QuantiFERON -CMV İnsan Sitomegalovirüs peptit antijenlerine oluşan tepkileri ölçen tam kan İnterferon-gama testi Sadece in vitro laboratuar kullanımı için Prospektüs
İÇİNDEKİLER KULLANIM AMACI GİRİŞ Test prensibi Testin Yapılması için Gerekli Süre REAKTİFLER VE SAKLANMASI CMV ve Kontrol Antijen kan toplama tüpleri QuantiFERON ELISA bileşenleri Gerekli materyaller (fakat sağlanmayan) Saklama Talimatları Kan alma tüpleri ELISA kit reaktifler Çözülmüş ve Artan Reaktifler ÖNLEMLER NUMUNE TOPLAMA VE KULLANIMI KULLANIM TALİMATLARI BİRİNCİ AŞAMA Kanın inkübasyonu ve Plazmanın toplanması İKİNCİ AŞAMA İnsan IFN-γ QuantiFERON ELISA HESAPLAMA VE TESTİN YORUMLANMASI Standart Eğrinin Çizilmesi Testin kalite kontrolü Sonuçların yorumlanması SINIRLAMALAR TEKNİK BİLGİ Belirsiz Sonuçlar ELISA Sorun giderme Standartların Düşük Optik Yoğunluk Okumaları Spesifik Olmayan Renk Oluşumu/Yüksek Arka Plan Rengi Doğrusal Olmayan Standart Eğri ve Tekrarlama Değişkenliği Fibrin Pıhtılı Plazma Numuneleri BİBLİYOGRAFYA Transplantasyon HIV / AIDS TEKNİK SERVİS KISALTILMIŞ TEST PROSEDÜRÜ Adım 1 Kan inkübasyonu ve plazma toplama Adım 2 İnsan IFN-γ için QuantiFERON ELISA
KULLANIM AMACI QuantiFERON-CMV, heparinli tam kan içindeki hücrelerin, uyarıcı insan sitomegalovirüs (CMV) proteinlerinin peptit kokteyli ile uyarılmasını kullanan, bir in vitro teşhis testidir. Enzim Bağlı İmmün Absorbsiyon Testi (ELISA) ile interferon-γ (IFN-γ) tespiti, CMV enfeksiyonu ile ilgili olan bu peptit antijenlerine olan in vitro cevabın saptanması için kullanılır. Bu bağışıklık fonksiyon kaybı CMV hastalığının gelişimi ile ilişkili olabilir. QuantiFERON-CMV in kullanım amacı kişinin CMV hastalığa yakalanma riskine karşı anti-cmv bağışıklık seviyesini izlemek içindir. QuantiFERON-CMV, CMV enfeksiyonunu belirleyen bir test değildir ve CMV enfeksiyonu dışında kullanılmamalıdır. GİRİŞ CMV, yetişkinlerin 50-85% arasında enfekte olan bir herpes virüsüdür. Bu immunsupresyonun özellikle transplantasyon sonrası sık görülen bir komplikasyondur ve transplant alıcılarında önemli ölçüde hastalık oranı ve ölüm oranına katkıda bulunabilir. Nakledilen bir organın reddini önlemek için kullanılan mevcut immünsupresif terapilerin T-lenfositleri ve hücre-aracılı immün (CMI) tepkileri üzerine zararlı etkileri vardır ve nakil sonrası viral enfeksiyonlar için artmış duyarlılık ile sonuçlanır. Ayrıca, bastırılan CMV çoğaltmada T-hücre fonksiyonunun önemi CD8 + CMV-spesifik sitotoksik T-lenfositleri (CTLS) virüsü-ilişkili patojenlere karşı korunarak vurgulanır. İmmunosuppress olan hastalarda ve IFN-γ üretiminde CD8+ CMV-spesifik CTLlerin sayımı CMV hastalığa yakalanma riskini tahmin edebilir. IFN-γ üretimi CMV-spesifik CTLlerin tanımlanması için fonksiyonel bir vekil olabilir. QuantiFERON-CMV, CMV proteinlerinini simülasyonu olan peptit antijenlerine karşı CMI tepkisini ölçen bir testtir. CMV peptitler A1, A2, A3, A11, A23, A24, A26, B7, B8, B27, B35, B40, B41, B44, B51, B52, B57, B58, B60 ve insan popülasyonunun >98% kapsayan Cw6 (A30, B13) HLA Sınıf I haplotipler içeren CD8+ T-hücrelerini hedeflemek için tasarlanmıştır. CMV ile enfekte olmuş bireyler genellikle kanda antijenleri tanıyan CD8 + lenfositlere sahiptir. Bu tanıma süreci sitokinin, IFN-γ, üretimi ve salgısını içerir. IFN-γ in sonraki kantifikasyonu ve tespiti bu testin temelini oluşturur. Çalışmalar CMV peptitlere -QuantiFERON CMV ile ölçüldüğü gibi- karşı IFN-γ tepkileri arasındaki uyumun düzeyini göstermiştir ve anti-cmv seroloji bilgilerin % 97 si sağlıklı kişilerde bulunur. Tüm sero negatif bireyler QuantiFERON-CMV tarafından reaktif edilemedi ve 16/17 (94%) sero pozitif bireyler QuantiFERON-CMV tarafından reaktif edildi [1]. Benzer sonuçlar solid organ nakli [1,2] ve HIV enfekte hastalardan alınan örneklerin test edilmesi ile elde edilmiştir [3]. Bu bağışıklığın fonksiyon kaybı CMV hastalığı gelişimi ile ilişkili olduğu için QuantiFERON-CM, CMV hastalığa yakalanma riski olan kişilerde anti-cmv bağışıklık düzeyini seri olarak izlemek için kullanılmak üzere tasarlanmıştır [2]. Test prensibi QuantiFERON-CMV testi iki aşamada yapılır. İlk aşamada, her bir QuantiFERON-CMV kan alma tüplerine tam kan alınır. Bu tüpler, Nil Kontrol tüpü, CMV Antijen Tüpü ve opsiyonel Mitogen tüpüdür. Mitogen tüpü, QuantiFERON-CMV testinde bir pozitif kontrol olarak kullanılabilir. Bu tüp, özellikle kişinin bağışıklık durumu ile ilgili şüpheyi ortadan kaldırabilir. Tüpler, kan alımından sonraki 16 saat içinde, mümkün olduğunca çabuk 37 C de inkübe edilmelidir. 16 ila 24 saatlik inkübasyon periyodundan sonra, tüpler santrifüj edilir, plazma ayrılır ve QuantiFERON ELISA çalışmasıyla IFN-γ (IU/mL) miktarı ölçülür. CMV Antijen ve Mitogen tüplerinden alınan plazma numunelerinde IFN-γ in miktarı bireyler orta immunosüpresyon olsa bile çoğunlukla ELISA okuyucuların üst sınırı üzerinde olabilir. Kantitatif sonuçlar için, düzgün plazma için hesaplanan değerleri kullanın. IU/mL olan kantitatif sonuçlar için, plazma örnekleri Yeşil Dilüentte 1/10 oranında dilüe edilmelidir ve düzgün plazma ile birlikte ELISA da test edilmelidir. Not: QuantiFERON ELISA (yani 10 IU / ml e kadar) aralığı içinde örnekler için, düzgün plazma örneği ile elde edilen sonuç kullanılmalıdır. Bazı IFN-γ konsantrasyonları için, plazma örneklerinin 1 / 10 oranında dilüsyonu kullanılarak elde edilen değerler hatalı olabilir.
Bir test, Nil IFN-γ IU/mL değerinin önemli ölçüde üzerinde olan CMV Antijen tüpünde bir IFN-γ yanıtı için reaktif olarak kabul edilir. Mitogen tüpü kullanılmışsa, Mitogen tarafından uyarılmış plazma numunesi, test edilen her numunenin kendi IFN-γ poizitif kontrolü olur. Mitogen e karşı düşük cevap olması (<0.5 IU/mL), kan numunesinde de CMV antijenlerine karşı negatif bir cevap varken, şüpheli bir sonucu gösterir. Bu durum, yetersiz lenfosit olması, uygun olmayan numune alınması yüzünden azalmış lenfosit aktivitesi, Mitogen tüpünün hatalı doldurulması veya karıştırılması ya da hastanın lenfositlerinin IFN-γ salınımının yetersiz olması nedeniyle ortaya çıkar. Nil numunesi arka plan rengini, heterofil antikor etkilerini veya kan numunesindeki spesifik olmayan IFN-γ nın testteki düzeltmesini sağlar. Nil tüpünün IFN-γ seviyesi CMV antijen tüpünün ve Mitogen tüpünün IFN-γ seviyesinden çıkartılır. Testi gerçekleştirmek için gerekli zaman QuantiFERON-CMV testinin yapılması için gereken süre aşağıda hesaplanmıştır; çoklu numunelerin toplu çalışılma süresi ayrıca belirtilmiştir: Kan tüplerinin 37 C inkübasyonu: ELISA: 16 ila 24 saat Her bir ELISA plak için yaklaşık 3 saat 1 saatten daha az çalışma Her bir plak için 10 ila 15 dakika eklenir REAKTİF VE SAKLAMA CMV ve Kontrol Antijen kan toplama tüpleri (Tek Hasta Paket Katalog Numarası: 0192 0301) Nil Kontrol (Gri Kapak) CMV Antigen (Mavi kapak) Mitogen Kontrol (Pembe kapak) 1 tüp 1 tüp 1 tüp QuantiFERON ELISA bileşenleri (Katalog Numarası:0350 0201) Mikroplak stripleri İnsan IFN-γ Standard (liyofilize ) Mitogen Kontrol (Pembe kapak) Yeşil Dilüent Konjugate 100X Kons. (liyofilize) Yıkama tamponu 20X Kons. Enzim Substrat Solüsyonu Enzim Durdurma Solüsyonu 24 x 8 kuyu 1 x şişe 1 x 30 ml 1 x 30 ml 1 x 0.3 ml 1 x 100 ml 1 x 30 ml 1 x 15 ml Gerekli materyaller (fakat sağlanmayan) 37 C inkübatör. CO2 gerekli değil. 50μL ila 100μL dağıtım için kalibre edilmiş değiştirilebilir hacimli pipetler ve tek kullanımlık pipet uçları. 50μL ila 100μL dağıtım yapabilen kalibre edilmiş çok kanallı pipetler ve tek kullanımlık pipet uçları. Mikroplaka çalkalayıcı. Deiyonize veya distile su-2 L. Mikroplaka yıkayıcı (otomatik yıkayıcı önerilir). Mikroplaka okuyucu 450 nm filtre ve 620 nm ile 650 nm referans filtre ile fit edilmiştir.
Saklama Talimatları Kan Alma Tüpleri 4 C ile 25 C de kan alma tüplerini saklayın. ELISA Kit Reaktifleri Kit 2 C ile 8 C de saklayın. Direk güneş ışığından Enzim Substrat Solüsyonu her zaman koruyun. Çözünmüş ve Artan Reaktifler Reaktiflerin nasıl çözüleceği hakkındaki bilgiler için, lütfen sayfa 4 ve 5 de Aşama 2 Prosedüre (adım 3 ve 5) bakın. Çözülen Kit Standardı 2 C to 8 C de saklandığında, 3 aya kadar kullanılabilir. o Kit Standardının çözüldüğü tarihi not ediniz. Çözüldükten sonra, kullanılmayan Konjugat 100X Konsantre yi 2 C ile 8 C de saklanmalıdır ve 3 ay içinde kullanılmalıdır. o Konjugatın çözüldüğü tarihi not ediniz. Çalışma için hazırlanan Konjugat 6 saat içinde kullanılmalıdır. Çalışma için hazırlanan Yıkama Tamponu oda sıcaklığında 2 hafta saklanabilir. ÖNLEMLER Sadece in vitro laboratuar kullanımı içindir. Zararlı: Enzim Substrat Solüsyonu solunduğunda ve cilt ile temasında zararlı madde olan 3,3,5,5 tetrametilbenzidin içerir. Deri ve göz tahriş edicidir. Mutajendir. Potansiyel bir kanserojen kabul edildiği için göz koruyucu kullanın, eldiven takın. Zararlı: Enzim Durdurma Solüsyonu H 2 SO 4 içerir. Bu solüsyon göz ve deri temasında, solunduğunda ve yutulduğunda zararlıdır. Koruyucu gözlük kullanın, normal laboratuar koruyucu önlüklerinizi giyin ve eldiven takın. Eğer durdurucu solüsyon deri veya göze temas ederse, önce bol su ile yıkayın ve sonra tibbi yardım isteyin. Zararlı: IFN-γ Standard ve 100X Konjugate Konsantre eğer yutulursa rahatsız edici olabilir ve cilt tahrişine neden olabilir. Normal laboratuar koruyucu önlüklerinizi giyin ve eldiven takın. İnsan kanını potansiyel bulaşıcı olarak kullanın. Kanla çalışma kılavuzlarını inceleyin. Thimerosal bazı reaktiflerde koruyucu olarak kullanılır. Yutulduğunda, solunduğunda veya cilt teması olduğunda toksik olabilir. Yeşil Dilüent normal fare serumu ve alerjik tepkileri tetikleyen kazein içerir; deri ile temasından kaçının. Kit prospektüs işlemleri hatalı sonuçlar oluşturabilir. Lütfen kullanmadan önce talimatları dikkatle okuyun. Hasarlı veya akmış kit reaktiflerini kullanmayın. Farklı QuantiFERON ELISA kitlerinin reaktiflerini karıştırmayın ve birlikte kullanmayın. Artan reaktifleri ve biyolojik numuneleri Yerel, Ulusal ve Federal düzenlemelere göre imha edin. Kullanım tarihinden sonra QuantiFERON-CMV kan toplama tüplerini veya QuantiFERON ELISA kiti kullanmayın. NUMUNE TOPLAMA VE İŞLEME QuantiFERON-CMV aşağıdaki kan toplama tüplerini kullanır: Nil Kontrol (Gri kapak) CMV Antijen (Mavi kapak) Mitojen Kontrol (Pembe kapak)
Tüpler kullanım için oda sıcaklığında olmalıdır (17 C ile 27 C). Bu aralığın dışındaki sıcaklıklarda kullanım veya saklama hatalı sonuçlara neden olabilir. Antijenler kan alma tüplerinin iç yüzeyine yapıştırılmıştır, bu yüzden kan alımından sonra iyice çalkalanması çok önemlidir. Kan alımını takip eden 16 saat içinde, tüpler mümkün olduğunca çabuk 37 C lik inkübatöre transfer edilmelidir. En uygun sonuç için aşağıdaki prosedürü uygulayın: 1. Her hasta için, QuantiFERON-CMV kan alma tüplerinin içine doğrudan venepuncture tarafından1 ml kan toplayın. 1mL lik tüpler diğer tüplere göre biraz yavaş dolduğundan, tüp tamamen dolduğunda, yeterli hacmin tüpe alındığından emin olmak için, iğneyi 2-3 saniye tüpün içinde bekletiniz. Tüpün yanındaki siyah işaret, 1 ml dolum hacmini gösterir. QuantiFERON-CMVkan alma tüpleri, 0.8 ila 1.2 ml arasındaki hacimler için onaylanmıştır. Herhangi bir tüpte kan seviyesi belirteç çizgisine yakın değilse, başka bir kan numunesi alınması tavsiye edilir. QuantiFERON-CMV kan toplama tüpleri 810 metre rakıma kadar 0,8 ve 1,2 ml arasında çekmek için valide edilmiştir. Bu yükseklikten yukarıdaki kullanıcılara sağlar ki kan bu sınırlar içinde her tüpe çekilir. QuantiFERON-CMV kan alma tüpleri bu rakım aralıklarının dışında kullanılıyorsa veya tüpe alınan kan hacmi düşükse, kan bir şırınga kullanılarak alınabilir ve her üç tüpe de 1 er ml olarak dağıtılabilir. Emniyet nedeniyle, bu işlemi yaparken şırınga iğnesinin çıkarın, ilgili güvenlik prosedürlerini uygulayarak, üç QuantiFERON-CMV tüpünün de kapaklarını çıkarın ve her birine 1mL kan transfer edin (tüpün etiketinin yanındaki siyah işarete kadar). Kapakları dikkatlice kapatın ve aşağıda anlatıldığı gibi karıştırın. Kan alımı için kelebek iğne kullanılıyorsa, QuantiFERON-CMV tüpleri kullanılmadan önce, hortumun kanla dolduğundan emin olmak için, boş bir tüp kullanılmalıdır. 2.Tüpün tüm iç yüzeyinin kanla kaplı olmasını sağlamak için tüpleri 5 saniye (10x) sallayarak karıştırın. Tüplerdeki kan karıştıktan sonra köpürmesi beklenir. Kanda tüp içeriğinin tümüyle entegrasyonunu sağlamak için iyice karıştırma gereklidir. Daha fazla yardım için Cellestis web sitesindeki videoya bakın. Tüplerin aşırı enerjik sallanması kan içinde jel karışmasına ve jelin çıkarılmasına, potansiyel olarak hatalı sonuçlara neden olabilir ve kaçınılmalıdır. Bu etki 27 C yi aşan sıcaklıklarda çok belirgindir(81 F). 3. Uygun şekilde tüpleri etiketleyin. 4. Kan alımından sonra 16 saat içinde, tüpler mümkün olduğunca çabuk 37 C lik inkübatöre transfer edilebilmelidir. Kan örneklerini buzdolabına koymayın ve dondurmayın. KULLANIM İÇİN TALİMATLAR Birinci Aşama Kanın inkübasyonu ve plazmanın toplanması 1. Kan, alımından sonra hemen inkübe edilmeyecekse, Adım 2 te anlatıldığı gibi, tüplerin çalkalanması inkübasyondan hemen önce tekrarlanmalıdır. 2. Tüpleri, 37 C de 16 ila 24 saat dik olarak inkübe edin. İnkübatörün CO 2 içermesi veya nemli olması gerekli değildir. 3. Kan alma tüpleri, santrifüj işleminden önce, 2 C ila 27 C de 3 gün saklanabilir.
4. 37 C de tüplerin inkübasyonundan sonra, tüpler 15 dakika 2000 ila 3000 RCF (g) de santrifüj edilerek plazma ayrılır. Tüpteki jel, hücreleri plazmadan ayırır. Bu işlem olmazsa, tüpler daha yüksek bir hızda tekrar santrifüj edilmelidir. Santrifüj yapılmadan da plazmayı almak mümkündür, ancak hücresiz olarak plazmayı ayırmak için ekstra dikkat edilmesi gereklidir. 5. Plazma numuneleri, özellikle otomatik ELISA cihazları kullanılıyorsa, kan alma tüplerinden direk olarak QuantiFERON ELISA plağına yüklenebilir. 6. Alternatif olarak, plazma numuneleri, santrifüj edilmiş tüpler olarak veya plazması farklı bir tüpe ayrılarak, ELISA çalışmasından önce saklanabilir. Örneğin, numuneler saklanacaksa, 150μL den fazla plazma mikroplak kuyularına veya 96 kuyulu mikrotüplere ayrılabilir, dökülmesini ve buharlaşmasını önlemek için üstü uygun şekilde kapatılır. Plazma numuneleri, 2 C ila 8 C de 4 hafta, 20 C de (tercihen 70 C den düşük) daha uzun süre için saklanabilir. İkinci Aşama - İnsan IFN-γ QuantiFERON ELISA 1. Tüm plazma numuneleri ve reaktifler, Konjugat 100X Konsantre hariç, kullanmadan önce oda sıcaklığına (17 C ile 27 C) getirilmelidir. Oda sıcaklığında en az 60 dakika bekletilmelidir. 2. Kullanılmayacak stripleri plak çerçevesinden çıkarın, ambalajına geri koyup sıkıca kapatın ve buzdolabına geri koyun. En az bir strip QuantiFERON ELISA Standartları için ve test edilecek numuneler için gereken miktarda strip bulundurun. Kullanımdan sonra, kalan striplerin kullanımı için plak çerçevesini ve kapağı saklayınız. 3. Dondurularak kurutulmuş Kit Standardını, Standart şişesinin etiketinde belirtilen miktarda deiyonize veya distile su ile çözünüz. Köpürmesini azaltmak ve belirtilen hacimde Standardın çözülmesi ile 8.0 IU/mL konsantrasyonunda solüsyon elde edilir. 4. Standart eğri Kit standardın 3 dilüsyonu ve Standart 4 olarak sadece Yeşil Dilüsyon kullanılarak hazırlandı (0 IU/mL). Yeşil Dilüent kullanarak dilüe edin. Standartlar en az çift olarak çalışılmalıdır: a. 4 tüpe S1, S2, S3, S4 yazın. b. S1, S2, S3, S4 e 150µL GD ekleyin. c. S1 e 150µL Kit Standardı koyun ve iyice karıştırın. d. S1 den 50µL alıp S2 ye koyun ve iyice karıştırın. e. S2 den 50µL alıp S3 e koyun ve iyice karıştırın. f. GD tek başına sıfırlık standart olacaktır (S4).,
ŞEKİL 1. 3-nokta Standart eğrisinin Hazırlanışı Her ELISA çalışmasında Kit Standardının dilüsyonlarını taze olarak hazırlayınız. 5. Dondurularak kurutulmuş Konjugat 100X Konsantre yi 0.3 ml deiyonize veya distile su ile çözünüz. Köpürmesini azaltmak ve Konjugat ın tamamen çözündüğünden emin olmak için, hafifçe karıştırınız. 6. Çalışma Konjugatı, çözülen Konjugat 100X Konsantre nin gereken miktarda Yeşil Dilüent ile dilüe edilmesiyle hazırlanır, hazırlama miktarları için Tablo 1 Konjugat Hazırlanışı na bakınız. Köpürmeyi engellemek için iyice ama kibarca karıştırınız. Kullanımdan hemen sonra, kalan Konjugat 100X Konsantre yi 2 C to 8 C ye kaldırınız. Sadece Yeşil Dilüent kullanınız. TABLO 1. Konjugat Hazırlanışı STRİP SAYISI KONJUGAT 100X KONSANTRE HACMİ YEŞİL DİLÜENT HACMİ 2 10 μl 1.0 ml 3 15 μl 1.5 ml 4 20 μl 2.0 ml 5 25 μl 2.5 ml 6 30 μl 3.0 ml 7 35 μl 3.5 ml 8 40 μl 4.0 ml 9 45 μl 4.5 ml 10 50 μl 5.0 ml 11 55 μl 5.5 ml 12 60 μl 6.0 ml
7. Teste başlamadan önce, IFN-γ tüm numune içinde eşit dağıldığından emin olmak için, plazmalar çalkalanmalıdır. Ayrıca, eğer kantitatif sonuçlar gerekliyse, Yeşil Diluentte CMV ve Mitogen plazmalar 1/10 oranında dilüe edin. Nil plazma dilüe edilmelidir. Aşağıdaki numuneler test edilmelidir: Nil, CMV Antigen, Mitogen, CMV Antigen (1/10), Mitogen (1/10) Ancak aşağıdaki örnek hasta seçenekleri QuantiFERON-CMV analiz yazılımı tarafından desteklenir: Nil, CMV Antigen, Mitogen Nil, CMV Antigen (1/10), Mitogen (1/10) Nil, CMV Antigen, Mitogen, CMV Antigen (1/10) Nil, CMV Antigen (1/10), Mitogen 8. Kullanılan tüm ELISA kuyularına, çok kanallı pipet kullanarak, taze hazırlanmış çalışma konjugatından 50µL ekleyiniz. 9. Çok kanallı pipet kullanarak, uygun kuyulara 50µL plazma numunelerini pipetleyin. En son olarak her Standarttan 50µL pipetleyin. 10. Mikroplak çalkalayıcı kullanarak, 1 dakika konjugat ve plazma numuneleri/standartları iyice karıştırınız. 11. Her plağı kapak ile kapatın ve oda sıcaklığında (17 C ile 27 C) 120 ± 5 dakika inkübe edin. İnkübasyon sırasında plaklar direk güneş ışığına maruz kalmamalıdır. 12. İnkübasyon sırasında, bir birim Wash Buffer 20X Konsantreyi 19 birim deiyonize veya distile su ile dilüe edin ve iyice karıştırın. Mevcut Wash Buffer 20X Konsantre, 2L yıkama solüsyonu hazırlamak için yeterlidir. İnkübasyondan sonra kuyuları 400µL yıkama solüsyonu ile en az 6 kez yıkayınız. Otomatik bir plak yıkayıcı kullanılması tavsiye edilir. Testin performansı için düzgün bir yıkama yapılması çok önemlidir. Her kuyunun, her yıkama aşamasında, yıkama solüsyonu ile tamamen dolu olduğundan emin olun. Her yıkama adımı arasında en az 5 saniye bekleme periyodu (soak) olması tavsiye edilir. Atık kabına standart laboratuar dezenfenktantı eklenmelidir ve potansiyel enfektif materyallerinin dekontaminasyonu için gerekli prosedürler uygulanmalıdır. 13. Plakları ters çevirip, kalan yıkama solüsyonunu kuyulardan uzaklaştırmak için kağıt havlu üzerine vurun. Her kuyuya 100µL Enzim Substrat Solüsyonundan ekleyin ve bir mikroplak çalkalayıcı kullanarak iyice karıştırın. 14. Her plağı kapak ile kapatın ve oda sıcaklığında (17 C ile 27 C) 30 dakika inkübe edin. İnkübasyon sırasında plaklar direk güneş ışığına maruz kalmamalıdır. 15. 30 dakikalık inkübasyonu takiben, her kuyuya 50L Enzim Durdurma Solüsyonu ekleyin ve karıştırın. Enzime Durdurma Solüsyonununun kuyulara pipetlenmesi, 13. adımdaki substrat dağıtımındaki aynı sırayla ve yaklaşık olarak aynı hızda olmalıdır. 16. Bir mikroplak okuyucu kullanarak, 450nm ana dalga boyunda ve 620nm ila 650nm arasında bir referans dalgaboyunu kullanarak durdurma solüsyonunun eklenmesinden sonraki 5 dakika içinde her bir kuyunun Optik Dansitesini (OD) ölçün. OD değerleri sonuçların hesaplanmasında kullanılır.
HESAPLAMA VE TESTİN YORUMLANMASI Ham verilerin analizinde kullanılan ve sonuçları hesaplayan, QuantiFERON-CMV Analiz Yazılımı, Cellestis tarafından hazırlanmıştır. Yazılım, testin Kalite Kontrol değerlendirmesini, standart eğrinin çizilmesini ve Sonuçların Yorumlanması bölümünde anlatılan, her numunenin test sonuçlarının hesaplanmasını gerçekleştirir. QuantiFERON-CMV Yazılımını kullanmak yerine, sonuçlar aşağıdaki metoda göre hesaplanabilir: Standart Eğrinin Çizilmesi Her plaktaki Kit Standardı tekrarlamalarından ortalama OD değerlerini hesaplayın. IU/ml olarak, standartların IFN-γ konsantrasyonlarının log (e) sine karşı (x-ekseni), ortalama OD lerin log (e) si (y-ekseni) ile bir log (e) -log (e) standart eğrisi çiziniz, bu hesaplamalara sıfırlık standardı katmayınız. Standart eğrinin en iyi çizimini regresyon analizi hesaplayınız. Numunelerin OD değerlerini kullanarak, her bir test plazma numunesinin IFN-γ konsantrasyonu (IU/mL) belirlemek için standart eğriyi kullanın. Kantitatif sonuçları, plazmayı hesaplamak için kullanın. ELISA, 10 IU/mL içeren plazma örnekleri için doğrudur. Bu hesaplamalar, mikroplak okuyucularla gelen yazılımları, standart hesaplama programları veya istatistik yazılımları (Microsoft Excel gibi) ile de yapılabilir. Bu paketlerin, regresyon analizinin, standartların değişim katsayısının (%CV) ve satndart eğrinin doğruluk katsayısının (r) hesaplanmasında kullanılması tavsiye edilir. Testin Kalite Kontrolü Test sonucunun kesinliği, doğru bir standart eğrinin oluşturulmasına bağlıdır. Bu yüzden, standartlardan ortaya çıkan sonuçlar, numune sonuçları yorumlanmadan önce gözden geçirilmelidir. ELISA nın geçerli olması için: Standart 1 in ortalama OD değeri 0.600 olmalıdır. Standart 1 ve Standart 2 nin tekrarlarının OD değerleri arasındaki %CV 15% olmalıdır. Standart 3 ve Standart 4 ün(yeşil Dilüent) tekrarlamalarının OD değerleri, ortalamaları arasında 0.040 optik dansite değerinden fazla farklılık göstermemelidir. Standartların ortalama absorbans değerlerinden hesaplanan doğruluk katsayısı (r) 0.98 olmalıdır. Çalışma sonunda yukarıdaki kriterler uymuyorsa, çalışma geçersiz kabul edilmeli ve tekrarlanmalıdır. Sıfır Standardının (Yeşil Dilüent) ortalama OD değeri 0.150 olmalıdır. Eğer bu OD değeri > 0.150 ise plak yıkama prosedürü gözden geçirilmelidir. Sonuçların Yorumlanması QuantiFERON-CMV sonuçları aşağıdaki kriterler kullanılarak yorumlanır:
1 CMV Antijen ve Mitogen pozitif kontrole oluşan IFN-γ cevap, genellikle mikroplak okuyucuların okuma aralığının dışında olabilir. Bu durum test sonuçlarına herhangi bir etki oluşturulmaz. 2 Muhtemel sebepler için Problem Çözme bölümüne bakınız. SINIRLAMALAR QuantiFERON-CMV test sonuçları, her bireyin kendi epidemiyolojik geçmişi, mevcut medikal durumu ve diğer teşhis değerlendirmelerinin bir birleşimi ile birlikte kullanılmalıdır. Emin olunmayan veya şüpheli sonuçlar aşağıdaki sebepler nedeniyle olabilir: Paket Prospektüsünde anlatılan prosedürün tam uygulanmaması, Nil tüpteki IFN-γ seviyesinin aşırı yüksek olması, Kan numunelerinin 37 C deki inkübasyonunun 16 saatten fazla olması. TEKNİK BİLGİ Şüpheli Sonuçlar Şüpheli sonuçlar nadir olarak olabilir ve testi yapılan kişinin immün durumundan kaynaklanabilir, ancak birçok teknik faktörden de kaynaklanmış olabilir: 37 C deki kanın inkübasyonunun 16 saatten fazla olması Kanın tavsiye edilen sıcaklık aralığının (17 C ile 27 C) dışında bekletilmesi Kan alma tüplerinin yeterli olarak karıştırılmaması Kan numunelerinin alımı, kullanımı ile ilgili bir teknik sorundan şüpheleniliyorsa, tüm QuantiFERON-CMV testini yeni kan numunesi ile tekrarlayınız. Yetersiz yıkama veya diğer prosedürdeki sapmalardan şüpheleniliyorsa, Uyarılmış plazmalar ile ELISA testinin tekrarlanması yapılmalıdır. Şüpheli test sonuçları, ELISA testinde bir hata olmadığında, tekrarlanmasına gerek yoktur. Standartların Düşük Optik Yoğunluk Okumaları MUHTEMEL NEDEN Standartların dilüsyon hatası. Pipetleme hatası. ÇÖZÜM Kit standardının prospektüste anlatıldığı şekilde hazırlandığından emin olun. Pipetlerin üreticilerinin belirttiği gibi kalibre edildiğinden emin olun.
İnkübasyon sıcaklığının çok düşük olması. İnkübasyon süresinin çok kısa olması. Hatalı plak okuyucu filtresi kullanılması. Reaktiflerin çok soğuk olması. Kit / Reaktiflerin son kullanma tarihinin geçmesi. ELISA nın inkübasyonu oda sıcaklığında, 17 C ila 27 C yapılmalıdır. Plağın konjugat, standartlar ve numuneler ile inkübasyonu 120 ± 5 dakika olmalıdır. Enzim Substrat Solüsyonu plakta 30 dakika inkübe edilmelidir. Plak ana filtre olarak 450nm de, referans filtre olarak da 620 ila 650nm arasında okunmalıdır. Konjugat 100X Konsantre hariç, tüm reaktifler, All reagents, with the exception of the Konjugat 100X Concentrate, mutlaka teste başlamadan önce oda sıcaklığına getirilmelidir. Bu işlem yaklaşık bir saat sürer. Kullanılan kitin son kullanma tarihinin geçmediğinden emin olun. Çözülen Standardın ve Konjugat 100X Konsantrenin çözüldüğü tarihten sonraki 3 ay için kullanıldığından emin olun. Spesifik olmayan Renk Oluşumu/Yüksek Arka Plan Rengi MUHTEMEL NEDEN Yetersiz plak yıkaması. ELISA kuyularının birbirine kontaminasyonu. İnkübasyon sıcaklığının çok yüksek olması. Kit / Reaktiflerin son kullanma tarihinin geçmesi. Enzim Substrat Solüsyonunun kontamine olması. ÇÖZÜM Plağı en az 6 kez 400µL/kuyu yıkama solüsyonu ile yıkayınız. Kullanılan yıkayıcıya bağlı olarak 6 yıkamadan fazlası gerekli olabilir. Yıkama adımları arası bekleme (soak) süresi en az 5 saniye olmalıdır. Pipetleme veya numunelerin çalkalanması sırasında riski azaltmak için dikkat edin. ELISA nın inkübasyonu oda sıcaklığında, 17 C ila 27 C yapılmalıdır. Kullanılan kitin son kullanma tarihinin geçmediğinden emin olun. Çözülen Standardın ve Konjugat 100X Konsantrenin çözüldüğü tarihten sonraki 3 ay için kullanıldığından emin olun. Mavi renklenme mevcutsa substratı kullanmayın. Temiz reaktif kapları kullanıldığından emin olun. Doğrusal Olmayan Standart Eğri ve Tekrarlama Değişkenliği MUHTEMEL NEDEN Yetersiz plak yıkaması. Standartların dilüsyon hatası. Yetersiz karıştırma. ÇÖZÜM Plağı en az 6 kez 400µL/kuyu yıkama solüsyonu ile yıkayınız. Kullanılan yıkayıcıya bağlı olarak 6 yıkamadan fazlası gerekli olabilir. Yıkama adımları arası bekleme (soak) süresi en az 5 saniye olmalıdır. Kit standardının prospektüste anlatıldığı şekilde hazırlandığından emin olun. Plağa pipetlemeden önce, reaktifleri alt üst yaparak veya vorteksleyerek iyice karıştırın.
Değişken pipetleme tekniği veya testin yapılışı sırasında ara verilmesi. Numune ve standartların eklenmesi, ara vermeden yapılmalıdır. Tüm reaktifler teste başlamadan önce hazırlanmalıdır. Fibrin Pıhtılı Plazma Numuneleri MUHTEMEL NEDEN Plazma numunelerinin uzun süreli saklanması fibrin oluşumuna neden olabilir. ÇÖZÜM Pıhtının çökelmesi ve plazmanın pipetlenmesini kolaylaştırmak için numuneyi santrifüj ediniz. BİBLİYOGRAFYAHY Transplantasyon 1. Walker S, Fazou C, Crough T, Holdsworth R, Kiely P, Veale M, Bell S, Gailbraith A, McNeil K, Jones S, Khanna R. Ex vivo monitoring of human cytomegalovirus-specific CD8+ T-cell responses using QuantiFERON -CMV. Transpl Infect Dis 9, 165-70 (2007). 2. Westall GP, Mifsud N, Kotsimbos T. Linking CMV serostatus to episodes of CMV reactivation following lung transplantation by measuring CMV-specific CD8+ T cell immunity. Am J Transplant 8, 1749-54 (2008). 3. Kumar D, Chernenko S, Preiksaitis J, Moussa G, Cobos I, Manuel O, Fenton J, Venkataraman S, Humar A. Cellmediated immunity to predict Cytomegalovirus disease in high-risk solid organ transplant recipients. Am J Transplant 9, 1214-22 (2009). 4. Danziger-Isakov L, Heeger PS. Clinical utility of measuring T-cell immunity to CMV in transplant recipients. Am J Transplant 9, 987-8 (2009). HIV/AIDS 5. Singh KP, Howard JL, Wild SP, Jones SL, Hoy J, Lewin SR. Human cytomegalovirus (HCMV)-specific CD8+ T-cell responses are reduced in HIV-infected individuals with a history of HCMV disease despite CD4+ T-cell recovery. Clin Immunol 124, 200-6 (2007). TEKNİK SERVİS Teknik servis için lütfen şunlara başvurun: Cellestis International Pty Ltd: Phone: +61 3 9571 3500 Fax: +61 3 9571 3544 Email: quantiferon@cellestis.com Website: www.cellestis.com Cellestis GmbH: Phone: +49 6151 428 59-0 (Avrupa) Fax: +49 6151 428 59-110 Email: europe@cellestis.com
KISALTILMIŞ TEST PROSEDÜRÜ AŞAMA 1 Kan inkübasyonu ve plazma toplama 1. Hastanın kanını kan alma tüplerine alın ve tüpleri 5 saniye (veya 10 kez) şiddetlice çalkalayınız. 2. Tüpleri dik olarak 37 C de 16 ila 24 saat inkübe edin. 3. İnkübasyondan sonra, plazma ve eritrositlerin ayrılması için 5 ila 15 dakika, 2000 ila 3000g RCF de santrifüj edin. 4. Santifüjden sonra, IFN-γ ölçümü için plazma numunelerini ayırın.
AŞAMA 2 IFN-γ QuantiFERON ELISA 1. Konjugat 100X Konsantre hariç, ELISA reaktiflerini çalışma sıcaklığına getirmek için, oda sıcaklığında en az 60 dakika bekletin. 2. Kit standardını distile veya deiyonize su ile çözün. Standartları hazırlayın. 3. Dondurularak kurutulmuş Konjugat 100X Konsantre yi distile veya deiyonize su ile çözün. 4. Çalışma konjugatını Yeşil Dilüent ile hazırlayın ve her kuyuya 50μL pipetleyin. 5. İlgili kuyulara 50µL plazma numunelerini ve 50µL standartları pipetleyin. Çalkalayıcı kullanarak karıştırın. 6. Oda sıcaklığında 120 dakika inkübe edin. 7. 400µL/kuyu olacak şekilde yıkama solüsyonu ile en az 6 kez yıkayın. 8. Kuyulara 100µL Enzim Substrat Solüsyonu pipetleyin. Çalkalayıcı kullanarak karıştırın.
9. Oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edin. 10. Tüm kuyulara 50µL Stop Solüsyonu ekleyin. Çalkalayıcı kullanarak karıştırın. 11. Plağı 450nm ana filtre ve 620 ila 650nm referans filtre kullanarak okuyun. 12. Sonuçları hesaplayın. Üretici Cellestis Limited (Australia) and Cellestis GmbH (Europe) Level 1, Office Tower 2, Chadstone Centre, 1341 Dandenong Road, Chadstone, Victoria, 3148, Australia Tel: (Aust) +61 3 8527 3500, (Europe) +49 6151 428 59 0 E-mail: quantiferon@cellestis.com Website: www.cellestis.com Doc. No. 01925002D December 2009