MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER I DNA NIN KİMYASAL SENTEZİ, DİZİ ANALİZİ ve ÇOĞALTILMASI PCR
DNA NIN KİMYASAL SENTEZİ, DİZİ ANALİZİ ve ÇOĞALTILMASI Günümüzde DNA molekülünün kimyasal olarak sentezi dizisinin analizi çoğaltılması için temeli doğal süreçlere dayanan standart deneysel yöntemler geliştirilmiştir.
Bu yöntemler ile; genlerin izolasyonu, karakterize edilmeleri ve anlatımlarının analizleri mümkün olmaktadır.
DNA NIN KİMYASAL SENTEZİ Tek iplikli oligonükleotidlerin kimyasal olarak sentezi; genlerin oluşturulmasında, belli DNA dizilerinin çoğaltılmasında, klonlanmış genlerde mutasyon oluşturulmasında, gen kitaplıklarının taranmasında, DNA nın dizilenmesinde ve gen klonlanmasında kullanılır.
DNA NIN KİMYASAL SENTEZİ DNA Synthesizer - Gen Makineleri 50 boyutundaki tek iplikli oligonükleotidleri istenilen dizi bilgisine göre, 5 uca kimyasal olarak nükleotidleri ekler. Cihaz kolon içerir, bilgisayar desteklidir. Ekleme kademelidir, her kademeden sonra yıkama işlemi yapılır.
DNA NIN KİMYASAL SENTEZİ DNA Synthesizer - Gen Makineleri
DNA NIN KİMYASAL SENTEZİ Fosforamidit yöntemi 4 tip nükleotid için fosforamidit türevleri kullanılır.
DNA NIN KİMYASAL SENTEZİ Oligonükleotid kullanımı ile DNA sentezi 40-60 mer lik, işaretli, tek iplikli oligonükleotidler kullanılır. Oligonükleotidler her bir nükleotid için 4 olasılık hesabına göre sentezlenmişlerdir. Dizisi bilinmeyen DNA ların bulunması için kullanılırlar.
DNA DİZİ ANALİZİ YÖNTEMLERİ DNA nın dizisinin bilinmesi; genlerin yapılarının ve fonksiyonlarının anlaşılması için önemlidir. İki temel DNA dizi analizi, yöntemi bulan araştırıcılara Nobel Ödülü kazandırmıştır. Maxam- Gilbert yöntemi Sanger dideoksi yöntemi
DNA DİZİ ANALİZİ YÖNTEMLERİ Maxam- Gilbert Yöntemi (Kimyasal Yöntem) Yöntemin temeli; belli nükleotidleri parçalayan farklı kimyasal maddelerin kullanımına dayanır. 1) Dizisi belirlenecek DNA işaretlenir. 2) Kimyasal maddelerin etkisinde bırakılır. 3) Oluşan farklı uzunluktaki elektroforezi ile analiz edilir. parçalar jel
A- Maxam- Gilbert Yöntemi: DNA parçası bir ucundan P32 ile işaretlenir. Bu işaretli DNA parçası dört örnek olarak bölünür. Her örneğe, DNA da ki bazlardan birisini tahrip edecek şekilde bir kimyasal madde eklenir.
Piperidine kullanılarak, hasarlanmış nükleotidlerin bulunduğu yerlerden DNA yapısı fosfodiester bağlarından kırılır. Böylece P32 ile işaretlenmiş kısalı uzunlu parçalar elde edilmiş olur.
Maxam- Gilbert Yöntemi Daha sonra elektroforez ve otoradyografi ile sonuç alınır.
DNA DİZİ ANALİZİ YÖNTEMLERİ Sanger dideoksi yöntemi (Enzimatik Yöntem) Yöntemin temeli; tek iplikli DNA ya tamamlayıcı DNA sentezi sırasında dideoksinükleotidler kullanılarak sentezin çeşitli aşamalarda durdurulmasıdır.
Sanger dideoksi yöntemi DNA sentezi sırasında yeni nükleotid eklenirken dideoksinükleotidler, 3 OH grubu taşımadıklarından yapıya dideoksinükleotidin girdiği yerde sentez erken sonlanır.
Fred Sanger's metodu (dideoxy method) Burada kullanılan Dideoxynükleotidlerin klasik dntp lerden farklı olarak deoksiribozun 3` noktasında hydroxyl grubunun bulunmayışıdır. Bu eksiklik bağlanma sırasında ardından gelen dntp ler ile fosfodiester bağının oluşmamasına yol açar.
Dideoksinükleotid (ddntp)
Doğal olarak sentez devam ederken zincirin daha fazla uzaması imkansız hale gelir. ddntp ile klasik dört dntp bir reaksiyon karışımının içine konduğunda, DNA zincir uzaması için aralarında bir yarışma olur, seyrek fakat spesifik sonlanmalar oluşur. Dört farklı enzimatik reaksiyonda, dört farklı ddntp kullanılarak birer reaksiyon elde edilir.
M13 vektörü ile dizileme Tek iplikli DNA virusu Bakteri infeksiyonu ile çift iplikli RF oluşumu RF lerden tek iplikli M13 lerin sentezi Kapsidle paketlenme Olgun faj oluşumu 1) Dizisi belirlenecek DNA M13 de klonlanır. 2) Sanger yöntemi ile analizlenir. M13 yöntemi 500bç.lik DNA lar için uygundur.
Primer Walking Yürüme Yöntemi ile Dizileme 500 bç., den büyük DNA ların (ör: 5000bç.) dizilenmesi için kullanılır. Analizlenecek DNA hedef DNA- ucunda primer içerecek şekilde klonlanır, Sanger yöntemi ile dizisi belirlenir. Hedef DNA nın uzak ucuna ait eni primerle işlem tekrarlanır. Aşamalı olarak hedef DNA da yürüme yapılarak uzun DNA nın dizisi belirlenir.
Primer Walking Yürüme Yöntemi ile Dizileme
Otomatik Dizileme Temeli Sanger yöntemine dayanır. İşaretlemelerde genellikle floresan boyalar ( ) kullanılır. Otomatik dizileme cihazlarındaki otomasyon ile ve lazer ışığında 4 baz (A T G C) için 4 aynı emisyon veren kullanımı ile emisyon değerleri bilgisayar aracılığı ile analiz edilir.
Otomatik Dizileme
Otomatik DNA Sekansı=Dizilemesi
Shotgun Dizileme metodu uzun DNA parçalarını dizilemek için kullanılır. Bu metodta büyük boyutlardaki genomik DNA veya bakteri yapay kromozomları fiziksel olarak, rastgele küçük (300-800 bp) boyutlara parçalanır. Bu DNA parçacıkları, uçlarına eklenen adaptörlerden DNA yakalama boncuklan tarafından tutularak bir DNA kütüphanesi oluşturulur. Daha sonra her bir boncuk tarafından yakalanan DNA parçacığı ayrı ayrı dizilenir ve okunan bütün parçalar Biyoinformatik yazılımlarla birleştirilir. Shotgun Dizileme tekniği birçok önemli grup tarafından kullanılmıştır. Bu metod ile insan gibi karmaşık genomlardan (2) Drosophila melanogaster genomuna (3) ve Haemophilus influenzae (4) gibi bakteri ve virus genomlarına uzanan birçok türün tüm genom haritası ortaya çıkarılmıştır. De novo dizi okumaları kontigler haline getirildikten sonra bu parçalar pairedend (küt uç) okumaları ile doğru yönde dizilerek birleştirilir. Bu paired-end okumalarının herbir tarafında birbirlerinden yaklaşık olarak 2.5 kb uzaklıkta iki adet 20-mer'lik DNA parçacığı bulunur. Biyoinformatik yazılımlar sayesinde 20- merlik bu parçacıklar oluşturulan kontig'lere haritalanır ve böylece bu kontigler doğru yönde dizilerek birleştirilir. Bu bmeştirilmiş diziler sayesinde yüksek kalitede ve doğrulukta genom dizisi elde edilir. Günümüzde kullanılan yeni nesil dizileme sistemleri, Roche 454 genome analyzer, Illumina Genome Analyzer, Applied BioSystem SOLiD, Complete Genomics, Helios, Pacific Biosciences ve IonTorrent'dir.
DNA NIN ÇOĞALTILMASI PCR
DNA ÇOĞALTILMASI In vitro DNA çoğaltılması; ilgilenilen bir DNA parçasının (genin) bol miktarda eldesi, bu DNA nın analizi genetik mühendisliği çalışmaları için gereklidir.
Doğal hücre çoğalması REPLİKASYON Hücre bölünmesi sırasında DNA miktarının 2 katına çıkması Jenerasyonlar boyunca DNA miktarının başlangıca göre üssel artışı 30 jenerasyon sonunda milyar kat artış
REPLİKASYON
In vitro DNA çoğaltılması 1. Rekombinant DNA teknolojisi 70 li yıllarda gelişen teknoloji 2. PCR, Polymerase Chain Reaction, PZR, Polimeraz Zincir Reaksiyonu 80 li yıllarda gelişen teknoloji
In vitro DNA çoğaltılması Rekombinant DNA teknolojisi gen klonlaması
PCR PCR istenilen bir DNA parçasının replikasyon sürecinin taklit edilmesiyle birkaç saatte milyar katının kopyalanmasıdır. PCR belli bir DNA parçasının primerlerin yönlendirmesiyle enzimatik olarak sentezlenmesini sağlayan in vitro bir yöntemdir.
PCR PCR, 1983, 1986 Cetus PCR ın muciti Kary Mullis, 1993 de Nobel Ödülü nü alırken. (Saiki et al., 1985) Moleküler Biyolojiyi lisans yapan metot Moleküler Biyoloji ve hücre biyolojisinde diğer teknikler için anahtar merkezi bir yöntemdir. http://www.nobel.se/chemistry/laureates/1993/mullis-autobio.html Mullis, K.B. (1990) The unusual origin of the polymerase chain reaction. Scientific American. 262 (4) 56-65.
PCR KULLANIM ALANLARI: 1. Temel moleküler biyolojik çalışmalar Klonlama Dizi analizi DNA haritalaması DNA parmak izi analizinde İnsan Genom Projesi ve diğer Genom Projelerindeki araştırmalarda,
PCR KULLANIM ALANLARI: 2. Tıpta hastalık tanısı genetik hastalıklar (orak hücre anemisi, kistik fibroz, fragile X, lösemi vb.) infektif hastalıklar (AIDS, tüberküloz, vb.) prenatal tanı
PCR KULLANIM ALANLARI: 3. Tıpta allelik dizi varyasyonlarının belirlenmesi organ transplantasyonu için uygun doku tipinin belirlenmesi adli örneklerin genetik tiplendirilmesi (analık- babalık testi) hastalıkların genetik temelinin araştırılması mutasyon taraması
PCR KULLANIM ALANLARI: 4. Tarım & Hayvancılık Verim, dayanıklılık vb. tarımsal özelliklerce elit tiplerin seçimi
PCR KULLANIM ALANLARI: 5. Sistematik & Evolusyon Tür tanısı, türler arası akrabalık ilişkilerinin belirlenmesi, türlerin kökenlerinin araştırılması
PCR TANIMLAR: Replikasyonun in vitro olarak gerçekleştirilmesi Özgün bir DNA parçasının milyarlarca kopyasının primerlerce yönlendirilerek in vitro koşulda enzimatik sentezi
PCR Bir dizi sentez reaksiyonu içerir, bu nedenle polimeraz zincir (zincirleme) reaksiyonu adını alır. Reaksiyon iki primerin hedef DNA bölgesinde bağlandıkları diziler arasında ve termostabil DNA polimeraz enzimi tarafından katalizleme esasına dayanır.
PCR 1 PCR DÖNGÜSÜ 1- Denatürasyon 2- Primerin bağlanması (annealing) 3- Uzama (sentez) aşamalarından oluşur
PCR 1- Denatürasyon: Çoğaltılacak DNA parçasının yüksek sıcaklıkta iki ipliğinin birbirinden ayrılması Tek iplikli DNA ların oluşumu 92-95 o C
PCR 2- Primerin bağlanması (annealing): Denatürasyondan sonra sıcaklık düşürülür ve primerlerin tek iplikli DNA da kendilerine özgün dizilere bağlanması sağlanır. 55-60 o C
PCR 3- Uzama (sentez): Termostabil DNA polimerez primerlere bağlanır ve 3 uçlarına kalıba uygun nükleotidleri ekleyerek DNA sentezi yapar. 72 o C
PCR Sentez üsseldir 2 n ÖR: 30 döngü sonunda 2 30 kat DNA artışı olur. 40 döngüden fazlası istenmez. 30 döngüden sonra istenmeyen ürün artışı olur. Enzim miktarı kısıtlanır. Hedef dizi artışı ile primerler rekabet eder.
PCR BİLEŞENLERİ 1- Kalıp DNA: çoğaltılmak istenen diziyi içeren DNA Her çeşit organizmaya ekstrakromozomal DNA ait kromozomal ve Genomik DNA kitaplıkları RNA cdna Herhangi bir biyolojik materyale ait DNA örneği
PCR BİLEŞENLERİ 2- Primer molekül: çoğaltılmak istenen bölgenin sınır dizilerine tamamlayıcı tek iplikli kısa DNA parçaları 20 ya da daha az nükleotidden oluşurlar. Bilgisayarlar ile tasarlanırlar. Ticari olarak elde edilirler.
PCR BİLEŞENLERİ 3- DNA polimerazlar: Termostabil (sıcaklığa dayanıklı) özellikte Önceleri E.coli DNA polimaraz I Klenow fragmenti kullanıldı Thermus aquaticus Taq DNA polimeraz ı 70-80 o C da aktif, saniyede 37-100 nükleotid ekler Günümüzde rekombinant DNA polimerazlar da (AmpliTaq, Pfu polimeraz, Vent vb.) kullanılmakta
Termostabil DNA Polimerazlar ve Kaynakları DNA polimeraz Dogăl/Rekombinant Kaynak Taq Dogăl Thermus aquaticus Amplitaq Rekombinant T. aquaticus Amplitaq (Stoff el fragment) Rekombinant T. aquaticus Hot Tub TM Dogăl Thermus flavis Pyrostase TM Dogăl T. flavis Vent TM Rekombinant Thermococcus litoralis Deep Vent TM Rekombinant Pyrococcus GB- D Tth Rekombinant Thermus thermophilus Pfu Dogăl Pyrococcus furiosus UITma TM Rekombinant Thermotoga maritima
PCR da sıklıkla kullanılan DNA polimerazların o zellikleri Termostabilite- 95 C deki yarılanma o mru (dakika) 5 3 ekzonu kleaz aktivitesi 3 5 ekzonu kleaz aktivitesi Taq/ Amplitaq Stoffel fragment Vent TM Pfu Tth UITm a TM 40 80 400 >120 20 >50* var yok yok yok var Yok yok yok var var yok Var Processivity * * 50-60 5-10 7 *** 30-40 *** Kalıbı uzatma oranı (Nu kleotid/saniye) Revers transkriptaz aktivitesi Olus an DNA ucu 3 A 3 A 75 >50 >80 60 >33 *** zayıf zayıf *** *** var *** >%95 kuẗ *** 3 A Kuẗ *97,5 C de o lc u lmu sţu r. * * Enzimin DNA kalıbından ayrılmaksızın kalıba ekledig i ortalama nu kleotid sayısı. * * *Bilgi bulunmamaktadır.
PCR BİLEŞENLERİ 4- Deoksinükleotid trifosfatlar (dntp ler):dna yapıtaşları Yüksek saflıkta ve ticari olarak elde edilirler. Ayrı ayrı ya da karışım halinde bulunurlar. Genellikle 100µl lik konsantrasyonda kullanılırlar. Konsantrasyonları döngü sayısına, gen boyutuna, MgCl 2 konsantrasyonuna ve primer miktarına bağlıdır.
PCR BİLEŞENLERİ 5- MgCl 2 ve tampon: Tamponda genellikle Tris- HCl, KCl, MgCl 2 bulunur. Kullanılan enzime göre tampon içeriği değişebilir. Mg +2 iyonu dntp lerle geri dönüşümlü kompleksler oluşturur, koenzim olarak enzim aktivitesini uyarır DNA nın Tm değerini artırır. Genellikle 05-5mM kullanılırlar; fazlılığı spesifik olmayan ürün artışı ile yetersizliği verim düşüklüğüne neden olur. Mg +2 konsantrasyonu optimize edilmelidir.
PCR Karışımı Tek örnek için PCR karışımının hazırlanması ( 100 μl toplam hacim ) : DNA 100 ng 10 X Tampon 10 μl dntp 2 μl ( 200 μmol olacak şekilde) 25 mm MgCl 2 6 μl F primer 100 pmol R primer 100 pmol sdh2o 80 μl Taq polimeraz 2.5 ünite v Dört tür dntp (datp,dctp,dgtp,dttp)
PCR Koşulları 94 ºC denatürasyon 55-60 ºC annealing 72 ºC polimerizasyon Annealing derecesi primerin baz içeriğine ve uzunluğuna bağlı olarak değişken bir değerdir.her primer için annealing değerleri hesaplanır. Ø 2( A + T ) + 4 ( G + C ) Örnek Dizi : 5 CCTTAAGCTGGTGTCCAAAT 3 Ø 2 ( 11 AT) + 4 (9GC) = 58 0 C 5 GCTAGCAATATTTGTAAGCAT 3 Ø 2 (14 AT) + 4 ( 7 GC ) = 56 0 C
PCR ÇEŞİTLERİ Anchored (demirlenmiş) PCR: çoğaltılacak DNA nın sadece bir bölgesinin dizi bilgisi olduğunda Nested (yuvalanmış) PCR: özgün olmayan dizilerin çoğaltılmasını engellemek için Inverse (ters) PCR: bilinen bir diziden yararlanarak bu dizinin iki ucundaki bilinmeyen bölgenin çoğaltılmasında In situ PCR: hücre, doku yada doku parçaları içindeki DNA nın çoğaltılmasında, viral DNA, yada RT- PCR ile viral RNA ve transkriptlerin belirlenmesinde Multiplex (çoklu) PCR: birden fazla bölgenin aynı anda çoğaltılmasında Revers (geri) PCR RT PCR: RNA dan DNA çoğaltılmasında
PCR ÇEŞİTLERİ Asimetrik PCR: kullanılacak iki çeşit primerden biri miktarca diğerinden çok daha fazla kullanılır. Bu nedenle ipliklerden biri diğerinden fazla çoğaltılır. Asimeyrik PCR fazlaca çoğaltılan tek iplikli ürünün dizilenmesinde kullanılır. Multiplex (çoklu) PCR: birden fazla bölgenin aynı anda çoğaltılmasında Rastgele Çoğaltılmış Polimorfik DNA (RAPD PCR): rastgele seçilen primerlerle yapılan PCR olup, polimorfizmin belirlenmesinde kullanılır. Genetik işaretlerin elde edilmesinde ve genetik harita yapımında kullanılır. insanlarda STR (ardışık tekrarlı diziler) bu amaçla genetik tiplendirme ve haritalamada kullanılır.dna parmak izi olarak da bilinir.
PCR ÇEŞİTLERİ İmmuno PCR: PCR ile bir antijen saptama sistemi olup, özgül olarak antijen- antikor kompleksine bağlanmış bir işaret DNA parçasının çoğaltılması için kullanılır. Touchdown PCR Hot start PCR Kısmi Nested PCR Koloni PCR Arbitrary PCR Real Time PCR
REAL- TIME PCR GERÇEK ZAMANLI PCR Real time PCR ile ilgili ilk çalışma Russel Gene Higuchi ve ark. tarafından 1993 yılında yayınlanmıştır. Higuchi bu çalışmada interkalatör boya olarak ethidium bromid kullanmış thermocycler cihazını UV ile ışınlamış ve oluşan fluoresansı CCD kamera ile tespit etmiştir.
REAL- TIME PCR Real time PCR ile ilgili ilk çalışma Russel Gene Higuchi ve ark. tarafından 1993 yılında yayınlanmıştır. Higuchi bu çalışmada interkalatör boya olarak ethidium bromid kullanmış thermocycler cihazını UV ile ışınlamış ve oluşan fluoresansı CCD kamera ile tespit etmiştir. Higuchi R. Fockler, Dollinger G. Watson R. (1993) Kinetic PCR analysis: real time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology 11:1026
Real Time PCR Nedir? Real Time PCR; Floresan işaretli problar veya interkalatör boyalar kullanılarak, gerçek zamanlı olarak incelenmek istenen örneğin içerdiği nükleik asitin (DNA/RNA) belirlenmesi ve miktarının gösterilebilmesi tekniğidir. Yani PCR amplifikasyonunu görünür hale getirir, moniterize eder. Floresan sinyali, PCR ürün miktarıyla doğru orantılı olarak artmaktadır. Real Time PCR tekniğinde sonuçlar, PCR analizi sırasında elde edilebilmektedir. Yani online izlenebilen bir çoğaltma yöntemidir.
Real Time PCR Avantajları? Konvansiyonel PCR plato fazında yani son noktada değerlendirilebilirken, Real Time PCR esnasında ekponansiyonel büyüme fazında datalar gözlemlenebilir. Floresan sinyalin gücü, doğrudan çoğaltılan ürün miktarı ile orantılıdır. Konvansiyonel ölçümlerden 1000 kat daha az nükleik asit ile çalışılabilir. İki kat artmış değişimi belirleyebilmehassasiyetindedir. PCR sonrası elektroforez gerektirmez.
Real Time PCR Avantajları? PCR sonrası basamaklar - Jel dökmek yok, Kuyucuklara örnek yükleme, yırtılmalar yok, Etidyum bromür ve UV ile temas/tehlikesi yok, Yüklenilen örneklerin jelden düşme tehlikesi yok, Zaman ve işgücü kaybı yok, Düşük kontaminasyon riski Günlük numune çalışma sayısı yüksektir (~200 numune/gün). Sensitivite (< 5 kopya) Geniş dinamik aralık (10-10 10 kopya) Tekrarlanabilir (CV < % 2.0) Sonuçlar kantite edilebilir. PCR dan daha pahalı değildir ($15/test). Multiplex PCR kullanımına uygun Hızlı (1h) & güvenilir sonuç...
Dezavantajlar Ø Günümüz teknolojisi ile eşzamanlı maksimum 4 reaksiyon yürütülebilmektedir (Multiplex). Ø Yüksek teknik beceri ve teknik destek gerektirir. Ø Kullanılan cihaz, teçhizat vs. maliyeti yüksektir. 160,000 $). (50,000 -
Real- Time PCR PCR eğrilerinin real-time analizi Numune Hazırlama Thermal Cycling Fluoresans Deteksiyonu Verilerin Analizi Cihaz
SİKLUS NO DNA MİKTARI 0 1 1 2 2 4 3 8 4 16 5 32 6 64 7 128 8 256 9 512 10 1.024 11 2.048 12 4.096 13 8.192 14 16.384 15 32.768 16 65.536 17 131.072 18 262.144 19 524.288 20 1.048.576 21 2.097.152 22 4.194.304 23 8.388.608 24 16.777.216 25 33.554.432 26 67.108.864 27 134.217.728 28 268.435.456 29 536.870.912 30 1.073.741.824 31 1.400.000.000 32 1.500.000.000 33 1.550.000.000 34 1.580.000.000 DNA MİKTARI DNA MİKTARI 1600000000 1400000000 1200000000 1000000000 800000000 600000000 400000000 200000000 0 10000000000 1000000000 100000000 10000000 1000000 100000 10000 1000 100 10 1 0 5 10 15 20 25 30 35 PCR SİKLUS SAYISI 0 5 10 15 20 25 30 35 PCR SİKLUS SAYISI
Kullanım yerleri ü Viral kantifikasyon ü Gen anlatım kantifikasyonu ü Array doğrulaması ü İlaç tedavisi etkinliği ü DNA hasar ölçümü ü Kalite kontrolu uygulama geçerliliği saptama ü Patojen saptaması ü Genotipleme ü Kromozomal translokasyonlar ü SNPs (Single nucleotide polymorpisms) ü Allelik diskriminasyonassay ü Metilasyon deteksiyonu ü Mikroarray sonuçlarını doğrulamak ü Mikrosatellit analizleri vs.
Gen anlatımının kantitasyonu Northern blotting mrna miktarının belirlenmesi: katı matrixte probla belirleme Günümüzde geçerli yöntem Daha fazla RNA ya gereksinim duyar. mrna miktarı hakkında kalitatif ve yarı kantitatif bilgi verir.
Gen anlatımının kantitasyonu Küçük bir miktar RNA örneğinden gen anlatımının kantitasyonunu yapmak Için transkriptin çoğaltılması gerekir. mrna temelli PCR da revers transkriptaz enzimi ile önce cdna sentez edilir, sonra da PCR ile kopya sayısı artırılır.
Gen anlatımının kantitasyonu Revers transkripsiyon ve floroforların geliştirilmesi ile DNA artışının gerçek zamanlı olarak ölçülmesi mümkün olur. Her siklusta DNA miktarı ölçülür. Elde edilen data bilgisayar yardımıyla relative gene expression olarak saptanır. Real- time PCR aynı zamanda örnekte belli bir DNA parçasının var olup olmadığının analizinde de kullanılır.
PCR Avantajlar PCR sadece yarı- kantitatif (ethidium bromide hassasiyet sorunu). Hassasiyet düşük PCR sonrası analizlere ihtiyaç var (jel elektroforezi) Real- Time PCR kantitatif sonuç veriyor ve diğer yöntemlere göre uygulaması çok daha kolay.
Real- Time PCR Real Time PCR da 3 metot mevcuttur. Ø Interkalatör Boya Metodu TaqMan Prob Ø Hidroliz Prob Metodu Ø Hibridizasyon Prob Metodu Molecular Beacon Prob
I. İnterkalatör Boya metodu (DNA- binding dyes) SYBR GREEN SYBR green çift zincirli DNA nın minor oluğuna bağlanır. Spesifik değildir. Maliyet düşüktür. Tarama amacıyla
SYBR Green Hedef DNA Denaturasyon Denatürasyon sırasında bağlanmamış SYBR Green düşük miktarda fluoresans verirler.
Annealing derecesinde moleküller oluşan çift zincirli primer- hedef DNA ya bağlanmaya başlarlar. Polimerizasyon basamağında daha fazla molekül sentezlenen DNA ya bağlanır ve oluşan fluoresans real- time moniterize edilebilir.
Çift iplikli DNA boyaları ile Real-time PCR Çift iplikli DNA ya bağlanan SYBR- green floresan boyası PCR siklus sayısı arttıkça artar. Böylece artan DNA miktarı da belirlenir. Dezavantajı; primer dimerleri gibi spesifik olmayan çift iplikli DNA ya da bağlanmasıdır.
TaqMan II. Hidroliz Prob Metodu Primer Taq 5 R Q 3 5 PCR sırasında prob hedef DNA dizisiyle hibridize olur. 5 3 R Q 5 Prob ekstansiyon sırasında polimeraz enzimi ile uzaklaştırılır.
II. Hidroliz Prob Metodu TaqMan 5 3 R Q Reporter Quencher den polimeraz enziminin 5 3 nükleaz etkisi ile ayrılır. 5 3 R Q Serbest reporter ışık yayar. kalan fluoresan
Hidroliz ile floresans değişimi İntakt Prob Bölünmüş Prob Dalgaboyu Dalgaboyu
Floresan reporter prob kullanımı Iki farklı boya taşıyan problar kullanılır. DNA ya spesifik olarak bağlanan probların uçlarındaki boya DNA polimerazın ekzonükleaz aktivitesi ile parçalandığında ışıma ölçülerek DNA miktarındaki artış belirlenir.
Taqman probları
II. Hidroliz Prob Metodu Moleküler Beacon (M. işaretleyiciler Ø DNA hibridizasyon problarıdır. Ø Baş ve gövde kısımlarından oluşmuştur. Ø Fluoresans marker (reporter) ve quencher her bir uçta bulunmaktadır. (Bustin 2000) Reporter Quencer
II. Hidroliz Prob Metodu Moleküler Beacon Ø Solüsyon içerisindeki serbest moleküler beaconlar kendilerine özgü yapıyı oluştururlar. Ø Uygun annealing derecesinde ve komplementar hedefin varlığında konformasyonel değişikliğe uğrarlar. Ø DNA spesifik olmaları ve düşük background avantajlarıdır.
II. Hidroliz Prob Metodu Moleküler Beacon Ø Uygun annealing derecesinde hedef DNA dizisine bağlanır ve fluoresans verir. Ø Ekstansiyon fazında ısı artırılınca hedef diziden ayrılır ve fluoresans kaybolur. Ø Her siklus için bu tekrarlanır.
III. Hibridizasyon Prob Metodu FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) Ø Donör fluorofor uygun dalgaboyu ile eksite edilir. Ø Donör enerjisi akseptör fluorofora aktarılır. Ø Akseptör fluorofor daha uzun dalga boyunda emisyon yapar.
III. Hibridizasyon Prob Metodu (A) Denatürasyon basamağında hibridizasyon probları solüsyon içerisinde ayrı ayrı durmaktadırlar. (B) Annealing basamağında, problar hedef DNA dizisine yan yana bağlanır. Birinci boyanın emisyon enerjisi ikinci boyayı eksite eder. Eksite olan ikinci boya da emisyon enerjisi yayar. Dr. Mehmet UYSAL
III. Hibridizasyon Prob Metodu (C) Ekstansiyon basamağında her iki prob tekrar hedef DNA dizisinden ayrılmaya başlar. (D) Polimerizasyon bitiminde problar serbest hale dönerler
Fluoresans Boyalar 6-FAM : 6-carboxyfluorescein TAMRA: 6-carboxytetramethylrhodamine Dr. Mehmet UYSAL
Fluoresans Ölçümü Lamp Lamba Excitation Filter Fold Mirror Fresnel Lens Well Lenses Dichroic Mirror Multi- Element Lens CCD Kamera Filter Wheel 96-Well Plate Peltier-based block thermal cycling system
icycler BioRad 5700 Applied Biosystems 7700 Applied Biosystems (1998) LightCycler Roche (2000) FluorTracker Stratagene FluorImager Molecular Dynamics
Primer- Prob Dizaynı Ø Tm dereceleri primer için 58-60 o C prob için 68-70 o C olmalı Ø G- C içerikleri % 30-80 aralığında olmalı Ø Primerlar 15-30 baz uzunluğundaolmalı Ø Primerın 3 ucundaki son 5 nükleotitteki total G- C içeriği 2 yi aşmamalı. Ø Maksimum amplikon büyüklüğü 400 bp i aşmamalı (ideali 50-150 bp). Ø Problar ardışık benzer nükleotit içermemeli (özellikle 4 veya daha fazla ardışık G), Ø Problardaki % 30-80 aralığındaki G- C içeriğinde C, G den fazla olmalı, Ø Probların 5' ucunda G olmamalı
DATA ANALİZİ
Fluoresans Eğrisi Ø Real- time qpcr sırasında amplifikasyon farklı evreler meydana getirir. Başlangıç fazı Logaritmik faz Plato fazı Logaritmik faz Başlangıç fazı Plato fazı
Başlangıç Fazı Ø Ürün oluşmakta, ancak floresans background seviyesinin altında kalmaktadır. Başlangıç Fazı
Logaritmik Faz Ø Ürünün eksponansiyel birikimiyle floresans background seviyesinin üzerine çıkmaktadır. Ø Fluoresans amplifiye olan ürün miktarıyla direkt orantılı olarak yükselmektedir. Logaritmik Faz
Plato Fazı Ø DNA veya fluoresans miktarında reaksiyon bileşenlerinin (primer, taq polimeraz vs.) tükenmesine dolayı anlamlı artış yoktur. (Ginzinger, 2002) Plato Fazı
Numune Hazırlama Ø Master mix (TaqMan veya SYBR green) Ø Buffer + dntps + MgCl 2 Ø DNA polimeraz Ø ROX reporter = internal referans Ø Forward ve reverse primer Ø Taqman prob (veya SYBR green) Ø Template DNA Ø Cihaza yüklenir.
Kontroller Ø Negatif kontrol (DNA Ø) ü Reaktifleri kontaminasyon açısından kontrol Ø Pozitif kontrol ü Reaktif ve primerlerın çalışıp çalışmadığını ü Özellikle gen ekspresyonunun varlığını göstermek açısından önemlidir.
Ölçümün Dinamik Aralığı 10ng 0.001ng n Template konsantrasyonları; 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001 ng
KANTİTASYON Ø Relatif kantitasyon Ø Absolut kantitasyon Ø ROX ile normalizasyon Ø Baseline correction Ø Melting curve analiz (SYBR green) Ø Threshold cycle ile kantitasyon Ø End point ölçüm