Kullanım Talimatları SAS-1 HDL-Kolesterol Katalog No: 200500 1
SAS-1 HDL-KOLESTEROL KULLANIM AMACI SAS-1 HDL-Kolesterol Kit aşağıdaki reaksiyon sıralarına göre her bir lipoprotein kolesterol komponentinin enzimatik boyanması ve agaroz jel elektroforezi ile serum veya plazmada diğer lipoprotein sınıflarından gelen yüksek yoğunluklu lipoproteinin (HDL) ayrılması ve miktarının belirlenmesini amaçlar. Koroner kalp hastalığı (CHD) ile HDL Kolesterol ilişkisi 1951 1 de Barr ve arkadaşları ve 1975 2 de Miller ve Miller tarafından rapor edildi. Castelli 3-6 ve arkadaşlarını çalışması CHD riskini belirlemede kesin laboratuvar testi olarak HDL Kolesterol değerlendirmesine odaklanmıştır. Klinik olarak Total, HDL ve LDL Kolesteroller ve Trigliseritler 7 ölçümleri yapmak için Ulusal Kolesterol Eğitim Programın (NCEP) panelleri doğrudan klinik laboratuarlarına önerilir. Lipoprotein fraksiyonlarının kolesterol içeriği çeşitli ortamlarda 10 ultrasantrifüj 8, seçici çökelti 9 ve elektroforez ile tespit edilmiştir. UYARILAR VE ÖNLEMLER Tüm kitler yalnızca in-vitro diyagnostikte kullanım içindir. Herhangi bir kit bileşenini ağzınızla pipetlemeyin, ağzınıza sürmeyin. Tüm kit bileşenlerinin işlemi sırasında eldiven giyin. Risk, güvenlik koşulları ve atım bilgisi için ürün güvenlik kağıdına başvurun. BİLEŞENLER 1 - SAS-I HDL-Kolesterol Jel (x10) Agaroz koruyucu olarak sodyum azidli bir Tris/Barbital tamponu içerir. Paket içindeki jel kullanım için hazırdır. 2 - SAS-I HDL-Kolesterol Reaktif (10x 1ml) Yukarı gösterilen reaksiyon sırasına göre kolesterolun tanımlanması için gerekli bileşenleri içerir. Çözdürme talimatı için ADIM-ADIM PROSEDÜRE bakın. 3 - SAS-I HDL-Kolesterol Dilüent (1x 27ml) HEPES tamponda, ph 6.9-7.1,Triton X-100 içerir. Dilüent paket içinde kullanıma hazırdır. 2
4 - Diğer Kit Bileşenleri Her kit kullanım talimatları ve 10 jeli tamamlamak için yeterli miktarda kurutma kağıdı C,D,Soak-away kurutucu ve Reaktif Spreading Film içerir. SAKLAMA VE RAF ÖMRÜ 1 - SAS-I HDL-Kolesterol Jel Jeller 15-30 derecede saklanmalıdır ve paket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. DOLABA KOYMAYIN VEYA DONDURMAYIN. Jelin bozulmasını,1) jelin dondurulması kristal görünümü belirtir, 2) jelin kuruması, çatlama ve kuruluğu veya bakteriyal yada fungal kaynaklı agarozun görülür kontaminasyonunu belirtir. 2 - SAS-I HDL-Kolesterol Reaktif Reaktif 2...6 C de saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Çözünen reaktif 2...6 C de 72 saat stabildir. 3 - SAS-I HDL-Kolesterol Dilüent Dilüent 2...6 C de saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. SAĞLANMAYAN FAKAT GEREKSİNİLEN ÖĞELER Katolog No. Numune Aplikatör Ucu (1x10) Katolog No.210300 Numune Aplikatör Ucu (5x10) Katolog No.210100 Tek kullanımlık numune kapları (100) Katolog No.3100 REP Prep Katolog No.4062 Inkübasyon tepsisi 60-70 derece hava üfleme kapasiteli kurutma fırını 30 C li inkübatör Fiksatif Solüsyon: 950ml saf su ve 50 ml asedik asidi karıştırın. Ağzını sıkıca kapatarak saklayın. Saf su NUMUNE TOPLANMASI VE HAZIRLANMASI Tercih edilen numune taze toplanmış serum veya EDTA antikoagülate plazmadır. Numune 4 güne kadar 2...6 C de buzdolabında saklanmalıdır. DONDURMAYIN. Hasta hazırlama: 1) Eğer HDL Kolesterol sadece tespit edilecek parametrelerse, hastanın aç olmasına gerek yoktur. Eğer diğer lipid değerleri belirlenecekse, o zaman hasta numune almadan önce 12-14 saat aç olmalıdır. 2) Mümkünse 3-4 hafta süreyle hiç ilaç almamalıdır. 3) Hasta kilosunu korumalı ve en az 1 hafta normal diyet yapmalıdır. 4) Miyokard enfarktüsü veya benzeri travmatik vakadan sonra 4-8 hafta bekleyin. 3
Etkileyici Faktörler: 1) Heparin tedavisi lipoproteinlerin özellikle beta lipoproteinin göçündeki değişikliklere yol açabilir. Örnek hazırlama: Örnekler ve kalibratörler dilüsyonsuz kullanılmalıdır. ADIM-ADIM PROSEDÜR 1.Numune tepsisi veya tek kullanımlık numune kaplarının uygun kuyusuna numunenin 35μl pipetlenir. i) SAS-I & SAS-I Plus kullanıcıları: SAS-1 numune tepsisi kullanın. Aplikatör çekmecesinde numune tepsisi dikkatlice yerleştirilir. Tepisinin pozisyonuna kuvvetlice itilmesi sağlanır. ii) SAS-3 kullanıcıları: SPIFE/SAS-3 numune tepsisi kullanın. Kullanılan numune dikkatlice numune tepsisine yerleştirilir. Poziyonlandırılan tepsinin güvenilirliği sağlanır. 2. Jel paketinden alınır, çıkarılıp yerleştirilir ve: i)sas-1 kullanıcıları: Jel SAS-1 e yerleştirilir, agarozun yukarı tarafı, uygun elektrot kolları ile negatif ve pozitif uçları ayarlanır. ii) SAS-1 Plus kullanıcıları: Sıcak havuza REP Prep in 400 mikrolitresi boşaltılır. Sıcak havuza jel yerleştirilir, agarozun yukarı tarafı, uygun elektrot kolları ile pozitif ve negatif uçları ayarlanır ve jelin altında hava kabarcığı kalmamasına dikkat edin. iii)sas-3 kullanıcıları: Havuza ayarlama klavuzunu yerleştirin ve REP prep in 400 mikrolitresini odanın merkezine boşaltın. Jeli agarozun toplandığı kuyuya yerleştirin, klavuzu kullanın,uygun elektrot kolları ile negatif ve pozitif uçları ayarlayın, jelin altında hava kabarcığı kalmamasına dikkat edin. 3.Jelin yüzeyi kurutma kağıdı C ile kurutulur, kurutma kağıdı alınır. 4. i)sas-1 kullanıcıları: Elektrot kollarının üst tarafına elektrodlar eklenir böylece jel blokları ile temasa gelirler. ii)sas-1 Plus kullanıcıları:(yukarıdaki gibi) Jelin ve elektrodların üzerine kapak yerleştirilir ve teması sağlamak için 5 sn kuvvetlice bastırılır. iii)sas-3 kullanıcıları: Elektrod kollarına elektodlar eklenir böylece jel blokları 5.Cihaz üzerindeki pozisyonda bir aplikatör ucu biraraya getirilerek yerleştirilir.(sas-3 kullanıcıları: kısım 8). 6.HDL Elektroforezi yapılır: İ)SAS-1 kullanıcıları:80 volt,30 dakika, beş aplikasyon İİ)SAS-1 plus kullanıcıları: Elektroforez: 80 volt, 30 dk, 23 derece, beş aplikasyon İnkübasyon adımı 1: 30 dakika, 30 derece İİİ)SAS-3 kullanıcıları: Adım Zaman(dk:sn) Sıcaklık(derece) Voltaj Diğer Numune Yükleme 00:10 21 Hız 1 Numune Uygulama 00:10 21 Hız 1* 5 aplikasyon için Numune Yükleme,Numune Uygulama tekrar edin. Elektroforez 10:00 21 200 İnkübasyon 30:00 30 * Yerleştirme 1 kullanılır 4
7. SAS-1 ve SAS-3 kullanıcıları: Numuneler elektroforez olurken inkübasyon tepsisi içine su ile nemlendirilmiş kurutucu D koyun ve 30 C de inkübatörü ayarlayın. 8. Elektroforez sonunda yaklaşık 2-4 dakika, 1 ml HDL Diluent ekleyerek 1 flakon HDL Kolesterol reaktifini tekrar çözün ve iyice karıştırın. Sallamayın. 9.Elektroforezin ardından: i)sas-1 kullanıcıları: inkübasyon tepsisi içine agoraz jeli koyun. ii)sas-1 Plus kullanıcıları: kapak alınır, İİ)SAS-3 kullanıcıları: emici kağıtları alın, inkübasyon tepsisi içine agoraz jeli koyun. 10. Jelin ortası boyunca HDL-Kolesterol Reaktif şişe içeriğini dökün. 11. Hava kabarcığından kaçınarak reaktifi yaymak için reaktif yayma filminin bir kısmını uygulayın. 12. SAS-1 ve SAS-3 kullanıcılar: Jeli inkübe edin: 30 dakika, 30 C. SAS-1 Plus kullanıcılar: Jeli inkübe edin. 13. İnkübasyon sonrası, reaktif yayma filmini ve Gel Block Remover kullanarak her iki jeli alın. 14.Boyama kuyu tutucusuna jel eklenir. 15.Boyama biriminde HDL test programı ve izleyen uyarılar, Fiks, Yıkama ve kurutma jeli seçilir. a) SAS-2(Oto-boyayıcı) Adım Solüsyon Zaman(dk:sn) Port Sıcaklık(derece) Fiks Fiksatif solüsyon 10:00 2 Yıkama Saf su 02:00 1 Kurutma - 15:00 65 b) SAS-4(Oto-boyayıcı) Adım Solüsyon Zaman(dk:sn) Sıcaklık( o C) Diğer Fiks Fiksatif solüsyon 10:00 dolaşım AÇIK Yıkama Saf su 02:00 dolaşım AÇIK Kurutma - 15:00 65 c) Manual Bir boyama banyosu kullanarak,fiks ve yıkama adımları ve 60-70 derece üfleme kapasiteli bir kurutma fırını ile kurutma adımlarını,sas-2 Otoboyayıcı için listelenen adımlarda izleyin. 16. Boyama siklusunun sonunda, boyama alanından jeli alın. Jel şimdi incelenmek için hazırdır. SONUÇLARIN YORUMLANMASI Her bir laboratuar tek tek bu yöntem için elde edilen normal değerlere karşı jellerin değerlendirilmesini yapmalıdır. 5
NCEP kurallarında tedavi kararları öncelikle LDL kolesterol düzeylerine dayalıdır 7 : Sınıflandırma şemasında kabul edilen risk faktörleri yaş (erkek >45, kadın >55 yaş), erken CHD in aile öyküsü, sigara, hipertansiyon ve diyabetdir. HDL Kolesterol <35 mg/dl yüksek riskli olarak kabul edilir ve sınıflandırma bir risk faktörü olarak sayılır. HDL Kolesterol> 60 mg / dl koruyucu olarak kabul edilir ve risk faktörlerinin toplam sayısından bir çıkarılır. KALİTE KONTROL Jel HDL Kontrol (Katalog No.3189) her plaka çalışmasında ve prosedürün tüm basamaklarını doğrulamak için kullanılabilir. Uygun test değerleri için sağlanan paket içeriğine bakın. 6
BIBLIYOGRAFYA 1. Barr, D.P. et al Protein-lipid Relationships in Human Plasma, Am. J. Med., 1951 ; 11 : 480-493. 2. Miller, G.J and Miller, N.E. Plasma-High Density-Lipoprotein Concentration and Development of Ischemic Heart Disease, Lancet, 1976 ; 1 : 16-19. 3. Kannel, W.B. et al Serum Cholesterol, Lipoproteins and the Risk of Coronary Heart Disease Ann. Inter. Med., 1971 ; 74 (1) : 1-12. 4. Gordon, T. et al High Density Lipoprotein as a Protective Factor Against Coronary Artery Disease. The Framingham Study, Am. J. Med., 1977 ; 62 : 707-714. 5. Galen, R.S. HDL Cholesterol, How Good a Risk Factor?, Diag. Med., 1979 ; Nov/Dec : 39-58. 6. Castelli, W.P. et al. HDL Cholesterol and Other Lipids in Coronary Heart Disease The Cooperative Lipoprotein Phenotyping Study Circulation, 1977 ; 55 (5) : 767-772. 7. National Cholesterol Education Program, Second report of the expert panel on detection, evaluation and treatment of high blood cholesterol in adults (Adult Treatment Panel II). NCEP 1993. 8. Delalla, O.F. and Gofman, J.W. Ultracentrifugal Analysis of Serum Lipoprotein, in Methods of Biochemical Analysis, Vol. 1, D. Glick (Ed.), New York, Interscience, 459-478, 1954. 9. Burstein, M. and Scholnick, H.R., Precipitation of Chylomicrons and Very Low density Lipoproteins From Human Serum With Sodium Lauryl Sulfate, Life Sci., 1972; 11 : 177 184. 10. Cobb, S.A. and Sanders J.L., Enzymic Determination of Cholesterol in Serum Lipoproteins Separated by Electrophoresis, Clin. Chem., 1978; 24(7) : 1116-1120. 7