cm lik (40 adet) 4. Cam tüpler - yaklaşık ebatlar 15mmX150 mm ( 10 adet) 5. Cam pipet 5 mililitrelik pipet ( 5 adet) 6.Erlenmayer ( 250 mililitrelik) ( 10 adet) 7.Cam baget ( 5 adet) 8. Sarı uç-otomatik pipet için (1 torba) 9. Mavi uç-otomatik pipet ( 1 torba) 10.Yeast ekstrakt (Maya özütü) ( 250 gram) 11.Pepton ( 250 gram) 12.Glikoz ( 250 gram) 13.Agar agar( 250 gram) 14.NaCl ( 250 gram) 15.Alüminyum folyo (2 kutu) 16..Konik tabanlı santrifüj tüpü ( 20 adet) (15x100 mm) 7
METOD : Çanakkale liman bölgesinden numune alınacak üç bölge belirlendi. Halofilik bakteri ve mayaları çoğaltmak için gerekli besiyerleri aşağıda verildiği şekilde hazırlandı: I. erlenmayere 150 ml su ve 3 gr Nutrient Agar eklendi. Ağzı alüminyum folyo ile kapatılarak sterilizasyon için hazırlandı. II. Erlenmayere 150 ml su ve 1,2 gr Nutrient Broth eklendi. Ağzı alüminyum folyo ile kapatıldı. III. erlenmayere ise 150 ml su, 1.5 gr pepton ve 1.5 gr Yeast Ekstrakt eklenip manyetik karıştırıcıda çözüldü. Daha sonra 3 gr Agar Agar eklenerek sterilizasyona bırakıldı. Sterilizasyon işleminden sonra III. Erlenmayere 3 gr glukoz eklendi. Glukoz çözeltisi katılaşmayı önlemek için sterilizasyondan sonra seyreltilerek eklendi. Tuza dirençli bakteri ve mayaları izole etmek için I. ve III. erlenmayere NaCl eklenerek 0.1 M lık tuzlu ortam sağlandı. Aynı şekilde sterilizasyona bırakıldı. Diğer cam malzemelerde aynı şekilde sterilizasyon işleminden geçirildi. Erlenmayerde hazırlanan ve sterilizasyondan geçirilen besiyerleri petri kaplarına dökülerek ekime hazır hale getirildi. Çanakkale liman bölgesinde deniz yüzeyi, dip çamuru ve yosunlu bölgeden alınan örnekler sterilize edilmiş besiyerlerine ekildi. Santrifüj edilerek (3 dakika 2000rpm) çöktürülen örnekler YPD (Yeast Pepton Dekstroz) besiyerine ekildi. Örnekler üremenin daha çok olması için Nutrient Agar Broth besiyerine 5 ml glikoz ilave edilerek ekildi.1 gün boyunca inkübasyona bırakıldı. Sıvı besiyeri Nutrient agar broth besiyerine ekilen örnekler 1 gün sonra katı besiyerine ekildi. İnkübasyon sonucu bakteri ve mayaların üremeleri morfolojik olarak incelendi. 8
BULGULAR Araştırmalarımızda Çanakkale liman bölgesinde yüzey, yosunlu bölge ve dip çamuru olmak üzere üç farklı örnek alındı. Bu örneklerdeki bakteri ve maya türlerinin analizi için standart mikrobiyolojik yöntemler kullanılarak ekimler yapıldı. Araştırmamızın amacı halofilik bakteri ve maya örneklerini izole etmek olduğundan, alınan örnekler hem normal hem de 1 M NaCl içeren üreme ortamlarına ekim yapıldı. Deney sonuçları analiz edildiğinde yüzey suyunda normal besiyerinde üç farklı bakteri türü görülürken halofilik ortamda üreme olmadığı görüldü (Tablo 1) Dip çamuru analiz edildiğinde koloni morfolojisine göre beş farklı türe ait toplam 243 cfu/ml bakteri olduğu belirlendi. Fakat bu bakterilerden dört farklı türe ait 16 bakterinin halofilik olabileceği belirlendi. Yosunlu bölgeden alınan örnekte ise normal besi yerinde iki farklı türe ait 6 bakteri türü olduğu bulundu. Fakat bu bakteri örneklerinde sadece 2 bakterinin halofilik olduğu belirlendi. Tablo 1: Alınan örneklerin farklı besiyerlerine ekimleri sonucu üreyen bakteri kolonileri sayıları (Parantez içindeki rakamlar farklı türlerin koloni sayısını vermektedir.) Üreme birimi cfu/ ml cfu/ ml Örnekler NA besiyeri NA+NaCl besiyeri Yüzey suyu 6 ( 3+2+1 ) ÜREME YOK Dip çamuru 243 (13+10+2+5+212) 16 (2+2+3+9) Yosunlu bölge 6 (5+1) 2 Mayalar için yapılan deney sonuçları analiz edildiğinde yüzey suyunda normal besiyerinde üç farklı maya türü görülürken halofilik ortamda tek çeşit maya ürediği görüldü (Tablo 2) Dip çamuru analiz edildiğinde koloni morfolojisine göre dört farklı türe ait toplam 62 cfu/ml maya olduğu belirlendi. Fakat bu mayalardan iki farklı türe ait 3 mayanın halofilik olabileceği belirlendi. 9
Yosunlu bölgeden alınan örnekte ise normal besi yerinde iki farklı türe ait 6 maya türü olduğu bulundu. Fakat bu maya örneklerinde 5 mayanın halofilik olduğu belirlendi. Tablo 2: Alınan örneklerin farklı besiyerlerine ekimleri sonucu üreyen maya kolonileri sayıları (Parantez içindeki rakamlar farklı türlerin koloni sayısını vermektedir.) (Cfu/ml: Colony forming units/ml., mililitre örnekte koloni oluşturan maya sayısı) Üreme birimi cfu/ml cfu/ml Örnekler YPD YPD+NaCl besiyeri besiyeri Yüzey suyu 332 ( 244+68+20) 1 Dip çamuru 62 (3+1+10+48) 3 (1+2) Yosunlu bölge 6 (4+2) 5 (2+3) 10
Şekil:2.Maya kolonilerinin mikroskopik görüntüsü Şekil 3: Tüm besiyerlerinde üreyen bakteri ve maya kolonleri Yapılan çalışmalar sonucunda alınan örneklerde normal tuzlu ortamda bakteri ve mayalar ürerken NaCl eklenmiş besiyerlerinde bakteri ve koloni sayısının azaldığı görüldü. Halofilik olmayan bakterilerin tuzlu ortamda üreyemedikleri, görüldü. Çanakkale liman bölgesinde halofilik bakteri izolasyonunun mümkün olduğu sonucuna varıldı. 11
TARTIŞMA Halofilik mikroorganizmalar çeşitli tuz konsantrasyonlarında üreyebilen mikroorganizmalar olup hem bilimsel hem de teknolojik açıdan önemi olan canlı gruplarıdır. Bazı halofilik mikroganizmalar kaya tuzları gibi katı ortamlarda bulunurken bir grup halofilik mikroorganizma ise tuzlu deniz sularında ve tuz göllerinde bulunabilmektedir (Horokoshi ve Grant 1998). Halofilik bakteri ve mayalar endüstriyel önemi olan ve ekstrem şartlar olan 1 M NaCl gibi yüksek tuz içeren ortamlarda biyokimyasal özelliklerini ve aktivitelerini kaybetmeyen çeşitli enzimler içermektedir. Bu tür mikroorganizmalardan aşırı şartlarda aktivite gösteren değişik enzimlerin saflaştırılması endüstriyel açıdan çok önemlidir. (KSU. Journal of Science and Engineering 9(1), 2006) Araştırmamızın amacı Çanakkale liman bölgesindeki deniz suyunun farklı deniz suyu örnekleri hem normal hem de yüksek konsantrasyonlarda tuz içeren üreme ortamlarına ekilerek mikroorganizma profilleri belirlendi. Elde edilen sonuçlara göre liman bölgesinden alınan deniz suyu örneklerinin yüzey sularında çok az sayıda mikroorganizma olduğu belirlendi. Yüzey suyunda az sayıda mikroorganizma bulunması boğaz akıntıları nedeni ile sürekli olarak boğaz suyunun temizlenmesi, ayrıca Çanakkale yerleşim merkezi evsel endüstriyel atıklarının liman suyuna karışmaması veya çok iyi derecede arıtılarak verilmesi olabilir. Benzer sonuçlar yosunlu bölgeden alınan deniz suyu örneklerinden elde edildi. Çanakkale liman bölgesi deniz dibi çamur örneklerinin mikrobiyolojik analizi ise bu bölgede önemli çeşitlikte normal ve halofilik bakteri ve maya türlerinin bulunduğunu gösterdi. Bu bölgeden elde edile örneklerin yaklaşık % 10 unun halofilik bakteri ve mayalardan oluştuğu bulundu. Bu halofilik mikroorganizmaların türlerinin kesin olarak belirlenebilmesi için daha ayrıntılı araştırmalar yapılması gerekmektedir. Bununla birlikte üreme ortamlarındaki koloni morfolojilerine göre analiz edildiklerinde toplam sekiz farklı halofilik bakteri ve maya türü olduğu belirlendi. (Özcan 2004) 12
KAYNAKLAR : 1) Beard, S. J., Hayes, P. K. and Walsby, A. E. 1997. Growth competetion between Halobacterium salinarum strain PHH1 and mutants affected in gas vesicle 2) synthesis. Microniology UK, 143; 467-473. 3) Bhat, M.K., 2000. Cellulases and Related Enzymes in Biotechnology. iotechnology Advances 18, 355-383. 4) DasSarma, S. 1993. Identification and analysis of the gas vesicle gene cluster on an unstable plasmid of Halobacterium halobium. Experientia, 49; 482-486. 5) Gessesse, A., 1998. Purification and Properties of Two Thermostable Alkaline Xylanases From an Alkaliphilic Bacillus sp. Applıed and Envıromental Microbiology. p. 3533-3535. 6) Horikoshi, K., Grant, W.D. (1998). Extremophiles, sayfa 93-.133 7) Niehaus, F., Bertoldo, C., Kahler, M., Antranikian, G., 1999. Extremophiles As a Source of Novel Enzymes For Indusrtial Application. Appl Microbiol Biotechnol. 51: 711-729Zeikus, J.G., 1979. Enzyme Microb. Technol. 1,243. 8) Van den Burg, B. (2003) Extremophiles as a source for novel enzymes. 9) Current Opinion in Microbiology, 6, sayfa 213-218 10) Wiseman, A., 1987. Handbook of Enzymes Biotechnology. Second Edition. Chapter 3. The Application of Enzymes in Industry p. 274-373. 13
TEŞEKKÜR Çalışmamız boyunca desteğini bizden esirgemeyen başta Prof. Dr. Sezai TÜRKEL olmak üzere, Prof. Dr. Turan GÜVEN ve Prof. Dr. Ahmet AKSOY hocalarımıza, çalıştayda varlıkları ile moralimizi yüksek tutan arkadaşlarımıza teşekkür ederiz. 14