ELISA Dr. Serkan SAYINER - serkan.sayiner@neu.edu.tr
ELISA nedir? Enzim bağlı konjugat ve enzim spesifik substrat kullanılarak, antijen-antikor reaksiyonlarının renk değişimi olarak elde edilmesi ve bunun kantitatif olarak gösterilmesi ile biyolojik sıvılardaki aranan maddelerin varlığı ve konsantrasyonu tayin edilebilir. Bu mantık üzerinden çalışılan metotlara ELISA denir.
ELISA nedir? Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Çalışma Prensibi; 1. Enzimle işaretli antijen yada antikorun, 2. Serbest antijen yada antikor ile reaksiyona girmesi ve, 3. Oluşan antijen-antikor kompleksinin enzim aktivitesinin, 4. Enzime spesifik bir substrat varlığında ortaya konulması esasına dayanır. Kantitatif bir yöntemdir. Yarı-kantitatif rapid ELISA da vardır.
ELISA nedir? Bu teknik ile çok düşük konsantrasyondaki maddeler kendilerine karşı elde edilen antijen veya antikorlar kullanılarak yüksek spesifite ile tespit edilebilir. Peptid veya proteinler Hormonlar Vitaminler İlaçlar Bir antikorun, spesifik olduğu antijen dışında farklı bir moleküle bağlanması hemen hemen imkansızdır.
ELISA nedir? Dolayısı ile; Antijen kullanarak, antikorunun varlığı ve miktarı, Antikor kullanarak, antijeninin varlığı ve miktarını gösterebiliriz. Antijen-antikor reaksiyonlarını enzimler kullanarak gösteren tüm teknik ve metodlara genel olarak enzim immunotestler denir.
ELISA tarihi Peter Perlmann ve Eva Engvall İsveçli bilim insanları. 1971 yılında ELISA ilk yayını. RIA yı modifiye etmişler. Spefisik proteinlerin ve diğer immunojenlerin tespiti için antikorların kullanılabileceği esasında çalışmalarını geliştirip ELISA direkt ELISA metodunu yayınlamışlar.
ELISA nasıl çalışır? ELISA da kullanılan antijen katı faza bağlıdır. Katı faz olarak polistern, polivinil ve polipropilen tüpler veya mikroplakalar kullanılır. Bu tüpler antijen ve antikoru uygun şekilde adsorbe etmeye elverişli olmalıdır ve diğer fazlardaki maddeleri adsorbe etmemelidir.
ELISA nasıl çalışır? ELISA da kullanılan enzimler; Beta-galaktosidaz, glikoz oksidaz, peroksidaz, alkalin fosfataz, biotin Horseradish peroksidaz ELISA da kullanılan substratlar; P-nitro-fenil fosfat, tetrametilbenzidin (TMB), 5-amino salisilik asit Enzimlerin katabolik etkileri, immunolojik reaksiyonların ivmesi ve spesifitesini belirler.
ELISA nasıl çalışır? Enzim-substrat reaksiyonları genelde 30-60 dakika sürer. Daha kısa da sürebilir. Ör. 10-15 dakika. Enzim substrat reaksiyonu NaOH, HCl ve H 2 SO 4 kullanılarak sonlandırılır. Oluşan rengin absorbansı genelde 400-600 nm dalga boyunda spektrofotometrede okutulur. Dalga boyu kullanılan konjugatın karakteristiğine bağlıdır.
ELISA Çeşitleri 1. Homojen Enzimatik İmmunoassay Enzim antikora bağlandığı anda inaktif olur. Antijen veya ortamda bulunan ve reaksiyoa girmeyen maddelerin atılımı yoktur. Diğer bir ifade ile yıkama basamağı yoktur. Özel kullanım içindir. Genelde küçük miktarlarda bulunan terapötik ilaçların ölçümünde kullanılır. Uygulanması kolay ama pahalı metodlardır. Sensitivitesi düşüktür.
ELISA Çeşitleri 2. Heterojen Enzimatik İmmunoassay Spesifik antikor ve çözünür antijen tespiti içindaha çok kullanılır. Ölçülen maddelerin farklı yapısı ve karakteristiği nedeniyle farklı alt tipleri vardır. Antijen ve antikor bağlanmasını takiben ortamda bulunan herhangi bir molekülün interferans yaratmasını engellemek için yıkama işlemi yapılır. Antijen-antikor kompleksi tüpün duvarına (katı faz) bağlıdır. Bunun dışında kalanlar yıkama ile uzaklaştırılır. Sensitivitesi yüksektir.
ELISA ÇEŞİTLERİ HOMOJEN HETEROJEN DİREKT ELISA İNDİREKT ELISA Sandviç ELISA Kompetitif ELISA
Direkt ELISA İlk geliştirilen ve diğerlerinin öncüsü olan tekniktir. Yüksek molekül ağırlıklı antijenlerin tespit edilmesi için uygundur. Adımları; Katı faz (Plate), direkt aranan antijen veya antikor ile kaplanır. Enzim işaretli antijen veya antikor eklenir ve ölçüm mümkün kılınır. İnkübasyon sonrası bağlanmayan antijen veya antikorlar ortamdan yıkama işlemi ile uzaklaştırılır. Daha sonra uygun substrat eklenir ve renk değişimi üzerinden ölçüm yapılarak antijen veya antikor miktarı belirlenir. Oluşan rengin absorbans şiddeti ile konsantrasyon doğru orantılıdır.
Direkt ELISA 2 4 1 3 5 6
İndirekt ELISA (ielisa) Antikor konsantrasyonu ölçümü için kullanılır. Katı faz (plate) antijen ile kaplıdır. Test edilecek örnek eklenir ve antijen-antikor kompleksi oluşur. Daha sonra test edilecek antikora karşı elde edilmiş ikinci bir antikor (enzimle işaretli konjugat) eklenir. Enzime spesifik substrat eklenmesi ile oluşan rengin absorbansı ölçülmek suretiyle miktar tayini yapılır. Oluşan rengin absorbans şiddeti ile konsantrasyon doğru orantılıdır. Endokrinolojide çok sık kullanılır. Ör. Canine TSH.
İndirekt ELISA 2 4 1 3 5 6
Sandviç ELISA Teknikde iki antikor kullanılır. 1. Katı faz yakalama antikoru (capture antibody) ile kaplı ve blokedir. 2. Enzim işaretli antikordur (konjugat). Sandviç ELISA teknikleri diğerlerine göre 2-5 kat daha duyarlıdır. Adımlar; Örnek eklenir ve içindeki antijenin bağlanması için inkübe edilir. Daha sonra yıkanarak bağlanmayanlar uzaklaştırılır. Enzim ile işaretli ikinci antikor (konjugat) eklenir ve antijen-antikor kompleksine bağlanır. Bu noktada sandviç şekillenir. Yıkama yapılır ve substrat eklenir. Reaksiyon durdurulur ve oluşan rengin şiddeti ölçülerek miktar tayini yapılır. Oluşan rengin absorbans şiddeti ile konsantrasyon doğru orantılıdır.
Sandviç ELISA 2 4 1 3 5 6
Modifiye Sandviç ELISA Teknikde üç antikor kullanılır. 1. Katı faz yakalama antikoru (capture antibody) ile kaplı ve blokedir. 2. Primer antikor enzimle işaretli değildir (örnek serumda da olabilir). 3. Sekunder antikor enzimle işaretlidir ve ikinci antikora karşı elde edilmiştir (konjugat/detection antibody). Katı faz ve ikinci antikorlar farklı hayvanlardan elde edilmelidir ki üçüncü antikor katı fazdaki antikora bağlanmasın. Oluşan rengin absorbans şiddeti ile konsantrasyon doğru orantılıdır.
Modifiye Sandviç ELISA 2 4 6 1 3 5 7 8
Kompetitif ELISA (celisa) Bu teknikde katı faz antijen spesifik antikor veya antikor spesifik antijen ile kaplıdır. Ölçüm yapılacak örnek ve enzim işaretli antijen veya antikor simültane olarak ortama eklenir. Böylece birbirileri ile katı fazdaki antijen/antikora bağlanmak için yarışmaya girerler. Yıkamadan sonra enzime spesifik substrat eklenir ve elde edilen rengin absorbansı reaksiyon durdurulduktan sonra okunur. Oluşan rengin absorbans şiddeti ile konsantrasyon ters orantılıdır.
Kompetitif ELISA (celisa) 2 4 1 3 5 6
ELISA nın Genel Adımları 1. Kit İçerik ve Analiz Talimatı Kontrolü
ELISA nın Genel Adımları
ELISA nın Genel Adımları
ELISA nın Genel Adımları
ELISA nın Genel Adımları 2. Personel Yeterliliği
ELISA nın Genel Adımları 3. Gerekli Cihaz ve Sarf Malzemeler
ELISA nın Genel Adımları
ELISA nın Genel Adımları
ELISA nın Genel Adımları
ELISA nın Genel Adımları
ELISA nın Genel Adımları 4. Kullanılan Reaktifler, Hazırlanış ve Muhafaza Koşulları
ELISA nın Genel Adımları 5. Örnek Bilgisi ve Muhafa Koşulları
ELISA nın Genel Adımları 6. Kalite Kontrol Serumunun Hazırlanması???
ELISA nın Genel Adımları 7. Dikkat edilmesi gereken noktalar Tüm biyolojik materyallerin potansiyel enfeksiyon kaynağı olduğu unutulmamalıdır. Örnek ve reaktifler ile çalışırken koruyucu eldiven, giysi, göz ve yüz koruyucu kullanılmalıdır. Ek bilgiler için MSDS (Materyal Güvenlik Sertifikası) okunmalıdır. TMB substat reaktifi direk ışığa veya oksidan ajanlara maruz kalmamalıdır. Kit reaktifleri kontamine edilmemelidir.
ELISA nın Genel Adımları 8. Analiz Prosedürü Değişken olmakla birlikte aşağıdaki adımları içerir. 1. Çalışma öncesi Mikroplaka, Reaktifler ve örneklerin oda sıcaklığına getirilmesi. 2. Kalibratör, Örnek ve Kontrol Serumlarının önceden belirlenen kuyucuklara pipetlenmesi. 3. Konjugatın eklenmesi ve inkübasyon (Süreler önemli). 4. Yıkama ve sonrasında substratın eklenmesi. 5. İnkübasyon ve reaksiyonun durdurulması. 6. Oluşan rengin absorbansının belirli dalga boyunda spektrofotometrede okutulması ve nicel sonuçların elde edilmesi. Okutma genel olarak 10 dakika içinde yapılmalıdır.
ELISA nın Genel Adımları 9. Hesaplama ve Analiz Sonucunun Değerlendirilmesi Manuel (Grafik kağıdı veya excel, numbers, calc gibi yazılımlar ile) Otomatik (Cihaz üzerinden-on board veya bilgisayar yazılımı üzerinden)
ELISA nın Genel Adımları
ELISA nın Genel Adımları **Kalite Kontrol** PC, NC, Kalite Kontrol Serumu, Analiz Sertifikası...
Performans Verileri Kalite Kontrol Spesifite, sensitivite Doğruluk Kesinlik: Tekrarlanabilirlik (inter-assay, intra-assay) ve Uyarlık Gerçeklik/Bias Linearite LOD (Limit of detection) LOQ (Limit of quantification) Recovery (Geri kazanım)
Analitik hata kaynakları Analit, hayvan türü ve metod uyumu. Performans kriterleri dışına çıkmak Personel hatası veya yetersizliği Ekipman arıza veya fonksiyon bozulması Reaktif ve kimyasal malzemelerin bozulması, kontamine olması Hatalı veya yetersiz yıkama Hatalı örnek alımı ve muhafazası
SORULARINIZ?
Kaynaklar Aydin S. (2015). A short history, principles, and types of ELISA, and our laboratory experience with peptide/protein analyses using ELISA. Peptides, 72: 4-15 IDEXX. ELISA Technical Guide. İnternet Erişim: https://www.idexx.com/pdf/en_us/livestock-poultry/elisa-technical-guide.pdf Erişim Tarihi: 30.03.2016 Karagül H, Altıntaş A, Fidancı UR, Sel T, 2000. Klinik Biyokimya. Medisan, Ankara Thermo Scientific. ELISA technical guide and protocols. İnternet Erişim: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/tr0065-elisaguide.pdf Erişim Tarihi: 30.03.2016