Elektoforez ENSTRÜMENTAL ANALİZ Elektroforez Elektroforez yüklü moleküllerin bir elektriksel alandaki hareketlerinin izlendiği bir tekniktir. Bir örnekteki maddelerin tümü veya bazıları iyonlaşabiliyorsa karışım bir elektrik alana konularak bileşenlerin ayırımı yapılabilir. Elektrik alanda yüklü moleküller hareket eder. Bu hareketin hızı iyonun cinsine, yüküne, alanın şiddetine bağlıdır. Bu yöntem elektroforez olarak isimlendirilir. 1 2 Elektroforezin prensibi: Zıt yükteki elektrotlara doğru, farklı hızlarda hareket eden değişik yükteki moleküllerin elektriksel alanda birbirinden ayrılmasına dayanır. Yüksüz moleküller elektriksel alandan etkilenmezler, hareket etmezler. Farklı büyüklükteki moleküller farklı hızlarda yol alırlar. Büyük moleküllerin hızları daha yavaştır Bu sistemde analizi yapılacak örnek bir destek ortamına uygulanır. Destek maddesi içerisinde uygun bir tampon bulunan bir elektroforez cihazına yerleştir ve elektrik akımı verilerek işlem gerçekleştirilir. Analizi yapılacak örnek destek maddesine bir leke ya da ince bir bant şeklinde uygulanır. 3 4 Destek maddeler süzgeç kağıdı, Selüloz asetat zarları, Nişasta jeli, Agaroz jeli Akrilamid jeli olabilir Modern elektroforetik tekniklerde daha çok jeller tercih edilir Kağıt elektroforezi ucuz ve kolay bir yöntemdir. Kağıt elektoforezinde elektrotların daldırıldığı ve kağıdın ıslatılmasında kullanılan tamponların konsantrasyonları önemlidir. Çünkü organik asitlerin çoğu ancak belli ph da iyonlar oluşturur. 5 6 1
Poliakrilamid jel elektroforezi(page) Kağıt elektroforezi kağıt kromatografisine benzer. Burada örnek kağıdın uç bölgelerine değil de ortasına uygulanır. Örnekler bileşenleri + veya kutuplara doğru hareket eder. Kağıt elektroforezi karbonhidratlar ve aminoasitler gibi düşük molekül ağırlıklı bileşiklerin belirlenmesinde kullanılır. Küçük boyuttaki nükleik asit ve proteinler için çok yüksek ayrıştırma gücüne sahiptir. Proteinlerin analizinde ayrıştırılmasında en fazla kullanılan yöntemlerden biridir. Temelde protein tanımlama (molekül ağırlığını, oligomerik mi, monomerik mi olduğunu, miktarını, saflığını belirlemek vs) ve saflaştırma amacıyla kullanılan bu yöntem bir proteinin sentezlenip sentezlenmediği; sentezleniyorsa işlevsel olup olmadığı hakkında da bilgi verir. 7 8 Destek materyali olarak akrilamit ve bisakrilamidin serbest radikaller eşliğinde polimerizasyonu ile hazırlanan poliakrilamid jeller kullanılır. Poliakrilamid miktarı değiştirilerek jeldeki gözeneklerin büyüklüğü kontrol edilebilir. Göç eden moleküllerle destek materyali arasındaki etkileşim en düşük düzeydedir. Moleküller yük ve büyüklüklerine göre ayrılırlar Ayrıca destek materyali oldukça kararlı ve dayanıklıdır. 9 Poliakrilamid jeller akrilamid ve çapraz bağlayıcı N,N -metilen-bis-akrilamidin polimerizasyonu ile hazırlanır. Çapraz bağlayıcı jelde polipeptitlerin geçeceği porları oluşturur Reaksiyon başlatıcı ve katalizör olarak amonyum persülfat, katalizör olarak datemed (tetrametilenetilendiamin) kullanılır Bir jelin ayrıştırma gücü ve molekül boyutu aralığı akrilamid ve bisakrilamidin konsantrasyonuna bağlıdır. Düşük konsantrasyonda daha büyük porlar oluşur ve yüksek molekül ağırlıklı biyolojik moleküllerin analizi yapılabilir. 10 Jellerin hazırlanmasında kullanılan akrilamid bir nörotoksindir ve kanser oluşturma tehlikesi vardır. Bu nedenle eldivenle çalışılması gerekmektedir. Poliakrilamid jellerde yapılan elektroforez örnekteki bileşenlerin daha iyi ayrılmalarına yol açar, çünkü ayırım hem moleküler elekleme (jel filtrasyon) hem de elektroforetik harekete dayanır. Jel filtrasyondan farkı küçük moleküllerin büyük moleküllerden daha hızlı hareket etmeleridir 11 12 2
PAGE çubuk (tüp) biçiminde veya düzlemsel biçimde hazırlanan jellerde gerçekleştirilebilir. Düzlemsel poliakrilamid jel belli uzaklıkta (0.5-2 mm) tutulan iki cam plaka (jel kaseti) arasında ve genellikle 8x10 cm veya 10x10 cm boyutunda hazırlanır. Polimerizasyon plakaların içinde gerçekleştirilir. Düzlemsel jellerde daha fazla örneği analiz etmek mümkün olduğu için daha çok bunlar tercih edilir. 13 14 Polimerizasyon sırasında jelin üst kısmına yerleştirilen plastik bir tarak ile kuyucukların oluşumu sağlanır. Jeli oluşturmak için kullanılan çözeltiler belirli oranlarda karıştırılarak hava kabarcığı kalmayacak şekilde iki cam plaka arasındaki boşluğa bir pipetle dikkatlice dökülür. Polimerizasyondan sonra tarak çıkarılır. Jel kaseti tampon küvetine yerleştirilir, Örnekler kuyucuklara uygulanır ve akım geçirilir. İşlemin izlenmesi için örnekler bir boya maddesi (bromofenol mavisi) ile karıştırılarak uygulanır 15 16 Üst kısımda katot alt kısımda ise anot bulunur. Biyolojik moleküllerin çoğu negatif yüklü olduğu için anoda doğru hareket ederler. Elektroforez bitiminde jel uygun bir boya (Coomassie brillant blue veya gümüş nitrat)ile boyanarak görüntülenir 17 18 3
SDS-PAGE (Sodyum dodesil sülfatpoliakrilamid jel elektroforezi) PAGE in modifiye edilmiş şeklidir. Sodyum dodesil sülfat (SDS) kullanılarak proteinler denatüre edildikten sonra poliakrilamidde ayrılırlar. SDS-PAGE de proteinler molekül büyüklüklerine göre ayrılır. SDS-PAGE in en büyük yararı proteinlerin molekül ağırlıklarının belirlenmesine olanak vermesidir. SDS-PAGE molekül ağırlığı belirlemesinde kullanılır. Jele yüklenen standart standart protein örnekleri (marker) yardımı ile molekül ağırlığı belirlenir. PAGE de ise proteinin molekül ağırlığı hakkında bilgi edinmek mümkün değildir. Çünkü buradaki ayırımı molekül büyüklüğü yanında molekül şekli ve yükü de etkiler. SDS-PAGE DE proteinler denatüre edildiğinden biyolojik aktiviteleri ortadan kalkar. PAGE de ise proteinler ya da enzimler biyolojik aktivitelerini kaybetmeksizin ayrılabilirler. 19 20 Agaroz jel elektroforezi PAGE daha çok proteinlerin ve küçük DNA parçalarının ayırımı ve analizi için kullanışlıdır. Poliakrilamid jeldeki küçük por boyutları büyük DNA molekülleri için uygun değildir. Büyük DNA moleküllerinin ayırımında agaroz destekli elektroforez kullanılır. Agaroz: bir algden elde edilen agaroz, galaktopiranoz türevlerinin lineer bir polimeridir. Jel elektroforez tamponuna konmuş agarozun yüksek sıcaklıkta çözündürülmesi ile hazırlanır. Agaroz çözeltisi yaklaşık 50 C ye kadar soğutularak jel tepsisine dökülür. Agaroz konsantrasyonu % 0.3-2.0 arasındadır. Büyük moleküller için düşük konsantrasyon, küçük moleküller için yüksek konsantrasyonda hazırlanır. 21 22 Ayırımı yapılacak örnek taraklarla oluşturulmuş kuyucuklara yerleştirilir ve ayırım yapılıncaya kadar voltaj uygulanır. Küçük moleküller daha hızlı hareket ederler. Büyük moleküller de yavaş hareket ederler. Aynı jelde molekül ağırlığı bilinen standartlar da yürütülerek örneklerin molekül ağırlıkları belirlenir. 23 UV ışık altında floresan etki gösteren etidiyum bromür boyası kullanılarak oluşan bantların görüntülenmesi sağlanır (Boya hazırlanırken jele ilave edilir. Etidiyum bromür mutajendir. Mutlaka eldivenle çalışılmalı. 24 4
Elektroforezin Gıda Analizlerindeki Uygulamaları Gıda proteinlerinin çeşitli amaçlarla tayinlerinde elektroforez çok kullanılan bir analiz yöntemidir. Hemen hemen tüm gıdalarda elektroforez tekniği kullanılabilmektedir. Örneğin, buğday ve diğer tahıl ürünlerindeki protein fraksiyonları elektroforez ile izole edilip ayrılabilmektedir. Yine tahıllarda bulunan ve ekmek yapımında önemli bir yere sahip glutenin alt ünitelerinin yapısı, SDS-PAGE ile incelenebilmiştir. Elektroforez, çeşitli süt proteinlerinin ayrımında da kullanılmaktadır. Örneğin, başlıca proteini olan kazein, elektroforez işleminden önce ph 4.6 da asit ile çöktürülerek çeşitli fraksiyonlara ayrılmış Albümin ve laktoglobinlerin ise yine a, β, γ olarak alt gruplarının olduğu belirlenmiştir. Elektroforez bazı süt karışımlarının belirlenmesinde de etkili bir yoldur. Koyun ve inek sütlerinden yapılmış çeşitli peynirlerin belirlenmesinde de elektroforez tekniği kullanılmaktadır. Yumurta proteinleri elektroforezde karakteristik bant verirler. Bu yöntemle yumurta akının protein içeriği belirlenebilir. Etlerdeki yabancı et karışımları da belirlenebilmektedir. 25 26 Elektroforez, proteinlerin ve enzimlerin saflığının kontrolünde, Oligonükleititlerin analizinde, proteinlerin moleküler ağırlıklarının tespitinde, Proteinlerin izoelektrik ph larının belirlenmesinde, 27 Protein ve enzimlerin preparatif amaçlarla elde edilmesinde de kullanılır. 28 5