ZEYTİN VE ZEYTİN YAĞLARINDAKİ FENOLİK BİLEŞENLERİN GAZ KROMATOGRAFİSİ İLE TAYİNİNDE KULLANILAN ÖRNEK HAZIRLAMA METODLARI Sinem Güner, Merve Özgen, Dilek Gülbahar, Duygu Menç, Elif Tümay Özer*, Şeref Güçer Uludağ Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Kimya Bölümü 16059 Görükle/Bursa *e-mail:etumay@yahoo.com Özet Zeytin ve zeytinyağı; Akdeniz diyetinde sıklıkla kullanılan gıdalar arasında yer almaktadır. İçerdiği fenolik bileşenler sebebiyle, yüksek antioksidan özellik göstermeleri; zeytin ve ürünlerini sağlıklı bir beslenme zincirinde önemli bir halka olmasını sağlamıştır. Zeytin ve zeytinyağının fenolik içeriği birçok parametreye bağlı olarak farklılık göstermektedir. Bunların başında; iklim ve çevre koşulları, yetiştirilen zeytin türünün farklılığı ve zeytinin işleme türü gelmektedir. Fenolik bileşenler, sızma zeytinyağlarının kendine özgü keskin tadından ve yüksek stabilitelerinden sorumlu bileşenler olarak bilinmektedir. Son yıllardaki çalışmalar, zeytinyağındaki fenolik bileşenlerin, düşük yoğunluklu lipoproteinlerin oksidasyonunu inhibe ettiği ve diyetlerde sağlık açısından yararlı birçok etkisi olduğunu göstermektedir(1,2). Zeytin ve zeytinyağının içerdiği fenolik bileşenlerin başında tyrosol ve hidroksityrosol gelmektedir. Bunları kafeik asit, ferulik asit, vanilik asit, p-kumarik asit, p- hidroksibenzoik asit, sinamik asit ve oleuropein izlemektedir. Bu bileşenlerin tekli analizlerinde genel olarak kromatografik (gaz ve sıvı) tekniklerden yararlanılmaktadır(4,5). Gaz kromatografisinde bu bileşenlerin kalitatif ve kantitatif tayinlerinde genel olarak kütle spektrometresi detektör olarak kullanılmıştır(6). Zeytin ve zeytinyağının içerdiği fenolik yapıların GC-MS ile tayininde; analitlerin öncelikle düşük kaynama noktasına sahip yapıya çevrilmesi amacıyla değişik türevlendirme basamakları kullanılmaktadır. Çalışmamızda fenolik bileşenlerin GC-MS ile tayininde kullanılan örnek hazırlama işlemlerine ilişkin bir derleme sunulacaktır. Anahtar Kelimeler: zeytinyağı, fenolik bileşenler, gaz kromatografisi 1. Giriş Zeytin ve zeytinyağının fenolik içeriği; bitkinin yetiştiği iklim ve çevre koşullarına, zeytin ve işlenme türünün farklılığına bağlı olarak değişim göstermektedir. Zeytin ve zeytinyağının içerdiği fenolik bileşenlerin başında tyrosol ve hidroksityrosol gelmektedir. Bunları kafeik asit, ferulik asit, vanilik asit, p- kumarik asit, p-hidroksibenzoik asit, sinamik asit ve oleuropein izlemektedir. Bu bileşenlerin tekli analizlerinde genel olarak kromatografik tekniklerden yararlanılmaktadır(4,5). Sıvı kromatografisinde hazırlanan örnekler cihaza direkt olarak enjekte edilip, uygun olarak seçilen hareketli faz yardımıyla kolondan geçirilerek ayrımı yapılmakta ve analite uygun detektörler yardımıyla analizi gerçekleştirilmektedir. Gaz kromatrografisinde ise örneğin analizinin yapılabilmesi için uçucu olması gerekmektedir. Bu amaçla analitin uçucu hale getirilmesi için türevlendirme işlemi yapılmalıdır. Türevlendirme; gaz kromatografisi analizlerine uygun özellikte bileşikler elde etmek için uygulanan kimyasal bir işlemdir. Maddelerin uçuculuğunu artırmak, kararlı hale getirmek, kromatografik davranışı ve belirlenebilirliği iyileştirmek, kaynama noktasını düşürmek, polariteyi azaltmak ve daha iyi ayırma sağlamak için türevlendirme işlemi uygulanır. Türevlendirme ile OH, NH, SH gibi polar grupları elimine edilir ve türevler O, N, S ve P grupları üzerinde olur. Pratikte bilinen üç çeşit türevlendirme türü vardır. Bunlar; sililasyon, alkilleme ve açillemedir. Türevlendirme işleminde kullanılan reaktifler; N,O-Bis(trimetilsili) asetamid (BSA), N,O- Bis(trimetilsili) trifloroasetamid (BSTFA), Etildimetillsili klorür, Hekzametildisilazan (HMDS), Isopropildimetilsili klorür, N,O-(bis) siliasetamid, N-Trimetilsili-N-metiltrifloroasetamid (MSTFA), Tertiarybutildimetilklorsilan (TBDMCS), N-Tertiarybutilsili-N-metiltrifloroasetamid (MTBSTFA), Tertiarybutildimetilsili klorür (TBDMSCl), N-Tertiarybutildimetilsilimidazol (TBDMSIM), Trimetilbromosilan (TMBS), Trimetilklorosilan (TMCS), N-Trimetilsilidietilamin (TMSDEA), Trimetilsilimidazol (TMSIM) dür. Bu reaktiflerin herhangi biri veya birkaçı seçilerek türevlendirilmesi 37
istenilen yapılar ile uygun reaksiyon koşullarında reaksiyona girmesi sağlanır. Fenolik bir yapı ile türevlendirmede kullanılan bir reaktifin verdiği reaksiyon aşağıda gösterilmiştir. 38 Şekil 1. Türevlendirme reaksiyonun genel gösterimi Literatür çalışmalarında zeytinyağındaki fenolik bileşenlerin analizinde genel olarak yapılan örnek hazırlama işlemi sıvı-sıvı ekstraksiyonudur. Bunun için genellikle metanol veya değişik oranlardaki (80:20, 60:40) metanol: su karışımı ile ekstraksiyon gerçekleştirilmiş ve birkaç kez tekrar edilen ekstraksiyon sonrası birleştirilen ekstraktlar, azot atmosferi veya vakumlu buharlaştırıcıda uçurularak deriştirme işlemi sağlanmış ve yağ kalıntılarının uzaklaştırılması için heksan ile ekstraksiyon yapılmıştır. Ekstraksiyon sonrası GC ye verilmeden önce gerçekleştirilen türevlendirme işleminde genel olarak; N,O- Bis(trimetilsili) trifloroasetamid (BSTFA) ve Trimetilklorosilan (TMCS) kullanılmıştır. Türevlendirme işlemi sırasında ortamda nem veya su türevlendirmenin verimini düşüren en önemli parametrelerden biridir. Bu amaçla literatürde, türevlendirmede kullanılan reaktiflere susuz Na 2 SO 4 eklenmesi önerilmektedir. Türevlendirme için azot atmosferinde uçurulan yapılara BSTFA: TMCS (99:1) karışımından 100-200 µl arasında değişen hacimlerde eklenerek oda sıcaklığında 30 60 dakika bekletilerek enjeksiyona hazır hale getirilmiştir(6-9). Farklı bir türevlendirme işlemi olarak uçurulan ekstraktların piridin/hmds/tmcs (2:1:1) karışımı ile oda sıcaklığında 1 saat bekletilerek türevlendirme gerçekleştirilmiştir(2). Ayrıca 0,1 ml BSTFA ve 0,4 ml N,N-dimetil formamid ile 60 C de 1 saat türevlendirme işlemini yapılmıştır(10). Çalışmamızda zeytinyağı içeriğinde bulunabilecek tyrosol, syringik asit, protokatekuik asit, p-kumarik asit, ferulik asit, 4-hidroksi benzoik asit, vanilik asit, kafeik asit ve veratrik asite ilişkin standartlar üzerinden değişik türevlendirme çalışmaları, GC-MS ile selektif iyon modunda (SIM) gerçekleştirilmiştir. 2. Materyal Metod 2.1. Reaktifler Çalışmada kromatografik saflıkta merck etanol, etil asetat, BSTFA:TMCS (99:1), BSTFA, piridin, tyrosol, syringik asit, protokatekuik asit, p-kumarik asit, ferulik asit, 4-hidroksi benzoik asit, vanilik asit, kafeik asit ve veratrik asit kullanılmıştır. 2.2. Gaz Kromatografisi Kütle Spektrometresi Shımadzu marka QP-5000 model GC-MS kullanılmıştır. Ayırmada kullanılan kolon DB-5 olup 30 m uzunluğunda, 0,25 mm çapında ve 0,25 µm film kalınlığına sahiptir. Kullanılan fırın programı çizelge 1 de gösterilmiştir. Detektör sıcaklığı 280 C, taşıyıcı gaz helyum ve akış hızı 1 ml/dk olarak kullanılmıştır. Enjeksiyon splitless modunda çalışılmıştır. Çizelge 1. Gaz kromatografisi fırın sıcaklık programı. Artış hızı ( C/dk ) Sıcaklık ( C ) Süre (dk) - 100 10 15 300 20 Ayırmada selektif iyon modu kullanılmıştır. Bunun için her bir standarda ilişkin kullanılan parçalanma ürünlerine ilişkin kütle/yük (m/z) oranları çizelge 2 de verilmiştir.
Çizelge 2. SIM modta kullanılan m/z değerleri Pik Standart Adı Alıkonma m/z no: Zamanı(dk) 1 tyrosol 13,908 282+267+193+179 2 4-hidroksi benzoik asit 14,667 282+267+223+193 3 3,4-dimetoksi benzoik asit (veratrik asit) 15,825 254+239+195+165 4 3-metoksi, 4- hidroksi benzoik asit (vanilik asit) 16,483 312+297+282+267+253+223 5 3,4-dihidroksi benzoik asit ( protokatekuik asit) 17,192 282+267+193+165+370+355 6 4-hidroksi, 3,5-dimetoksi benzoik asit (syringik asit) 18,092 342+327+312+297+253 7 4-hidroksi sinamik asit (p-kumarik asit) 18,517 308+293+279+219+249 8 4-hidroksi, 3-metoksisinamik asit (ferulik asit) 20,150 338+323+308+293+249 9 3,4-dihidroksi sinamik asit (kafeik asit) 20,633 396+381+219+191+307+249 3. Bulgular ve Tartışma Çalışmamızda dört farklı türevlendirme işlemi uygulanmıştır. Bunun için öncelikle dokuz standardı içeren bir standart karışımı(100 mg/l) etanolde çözülerek hazırlanmıştır. Bu çözeltiden alınan 0,5 ml standart çözelti alınarak azot atmosferinde uçurulmuş, 1.yol : 400 µl BSTFA; 100 µl piridin; 500 µl etilasetat karışımı ile oda sıcaklığında 30 dak., 2.yol : 400 µl BSTFA:TMCS (99:1); 100 µl piridin; 500 µl etilasetat karışımı ile oda sıcaklığında 30 dak., 3.yol : 100 µl BSTFA:TMCS (99:1) ile oda sıcaklığında 30 dak., türevlendirilip, daha sonra etanol ile 1000 µl ye tamamlama, 4.yol : 100 µl BSTFA:TMCS (99:1) ile oda sıcaklığında 30 dak., türevlendirilip, daha sonra etilasetat ile 1000 µl ye tamamlama işlemleri yapılmıştır. Elde edilen türevli örnekler yukarıda değinilen koşullar altında 1 µl hacminde olacak şekilde GC-MS e enjekte edilmiştir. Elde edilen dört farklı örneğe ait toplam iyon kromatogramları, şekil 2-5 te verilmiştir. Şekil 2. Birinci türevlendirmeye ait kromatogram. 39
(x100,000) 3.0 Şekil 3. İkinci türevlendirmeye ait kromatogram. 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5 13.0 14.0 15.0 16.0 17.0 18.0 19.0 20.0 21.0 22.0 23.0 24.0 25.0 Şekil 4. Üçüncü türevlendirmeye ait kromatogram. Şekil 5. Dördüncü türevlendirmeye ait kromatogram. Üçüncü türevlendirme işleminin herhangi bir etkisinin olmadığı ve standartların türevlendirilemediği görülmektedir. Bu da türevlendirme işleminde; çözücü olarak etanolün uygun olamadığını göstermektedir. Bir, iki ve dördüncü türevlendirmelere ait kromatogramlara bakıldığında birbirine yakın pik alanı ve yükseklikleri görülmüştür. Dördüncü türevlendirme işleminde tyrosol, 4-hidroksi benzoik asit, 3,4-dimetoksi benzoik asit (veratrik asit) ve 3-metoksi, 4- hidroksi benzoik aside (vanilik asit) ait pik yüksekliklerinin, diğer türevlendirmelere göre yüksek olduğu görülmektedir. Bu da türevlendirme verimi açısından dördüncü türevlendirmenin daha olumlu olduğunu gösterir. 4. Sonuç Türevlendirme işlemi için kullanılan türevlendirici miktarı ve çeşidinin az olması, ekonomik olan ve yüksek pik alanı veren dördüncü türevlendirme çeşidinin tercih edilmesi gerekliliğini doğurmaktadır. Dördüncü türevlendirme işleminde kullanılan trimetil klorsilanın (TMCS) türevlendirmede katalizör etkisi gösterdiği de bilinmektedir(6). Ayrıca türevlendirme işleminde selektif iyon modunun(sim) kullanılması ile tayin sınırları ve kromatograma ait zemin çizgisi (baseline) düşürülmüş, seçicilik arttırılmıştır. Bu türevlendirme işleminin zeytinyağındaki fenolik maddelerin analizinde de kullanılabilirliği ve izlenmesi bundan sonraki çalışmalarımıza konu olacaktır. 40
5. Kaynaklar 1. Visioli F., Galli C.,1998. Olive Oil Phenols and Their Potential Effects on Human Health. J. Agric. Food Chem., 46 (10), 4292-4296. 2. Marsilio V., Campestre C., Lanza B.2001. Phenolic compounds change during California-style ripe olive processing. Food Chemistry, 74: 55-60. 3. Montedoro G., Servili M., Baldioli M., Miniati E.,1992. Simple and Hydrolyzable Phenolic Compounds in Virgin Olive Oil. 1.Their Extraction, Separation, and Quantitative and Semiquantitative Evaluation by HPLC. J. Agric. Food Chem, 40:1571-1576. 4. Caponio F., Alloggio V., Gomes T., 1999. Phenolic compounds of virgin olive oil:influence of paste preparation techniques. Food Chemistry 64:203-209. 5. Murkovic M., Lechner S. Pietzka A. and et.al. 2004. Analysis of minor components in olive oil. J.Biochem.Biophys.Methods, 61:155-160. 6. Saitta, M., Curto, S.L., Salvo, F., Di Bella, G., Dugo, G. 2002. Gas chromatographic tandem mass spectrometric identification of phenolic compounds in sicilian olive oils. Analytica Chimica Acta, 466: 335 344. 7. Liberatore, L., Procida, G., d'alessandro, N., Cichelli, A., 2001. Solid-phase extraction and gas chromatographic analysis of phenolic compounds in virgin olive oil. Food Chemistry 73: 119-124. 8. Owen, R.W., Mier, W., Giacosa, A., Hull, W.E., Spiegelhalder, B., Bartsch, H.,2000. Phenolic compounds and squalene in olive oils: the concentration and antioxidant potential of total phenols, simple phenols, secoiridoids, lignans and squalene. Food and Chemical Toxicology 38 : 647-659. 9. Owen, R.W., Giacosa, A., Hull, W.E., Haubner, R., Spiegelhalder, B., Bartsch, H.,2000. The antioxidant/anticancer potential of phenolic compounds isolated from olive oil. European Journal of Cancer 36 : 1235-1247. 10. Jamoussi B., Bedoui A., Hassine, B.B, Abderraba A., 2005. Analyses of phenolic compounds occurring in olive oil mill wastewaters by GC-MS. Toxicology&Environmental Chemistry, 87(1): 45-53. 41