ÖZEL EGE LİSESİ İZMİR, ÇAMALTI TUZLASI NDAN İZOLE EDİLEN EKSTREM HALOFİLİK MİKROORGANİZMALARIN HÜCRE DIŞI PROTEAZ AKTİVİTELERİNİN ARAŞTIRILMASI HAZIRLAYAN ÖĞRENCİLER: Egem ERASLAN Kemal AKSOY DANIŞMAN ÖĞRETMEN: Mesut ESEN 2007 İZMİR 1
Projenin Adı: İZMİR, ÇAMALTI TUZLASI NDAN İZOLE EDİLEN EKSTREM HALOFİLİK MİKROORGANİZMALARIN HÜCRE DIŞI PROTEAZ AKTİVİTELERİNİN ARAŞTIRILMASI. Projenin Amacı: Bu araştırmada Türkiye nin en büyük kıyısal deniz tuzlası olan Çamaltı Tuzlası ndan alınan tuzlu toprak örneklerinden ekstrem halofilik mikroorganizma izolasyonu ve elde edilen izolatlardan hücre dışı proteaz enziminin varlığının ortaya konması ve bu proteaz enziminin aktivitesinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Giriş: Son yıllarda yapılan çalışmalar mikrobiyal yaşamın spesifik çevrelerle sınırlı olmadığını, mikrobiyal komünitelerin yüksek sıcaklık, yüksek tuz, düşük sıcaklık, asidik ve alkali ph, yüksek basınç gibi ekstrem olarak tabir edilen çevrelerde de bulunabileceğini ortaya koymuştur. Bu ekstrem çevrelerde yaşayan mikroorganizmalar ekstremofiller olarak adlandırılırlar (Van den Burg, 2003). Ekstremofilik mikroorganizmaların, yüksek tuz konsantrasyonlarında yaşayan üyeleri olan halofiller, filogenetik ağacın üç domaininde de (Bacteria, Archaea, Eukarya) yer almaktadır (Horikoshi and Grant, 1998). Halofiller Kushner e göre (1978, 1993); halofilik olmayanlar (0-1M NaCl), az halofiller (0,2-2,0M NaCl), ılımlı halofiller (0,4-3,5M NaCl), ekstreme yakın halofiller(1.4-4.0 M NaCl), ekstrem halofiller(2,0-5,2m NaCl) halotolerantlar (0->1M NaCl) ve değişken halofiller (0- >3M NaCl) olarak sınıflandırılırlar. Halofilik mikroorganizmalar tuzla, hipersalin sular gibi bölgelerde bulunurlar. Bu ortamlarda; ökaryotlar içerisinde yeşil alg olan Dunaliella (%10 tuz konsantrasyonu), Artemia salina, Ephydra gibi organizmalar yer alır. Bakterilerden ise; Salinibacter ruber (%20 tuz konsantrasyonu) en ekstrem halofilik bakteri olan özel bir türdür. Halobacterium, Haloferax, Haloarcula gibi genuslarsa Archaea domaininde yer alır ve bu mikroorganizmalar tuzun doygunluk noktasına yakın konsantrasyonlarda yaşayabilir ( %35) (Horikoshi and Grant, 1998). 2
Halofilik mikroorganizmaların yüksek tuz konsantrasyonlarında nasıl yaşamlarını sürdürülebildikleri Halobacterium gibi model organizmalarla yapılan çalışmalarla ortaya konulmuştur. Bu tip mikroorganizmaların çevrelerindeki yüksek ozmotik basınçta yaşabilmek için temel olarak iki strateji geliştirdiği kabul edilmektedir. Bunlardan iç tuz stratejisinde hücre içinde K + veya bazı hücrelerde Na + akümüle edilir ve böylece tüm hücre içi sistemler dış ortamdaki yüksek tuz konsantrasyonu nedeniyle oluşan basınca karşı adapte olabilirler. İkinci strateji olan compatible solute stratejisinde hücre kendisinin ürettiği stabilite edici organik maddeler ile (ektoin, glisin, betain gibi) hücre içi sistemlerin yüksek tuz koşullarına adaptasyonu gerekmeksizin hücre ile ortamın ozmotik basıncını dengeler ve yaşamını sürdürür (Oren, 1999). Halofilik mikroorganizmalar diğer ekstremofilik mikroorganizmalarla karşılaştıklarında basit besiyerlerinde kolay üretilebilmelerinden dolayı biyoteknolojik olarak büyük bir potansiyele sahiptirler. Ancak ekstremofilik mikroorganizmalarla ilgili alınan patent uygulamalarının sadece %20 si halofilik mikroorganizmalara aittir (Horiskoshi and Grant, 1998). Bu uygulamalardan bazıları bakteriyorodopsin (biyosensör yapımı, bilgilerin holografik olarak depolanması, elektronik sanayi), halorodopsin (deniz suyunun desalinizasyonu), biyopolimerler (polihidroksialkonatlar, parçalanabilir plastik üretimi) 84 kda luk bir protein (myc onkogenin saptanması). Bunların dışında, fermente gıdaların ve gıda katkı maddelerinin hazırlanmasında, biyosürfektanlar petrol kontamineli toprak ve suların temizlenmesinde (Margesin and Schinner, 2001). Ülkemizde halofilik mikroorganizmalar üzerine yapılan çalışmalar izolasyon ve sayım (Yaşa et al, 2004 ve Birbir and Sesal, 2003), enzim aktivitelerinin nitel olarak ortaya konması (Birbir et al., 2004) üzerine olup enzim üretim parametrelerini içermemektedirler. Yapılan diğer çalışmalar ise ılımlı halofilllerle ilgilidir. Örneğin; Sanchez-Porro ve ark, (2003) ılımlı halofilik tip türlerin hücre dışı enzim üretim kapasitelerini nitel olarak incelenmiştir ve yaklaşık türlerin %20 sinde proteaz aktivitesi olduğunu görmüştür. 3
Biyoteknolojik olarak mikroorganizmalardan dolayısıyla ekstrem halofillerden yararlanabilmek için onların kültür ortamlarında yetiştirilmeleri gereklidir. Bu bağlamda, çalışmamızda kültüre edilebilir veya saf kültür halinde elde edilebilen ekstrem halofilik Bacteria ve Archaea domainlerine ait mikroorganizmaların ülkemizin en önemli tuzlarından olan Çamaltı Tuzlası ndan izolasyonu bir ön koşul olarak görülmektedir. Çalışmamızda izole edilen türlerin proteaz enzimi üretme kapasitelerinin araştırılmasının yanında ülkemiz ekstrem halofilik kültüre edilebilir prokaryotik çeşitliliğinin ortaya çıkarılmasına katkıda bulunmak hedeflenmiştir. 4
Yöntem: - Örnekleme ve Zenginleştirme: Örnekler, Kasım ayında Çamaltı Tuzlası nın 2 farklı bölgesinden üstteki tuzlu toprak 10 cm kadar açılarak alınmıştır. Alınan örnekler, kilitli buzdolabı poşetlerine aktarılarak laboratuvara ulaştırılmış ve her bir örnekten 5 gr alınarak 250 ml lik erlenlerde 50 ml sıvı modifiye SW-20 ve SW-25 içeren ortamlara (Nieto et al., 1989 a modifiye edilmiştir) aktarılıp 40 o C'de 120rpm de 5 gün çalkalamalı inkübatörde inkübe edilerek mikroorganizmaların bu ortamda gelişmeleri sağlanmıştır. - İzolasyon: Zenginleştirme ortamlarından bir öze dolusu alınan örnekler çizgi ekim tekniğiyle katı SW-20, SW-25 ortamlarına ekilmiş 40 o C ye ayarlanmış etüvde 7 gün inkübe edilmişlerdir ve petriler kurumayı engellemek için (nemlendirme sağlaması amacıyla) su dolu kaba yerleştirilmişlerdir. İnkübasyon sonucunda petrilerde oluşan farklı renkte pigmentlere sahip koloniler (kırmızı, pembe, turuncu) ortamdan alınarak tekrar katı besiyerine ekilmek suretiyle saflaştırmaları yapılmıştır. Buna göre 14 farklı izolat seçilmiş ve bu izolatların saflığını kontrol amacıyla Dussault un halofilik mikroorganizmalar için gram boyama tekniğinden (Dussault, 1955) ve fazkontrast mikroskobundan yararlanılmıştır(şekil 1). Mikroskop analizleri sonucu kısa basil, uzun ince basil, üçgen, kare, disk ve bunların yanı sıra pleomorfik şekilli hücrelere rastlanmıştır. Elde edilen 14 izolatın büyümeleri için gerekli optimum (en iyi) tuz konsantrasyonları her bir izolat %10-25 arası tuz içeriğine sahip katı SW ortamlarına ekilerek belirlenmiştir. Seçilen 14 izolat daha sonraki çalışmalarda kullanılmak üzere stoklama amacıyla yatık SW-20 ortamında 40 o C de 3 gün üretilerek buzdolabında saklanmıştır. İzolatlar 2 ayda bir tekrar aktive edilmiştir. 5
SW-25 MEDİUM NaCl 202,5 gr MgCl 2 gr ( MgCl 2.6H 2 O için 37,25 gr ) MgSO 4 gr ( MgSO 4.7H 2 O için 49,25gr ) CaCl 2 gr ( CaCl 2.2H 2 O için 12 gr ) KCl 5 gr NaHCO 3 0,15 gr NaBr 0,065 gr Yeast ekstract 5 gr Distile su: 1000 ml ph: 7.2 Agar: 20 gr Şekil 1: Mikroorganizmaların faz-kontrast mikroskobundaki görüntüleri ve çizgi ekimleri 6
- Nitel Proteaz Aktivite Taraması: Katı ortamda proteaz taraması yapmak için, %10 luk skim-milk çözeltisi stok olarak hazırlanmış ve ortamdan ayrı olarak üç gün üst üste 105 o C de 5 dk. tutularak otoklavlanmış ve son konsantrasyonu %1 olacak şekilde steril SW-25 ortamına aktarılmıştır. İzolatlar, %1 oranında skim-milk içeren katı SW-25 ortamına 2 paralelli olacak şekilde nokta ekimi ile ekilmiş ve 40 o C de 5 gün inkübe edilmiştir. - Nicel Proteaz Aktivite Ölçüm Yöntemi Aktivite ölçümü için seçilen 4 izolatın aktivite ortamına aktarılmadan önce sıvı aktifleştirme kültürleri hazırlanmış(şekil 2) ve 660 nm de 24 saatte bir absorbansları ölçülerek büyüme eğrileri çıkarılmış ve buna göre 250ml lik erlenlerde hazırlanmış 50ml lik %1 maya ekstraktı (yeast extract) ve pepton içeren sıvı SW-20 ortamlarına %2 oranında (50 ml ye 1ml mikroorganizma) absorbansı 660 nm dalga boyunda 0,8-1 olan kültürlerden aktarılmıştır. Şekil 2 :İzolatların SW-20 ortamındaki 40 o C deki 3 günlük inkübasyondan sonraki görüntüleri. Aktivite ölçümü için örnekler 1,5 ml lik ependorf tüplerine (2 paralel olacak şekilde, toplam 3ml) alınıp 10.000 g de 10 dk +4 o C de santrifüjlenmişlerdir. % 0,65 (v/w) kazein substratı 1M NaCl içeren 50 mm fosfat tamponunda (ph 7,5) hazırlanmıştır. Substratın çözünmesi için 40 o C'ye ayarlanmış ısıtıcılı-manyetik karıştırıcıda 30 dak. karıştırılmıştır. Kazein substratı 2 paralel ve bir kör örneği olacak şekilde hazırlanmış temiz tüplere 2,5 ml olarak cam pipet yardımıyla paylaştırılmıştır. Tüpler enzim için gerekli olan optimum sıcaklığa getirilmek için 37 o C lik su banyosunda 5 dk. bekletilmiştir. 5 dk. İnkübasyondan sonra, santrifüjlenen örneklerden 0,5 ml alınıp kör dışındaki tüplere mikropipet yardımıyla aktarılmıştır. 7
İnkübasyon sonucunda örneklere 2,5 ml 110 mm TCA (Trikloroasetikasit) (%1,79 v/w) ilave edilerek enzimatik reaksiyon durdurulmuştur.şahit olarak (kör) tüplere 2,5 ml TCA ve daha sonra 0,5 ml enzim çözeltisi ilave edilmiştir. Bütün tüpler karıştırıldıktan sonra 37 o C de 30 dk. su banyosunda tutulmuşlardır. İnkübasyon sonunda tüpler santrifüj için ağırlıkları ölçülerek aynı ağırlıkta olanlar karşılıklı gelecek şekilde santrifüje yerleştirilip 5000g de 10 dk. 10 o C'de santrifüjlenmişlerdi. Santrifüj tüpünün üstünde temiz sıvıdan altındaki çökeltiye dokunmadan 0,5 ml alınarak işaretlenmiş temiz tüplere aktarılmış ve üzerlerine 1,25 ml Na 2 CO 3 (500mM) ilave edilmiş ve süre sonunda tüplere 0,25 ml Folin reaktifi aktarılmıştır (1kısım Folin 4 kısım steril distile su). Tüpler karıştırıldıktan sonra 37 o C de 30dak. su banyosunda tutulmuşlardır. Örneklerin absorbansları 660nm de spektrofotometrede ölçülmüştür. Bunun için ışık yolu 1 cm olan tek kullanımlık küvetlere 1ml örnek aktarılmıştır (2 paralel kör ve 2 paralel örnek). Elde edilen absorbans değerinden proteaz aktiviteleri hesaplanmıştır. 1 birim proteaz aktivitesi reaksiyon koşullarında dakikada 1 μmol (181 μg) tirozin oluşturan enzim miktarı olarak tanımlanmıştır. Aktivitenin hesaplanması için aşağıdaki formülden yararlanılmıştır: Unit /ml= Absorbans Eğim X Denemenin toplam hacmi (5,5ml) Kullanılan enzim Reaksiyon Kolorimetrik Miktarı (0,5ml) x süresi (10dk) x tayinde kullanılan enzim hacmi (0,5 ml) Formülde kullanılan eğime ulaşmak için, Tirozin standart grafiği kullanılmıştır(grafik 1). Grafiğin hazırlanması için aşağıdaki çözeltiler ve tablodan yararlanılmıştır(tablo 1). Grafik hazırlanırken proteaz aktivite ölçümünün 2. basamağı burada da aynen uygulanmıştır. 8
Çözelti 1: 1,1 mm L-Tirozin: 100 ml steril distile suya 0,0199 gr L-Tirozin katılmıştır. Hafifçe ısıtılarak çözünmesi sağlanmıştır. m n M= n= m M A X v M= 0,0011M= MA v 181,19 gr. 0,1 lt X= 0,0199 gr / 100 ml steril distile su : %33,43 lük stok tuz çözeltisi (ortamda tuz konsantrasyonu 1M olacak şekilde) X. 1,4 ml = 8 ml. % 5.85 X = % 33,43 Çözelti 3: Na 2 CO 3 (500mM) (Na=23 C=12 O=16 Na 2 CO 3 M A 106gr.) X 0,5 M = X = 5,3 gr / 100 ml 106 gr. 0,1 lt Çözelti 4: Folin reaktifi( 1:4 ) 100 ml için; 20 ml Folin: 80 ml steril distile su Tablo 1:Tirozin Standart Grafiğinin Hazırlanması Standart 1 Standart 2 Standart 3 Standart 4 Standart 5 Standart 6 Kör Çözelti 1 100μl 200 300 400 500 600 - Distile su+ 1400μl 1400μl 1400μl 1400μl 1400μl 1400μl 1400μl + + + + + + 500μl Distile su 400μl Distile su 300μl Distile su 200μl Distile su 100μl Distile su 600μl Distile su Çözelti 3 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml 5ml Çözelti 4 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1 ml 9
37 o C 30 dak su banyosunda tutulur. 660 nm de absorbanslar okunur. Grafik için y = mx + c eşitliği kullanılır. y=absorbans m=eğim x=l-tirozin (μmol) Standart 1 : 100μl Stok çözelti 1 = 0,11μmol Tirozin Standart 2 : 200μl Stok çözelti 1 = 0,22μmol Tirozin Standart 3 : 300μl Stok çözelti 1 = 0,33μmol Tirozin Standart 4 : 400μl Stok çözelti 1 = 0,44μmol Tirozin Standart 5 : 500μl Stok çözelti 1 = 0,55μmol Tirozin Standart 6 : 600μl Stok çözelti 1 = 0,66μmol Tirozin Absorbans 660nm 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Tirozin Standart Grafiği 0,11 0,22 0,33 0,44 0,55 0,66 Tirozin(µmol) y=0,0074x+0,0039 R 2 =0,9998 Tirozin Standart Grafiği Doğrusal (Tirozin Standart Grafiği) Grafik 1:Tirozin standart grafiği 10
Sonuçlar: Seçilen 14 izolatın %70 inin en iyi %20 tuz konsantrasyonunda, %30 unun en iyi %25 tuz konsantrasyonunda büyüdüğü gözlenmiştir(tablo 2). ORGANİZMA SW 10 SW 15 SW 20 SW 25 1 ++ ++ +++ ++ 2 - - +- ++ 3 - - +- + 4 ++ ++ +++ ++ 5 - - +- + 6 ++ ++ +++ ++ 7 ++ ++ +++ ++ 8 - - +++ + 9 - - +- + 10 ++ ++ +++ ++ 11 - - + + 12 +- + ++ ++ 13 ++ ++ +++ ++ 14 - - +- + - : Büyüme yok +- : Büyüme çok zayıf + : Büyüme zayıf ++ : Büyüme iyi +++ : Büyüme çok iyi Tablo 2: 14 izolatın en iyi büyüdükleri NaCl (% g/l) konsantrasyonları Organizmalara ait genel büyüme eğrisi aşağıdaki gibidir: Büyüme Eğrisi OD 660nm 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 1. gün 2. gün 3. gün 4. gün 5. gün 6. gün günler Seri 1 Grafik 2: 14 nolu izolatın büyüme eğrisi 11
Ayrıca seçilen 14 izolatın yeast ve pepton gibi kompleks besiyerlerinde büyümeleri onların kemoorganotrof olduklarını göstermektedir.bu 14 izolatın ön proteaz aktivite taramasında ise; 4 izolatın (2, 5, 9, 14 numaralı izolatlar) inkübasyon sonunda opak durumdaki ortamda şeffaf zon oluşturduğu gözlenmiştir. Proteaz aktivitesine sahip olan bu izolatların aktivite birimlerini belirlemek amacıyla yapılan ölçüm sonucu aşağıdaki grafikte gösterilmektedir. Günlere Bağlı Protez Aktivite Grafiği 0,2 Aktivite (Unit/ml) 0,15 0,1 0,05 0 1.gün 2.gün 3.gün 4.gün 5.gün 6.gün Seri 1 Günler Grafik 3: 14 no lu izolatın günlere bağlı protez aktiviteleri 12
Tartışma ve Öneriler: Ekstrem halofilik mikroorganizmaların özellikle yüksek tuz içeren ortamlarda bol bulundukları ve basit ortamlarda sadece ortamın tuz konsantrasyonu arttırılarak kolayca izole edilebildikleri görülmüştür.tuzun bir çok gıdanın korunması amacıyla kullanıldığı göz önüne alındığında tuzun koruyucu olarak kullanıldığı gıdalarda ekstrem halofilik mikroorganizmaların gelişmesi diğer mikroorganizmalara göre çok daha kolay olacaktır.dolayısıyla bu tip gıdaların bozulmasında halofilik mikroorganizmalar önemli bir role sahiptir.bu durum özellikle tuzlanmış balıklarda ve deri endüstrisinde önemli ekonomik kayıplara neden olmaktadır.ekstrem halofilik mikroorganizmaların gıdalarda neden olduğu bu bozulmalar özellikle onların hücre dışı enzim aktiviteleri (lipaz,proteaz) ile ilgilidir.ancak yüksek tuz konsantrasyonlarında gerçekleştirilen bazı biyoteknolojik uygulamalar için ise bu mikroorganizmaların lipaz ve proteazları büyük ilgi çekmektedir.ayrıca bu mikroorganizmaların patojenik özellikleri olmadığı, halosin adı verilen proteinik yapıda antimikrobiyalleri ve ß-karoten benzeri bakteriyorodopsinleri de ürettikleri bilinmektedir.bu amaçla çalışmamızda da gösterildiği gibi proteaz üreticisi olan bu tip mikroorganizmalar özellikle peynir gibi gıdaların olgunlaşma sürecinde farklı tat ve aromalarda ürünlerin üretiminde de kullanılabilirler. Sonuç olarak, çalışmamızda % 25 NaCl içeren besiyerinde üretilen 14 nolu izolat 0,15 U/ml proteaz aktivitesi ile potansiyel bir halofilik proteaz üreticisidir ve peynir olgunlaştırılması gibi klasik biyoteknolojik işlemlerde kullanılabilir. 13
Kaynaklar 1) Birbir, M., Ogan, A., Calli, B., Mertoğlu, B. (2004). Enzyme characteristics of extremely halophilic archaeal community in Tuzkoy Salt Mine, Turkey World Journal of Microbiology & Biotechnology, 20, sayfa 613-621 2) Birbir, M., Sesal, C. (2003). Extremely Halophilic Bacterial Community in Şereflikoçhisar Salt Lake in Turkey. Turk J. Biol. 27, sayfa 7-22 3) Dussault, H.P. (1955). An improved technique for staining red halophilic bacteria. J. Bacterial, 70, sayfa 484-485 4) Horikoshi, K., Grant, W.D. (1998). Extremophiles, sayfa 93-133 5) Kushner, D.J. (1978). Life in high salt and solute concentrations: halophilic bacteria. In Kushner D.J. (ed): Microbial Life in Extreme Environments. London: Academic Press, sayfa 87-103 6) Kushner, D.J. (1993). Growth and nutrition of halopbilic bacteria in Vreeland Hachstein L (eds): The Biology of Halophilic Bacteria. Boca Raton: FL CRC Pres, sayfa 87-103 7) Margejin, R., Schinner, F. (2001). Potential of halotolerant and holophilic microorganisms for biotechnology. Extremophiles, 5, sayfa 73-80 8) Nieto, J.J., Fernandez-Castillo, R., Marquez, M.C. Ventosa, A., Quesada, E.and Ruiz-Berraquero, F. (1989). Survey of Metal Tolerance in Moderately Halophilic Eubacteria. Applied and Environmental Microbiology, 55, sayfa 2385-2390 9) Oren, A. (1999). Bioenergetic Aspects of Halophilism, Microbial. Mol. Biol. Rev, 63, sayfa 334-348 10) Sanchez-Porro, C., Martin, S., Mellado, E., Ventosa, A. (2003). Diversity of moderately halophilic bacteria producing extracellular hydrolytic enzymes. Journal of Applied Microbiology, 94, sayfa 295-300 11) Van den Burg, B. (2003) Extremophiles as a source for novel enzymes. Current Opinion in Microbiology, 6, sayfa 213-218 12) Yaşa İ., Bitlisli, B.O., Karavana, H.A., Başaran, B., Sarı, O., Birbir, M. (2004). The Effect of Conservation Defects on the Suede avality of Double- Face. Journal Of the American Leather Chemists Association JALCA, 99, sayfa 494-501 14