BD GeneOhm Lizis Kiti REF 441243 P0015(03)_TR Türkçe Tarih: 2014-10
İçindekiler Türkçe... 3 Kullanım Amacı... 3 Ayıraçlar... 3 Önlemler... 3 Sağlanan materyaller... 3 Saklama, muamele ve stabilite... 3 Gereken ama sağlanmayan materyaller... 4 Kullanım talimatı... 4 A- Lizis için örnek hazırlama... 4 B- Konsantrasyon Yöntemi... 5 C- Seyreltme Yöntemi... 5 D- Yıkama Yöntemi... 5 E- Lizis Yöntemi... 5 Sonuçlar... 6 Referanslar... 7 Semboller İndeksi... 8 P0015(03)_TR -2-
Türkçe Kullanım Amacı BD GeneOhm Lizis kiti farklı örnek tiplerinden hücreler ve sporların hızlı lizisi içindir. Ayıraçlar BD GeneOhm Lizis Kiti Örnek tamponu (Sample Buffer) Tris-EDTA tamponu Lizis tüpü (Lysis tube) Cam boncuklar 100 reaksiyon 120 X 1 ml 100 tüp Önlemler Dış karton güvenlik mührü bozulmuşsa kiti kullanmayın. Koruyucu poşetler geldiklerinde açık veya yırtıksa ayıraçları kullanmayın. Koruyucu poşetleri her kullanımdan sonra fermuar şeklinde kapanan mühürle kapatın. Ayıraçları son kullanma tarihinden sonra kullanmayın. Ayıraçların kapaklarını birbirleriyle değiştirmeyin çünkü kontaminasyon oluşabilir ve test sonuçlarını tehlikeye atabilir. Steril atılabilir filtre bloklu veya pozitif displasman pipettör uçlarının kullanılması önerilir. Her örnek veya ayıraç için yeni bir uç kullanın. Örnekleri daima bulaşıcı olabilirlermiş gibi Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories 1 ve CLSI Belgesi M29 2 içinde tanımlandığı gibi güvenli laboratuvar işlemlerine göre kullanın. Kit ayıraçlarını kullanırken koruyucu giysiler ve tek kullanımlık eldivenler kullanın. Ellerinizi kullanımdan sonra iyice yıkayın. Ağzınızla pipetlemeyin. Örneklerin kullanıldığı yerlerde sigara içmeyin ve bir şey yemeyin ve içmeyin. Kullanılmamış ayıraçları ve atıkları ulusal, bölgesel ve yerel düzenlemelere göre atın. Sağlanan materyaller Örnek tamponu (Sample Buffer) Lizis tüpü (Lysis tube) Saklama, muamele ve stabilite Kit İçeriği Sample Buffer (mavi kapak) Lysis tube (sarı kapak) Mühürlü poşet Açılmış poşet Sıcaklık 2 25 C 2 25 C Stabilite Son Kullanma tarihi Son Kullanma tarihi Sıcaklık 2 25 C 2 25 C Stabilite 2 ay 1 Son Kullanma tarihi 1 Poşetin her kullanımdan sonra fermuar şeklinde kapanan mühürle uygun şekilde kapatılması şartıyla. P0015(03)_TR -3-
Gereken ama sağlanmayan materyaller Vortex Genie 2 (Scientific Industries Inc.) 1,5 ml mikrotüp tutucu veya eşdeğeri ile; çok sayıda örneğin işleme konması için çok sayıda tutma bölgesi olan adaptör kullanılabilir Mikropipetörler (hassas aralık 10 100 µl ile 100 1000 µl arasında) Steril filtre bloklu veya pozitif displasman mikropipetör uçları Steril transfer pipetleri (isteğe bağlı) Steril tüpler (isteğe bağlı) Steril Salin (%0,85 NaCl) (isteğe bağlı) Makas (isteğe bağlı) Gazlı bez (isteğe bağlı) Tek kullanımlık eldivenler Mikrosantrifüj, yüksek (14.000 x g değerine ulaşmalıdır) (isteğe bağlı) ve düşük hızda santrifügasyon için Kuru ısıtma bloğu 1,5 ml tüpler için veya su banyosu Buz veya soğutma bloğu 1,5 ml tüpler için Kronometre veya süre ölçer Kullanım talimatı Not: Her örneğin işlem göre hazırlanması için bir Lysis tube ( lizis tüpü, sarı kapak) ve en az bir Sample Buffer (örnek tamponu, mavi kapak) gerekir. Gerekli sayıda tüpü koruyucu poşetten çıkarın ve poşetleri fermuar şeklinde kapanan mühürle kapatın. (Hazırlama süresi yaklaşık 15 dk) A- Lizis için örnek hazırlama 1) İzole koloniler için aşağıdaki işlem önerilir: i. İzole kolonileri 0,5 McFarland türbidite elde edece şekilde steril salin (%0,85 NaCl) içinde tekrar süspansiyon haline getirin. ii. Örnek seyreltmesi gerekliyse C basamağı ile devam edin. Değilse D basamağı ile devam edin. 2) Bir eküvyonla alınmış örnek için aşağıdaki işlem önerilir: i. Toplama cihazını (eküvyon) bir örnek tamponu tüpüne (mavi kapak) yerleştirin. Örnek tamponu tüpünün tanımını kapak ve/veya tüp etiketi üzerine yazın. ii. Eküvyon sapını kırın ve tüpü sıkıca kapatın. Eküvyonu, tüp kenarına yakın olarak ucundan tutun (kontaminasyon riskini en aza indirmek için gazlı bez kullanın). Eküvyonu en dipten bir kaç milimetre kaldırın ve kırmak için tüpün kenarına doğru itin. Alternatif yöntem: kök kısmını kesmek için temiz makas kullanın. Kapağın sıkıca kapandığından emin olun. iii. Yüksek hızda 1 dakika vorteksleyin. Süre örnek tipine göre değişebilir. Çok sayıda örneği işleme koymak için çok sayıda tutma bölgesi olan adaptör kullanılabilir. iv. Örneği konsantre etmek için a B basamağı ile devam edin. Örneği seyreltmek için nokta C ile devam edin. v. Basamak iv gerekli değilse E basamağı (Lizis Yöntemi) ile devam edin. 3) Aşağıdaki işlemler tüm örnek tipleri için önerilir: i. Örneği konsantre etmek gerekiyorsa B basamağı ile devam edin. ii. Örneği seyreltmek gerekiyorsa C basamağı ile devam edin. iii. Örneği yıkamak gerekiyorsa D basamağı ile devam edin. P0015(03)_TR -4-
iv. Örnek tipi lizis öncesinde bir muamele gerektirmiyorsa doğrudan E basamağı (Lizis Yöntemi) ile devam edin. B- Konsantrasyon Yöntemi 1) Lizis tüpüne en fazla 1000 µl örnek aktarın, sıkıca kapatın ve oda sıcaklığında yüksek hızda 5 dakika santrifüjedin (14.000 x g ile 21.000 x g arasında). 2) Süpernatanı alıp atın. Steril bir transfer pipeti kullanın; pellete dokunmamaya dikkat edin. Her örnek için yeni bir transfer pipeti kullanın. 3) Gerekirse basamak 1 ve 2'yi gerektiği kadar tekrarlayın. Aksi halde basamak 4 ile devam edin. 4) Lizis tüpüne 50 µl 100 µl örnek tamponu ekleyin; sıkıca kapatın. Bir yıkama basamağı gerekliyse nokta D ile devam edin. 5) Lizis Yönteminde (E) basamak 2 ile devam edin. C- Seyreltme Yöntemi 1) Konsantre bir örneği seyreltmek için örnek tamponu kullanın. 2) Lizis Yönteminde (E) basamak 1 ile devam edin. D- Yıkama Yöntemi 1) Örnekten maksimum 1000 µl bulunan lizis tüpünü oda sıcaklığında yüksek hızda 5 dakika santrifüje edin (14.000 x g ile 21.000 x g arasında). 2) Süpernatanı alıp atın. Steril bir transfer pipeti kullanın; pellete dokunmamaya dikkat edin. Her örnek için yeni bir transfer pipeti kullanın. 3) Lizis tüpüne 50 µl 100 µl örnek tamponu ekleyin; sıkıca kapatın. Her örnek için yeni bir pipettör ucu kullanın. 4) Basamak 1 3'ü gerektiği kadar tekrarlayın. 5) Lizis Yönteminde (E) basamak 2 ile devam edin. E- Lizis Yöntemi 1) Lizis tüpüne (sarı kapak) 50 µl 100 µl örnek ekleyin; sıkıca kapatın. Her örnek için uygun mikropipetör ve yeni bir pipetör ucu kullanın. Lizis tüpünün tanımını kapak ve/veya tüp etiketi üzerine yazın. Lizis tüpüne 100 µl'den fazla örnek eklemeyin. 2) Yüksek hızda 5 dakika vorteksleyin. Süre lizis yapılan örnek tipine göre değişebilir. Çok sayıda örneği işleme koymak için çok sayıda tutma bölgesi olan adaptör kullanılabilir. 3) Lizis tüpünü düşük hızda 2 5 saniye santrifüje ederek içeriği tüpün alt kısmına getirin. 4) İki (2) dakika boyunca 95 ± 2 C'de ısıtın. Kuru ısıtma bloğu veya su banyosu kullanın. 5) Lizis tüpünü buz üzerinde veya bir soğutma bloğunda tutun. Notlar: 1- Lizatı seyreltme: Lizatı seyreltmek için lizis tüpüne uygun hacimde örnek tamponu ekleyin ve buz üzerinde veya bir soğutma bloğunda saklayın. 2- Lizatı saklama: Lizat gerekirse daha sonra kullanılmak üzere -20 ± 5ºC derecede donmuş olarak saklanabilir. Dondurma-çözme döngüsü PCR engelleyici maddeleri de ortadan kaldırabilir. P0015(03)_TR -5-
Sonuçlar Tablo 1. Beklenen verim Streptococcus agalactiae 1 CFU : Koloni Oluşturan Ünit Türler Örnek Tipi Miktar (CFU 1 /ml) Lizis etkinliği (%) Vajinal/anal sürüntü Staphylococcus aureus Bakteriyel süspansiyonu > 99 Bacillus anthracis (vejetatif hücreler) Nazal sürüntü 10 5 ile 10 6 arasında > 99 Bacillus anthracis (sporlar) Silika tozu (0,24 mg) > 99 Bacillus subtilis (sporlar) Spor süspansiyonu 98,8 BD GeneOhm Lizis kiti ile elde edilen lizis oluşan lizatlarda mevcut genomik nükleik asit amplifikasyonu ile gösterildiği şekilde 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 intraselüler bileşenlerin serbest bırakılmasıyla sonuçlanır. 98,8 Tablo 2. PCR reaksiyonu ile saptanan CFU Türler Örnek tipi İlk Konsantrasyon Lizis tüpüne eklenen hacim (µl) Hesaplama Lizatı seyreltme Reaksiyon tüpüne eklenen hacim (µl) Son konsantrasyon S. saprophyticus 3 İdrar 1,4 x 10 3 CFU/mL 50 Geçersiz 1 1,4 CFU/rx C. difficile 4 Gaita 10 7 CFU/g gaita 75 (sıvı gaita) Geçersiz 1,5 10 4 CFU/g gaita M. smegmatis Süspansiyon 2,4 x 10 5 CFU/mL 100 1/2500 1 9,6 CFU/rx S. epidermidis Süspansiyon 2,4 x 10 8 CFU/mL 100 1/10000 1 24 CFU/rx E. coli 8 Gaita 10 8 100 CFU/g gaita Geçersiz 1,5 10 5 CFU/g gaita (sıvı gaita) E. coli Süspansiyon 10 8 CFU/mL 100 1/100000 1 1 CFU/rx E. faecium Süspansiyon 8 x 10 8 CFU/mL 100 1/100000 1 8 CFU/rx C. albicans Süspansiyon 10 8 CFU/mL 10 1/10000 1 10 CFU/rx P0015(03)_TR -6-
Referanslar 1 Centers for disease Control and prevention. Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. Richmond JY and McKinney RW (eds) (1993). HHS Publication number (CDC) 93-8395. 2 Clinical and Laboratory Standards Institute. Protection of laboratory workers from occupationally acquired infections; Approved Guidelines Document M29 (Refer to the latest edition). 3 Martineau, F. et al. Development of a rapid PCR Assay Specific for Staphylococcus saprophyticus and Application to Direct Detection from Urine Samples. Journal of Clinical Microbiology. Sept 2000; 38(9): 3280-3284. 4 Bélanger, S D. et al. Rapid Detection of Clostridium difficile in Feces by Real-Time PCR. Journal of Clinical Microbiology. Feb. 2003; 41(2): 730-734. 5 BD Diagnostics, Sainte-Foy, Québec, Canada. Package insert of BD GeneOhm MRSA Assay (cat. # 441242 for 200 tests kit and 441244 for 48 tests kit). 6 BD Diagnostics, Sainte-Foy, Québec, Canada. Package insert of BD GeneOhm Strep B Assay (cat. # 441240). 7 Comparison of nine commercial kits for rapid nucleic acid extraction from microbial cultures. (M. Dion, C. Ménard, F.J. Picard et al.abstr. 99th Annual Meeting of ASM, Chicago, abstr. C-481, 1999). 8 Bélanger, S D. et al. Rapid Detection of Shiga Toxin-Producing Bacteria in Feces by Multiplex PCR with Molecular Beacon on the Smart Cycler. Journal of Clinical Microbiology. Apr. 2002; 40(4) : 1436-1440. 9 Martineau, F. et al. Species-Specific and ubiquitous DNA-Based Assays for Rapid Identification of Staphylococcus epidermidis Journal of Clinical Microbiology. Dec. 1996; 34(12): 2888-2893. P0015(03)_TR -7-
Semboller İndeksi Sembol Anlamı Katalog numarası In Vitro Diagnostik kullanım Üretici Yetkili avrupa temsilcisi İçindekiler n test için yeterlidir Parti kodu Son kullanma tarihi Sıcaklık sınırlaması Kullandıktan sonra torbayı tekrar mühürleyin Kullanma talimatına bakınız Müşteri Servisi : +1.888.436.3646 Benex Limited Pottery Road, Dun Loaghaire, Co. Dublin, Ireland GeneOhm Sciences Canada, Inc. 2555 boul. du Parc-Technologique Québec, QC, Canada, G1P 4S5 BD, BD Logo and all other trademarks are property of Becton, Dickinson and Company 2014 BD. P0015(03)_TR - 8 -