B. Bahar KAYSERİLİOĞLU FARMASÖTİK TEKNOLOJİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ. DANIŞMAN Prof.Dr. Tamer BAYKARA 2008-ANKARA

TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ VAJİNAL UYGULAMAYA YÖNELİK OLARAK LACTOBACILLUS GASSERI SUŞLARI İÇEREN MUKOADEZİF TABLETLERİN HAZIRLANMASI, TEKNOLOJİK VE BİYOLOJİK AÇIDAN DEĞERLENDİRİLMESİ B. Bahar KAYSERİLİOĞLU FARMASÖTİK TEKNOLOJİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof.Dr. Tamer BAYKARA 2008-ANKARA

TÜRKİYE CUMHURİYETİ ANKARA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ VAJİNAL UYGULAMAYA YÖNELİK OLARAK LACTOBACILLUS GASSERI SUŞLARI İÇEREN MUKOADEZİF TABLETLERİN HAZIRLANMASI, TEKNOLOJİK VE BİYOLOJİK AÇIDAN DEĞERLENDİRİLMESİ B. Bahar KAYSERİLİOĞLU FARMASÖTİK TEKNOLOJİ ANABİLİM DALI DOKTORA TEZİ DANIŞMAN Prof.Dr. Tamer BAYKARA Bu tez TÜBİTAK tarafından 107S447 proje numarası ile desteklenmiştir. 2008-ANKARA

ii Ankara Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Farmasötik Teknoloji Doktora Programı çerçevesinde yürütülmüş olan bu çalışma, aşağıdaki jüri tarafından Doktora Tezi olarak kabul edilmiştir. Tez Savunma Tarihi: 25/07/2008 Prof.Dr. Tamer BAYKARA Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı Prof.Dr. Nilüfer TARIMCI Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı Prof.Dr. Belma ASLIM Gazi Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü Prof.Dr. Nurten ALTANLAR Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Doç.Dr. Nilüfer YÜKSEL Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı

iii İÇİNDEKİLER Kabul ve Onay İçindekiler Önsöz Simgeler ve Kısaltmalar Şekiller Tablolar ii iii viii ix x xii 1. GİRİŞ 1 1.1. Vajinanın Anatomik ve Fizyolojik Yapısı 1 1.1.1. Vajinal Sekresyonlar 2 1.1.2. Vajinal ph 3 1.1.3. Siklik Değişiklikler ve Menopoz 3 1.1.4. Vajinal Mikroflora 5 1.2. Laktobasillerin Vajinal Ekosistemdeki Koruyucu Etkileri ve Olası 6 Kontrol Mekanizmaları 1.2.1. Laktik Asit Üretimi ve Düşük Vajinal ph 6 1.2.2. Hidrojen peroksit Üretimi 7 1.2.3. Bakteriyosin ve Bakteriyosin Benzeri Maddelerin Üretimi 7 1.2.4. Bariyer Popülasyonunun Oluşumu 8 1.2.5. İmmun Sistemin Stimulasyonu 9 1.3. Abnormal Vajinal Flora ile İlişkili Enfeksiyonlar 9 1.4. Laktobasillerin Ürogenital Hastalıkların Önlenmesinde ve 12 Tedavisinde Destekleyici Ajan (Probiyotik) Olarak Kullanılması 1.4.1. Probiyotik: Tanımı, Klinik Etkileri 12 1.4.2. Vajinal Probiyotik Olarak Kullanılan Laktobasillerin Taşıması Gereken Özellikler 16 1.4.2.1. Patojen Olmama 17 1.4.2.2. Dokuya Tutunma (Adezyon) ve Vajinada Kalabilme 18 1.4.2.3. Patojenlerin Adezyonunu ve Kolonizasyonunu Önleme 21 1.4.2.4. Popülasyon Stabilitesi 22

iv 1.4.2.5. Patojenler Üzerinde Antimikrobiyal Aktivite 22 1.5. İlaç Uygulama Yeri Olarak Vajina 25 1.5.1. Vajinal Yol ile İlaç Uygulamanın Avantajları ve Dezavantajları 25 1.5.2. Vajinal Uygulamaya Yönelik İlaç Şekilleri 26 1.5.3. Mukoadezyon: Tanımı ve Mekanizması 26 1.5.3.1. Mukus Mukoadezif Polimer Etkileşimi 27 1.5.3.2. Mukoadezyon Mekanizmaları 30 1.5.3.3. Mukoadezyonu Ölçmek İçin Kullanılan Yöntemler 32 1.6. Probiyotik İçeren İlaç Şekillerinin Hazırlanması 33 1.6.1. Mikroorganizmaların Liyofilizasyonu (Dondurarak Kurutma) 35 1.6.2. Probiyotik İçeren Tablet Formülasyonlarının Hazırlanması 38 1.7. Çalışmada Kullanılan Lactobacillus gasseri H14 ve Lactobacillus 39 gasseri H15 Suşlarının Tanımlanmış Probiyotik Özellikleri 1.8. Tezin Amacı 41 2. GEREÇ VE YÖNTEM 43 2.1. Gereçler 43 2.1.1. Deneysel Çalışmalarda Kullanılan Maddeler 43 2.1.2. Deneysel Çalışmalarda Kullanılan Aletler 45 2.2. Yöntemler 47 2.2.1. Lactobacillus gasseri Suşlarının Temini 47 2.2.1.1. Bakterilerin Aktifleştirilmesi ve Gelişme Ortamları 47 2.2.1.2. Bakterilerin Gram Boyama Yöntemi ile Boyanması ve Mikroskobik 47 Olarak İncelenmesi 2.2.1.3. Çalışmada Kullanılan Besi Ortamları 48 2.2.1.4. Çalışmada Kullanılan Tampon Çözeltiler 49 2.2.2. L. gasseri H14 ve L. gasseri H15 in HeLa Hücrelerine Adezyon Özelliklerinin Belirlenmesi 49 2.2.2.1. HeLa Hücre Kültürünün Hazırlanması 50 2.2.2.2. Lactobacillus gasseri Suşlarının Adezyon Çalışması İçin 51 Hazırlanması 2.2.2.3. Adezyon Deneyi 52

v 2.2.3. Lactobacillus gasseri H14 ve Lactobacillus gasseri H15 Suşlarının Liyofilizasyonu 53 2.2.3.1. Mikroorganizmaların Liyofilizasyon İşlemi İçin Hazırlanması 53 2.2.3.2. Liyofilizasyon Ortamının Hazırlanması 54 2.2.3.3. Liyofilizasyon İşlemi 54 2.2.3.4. Liyofilizasyonda Kullanılacak Bakteri Miktarını ve Liyofilizasyon 55 Ortamını Belirlemeye Yönelik Ön Çalışmalar 2.2.3.5. Liyofilize Bakterilerde Canlılık Tayini 55 2.2.4. Mukoadezif Tablet Formülasyonlarının Geliştirilmesine Yönelik Çalışmalar 56 2.2.4.1. Tablet Formülasyonlarının Hazırlanması 56 2.2.4.2. Mukoadezif Polimerlerin Seçilmesine Yönelik Ön Formüller 57 2.2.5. Bakteri İçermeyen Mukoadezif Tabletlerde Yapılan Testler 59 2.2.5.1. Şişme Özelliklerinin Tayin Edilmesi 59 2.2.5.2. Dağılma Sürelerinin Tayin Edilmesi 59 2.2.5.3. Sertlik Tayini 59 2.2.5.4. Tabletlerde Kullanılan Polimerlerin Viskozluklarının 60 Değerlendirilmesi 2.2.5.5. In vitro Mukoadezyon Ölçümü 60 2.2.6. In vitro Sitotoksisite Tayini 62 2.2.6.1. HeLa Hücre Kültürünün Hazırlanması 62 2.2.6.2. Sitotoksisite Tayininde Kullanılan Numunelerin Hazırlanması 63 2.2.6.3. MTT Testi 63 2.2.7. Bakterilerin Yüklenmesi İçin Formül Seçimi 64 2.2.8. Liyofilize Bakterilerin Tabletlere Yüklenmesi 64 2.2.9. Tabletlerde Bakteri Canlılığının Tayini 64 2.2.10. Bakterilerin Tabletlerden Çıkış Özelliklerinin Belirlenmesi 65 2.2.11. Tablet Formülasyonlarında Yer Alan Bakterilerin HeLa Hücrelerine 65 Adezyon Özelliklerinin Belirlenmesi 2.2.12. Bakteri İçeren Tabletlerde Stabilite Çalışması 66 2.3. İstatistiksel Değerlendirme 66 3. BULGULAR 67

vi 3.1. Lactobacillus gasseri Suşları ile Yapılan Ön Çalışmalara Ait 67 Bulgular 3.1.1. Gram Boyama Yöntemi ile Boyanan Lactobacillus gasseri Suşlarına 67 Ait Işık Mikroskobu Görüntüleri 3.1.2. Lactobacillus gasseri H14 ve Lactobacillus gasseri H15 Suşlarının 68 Bakteri Süspansiyonu Halinde HeLa Hücrelerine Tutunma (Adezyon) Çalışmasına İlişkin Bulgular 3.1.3. Bakterilerin Liyofilizasyonu (Dondurarak Kurutulması) 70 3.2. Mukoadezif Tablet Formülasyonlarının Geliştirilmesine Yönelik 72 Çalışmalara İlişkin Bulgular 3.2.1. Şişme Çalışmalarına İlişkin Bulgular 72 3.2.2. Dağılma Çalışmalarına İlişkin Bulgular 75 3.2.3. Sertlik Tayinine Ait Bulgular 75 3.2.4. Viskozluk Ölçümüne İlişkin Bulgular 77 3.2.5. In vitro Mukoadezyon Ölçümüne İlişkin Bulgular 78 3.2.6. Sitotoksisite Çalışmalarına İlişkin Bulgular 85 3.3. Lactobacillus gasseri H15 Suşunun Tablet Formülasyonlarına 86 Yüklenmesine İlişkin Bulgular 3.3.1. Tabletlerde Bakteri Canlılığı Üzerinde Basıncın Etkisi 86 3.3.2. C974 ve HPMC ile Hazırlanan Tabletlerde Bakteri Canlılığı 87 3.3.3. Bakterilerin Tabletlerden Çıkış Çalışmalarına İlişkin Bulgular 87 3.4. Liyofilizasyon ve Tablet Basımı Sonrası Bakterilerin HeLa 89 Hücreleri Üzerine Adezyon Deneyi 3.5. Stabilite Çalışmasına Ait Bulgular 90 4. TARTIŞMA 91 4.1. Lactobacillus gasseri H14 ve Lactobacillus gasseri H15 Suşları ile 91 Yapılan Ön Çalışmalar 4.1.1. L. gasseri H14 ve L. gasseri H15 Suşlarının HeLa Hücreleri 91 Üzerinde Adezyon Özelliklerinin Belirlenmesine İlişkin Bulguların Değerlendirilmesi 4.1.2. L. gasseri H14 ve L. gasseri H15 Suşlarının Liyofilizasyonu İçin Yapılan Ön Çalışmalara İlişkin Bulguların Değerlendirilmesi 93

vii 4.1.3. Liyofilize Bakteri Örneklerinde Kontaminasyon Değerlendirmesi 95 4.1.4. Tablet Formülasyonlarına Yüklenecek Lactobacillus gasseri 95 Suşunun Seçimi 4.2. Mukoadezif Tablet Formülasyonlarının Geliştirilmesine İlişkin 96 Bulguların Değerlendirilmesi 4.2.1. Şişme Çalışmalarına İlişkin Bulguların Değerlendirilmesi 97 4.2.2. Dağılma Çalışmalarına İlişkin Bulguların Değerlendirilmesi 99 4.2.3. Sertlik Çalışmalarına İlişkin Bulguların Değerlendirilmesi 100 4.2.4. Viskozluk Çalışmalarına İlişkin Bulguların Değerlendirilmesi 100 4.2.5. In vitro Mukoadezyon Ölçümüne İlişkin Bulguların 101 Değerlendirilmesi 4.2.6. Sitotoksisite Tayinine İlişkin Bulguların Değerlendirilmesi 104 4.3. Lactobacillus gasseri H15 Suşunun Tablet Formülasyonlarına Yüklenmesine İlişkin Bulguların Değerlendirilmesi 105 4.3.1. Tabletlerde Bakteri Canlılığı Üzerinde Basıncın Etkisinin 105 Değerlendirilmesi 4.3.2. C974 ve HPMC İçeren Tabletlerde Canlılık Düzeylerinin 106 Belirlenmesi 4.3.3. Lactobacillus gasseri H15 in Tablet Formülasyonlarından Çıkış 106 Özelliklerinin Değerlendirilmesi 4.4. Lactobacillus gasseri Suşlarının Liyofilizasyon ve Tablet 107 Formülasyonu Sonrası HeLa Hücreleri Üzerindeki Adezyon Özelliklerinin Belirlenmesine Yönelik Bulguların Değerlendirilmesi 4.5. Lactobacillus gasseri H15 Suşunu İçeren Tabletlerin Stabilite 109 Çalışmalarına İlişkin Bulguların Değerlendirilmesi 5. SONUÇ VE ÖNERİLER 111 ÖZET 114 SUMMARY 115 KAYNAKLAR 116 ÖZGEÇMİŞ 128

viii ÖNSÖZ Bu çalışma Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Eczacılık Teknolojisi Bölümü Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı nda yapılmış ve TÜBİTAK tarafından 107S447 Numaralı proje ile desteklenmiştir. Bu araştırmayı yöneten, lisansüstü öğrenimim süresince bilgisi, tecrübesi ve desteği ile her zaman yanımda olan tez yöneticim Sayın Prof.Dr. Tamer BAYKARA ya teşekkür ederim. Çalışmalarımın bir kısmını gerçekleştirdiğim Gazi Üniversitesi Fen-Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümü öğretim üyesi Sayın Prof.Dr. Belma ASLIM a sağladığı bilimsel destek ve laboratuvar imkanları için teşekkür ederim. Aynı bölümde Araştırma Görevlisi olan Dr.Biyolog Zehra Nur YÜKSEKDAĞ a her zaman gösterdiği güleryüzü, sağladığı bilimsel destek ve sabrı için teşekkür ederim. Çalışmalarımdaki yardımlarından dolayı Anabilim Dalımız öğretim üyesi Sayın Doç.Dr. Nilüfer YÜKSEL e ve Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı öğretim üyesi Sayın Prof.Dr. Nurten ALTANLAR a teşekkür ederim. Hücre kültürü çalışmalarımda her zaman gösterdiği güleryüzü ve bilimsel desteği ile ilgisini ve yardımlarını eksik etmeyen ŞAP Enstitüsü Hücre ve Virüs Bankası Başkanı Uzm.Biyolog Şükran YILMAZ a teşekkürü borç bilirim. Mukoadezyon ölçümlerinin gerçekleştirilmesinde sağladıkları imkanlar ve ilgilerinden dolayı Ege Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı Öğretim Üyesi Doç.Dr. Esra BALOĞLU ve Araştırma Görevlisi Dr.Ecz. Sinem HIZARCIOĞLU na teşekkürü borç bilirim. Liyofilizasyon işlemlerini gerçekleştirdiğim Refik Saydam Hıfzıssıhha Merkezi Biyolojik Kontrol ve Araştırma Labotaruvarı çalışanlarını Vet. İlhan BOZYİĞİT e yardımlarından dolayı teşekkür ederim. Lisansüstü öğrenimim boyunca bilgilerinden yararlandığım Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı öğretim üyelerine ve sıcak ilgilerini esirgemeyen öğretim elemanlarına teşekkürü borç bilirim.

ix SİMGELER VE KISALTMALAR C971 Carbopol 971 C974 Carpobol 974 CFU Colony forming unit (Koloni oluşturma birimi) DMEM Dulbecco s Minimal Essential Medium EPS Ekzopolisakkarit FBS Fetal Bovine Serum HeLa cell Human epithellodial cervix carcinoma cell HPMC Hidroksipropilmetil selüloz ISO International Organization for Standardization MRS agar De Man Rogosa Sharp katı besiyeri MRS broth De Man Rogosa Sharp sıvı besiyeri MTT [3-(4,5 dimetiltiyazol-2-yl)-2,5-difeniltetrazolium bromür] Na-Alg Sodyum aljinat OD Optik dansite SH Standart Hata SM Skim milk (yağı alınmış süt tozu) SMA Skim milk + askorbik asit SMAL Skim milk + askorbik asit + laktoz

x ŞEKİLLER Şekil 1.1. Şekil 1.2. Kadın ürogenital sistemi; rektum ve üretra arasında yer alan vajinanın genel görünümü ve yapısı. Vajinal duvarın hücre dizilimi; a) Genel görünüm, b) Vajinanın tabakaları, c) Ayrıntılı görünüm. Şekil 1.3. Vajinal sekresyonlar. 3 Şekil 1.4. Şekil 1.5. Şekil 1.6. Şekil 1.7. Laktik asit bakterileri tarafından üretilen EPS nin sağlık üzerindeki olası etkilerinin şematik gösterimi (Ruas-Madiedo ve ark., 2002). Laktik asit bakterilerinin (LAB) vajinada patojen adezyonunu ve enfeksiyonu önleme mekanizmaları (Reid ve ark., 2001). a) Müsinin şematik yapısı, b) Disülfit bağları ile stabilize olmuş protein çekirdek (Leung ve Robinson, 1988, Ahuja ve ark., 1997). Vajinal dozaj formlarında da tercih edilen bazı yaygın ilk jenerasyon mukoadezif polimerlerin yapısı (Smart, 2005). Şekil 1.8. Dozaj formu ve mukozanın temas ve etkileşim basamakları. 30 Şekil 1.9. Mukoadezif polimer zincirleri ve müsin glikoproteinleri arasındaki etkileşimin basamakları. Şekil 1.10. Mukoadezif bağda kopmanın meydana geldiği olası bölgeler (Smart, 2005). Şekil 2.1. Adezyon deneyi için a) HeLa hücrelerinin CO 2 li inkübatörde 6 gözlü plaklarda çoğaltılması, b) Her bir gözde HeLa hücrelerinin üzerine tutunduğu 18x18 mm ebatlarında lamelleri içeren 6 gözlü plakların yakından görünümü. Şekil 2.2. Şekil 2.3. Adezyon çalışması sonrası hücrelere fikse olmuş bakterileri içeren lameller. Mikroorganizmaların dondurarak kurutulmasında kullanılan liyofilizatör. Şekil 2.4. Mukoadezyon ölçümlerinde kullanılan Texture Analyzer cihazının şematik görünümü. Şekil 2.5. Mukoadezyon tayininde kullanılan kuvvet-mesafe eğrisi. 61 Şekil 3.1. Şekil 3.2. Gram (+) Lactobacillus gasseri H15 suşunun mikroskobik görünümü (10x100 büyütme). L. gasseri suşlarının HeLa hücrelerine adezyon çalışmasına ait ışık mikroskobu görüntüleri; a) L. gasseri H14, b) L. gasseri H15 (10x100 büyütme). 1 2 21 23 28 29 31 32 51 52 54 60 67 69

xi Şekil 3.3. Şekil 3.4. Şekil 3.5. Şekil 3.6. Şekil 3.7. Şekil 3.8. Şekil 3.9. Farklı ortamlarda liyofilize edilen bakterilerin liyofilizasyon sonrası canlılık düzeyleri; SM: % 10 Skim milk, SMA: % 6 skim milk + % 2,5 askorbik asit, SMAL: % 6 skim milk + % 2,5 askorbik asit + % 8 laktoz. a) 15 MPa basınç altında hazırlanan ve polimerleri tek tek içeren formüllere (F1-F4) ait % şişme değerleri, b) 40 MPa basınç altında hazırlanan ve polimerleri tek tek içeren formüllere (F5- F8) ait % şişme değerleri. a) 15 MPa basınç altında hazırlanan ve farklı oranlarda polimer karışımlarını içeren formüllere ait % şişme değerleri, b) 40 MPa basınç altında hazırlanan ve farklı oranlarda polimer karışımlarını içeren formüllere ait % şişme değerleri. 15 MPa ve 40 MPa basınç ile hazırlanan ve polimerleri tek tek içeren formülasyonlara (F1-F8) ait dağılma süreleri. 15 MPa ve 40 MPa basınç ile hazırlanan ve farklı oranlarda polimer karışımlarını içeren formülasyonlara (F9-F16) ait dağılma süreleri. Farklı polimer oranlarında ve basınçlarda hazırlanan tablet formülasyonlarına ait sertlik değerleri. *: 15 MPa basınçla basılan HPMC içeren tabletlerde sertlik ölçülememiştir. **: 15 MPa basınçla basılan Na-Alg içeren bir tablette sertlik verisi ölçülebilmiştir. Texture Analyzer cihazı ile mukoadezyon ölçümüne ilişkin sonuçların grafiksel gösterimi. Şekil 3.10. 40 MPa basınç ile basılan tabletlere ait kuvvet-uzama eğrileri; a) Polimerleri tek tek içeren formüller (F5-F8), b) Farklı oranlarda polimer karışımlarını içeren formüller (F13-F16). Şekil 3.11. Şekil 3.12. Şekil 3.13. Polimerleri tek tek içeren ve farklı basınçlarda hazırlanan tablet formülasyonlarına ait mukoadezyon işi verileri. *: 15 MPa basınçla hazırlanan Na-Alg içeren formülasyonlarda tek mukoadezyon verisi elde edilebilmiştir. Farklı polimer oranlarında ve basınçlarda hazırlanan tablet formülasyonlarına ait mukoadezyon işi verileri. C974, HPMC ve Na-Alg a ait 24 saatlik sitotoksisite çalışması sonuçları. Şekil 3.14. Sitotoksisite çalışması sonucu HeLa hücrelerinin görünümü; a) Kontrol grubu, b) 0,035 mg/ml HPMC, c) 0,7 mg/ml C974, d) 0,7 mg/ml HPMC. Şekil 3.15. 15 MPa ve 40 MPa basınç ile hazırlanan HPMC tabletlerinde (F3 ve F7) L. gasseri H15 suşunun canlılık düzeyi. Şekil 3.16. L. gasseri H15 suşunun C974 içeren tabletlerden (F6) çıkışı. 88 Şekil 3.17. L. gasseri H15 suşunun HPMC içeren tabletlerden (F7) çıkışı. 88 72 73 74 76 76 77 79 83 84 84 85 85 87

xii ÇİZELGELER Çizelge 1.1. Çizelge 1.2. Çizelge 1.3. Çizelge 1.4. Çizelge 1.5. Çizelge 1.6. Çizelge 1.7. Sağlıklı kadınlarda hayatın farklı dönemlerinde vajinanın fizyolojik koşulları (Rodendo-Lopez ve ark., 1990, McGroarty, 1993, Carranza-Lira, 2003). Probiyotiklerin klinikte kullanım alanları (Salminen ve ark., 1998, Kopp-Hoolihan, 2001, Kaur ve ark., 2002, Plant ve Conway, 2002, Fioramonti, 2003, Saxelin, 2005). Probiyotik bakteri olarak önerilen suşların taşıması gereken özellikler (Kailasapathy ve Chin, 2000, Salminen ve ark., 1998, Kaur ve ark., 2002, Pusch ve ark., 2006). Gıdada ve farmasötik ürünlerde probiyotik olarak kullanılan suşlar (Collins ve ark., 1998, Kaur ve ark., 2002, Hoesl ve Altwein, 2005). Probiyotiklerin klinik değerlendirmesi için yapılması gereken çalışmalar (Salminen ve ark., 1998). L. gasseri suşlarına ait türlerin metabolik aktivite sonuçları (Kılıç, 2003, Halit, 2007). Lactobacillus spp. suşlarının bazı patojen mikroorganizmalar üzerinde inhibisyon etkisine ait inhibisyon zonunun çap değerleri (mm) (Aslım ve Kılıç, 2006). Çizelge 1.8. Vajinadan izole edilen Lactobacillus spp. suşlarının antibiyotiklere gösterdiği duyarlılık test sonuçları (Kılıç, 2003, Halit, 2007). Çizelge 2.1. Çizelge 2.2. Vajinal tabletlerin hazırlanmasında kullanılan birim ilaç şekli formülasyonu. Tablet formülasyonlarının hazırlanmasında çalışılan basınç değerleri ve kullanılan polimerler. Çizelge 2.3. Birim tablet formülündeki polimer karışımları ve oranları. 58 Çizelge 2.4. Texture analyzer cihazı ile in vitro mukoadezyon ölçümlerinde kullanılan test parametreleri. Çizelge 2.5. Stabilite çalışmalarına ait stabilite protokolü. 66 Çizelge 3.1. L. gasseri H14 ve L. gasseri H15 in HeLa hücrelerine adezyon * çalışması sonuçları (ortalama ± S.H. **, n=3). Çizelge 3.2. Çizelge 3.3. Farklı hacimlerde L. gasseri H14 süspansiyonu içeren liyofilizatlarda bakteri canlılığı. Farklı hacimlerde L. gasseri L. gasseri H15 süspansiyonu içeren liyofilizatlarda bakteri canlılığı. 4 13 14 15 16 39 40 40 57 58 62 68 70 70

xiii Çizelge 3.4. Çizelge 3.5. Çizelge 3.6. Çizelge 3.7. Çizelge 3.8. Çizelge 3.9. Çizelge 3.10. Çizelge 3.11. Çizelge 3.12. Farklı liyofilizasyon ortamlarında L. gasseri H14 e ait canlılık düzeyleri. Farklı liyofilizasyon ortamlarında L. gasseri H15 e ait canlılık düzeyleri. Formülasyonların dağılma süreleri ve sertlik değerleri (ortalama ± S.H., n=3). Formülasyonların içerdiği polimer/polimer karışımlarına ait viskozluk değerleri. Formülasyonlara ait maksimum ayırma kuvveti ve adezyon işi verileri (ortalama ± S.H., n=3). 15 MPa ve 40 MPa basınç ile hazırlanan HPMC tabletlerinde (F3 ve F7) L. gasseri H15 suşunun canlılık düzeyi (ortalama ± S.H., n=3). C974 ve HPMC içeren tabletlerde (F6 ve F7) L. gasseri H15 suşuna ait canlılık düzeyleri (ortalama ± S.H., n=3). L. gasseri H15 in liyofilizasyon sonrası ve C974 ve HPMC içeren tablet formülasyonlarına (F6 ve F7) yüklenmesi sonrasında HeLa hücreleri üzerine adezyon* özellikleri (ortalama ± S.H., n=3). L. gasseri H15 in HPMC ve C974 içeren tabletlerde buzdolabında ve oda sıcaklığında saklama koşullarına ait 1 aylık stabilite sonuçları. 71 71 75 77 78 86 87 89 90

1 1. GİRİŞ 1.1. Vajinanın Anatomik ve Fizyolojik Yapısı Üreme sisteminin en önemli organı olan vajina, rektum, mesane ve üretra arasında bulunan ve uterusu vücudun dışına bağlayan yaklaşık 7-10 cm uzunluğunda fibromüsküler bir tüptür (Şekil 1.1) (Richardson ve Illum, 1992, Brannon-Peppas, 1993, Valenta, 2005). Şekil 1.1. Kadın ürogenital sistemi; rektum ve üretra arasında yer alan vajinanın genel görünümü ve yapısı. Vajinal ortam fonksiyon ve kasılma açısından hiçbir peristaltik harekete sahne olmamasına rağmen, tamamen hareketsiz olarak da nitelendirilmemektedir. Vajinal duvar epitelyal tabaka, orta kas tabakası ve dış fibröz tabaka olmak üzere üç tabakadan oluşmaktadır ve yeterli elastiklik için üst üste katlanmıştır (Brannon- Peppas, 1993, Valenta, 2005).

2 Vajinal epitelyum çok tabakalı, yassı ve non-keratinize yapıda olup, epitelyumun orta ve yüzeysel tabakalarındaki hücreler glikojen içermektedir (McGroarty, 1993) (Şekil 1.2). Şekil 1.2. Vajinal duvarın hücre dizilimi; a) Genel görünüm, b) Vajinanın tabakaları, c) Ayrıntılı görünüm. 1.1.1. Vajinal Sekresyonlar Vajinal epitelyum, goblet hücrelerini 1 içermemesine ve müsinin doğrudan salgılandığı bir yer olmamasına rağmen ince bir sıvı film tabakası ile kaplanmıştır ve genelde mukozal bir yüzey olarak nitelendirilmektedir (Vermani and Garg, 2000). Vajinada salgı bezi olarak vajinal sıvının üretiminde önemli bir katkısı olmadığı düşünülen Bartholin ve Skene bezleri bulunmaktadır. Vajinal sekresyon baskın olarak, servikal sekresyonlar ve vajinanın lümenine hücrelerarası kanallardaki kan damarlarından gelen transudalardan 2 oluşmaktadır (Şekil 1.3) (Knuth ve ark., 1993, McGroarty, 1993). Vajinal sıvının kimyasal bileşimi %90-95 su, proteinler, karbonhidratlar, inorganik-organik tuzlar, düşük molekül ağırlıklı organik bileşikler, laktik asit, asetik asit, gliserol, üre, glukoz, müsinler, yağ asitleri, amino asitler, 1 Genellikle sindirim ve solunum sistemlerini astarlayan tek tabakalı örtü epitelyum hücrelerinin aralarında bulunan, mukus salgılayarak çevredeki hücrelerin yüzeyinin korunmasını sağlayan tek hücreli bez (http://medical-dictionary.thefreedictionary.com). 2 Damar duvarlarından veya doku yüzeyinden hidrodinamik güçlerin etkisi ile dışarıya sızan sıvı (www.tipterimleri.com).

3 albuminler ve immunoglobulinlerden oluşmaktadır (Redondo-Lopez ve Cook, 1990, Owen ve Katz, 1999). Üreme çağındaki bir kadında salgılanan vajinal sıvı yaklaşık olarak 3-4 g/4 saat olarak ölçülmüştür. Östrojenden yoksun postmenopozal kadınlarda üretilen sıvının miktarı %50 daha azdır (Knuth, 1993). Şekil 1.3. Vajinal sekresyonlar. 1.1.2. Vajinal ph Üreme çağındaki sağlıklı bir kadında vajinal ph 4,0-4,5 arasında olup, soyulan epitel hücrelerdeki glikojeni laktik asite dönüştüren laktobasiller tarafından sürdürülmektedir (Hanna ve ark., 1985, Vermani ve Garg, 2000). Menstruel, servikal, uterin salgılar ve sperm ortamı alkaliye çeviren ajanlar olarak rol oynamakta ve ph yı artırmaktadır (Vermani ve Garg, 2000). 1.1.3. Siklik Değişiklikler ve Menopoz Menstruel siklus sırasında hormon (özellikle östrojen) düzeylerindeki değişiklikler epitelyum hücre tabakasının kalınlığında, hücreler arası kanalların genişliğinde, ph ve salgılarda değişikliğe yol açmaktadır (Valenta, 2005).

4 Premenopoz ve menopoz döneminde östrojen üretimindeki ve epitelyal hücre tabakasının kalınlığındaki azalmaya bağlı olarak, vajinal glikojen içeriğinde kalıcı bir azalma olmaktadır (Brizzolora ve ark., 1999). Bu ortamda asidofilik organizmalar daha fazla baskın olmamakta, bu da ph nın 5 ten 7 civarına kadar artmasıyla bakteriyel florada değişikliklere yol açarak patojenlerin yerleşmesi için uygun ortam oluşturmaktadır (Knuth, 1993, Valenta, 2005). Bu nedenle, postmenopozal dönemde distal üretrada gram-negatif çubuklar baskın hale gelmektedir. Bu popülasyon, üriner kanalı üropatojenlerin istilasından korumada laktobasillere göre daha az etkilidir. Bununla birlikte, östrojen ile tedavinin laktobasil biyofilminin tekrar oluşumunu sağladığı ve üriner kanal enfeksiyonlarının sıklığının azaldığı gösterilmiştir. Tüm postmenopozal kadınlar, ürogenital bakteriyel floraları laktobasiller tarafından baskın olmamasına rağmen üriner sistem enfeksiyonlarına aşırı hassasiyet göstermemektedir. Sağlıklı durumun sürdürülmesinde alternatif koruyucu mikroorganizmaların varlığı gibi diğer faktörlerin de etkili olduğu düşünülmektedir (McGroarty, 1993). Sağlıklı bir kadının hayatın farklı dönemlerinde vajinal fizyolojisindeki değişiklikler Çizelge 1.1 de özetlenmektedir. Çizelge 1.1. Sağlıklı kadınlarda hayatın farklı dönemlerinde vajinanın fizyolojik koşulları (Redondo-Lopez ve ark., 1990, McGroarty, 1993, Carranza-Lira ve ark., 2003). Gebelik / Yenidoğan Adet öncesi (prepubertal) dönem Adet (postpubertal) dönemi Postmenopozal dönem Östrojen düzeyi ++++ + +++ + ph <5,0 >5,0 <5,0 >5,0 Glikojen içeriği ++++ + +++ + Epitel kalınlığı Laktobasiller

5 1.1.4. Vajinal Mikroflora Vajinal mikroflora koliformlar, difteroidler, aerobik gram-pozitif koklar ve diğer potansiyel patojen bakterileri de içeren geniş bir mikroorganizma çeşitliliğine sahiptir. Normal postpubertal vajinal mikroflorada en baskın mikroorganizmalar Lactobacillus türleridir (Redondo-Lopez ve ark., 1990). Laktobasiller vajinal epitelyum yanında insan ve hayvanların intestinal kanal ve oral boşluklarındaki nemli yüzeylerde kolonize olan, çok az bir kısmı anaerobik koşullarda üremesine rağmen genel olarak fakültatif anaerob 3 üreyen mikroorganizmalardır (Vallor ve ark., 2001). Vajinal mikrofloranın tanımlanması için yapılan bir çalışmada, 54 sağlıklı kadının vajen florasından izole edilen 4997 izolat arasından 40 cins ve 94 tür tayin edilmiştir. Mikrofloranın belirlenmesine yönelik ilk çalışmalar, Lactobacillus acidophilus un genel olarak sağlıklı insan vajinasındaki laktobasiller arasında en sık izole edilen tür olarak kabul edildiğini göstermektedir. Bununla birlikte, daha güncel çalışmalar hangi türlerin baskın olduğu konusunda ilk çalışmalara ait sonuçlar ile benzerlik göstermemektedir (McGroarty, 1993). Sağlıklı bir kadının vajinal florasında L. acidophilus yanında L. johnsonii (jensenii), L. fermentum, L. casei, L. gasseri, L. brevis, L. plantarum, L. rhamnosus, L. crispatus, L. delbreuckii gibi diğer Lactobacillus suşları da mevcuttur (Sieber ve Dietz., 1998). Famularo ve ark. (2001), sağlıklı kadınlarda, L. acidophilus un yanında L. crispatus ve L. jensenii yi en yaygın vajinal Lactobacillus türleri olarak tanımlamışlardır. Aslım ve Kılıç (2006) Türk kadınlarının vajinal floralarından izole ettikleri suşlar arasında en yaygın (%21) bulunan suşun L. gasseri olduğunu saptamıştır. Bu çalışmalar, vajinal mikrofloranın ırka, yaşa ve yaşanılan bölgeye göre farklılıklar gösterebileceğini ortaya koymaktadır. Kılıç ve ark. (2001) tarafından yapılan bir çalışmada ise ABD ve Türkiye deki kadınlardan izole edilen laktobasiller arasında en yaygın elde edilen türlerin yaklaşık olarak eşit düzeylerde L. gasseri, L. crispatus ve L. jensenii olduğu gösterilmiştir. 3 Hem oksijenli hem de oksijensiz ortamda solunum yaparak gelişebilen (http://www.biyoweb.net).

6 Vajinanın ekolojisi, epitelyal hücrelerin glikojen içeriği, glukoz, ph, hormonal düzeyler, cinsel ilişki sırasındaki travma, doğum kontrol yöntemi, yaş, antimikrobiyal tedavi ve doğum gibi faktörlerden etkilenmektedir (Valenta, 2005). Laktobasillerin vajinadaki fonksiyonu, patojen mikroorganizmaların üremesini kısıtlayan bir ortam yaratmak ve bu ortamı sürdürmektir. Normal bir kadın genital mikroflorasındaki değişiklikler ve özellikle hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) üreten laktobasillerin azalması, genital ve üriner enfeksiyonlarda artışa sebep olmaktadır. Laktobasiller, hücre yüzeyinde patojenlerin yarışmalı olarak yerini alma (kompetetif eksklüzyon), antimikrobiyal bileşiklerin üretimi, besin maddeleri için yarışma ve immün sistemin stimüle edilmesi gibi çeşitli mekanizmalar ile ürogenital patojenlere engel olabilmektedir (Mastromarino ve ark., 2002). 1.2. Laktobasillerin Vajinal Ekosistemdeki Koruyucu Etkileri ve Olası Kontrol Mekanizmaları 1.2.1. Laktik Asit Üretimi ve Düşük Vajinal ph Laktobasiller düşük vajinal ph nın sürdürülmesine yardımcı olan laktik asit gibi çeşitli antimikrobiyal maddeleri üreterek vajinal ekosistemin kontrolünde koruyucu rol oynamaktadır (Al-Mushrif ve Jones, 1998). Laktobasillerin metabolizması sırasında üretilen laktik asitin vajinal asiditeye katkıda bulunmadığı, düşük vajinal ph nın birincil ve flora-kontrol edici kaynağının vajinal epitel hücreler tarafından üretilerek sekresyonlara karışan ve laktik asiti de içeren yağ asitleri olduğunu gösteren çalışmalar da mevcuttur (Redondo-Lopez ve ark., 1990). Rönnqvist ve ark., (2006) yaptıkları çalışmada ortalama vajinal ph nın vajinadaki laktobasil miktarı yüksek düzeylerde olduğunda önemli derecede düştüğünü göstermişlerdir. Vajinal ph değerinin 6,0 nın üzerinde (6,0-7,5 aralığı) olması enfeksiyona yol açan patojenlerin varlığını işaret etmektedir (Hanna ve ark., 1985). In vitro çalışmalar çeşitli Lactobacillus üreme ortamlarının asidifikasyonunun Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecalis, Klebsiella sp., Neisseria

7 gonorrhoeae, Eschericia coli, Gardnerella vaginalis, Salmonella typhimurium, Helicobacter pylori, Candida albicans, Mobiluncus türlerini içeren patojen mikroorganizmaların ve bakteriyel vajinozisli kadınların vajinal örneklerinden üretilen diğer bakterilerin çoğalmasını önlediğini göstermiştir (McGroarty, 1993, Tomas ve ark., 2003). 1.2.2. Hidrojen peroksit Üretimi Bir bakteriyel türün çoğalmasının hidrojen peroksit üreten başka bir bakteriyel tür tarafından inhibisyonu iyi bilinen bir bakteriyel antagonizma şeklidir (Eschenbach ve ark., 1989). Araştırmacılar, sağlıklı kadın deneklerin vajinal mikrofloralarında yaptıkları incelemelerde vajinal laktobasillerin büyük bir çoğunluğunun hidrojen peroksit üreten türler olduğunu göstermişlerdir. Bakteriyel vajinozis enfeksiyonu bulunan kadınlarda ise hidrojen peroksit üreten türlerin ancak yaklaşık %10 civarında mevcut bulunduğunu belirlemişlerdir (Al-Mushrif ve Jones, 1998, Eschenbach ve ark., 1989). Hidrojen peroksit üreten laktobasillerin kolonize olduğu kadınların bakteriyel vajinozis, HIV enfeksiyonu ve gonoreye yakalanma riskinin düşük olduğu belirtilmektedir (Vallor ve ark., 2001). Knezevic ve ark. (2005) HIV pozitif kadınlardan HIV negatif kadınlara göre daha az miktarda H 2 O 2 üreten laktobasil izole etmişlerdir. Otero ve Nader-Macias (2006), sığır vajinasından izole ettikleri L. gasseri CRL 1421 suşunun H 2 O 2 ve laktik asit üretiminin kombine etkisi sonucu patojenik Stapyhlococcus aureus üzerinde inhibitör etki gösterdiğini kanıtlayan çalışmalar yapmışlardır. Bu çalışmaların sonuçları, laktobasillerin özellikle hidrojen peroksit üreten türlerinin hayvanda ve insanda enfeksiyon riskini azalttığı şeklinde yorumlanmaktadır. 1.2.3. Bakteriyosin ve Bakteriyosin Benzeri Maddelerin Üretimi Bakteriyosinler bakteriler tarafından sentezlenen, genellikle aynı veya yakından ilişkili türlere ait suşları inhibe eden ve dar bir aktivite spektrumu gösteren protein

8 yapısında bakterisidal maddelerdir. Bakteriyosin benzeri maddeler ise, tam olarak tanımlanmamış veya tipik bakteriyosin tanımına uymayan, gram-pozitif ve gramnegatif bakteriler ile mantarlar üzerinde geniş bir aktivite spektrumuna eğilimli olan antagonistik maddelerdir. İnhibitör maddeleri üreten laktobasillerin ürogenital epitelyumda baskın olması, konakçının enfeksiyonlara karşı önemli bir savunma mekanizması oluşturmasında etkili bir faktördür. Araştırmacılar farklı Lactobacillus türleri tarafından üretilen bakteriyosin benzeri inhibitör maddeler sayesinde bu mikroorganizmaların ürogenital enfeksiyonların önlenmesinde olası probiyotik olarak uygulanabileceğini öne sürmüştür (McGroarty ve Reid, 1988, Ocana ve ark., 1999b). 1.2.4. Bariyer Popülasyonunun Oluşumu Ekolojide kompetetif eksklüzyon prensibi, iki türün aynı ekolojik bölgeyi (Lat. niche) kesinlikle aynı anda işgal edemeyeceğini belirtmektedir. İnsan vajinası söz konusu olduğunda sözü edilen bölge epitelyal hücreleri ifade etmektedir. Sterik engelleme ile hücrelere tutunmuş olan büyük miktarlardaki laktobasiller non-spesifik bir şekilde reseptör bölgelerini kaplayabilmektedir. Reseptörler için yarışma söz konusu olduğunda laktobasiller spesifik bağlanma bölgelerini işgal ederek, bu bölgelere patojenik mikroorganizmaların yerleşmesini engellemektedir. Üriner sistem enfeksiyonlarının tekrarından şikayet eden kadınlar laktobasillerin azaldığı bir ürogenital floraya sahiptir. Distal üretrada koruyucu bir film oluşturduğu düşünülen laktobasillere ait bariyer popülasyonunun, perianal bölgeden üst üriner kanala asılan E. coli gibi gram-negatif çubukların kolonizasyonunu ve enfeksiyonunu önlediği düşünülmektedir. Bariyer popülasyonu konakçının hormonal durumuna bağlı olarak önemli değişiklikler gösterebilmektedir (McGroarty, 1993).

9 1.2.5. İmmun Sistemin Stimulasyonu Lokal immun cevabın laktobasiller tarafından indüklenmesi olasılığı ve laktobasillerin vajinal mikroflorada makrofaj ve lenfosit aktivitesini düzenleyip düzenlemediği çeşitli çalışmalar ile araştırılmıştır. Gram pozitif bakteriyel hücre duvarı tarafından üretilen sinyal moleküllerinin, konakçıda çeşitli sitokinlerin (tümör nekrozis faktör, interlökin ve interferon) salımını veya üretimini stimule ettiği belirtilmektedir (Cross, 2002). Farelere oral olarak uygulanan L. casei nin fagositik aktiviteyi artırarak, enfeksiyon oluşturan bakterileri yok ettiği görülmüştür. L. casei ve L. acidophilus un sırasıyla subkutan ve intraperitonal enjeksiyonu fare peritonal makrofajlarının listerisidal aktivitesini stimule etmiştir. Önceden L. casei ile muamele edilen farelerde intraperitonal ve termal olarak oluşturulan yaralara Pseudomonas aeruginosa uygulandığında canlı kalan fare sayısının arttığı gözlenmiştir. Yapılan bir çalışmada L. bulgaricus un ürettiği antitümör bir madde olan blastolisinin aktif komponentinin, immunostimulan etkisi iyi bir şekilde tanımlanmış olan muramilpeptid içeren tetrasakkarit olduğu gösterilmiştir. Bu maddenin, tümör nekrosis faktör ve interferon gibi sitokinlerin üretimini stimule ettiği bilinmektedir (McGroarty, 1993). 1.3. Abnormal Vajinal Flora ile İlişkili Enfeksiyonlar Ürogenital enfeksiyonlar idrar kesesi, böbrekler, vajina, üretra, periüretra ve serviksi etkileyerek her yıl dünya çapında milyonlarca kadının hastalanmasına neden olmaktadır (Reid, 2001). Bu tür enfeksiyonlar zamanında tedavi edilmediğinde hamilelik sırasında prematüre doğum, nefrit, böbrek hasarı ve hatta ölüme kadar gidebilen ciddi komplikasyonlara neden olabilmektedir (Hoesl ve Altwein, 2005). Pek çok hasta, özellikle orijinal enfeksiyonun ilk yılında semptomların tekrar ortaya çıktığını deneyimlemektedir.

10 Üriner sistem enfeksiyonları Üriner sistem enfeksiyonlarına yol açan başlıca bakteriler E. coli, enterobakteriler, Staphylococcus saprophyticus ve Enterococcus faecalis olarak bilinmektedir. Genel olarak üriner sistem enfeksiyonu vakaları 1-7 gün arasında antibiyotik uygulanması ile tedavi edilebilmektedir. Bununla birlikte, üropatojenler arasında sıklıkla kullanılan antibiyotiklere (trimetoprim/sülfametoksazol gibi) karşı direnç gün geçtikçe artmakta ve hastalar üriner sistem enfeksiyonlarının tedavisinde veya bu tür hastalıklardan korunmak için alternatif doğal yöntemlere başvurmaktadırlar. Günümüzde, üriner sistem enfeksiyonları için koruyucu olarak idrar yoluna giren bakterilerin öldürülmesini sağlayan uzun süreli düşük dozlu antibiyotik tedavisi uygulanmakta ancak, bu tedavi şekli gerçek bir profilaksi sağlamamaktadır (Reid, 2001). Bakteriyel vajinozis Kadınlarda ürogenital hastalıkların en büyük nedeni olarak bilinen bakteriyel vajinozis (BV), vajinal florada hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) üreten türleri de içerecek şekilde Lactobacillus miktarında ve konsantrasyonunda azalma, Gardnerella vaginalis, Mobiluncus türleri, Mycoplasma hominis, Atopobium, Prevotella, Porphyromonas ve Bacterioides lere ait anaerobik gram-negatif çubuklar, Peptostreptococcus türleri, E. coli ve enterokoklar gibi aerobik bakterilerde artma ile ortaya çıkan bir hastalıktır. ph da artma (>5), kolonize olan patojenlerin ürettiği sialidaz ve aminden dolayı akıntı ve balıksı koku ile karakterize olan bu hastalık, üst genital kanalda enfeksiyona yol açarak hamileliklerde membranların erken yırtılmasına, erken doğumlara, düşük ağırlıklı bebek doğumu veya fetüsün/yenidoğanın ölümü gibi komplikasyonlara sebep olabilmekte, amniyotik sıvı enfeksiyonu, postpartum endometritis ve pelvik enflamasyon hastalığı gibi hastalıklara yol açmaktadır (Hillier ve ark., 1995, Kılıç ve ark., 2001, Reid ve Bocking, 2003, Anukam ve ark., 2006).

11 BV, yaşamı tehdit edici bir hastalık olmamasına rağmen, Chlamidia ve Herpes simplex virüsü enfeksiyonlarının yanı sıra HIV enfeksiyonu gibi cinsel yollar ile geçen hastalıkların bulaşma riskini artırmaktadır. Laktobasillerin ortamda tükenmesinden sonra HIV enfeksiyonuna maruz kalma olasılığındaki artış, bu kommensal bakterilerin virüse karşı bir çeşit bariyer oluşturduğunu düşündürmektedir. Laktobasillerin virüse karşı bariyer rolü oynamasında, asit üretimi, mukus veya spesifik antiviral ürünlerin üretiminin stimulasyonu gibi özellikleri söz konusudur. Böylece, BV si olan cinsel açıdan aktif kadınlarda HIV riskini azaltmak için vajinal floranın laktobasiller ile muamele edilmesi uygun bir yöntem olabilmektedir (Hillier ve ark., 1995, Reid, 2001). BV tedavisinde sıklıkla oral metronidazol (7 gün boyunca günde iki kez 500 mg) tedavisi uygulanmaktadır. Bunun yanı sıra, tek doz metronidazol, klindamisin vajinal krem (Voorspoels ve ark., 2002), metronidazol vajinal jel ve oral klindamisin de kullanılabilmektedir. Ancak, farklı mikroorganizmaların BV ye sebep olabilmesi, kür, tedavi ve iyileşmenin sağlanması gibi koşulları tek bir ajanın yol açtığı enfeksiyonların tedavisine göre daha komplike bir hale getirmektedir. Bu nedenle, etkinlik çoğu zaman yetersiz, enfeksiyonun tekrar etme riski yüksek ve hastaların ciddi yan etkilere maruz kalması söz konusu olabilmektedir (Famularo ve ark., 2001). Antibiyotik kullanımına bağlı olarak ortaya çıkan enfeksiyonlar Sistemik antibiyotik tedavisini takiben koruyucu normal floranın bozulmasından dolayı sıklıkla vulvovajinal kandidozis enfeksiyonları ortaya çıkmaktadır. Antibiyotik tedavisinden sonra, mesane ve vajinada ortaya çıkan bakteriyel enfeksiyonların yaygınlığı önemli sayılabilecek ölçüde yüksektir. Antibiyotik tedavisinin tamamlanmasından sonra, ürogenital flora hemen eski haline dönememekte, normale dönmeye başlaması ancak birkaç hafta sürebilmektedir (McGroarty, 1993).

12 Spermisid etkili preparatların kullanımı ile ilişkili enfeksiyonlar Nonoxynol-9 gibi spermisid içeren preparatların sürekli kullanımı vajinayı koruyucu hidrojen peroksit üreten laktobasil popülasyonunun azalmasına ve üropatojenlerin kolonizasyonunun artmasına yol açabilmektedir. Bu nedenle, spermisid kullanıcılarında ürogenital enfeksiyonların görülme sıklığı artmaktadır. Spermisid kullanan kadınların vajinal bölgelerinden alternatif kontraseptif yöntemleri uygulayan kadınlara göre iki kat daha fazla sıklıkta E. coli izole edilmiştir (McGroarty, 1993). Antimikrobiyal ajanlar bakteriyel enfeksiyonlar için klinik tedavide etkili olmasına rağmen, ürogenital patojenlerin antibiyotiklere karşı gösterdikleri direnç gün geçtikçe artmaktadır. E. coli ABD ve Kanada da trimetoprim/sulfametoksazol e karşı %18 civarında direnç gösterirken, İspanya da florokinolonlara karşı %30 civarında direnç göstermektedir. Bu bulgular, hastalıkların tedavisi için alternatif tedavi stratejilerinin geliştirilmesini kaçınılmaz kılmaktadır. Konuk olduğu canlının sağlığına yararlı etki sağlayan canlı bakterilerin ürogenital sistem enfeksiyonlarının tedavisinde kullanılması potansiyel yaklaşımlardan biridir. Vajinada kolonize olabilme ve ürogenital enfeksiyonlara sebep olan patojenlerin üremesini ve adezyonunu önleme açısından uygun suşun seçimi ile laktobasillerin tedavide oral veya vajinal yolla uygulanması, bu tip enfeksiyonlara yakalanma riskini azaltmaktadır (Reid ve Burton, 2002). 1.4. Laktobasillerin Ürogenital Hastalıkların Önlenmesinde ve Tedavisinde Destekleyici Ajan (Probiyotik) Olarak Kullanılması 1.4.1. Probiyotik: Tanımı, Klinik Etkileri Probiyotikler, insan veya hayvana uygulandığında konuk olduğu ev sahibi canlının (konakçının) mikrobiyal dengesini geliştirerek sağlığı üzerinde yararlı etkiler gösteren tek veya karışım halindeki canlı mikroorganizma kültürleridir (Kaur ve ark.,

13 2002, Mastromarino ve ark., 2002). Araştırmacılar, probiyotik terimini enfeksiyonları önlemek ve bozulmuş ekolojik dengeyi düzenlemek için intravajinal olarak kullanılan canlı preparatları tanımlamakta da kullanmaktadırlar (McGroarty, 1993). Probiyotiklerin insanlarda kullanım alanları ve iyi bir probiyotik suşun taşıması gereken özellikler sırasıyla Çizelge 1.2 ve Çizelge 1.3 te yer almaktadır. Bu bilgiler, ihtiyaç duyulan bölgeye uygulandığında konakçıya yararlı etkiler sağlayan probiyotik mikroorganizmaların seçiminde yol gösterici olabilir. Çizelge 1.2. Probiyotiklerin klinikte kullanım alanları (Salminen ve ark., 1998a, Kopp- Hoolihan, 2001, Kaur ve ark., 2002, Plant ve Conway, 2002, Fioramonti, 2003, Saxelin, 2005). Probiyotiklerin kullanım alanları ve klinik etkileri Mikrobiyal floranın dengelenmesi Candidiasis ve üriner sistem enfeksiyonlarının iyileştirilmesi İmmun sistemi düzenleyici aktivite Antimutajenik/antikarsinojenik aktivite Kanser oluşumunda etkili olan fekal enzimlerin azaltılması Kabızlığın önlenmesi için intestinal geçiş süresinin düzenlenmesi İrritabl bağırsak sendromu semptomlarının giderilmesi Yolculuk, antibiyotik kullanımı ve radyoterapi kaynaklı diyarenin tedavi edilmesi Serum kolesterol düzeylerinin dengelenmesi Helicobacter pylori ile ilişkili ülserlerin önlenmesi Çocuklarda mide koruyucu etkileri Alerjik rinitin iyileştirilmesi Besin kaynaklı alerjilerin azaltılması Yenidoğanda süt alerjisi/atopik dermatitin iyileştirilmesi ve atopik hastalık riskinin azaltılması Laktoz malabsorbsiyonu semptomlarının düzeltilmesi Gıda kaynaklı patojenler ve diş çürüğüne sebep olan organizmalara karşı antagonizma Solunum yolu enfeksiyonları riskinin azaltılması Aşı adjuvan (taşıyıcı) etkileri Romatoid artrit semptomlarının giderilmesi

14 Çizelge 1.3. Probiyotik bakteri olarak önerilen suşların taşıması gereken özellikler (Kailasapathy ve Chin, 2000, Salminen ve ark., 1998b, Kaur ve ark., 2002, Pusch ve ark., 2006). İyi bir probiyotik suşun taşıması gereken özellikler İnsan orijinli olma GRAS (genel olarak güvenli) statüsünde olma Gıdada ve klinik kullanımda güvenli olma Karsinojenik ve patojen olmama Doğru suş tanımlaması ve karakterizasyon, belgelenmiş güvenlik ve etkinlik İmmün sistemi zayıf ev sahibi canlıda bile non-patojenik olma Uygulandığı bölgede kolonize olabilme Patojenler üzerinde inhibitör etki gösteren asit, hidrojen peroksit, bakteriyosin ve diğer antimikrobiyal maddelerin üretimi Patojen bakterilere karşı antagonizma (Patojen eksklüzyonu, patojen adezyonunun önlenmesi veya azaltılması, genitoüriner sistem ve gastrointestinal sistem florasının düzenlenmesi) İstenen antibiyogram profiline sahip olma (Örn. istenen düzeyde antibiyotik/antifungal direnci) Yetişkin mukozal immün sisteminde canlı kalabilme Safra, asit, enzim ve oksijene dayanıklı olma İnsan bağırsak hücrelerine ve intestinal mukus glikoproteinlerine (müsin) bağlanma Bağırsaklarda canlı kalabilme, adezifliği ve diğer özellikleri sürdürebilme Uygun sitokin stimülasyonu ile mukozal immün sistem için immunostimulatör olma Antimutajenik ve antikarsinojenik özellikler (genotoksik ajanlara karşı koruma) gösterebilme Rekombinant proteinlerin ve peptidlerin insan gastrointestinal ve genitoüriner sisteminde uygun bölgeye taşınması için potansiyel bir taşıyıcı olma Sağlık üzerinde klinik olarak doğrulanmış ve belgelenmiş etkiler gösterebilme Normal dengeli flora oluşumu için koagregasyon Teknolojik uygunluk Çizelge 1.3 te yer alan özellikler bir genelleme olup, bu özelliklerin hepsi her patojenin yarattığı enfeksiyonu engellemede gerekli olmayabilir.

15 Süt ürünleri ve farmasötik probiyotik preparatlarında kullanılan mikroorganizmaların bir listesi Çizelge 1.4 te yer almaktadır. Bununla birlikte bu mikroorganizmaların çok azı yararlı özellikleri açısından iyi bir şekilde belgelenmiştir. Çizelge 1.4. Gıdada ve farmasötik ürünlerde probiyotik olarak kullanılan suşlar (Collins ve ark., 1998, Kaur ve ark., 2002, Hoesl ve Altwein, 2005). Lactobacillus türleri Bifidobacterium türleri Diğer L. acidophilus L. plantarum L. casei subspecies rhamnosus L. brevis L. delbreuckii subspecies bulgaricus L. fermentum L. gasseri L. helveticus L. johnsonii L. rhamnosus L. bulgaricus L. lactis L. paracasei L. reuteri L. salivarius B. bifidum B. longum B. infantis B. breve B. adolescentis B. lactis Streptococcus salivarius subspecies thermophilus Lactococcus lactis subspecies lactis Lactococcus lactis subspecies cremonis Enterococcus faecium Enterococcus faecalis Leuconostoc mesenteroides subspecies dextranium Propionibacterium freudenreichii Pediococcus acidilactici Saccharomyces boulardii Farmasötik preparatlarda kullanılması planlanan probiyotik suşların klinik değerlendirilmesinin Çizelge 1.5 te özetlendiği şekilde yapılması uygundur.

16 Çizelge 1.5. Probiyotiklerin klinik değerlendirmesi için yapılması gereken çalışmalar (Salminen ve ark., 1998b). Değerlendirilecek faktör Laktik asit bakterilerinin intrinsik özellikleri Metabolik ürünler Mukozal etkiler Doz-cevap etkileri Klinik değerlendirme Epidemiyolojik çalışmalar Klinik kriterler Adezyon faktörleri, antibiyotik rezistansı, plasmidlerin ve plasmid transfer potansiyelinin varlığı, enzim profili Konsantrasyonlar, intestinal mikrofloradaki antimikrobiyal etkiler, güvenlik İntestinal hücrelere ve mukusa adezyon, intestinal mukus degredasyonu Gönüllülerdeki oral uygulama ile doz cevap çalışmaları Yan etki potansiyeli, hastalık-spesifik etkiler, beslenme çalışmaları, intestinal mikroflora etkileri Sağlığa olan etkileri ve güvenlik için yeni suşların ve ürünlerin girişini izleyen büyük popülasyonların denetlenmesi Fonksiyonel ve klinik kullanım için probiyotik özelliklerin iyi klinik uygulamalar ile gösterilmesi için gereklilikler şu şekilde sıralanabilir: - Her suş bağımsız olarak belgelenmeli ve test edilmeli - Yakından ilişkili suşların verilerinin ekstrapolasyonu kabul edilmemeli - İyi tanımlanmış probiyotik suşlar, iyi tanımlanmış çalışma hazırlıkları - Çift körlü plasebo kontrollü insan çalışmaları - Randomize insan çalışmaları - Çeşitli bağımsız araştırma grupları tarafından doğrulanmış sonuçlar (Salminen ve ark., 1998b). 1.4.2. Vajinal Probiyotik Olarak Kullanılan Laktobasillerin Taşıması Gereken Özellikler Vajinal enfeksiyonların Lactobacillus ile replasman tedavisi ilk kez 1933 te ABD de Mohler ve Brown tarafından gündeme getirilmiştir (Famularo ve ark., 2001). Bu

17 tedavi yaklaşımı günümüzde artan antibiyotik direnci, hastaların doğal tedavi yöntemlerini tercih etmesi ve yararlı mikroorganizmaların kullanımına yönelik bilimdeki gelişmeler gibi pek çok nedenle gittikçe artan düzeyde ilgi toplamaktadır (Reid, 2000). 1940 larda antibiyotikler ve hızlı etki gösteren ilaçların ortaya çıkması, bakteriler ile tedaviyi (bakteriyoterapi) geri planda bırakmıştır. Ancak, son zamanlarda laktobasiller ve diğer canlı mikroorganizmaların insanda gastrointestinal ve ürogenital sistem hastalıklarının önlenmesi ve tedavisinde kullanılmasına olan ilginin artması ile birlikte yararlı bakteriler ile tedavi tekrar gündeme gelmiştir. Konvansiyonel farmasötik tedavilerin aksine canlı mikroorganizmalar ile tedavi, doğal oluşu ve yan etkilere yol açmaması nedeniyle günümüzde tekrar ilgi odağı haline gelmektedir. Vajinal probiyotik olarak kullanılan laktobasiller konakçıyı proliferasyonun inhibisyonu, toksin üretimi veya patojenik mikroorganizmaların adezyonu gibi durumlardan koruyabilmeli, toksik olmamalı ve vajinal mikroflorayı düzenleyebilmelidir (McGroarty, 1993). Kullanılacak suşların seçiminde kolay üretilebilme, üretim maliyetinin düşük olması ve raf ömrü gibi faktörler dikkate alınmalıdır. Vajinal probiyotiklerin taşıması gereken özellikler aşağıda ayrıntılı olarak açıklanmaktadır. 1.4.2.1. Patojen Olmama Probiyotik olarak kullanılacak olan laktobasiller konakçı canlı üzerinde patojenik etki göstermemelidir (McGroarty, 1993). Laktobasiller genel olarak insanlar için non-patojenik olarak bilinmektedir. Buna rağmen, neden olarak laktobasillerin gösterildiği menenjit, endokardit, pnömoni ve safra kesesi gibi bakteremik enfeksiyonlara ilişkin klinik raporlar mevcuttur. Bu enfeksiyonlar genel olarak immün sistemi baskılanmış veya temelde bazı hastalıkların mevcut bulunduğu hastalarda görülmüştür ve nadir olarak değerlendirilmektedir (Apostolou ve ark., 2001). Bununla birlikte, oral veya intravajinal kullanılan bir ticari Lactobacillus preparatının hastalık oluşturucu etkisi ile ilgili herhangi bir bildirime rastlanmamıştır.

18 Yine de, laktobasillerin fırsatçı patojenler olarak ortaya çıkma olasılığı konusunda dikkatli olunması gerekmektedir (McGroarty, 1993). 1.4.2.2. Dokuya Tutunma (Adezyon) ve Vajinada Kalabilme Mikroorganizmaların epitel hücrelere adezyonu kolonizasyon, spesifik bir bölgede varlıklarını sürdürme ve endojen bakteriyel floranın oluşması açısından temel basamaktır (Mardh ve Westrom, 1976, Mastromarino ve ark., 2002). Bu nedenle, probiyotik preparatlarda kullanılmak üzere seçilen laktobasillerin vajinal epitelyuma iyi bir şekilde tutunması gerekmektedir. Laktik asit bakterilerinin epitelyal ve mukozal yüzeylere adezyonu pek çok faktörü içeren kompleks bir işlemdir. Bakteriyel adezyon, bakteri ve reseptör hücre arasındaki spesifik veya nonspesifik etkileşimler sonucu meydana gelmektedir. Nonspesifik bağlanma, bakteri yüzeyi yüklerine ve hidrofobluğuna bağlı olarak elektrostatik veya hidrofobik etkileşimlerden kaynaklanmakta, spesifik bağlanma ise bakterinin yüzey antijenleri olan adezinler 4 (fimbriya 5, glikokaliks 6 gibi) ile konakçı hücredeki karbonhidrat reseptörleri arasındaki etkileşimler ile ortaya çıkmaktadır (Ibwala ve ark., 1990, Buck ve ark., 2005). Chan ve ark., (1985), Lactobacillus ların üroepitelyal hücrelere bağlanmasının bakteriyal glikokaliks veya hücre duvarı aracılı olabileceğini öne sürmüştür. Mukozal yüzeylere bağlanma probiyotiklerin ev sahibi canlıyı etkileme süresini uzatmaktadır. Bakterilerin adezyon özelliklerinin belirlenmesinde hedef bölgelerdeki epitel hücre dizileri ve mukus glikoproteinlerinin kullanıldığı çalışmalar mevcuttur (Ouwehand ve ark., 2001). Mikroorganizmaların konakçı dokuya tutunmasında dış yüzeylerinin hidrofobik yapısının da etkili olduğu öne sürülmekte ve bakterilerin in vitro hidrokarbonlara tutunma deneyleri ile adezyon özellikleri hakkında değerlendirme yapılabileceği belirtilmektedir (Rosenberg ve ark., 1980, Vinderola ve Reinheimer, 2003). L. acidophilus, L. jensenii ve L. gasseri ile yapılan bir çalışmada bakterilerin vajinal epitelyal hücrelere adezyonundan sorumlu 4 Bakteri yüzeyinde bulunan ve konakçı dokularına tutunmayı sağlayan protein, polisakkarit veya lipit yapısındaki maddeler (www.toraks.org.tr). 5 Bakterilerin yüzeyinde bulunan ve yüzeylere tutunmalarını sağlayan protein yapısındaki uzantılar. 6 Hücre duvarı dışında bulunan protein veya glikoprotein yapısında ağımsı yapı.

19 faktörlerin glikoproteinler veya karbonhidratlar olabileceği ileri sürülmüştür (Atassi ve ark., 2006a). Laktobasillerin adezyonu ile ilgili olarak gastrointestinal sistemde yapılan çalışmalar bu mikroorganizmaların konakçı canlıya spesifiklik gösterdiğini kanıtlamıştır (Stadler ve Viernstein, 2003). Apostolou ve ark. (2001), intestinal yüzeylere adezyonda insan feçes izolatlarının süt ürünlerinden elde edilen izolatlara göre daha iyi sonuçlar verdiğini göstermiştir. Yapılan çalışmalarda, rodentlerden izole edilen laktobasillerin tavuk epitel hücrelerine tutunmadığı, benzer şekilde bu durumun tam tersi denendiğinde de aynı sonucun alındığı görülmüştür. Yoğurttan izole edilen Lactobacillus suşlarının vajinal epitelyal hücrelere insan vajinasından izole edilen suşlar kadar iyi tutunmadığı belirlenmiştir. Kadın ürogenital kanalından izole edilen Lactobacillus suşunun farede kullanılması ile de kısıtlı başarının elde edildiği bir çalışma yapılmıştır (McGroarty, 1993). Bu çalışmalara ait sonuçlar, insan vajinasından elde edilmiş bir Lactobacillus suşunun vajinada etkin bir şekilde kolonize olabilme potansiyelinin diğer izolatlara göre daha yüksek olduğu beklentisini ortaya çıkarmaktadır (Famularo ve ark., 2001). Bakteriyel adezyonun belirlenmesinde uygun boyama işleminden sonra doğrudan ışık mikroskobu ile sayım, floresan etiketli organizmaların görüntülü analizi (Bianchi ve ark., 2004), hemaglütinasyon, ince tabaka kromatografi plaklarındaki immobilize moleküllere bağlanma, radyoetiketleme (Ouwehand ve ark., 2001) ve immünolojik yöntemler gibi metotlar kullanılmaktadır (O Mahony ve ark., 2005). Bu yöntemlerden hemaglutinasyon testi, memeli epitel hücre reseptörleri ile eritrosit membran reseptörleri arasındaki benzerlikten dolayı, bakterilerin eritrositleri çöktürme kapasitesinin epitel hücrelere tutunma özelliklerinin değerlendirilmesinde kullanıldığı bir testtir (Ocana ve ark., 1999a). Bakterilerin epitel hücrelere tutunma özelliklerinin belirlenmesinde bakterinin sayımı ve gözlenmesi için en yaygın olarak kullanılan yöntem ışık mikroskobu ile sayım metodudur (An ve Friedman, 1997). Lee ve ark. (2000) probiyotik bakterilerin intestinal dokuya adezyon özelliklerini hem Caco-2 hücrelerini kullanarak mikroskobik sayım ile ve hem de intestinal

20 mukus kullanarak radyoaktif etiketleme ile belirlemişler, elde ettikleri sonuçların birbiri ile uyumlu olduğunu göstermişlerdir. Laktobasillerin ürogenital kanalın dokularına bağlanmasında adezinlerin rolü hakkında çok az veri mevcuttur. Ürogenital sistemdeki laktobasillerin adezyon mekanizmaları halen araştırılmakta olup, son yıllarda bu alanda yapılan çalışmalar bakteriyel hücre tarafından üretilen proteinik yapılardan ekzopolisakkaritlerin de adezyonda önemli etkisi olabileceğini göstermektedir. Ekzopolisakkarit (EPS) üretimi ve bakteri adezyonu üzerindeki etkisi Mikroorganizmaların mukozal yüzeylere bağlanmasında mikrobiyal hücre yüzeyindeki proteinler ve polisakkaritler önemli rol oynamaktadır (Pridmore ve ark., 2004). Ekzopolisakkaritler (ekzosellüler polisakkaritler), bakterilerin çoğalması sırasında kapsül oluşturarak hücre yüzeyine veya serbest polisakkaritler olarak hücre dışına salınan, şeker veya şeker türevlerinin dallanmış ve tekrar eden ünitelerini içeren uzun zincirli polisakkaritlerdir. Bu maddeler gastrointestinal sistemde biyofilm oluşturarak uzun süre kalabilmektedirler. Bu nedenle, probiyotik bakterilerin yüzeylere adezyon ve kolonizasyon özelliklerini geliştirdikleri düşünülmektedir (Welman ve Maddox, 2003, Durlu-Özkaya ve ark., 2007). EPS, mikrobiyal hücrenin fagositoza, faj ataklarına, antibiyotiklere, metal iyonları, sülfür dioksit ve etanol gibi toksik bileşiklere ve ozmotik strese karşı korunmasında önemli bir rol oynamaktadır. Bunun yanında EPS nin, antitümör, antiülser, immünostimulan etkiler gösterdiği ve kan kolesterol düzeylerini düşürdüğü de öne sürülmektedir (Şekil 1.4). EPS polimerlerinin mukozal immün sistemde sinyal molekülleri olarak da görev yaptığı düşünülmektedir (Şengül ve ark., 2005). Laktik asit bakterileri tarafından üretilen EPS nin ekolojik fonksiyonu tam olarak tanımlanamamış ve kompleks bir olay olmasına rağmen, adezyon ve farklı ortamlarda hücrenin korunması ile ilgili olduğu düşünülmektedir (Ruas-Madiedo ve ark., 2002).

21 LAKTİK ASİT BAKTERİSİ MİDE EPS GUT Prebiyotik Antiülser İMMÜN SİSTEM Lemfosit proliferasyonu Makrofaj aktivasyonu Sitokin üretimi KAN Kolesterol düşürücü Antitümör aktivite Şekil 1.4. Laktik asit bakterileri tarafından üretilen EPS nin sağlık üzerindeki olası etkilerinin şematik gösterimi (Ruas-Madiedo ve ark., 2002). 1.4.2.3. Patojenlerin Adezyonunu ve Kolonizasyonunu Önleme Laktobasillerin vajinayı üropatojenlerin kolonizasyonundan koruma mekanizmaları, adezyon reseptörleri (etkileşim ve koagregasyon) için yarışma ve antimikrobiyal maddelerin (H 2 O 2, laktik asit, bakteriyosinler ve bakteriyosin benzeri maddeler gibi) üretimi olarak özetlenebilir (Osset ve ark., 2001). Laktobasillerin patojenik mikroorganizmaların insan epitelyal hücrelerine adezyonunu engellemek için kullanıldıklarını gösteren in vitro ve in vivo çalışmalar mevcuttur. Chan ve ark. (1985) ve Reid ve ark. (1987), HeLa hücrelerine adezyon için ürovajinal Lactobacillus kültürleri ile üropatojenler arasındaki yarışmada etkili mekanizmanın, reseptör bölgelerin spesifik blokajından ziyade laktobasillerin hücre duvarı fragmanlarından kaynaklı sterik engelleme olduğunu ileri sürmüşlerdir. Candida albicans ile yapılan bir çalışmada laktobasillerin bu patojenin vajinal epitel hücrelere ve HeLa hücrelerine adezyonunu yüksek oranda azalttığı gösterilmiştir. Chan ve ark. (1985), Lactobacillus casei GR-1 in tüm hücre ve hücre duvarı fragmanlarının üropatojenlerin üroepitelyal hücrelere adezyonunu önlediğini ve dişi sıçanları üriner sistem enfeksiyonlarından koruduğunu göstermişlerdir. Bununla birlikte, ticari bir Lactobacillus suşu ile çalışıldığında bu suşun E. coli nin adezyonunu hiçbir şekilde

22 etkilemediği gözlenmiştir. Bu durum, probiyotik olarak seçilecek laktobasillerin kullanım amaçlarına uygun olarak taşımaları gereken probiyotik özelliklerinin doğru bir şekilde tanımlanması gerektiğini ortaya koymaktadır (McGroarty, 1993). 1.4.2.4. Popülasyon Stabilitesi Yapay olarak yerleştirilen laktobasiller vajinal epitelyuma tutunabilmeli ve ortamda bulunan ve çoğalan endojen mikroorganizmalar ile birleşebilmelidir (koagregasyon oluşturabilmelidir). Koagrege mikroorganizma çiftleri arasındaki etkileşimlerin yüksek spesifiklikte lektin-karbonhidrat etkileşimleri üzerine kurulu olduğu düşünülmektedir. Araştırmacılar bu özelliğin laktobasillerin belirli ortamlardaki kolonizasyon ve biyofilm oluşturma potansiyelini artırabileceğini belirtmişlerdir (McGroarty, 1993, Wimpenny ve Colasanti, 2004). 1.4.2.5. Patojenler Üzerinde Antimikrobiyal Aktivite Ürogenital enfeksiyonların önlenmesi ve tedavisinde probiyotik olarak önerilen suşların ürettikleri hidrojen peroksit, laktik asit, bakteriyosin ve bakteriyosin benzeri maddeler ile üropatojenler üzerinde antimikrobiyal aktivite göstermeleri bu suşlarda aranan başlıca özellikler arasındadır. Laktik asit bakterilerinin (LAB) vajinada ürogenital patojenleri genel olarak inaktive etme mekanizmaları Şekil 1.5 te görülmektedir. Kommensal bakteriler tarafından veya dışarıdan uygulanan probiyotik organizmalar tarafından üretilen sinyal moleküllerinin ev sahibini aktive ettiği (Örn. mukus üretimini aktive ederek) ve/veya patojenin cevabını inhibe ettiği (Örn. virulans genlerinin inaktivasyonu) düşünülmektedir. Bu tür mekanizmalar ile laktobasillerin üropatojenik E. coli nin florada baskın olma ve mesaneye çıkma yeteneğini azalttığına inanılmaktadır (Reid ve ark., 2001).

23 Asit H 2 O 2 Bakteriyosinler Mukus üretimi? Vajinal epitelyum Ekzosellüler matris bağlayıcı proteinler Adezinler Hücre sinyalleşme proteinleri Patojenin virulans genlerini kapatan sinyaller Şekil 1.5. Laktik asit bakterilerinin (LAB) vajinada patojen adezyonunu ve enfeksiyonu önleme mekanizmaları (Reid ve ark., 2001). Kadınlarda üriner kanal enfeksiyonları, vulvovajinal kandidiazis ve bakteriyel vajinozis gibi enfeksiyonları önlemek için yapılan çalışmalarda laktobasillerin kullanılması ile değişen düzeylerde başarılı sonuçlar alınmıştır. Anukam ve ark. (2006), Lactobacillus rhamnosus GR-1 ve Lactobacillus reuteri RC-14 içeren ve her gece bir kez kullanılan kapsüller ile %0,75 metronidazol içeren ve günde iki kez kullanılan vajinal jelin siyah kadınlardaki etkinliğini klinik olarak incelemişlerdir. Laktobasillerin 5 gün boyunca intravajinal uygulanması ile metronidazol vajinal jele göre daha etkili sonuçlar elde edilmiştir. Bruce ve Reid (1988), fizyolojik suda 10 11 organizma/ml konsantrasyonda resüspande ettikleri L. casei ssp. rhamnosus GR-1 suşunu haftada iki kez hastaların vajenlerine yerleştirmişler ve hastaların tümünün üriner kanal enfeksiyonlarından korunduğu gözlemlemişlerdir. Reid ve ark. (1994) 0.5 g liyofilize L. casei var rhamnosus GR-1 içeren (>10 9 canlı hücre) bir jelatin kapsülü hastaya vajinal yolla uygulamışlar ve bakterileri implantasyondan 7 hafta sonra vajinadan canlı olarak geri elde etmişlerdir. Suşun plazmid içeriğinin kolonizasyon süresince değişmeden kalabildiğini göstermişlerdir. Hasta, ovülün uygulanmasından sonra iki gün içinde vajinit semptomlarından kurtulmuş ve 7 hafta boyunca da idrar yoluyla ilgili, vajinal veya sistemik herhangi bir semptom görülmemiştir.

24 Tedavide kullanılan mikroorganizmaların hedef bölgeye ulaşması için en uygun yol vajinaya yerleştirmek olmasına rağmen, oral uygulamalar da mevcuttur. Üropatojenler gibi Lactobacillus ların da ağızdan alındıktan sonra bağırsak aracılığıyla vajina ve idrar kesesine ulaşmaları mümkün olabilmektedir (Reid, 2000). Bu çalışmalar ümit verici görünmesine rağmen, raporlar gerekli kontrollerin gecikmesi veya hasta uyuncunun düşük olması gibi nedenlerden dolayı yetersiz kalmaktadır. Pek çok rapor ise çeşitli laktobasil preparatlarının tedavideki etkinliğinin deneysel veriler ile desteklenmediği bilgileri içermektedir. Daha kesin sonuçlar için randomize, çift körlü, plasebo kontrollü çalışmalara ihtiyaç duyulmaktadır. Tedavide, dikkatli bir şekilde seçilmiş ve özellikleri belirlenmiş laktobasillerin kullanılması ve tedavi boyunca vajinal florada gözlenen mikrobiyolojik verilere ait detaylı bilgilerin de toplanması gerekmektedir (McGroarty, 1993). Yukarıda sözü edilen özellikleri içeren probiyotik suşların ürogenital enfeksiyonların önlenmesi ve tedavisinde oral veya vajinal yolla uygulanabilmesi için dayanıklılıklarının artırılması ve hasta tarafından alınmalarının kolaylaştırılması için dozaj formu haline getirilmeleri önemli bir gerekliliktir. Ürogenital enfeksiyonlar için oral yolla kullanımlarına ilişkin çalışmalar mevcut olsa da söz konusu etkinin vajinaya lokal uygulama ile çok daha etkili sonuçlar vereceği düşünülmektedir. Vajinal uygulamada dozaj formunun ortamda kalış süresinin uzatılarak bakterilerin vajinal ortamdan hemen uzaklaşmasının önlenmesi ve dokuya tutunmalarının sağlanması için mukoadezif polimerler kullanılarak hazırlanan dozaj formlarının etkili olabileceği düşünülmektedir.

25 1.5. İlaç Uygulama Yeri Olarak Vajina Kadınlar ile ilgili bazı hastalıkların tedavisinde vajinal yol, lokal ve sistemik ilaç salımı için sıklıkla tercih edilen bir bölgedir. Genel olarak, vajinal boşluk lokal etki gösteren antibakteriyel, antifungal, antiprotozoal, antiviral ilaçlar, antienflamatuvarlar, spermisid ajanlar, prostaglandinler ve steroidlerin salımı için kullanılmaktadır (Vermani ve Garg, 2000, Valenta, 2005). 1.5.1. Vajinal Yol ile İlaç Uygulamanın Avantajları ve Dezavantajları Vajinal yolla ilaç uygulamanın avantajları, karaciğerde ilk geçiş metabolizmasından kaçınmak, gastrointestinal yan etkilerin önlenmesi, steroidlerin hepatik yan etkilerinin azaltılması, parenteral uygulamadaki ağrı, doku hasarı ve olası enfeksiyonların üstesinden gelinmesi ve ilaç şeklini hastanın kendi başına uygulayabilmesi ve gerekiyorsa uzaklaştırılabilmesi şeklinde sıralanabilir (Vermani ve Garg, 2000). Vajinal yolla ilaç uygulamada ortaya çıkan kısıtlayıcı faktörler, cinsiyete özgü ve hastalar tarafından az tercih edilen bir uygulama yolu olması (Vermani ve Garg, 2000, Valenta, 2005), östrojen konsantrasyonunun vajinal membranın geçirgenliğini etkilemesi ve dolayısıyla sistemik etki için tasarlanan ilaçların farmakokinetik özelliklerinin değişebilmesi, vajinal sıvı hacminin düşüklüğünün ilaçların vajinal absorbsiyonunu etkilemesidir. Ortamda nem filminin bulunması bir ilacın absorblanmadan önce çözelti halinde olması gerektiği için bir avantaj olmasına rağmen, kalın bir servikal mukus tabakasının bulunması ilaç absorbsiyonunda bir bariyer oluşturmakta ve yüksek miktarlardaki vajinal sıvı ilaç şeklinin uzaklaşmasına da neden olabilmektedir (Valenta, 2005).

26 1.5.2. Vajinal Uygulamaya Yönelik İlaç Şekilleri Vajinal dozaj formu olarak en sık kullanılan ilaç şekilleri kremler, jeller, tabletler, kapsüller, ovüller, köpükler, merhemler, filmler, tamponlar ve vajinal halkalardır. Genel olarak vajinal dozaj formları, sızıntı, bulaşma ve ortamda kalma süresinin azlığı gibi kısıtlamalardan dolayı hasta uyuncunu zorlaştırabilmektedir. Vajinal ilaç salım sistemlerinin tasarımında hasta uyuncunun olduğu kadar klinik gerekliliklerin de (istenen dağılma süresi, biyoadezyon, kalış süresi ve salım özelliklerinin) karşılanması gerekmektedir. İlacın ortamda kalış süresini artırmak, etkin maddeyi uzatılmış sürede ve tahmin edilen hızda salmak gibi amaçlara yönelik olarak geliştirilen mukoadezif formülasyonlar vajinal uygulamaya yönelik olarak sıklıkla tercih edilen ilaç şekilleri olarak karşımıza çıkmaktadır. Vajinal dozaj formlarının geliştirilmesi ve değerlendirilmesinde vajinal mikroflora, ph ve siklik değişiklikler gibi ortama bağlı özellikler göz önünde bulundurulmalıdır (Vermani ve Garg, 2000, Valenta, 2005). 1.5.3. Mukoadezyon: Tanımı ve Mekanizması Doğal veya sentetik bir polimerin biyolojik bir substrata bağlanması ve bu iki yüzeyin yüzeyler arası kuvvetler ile uzun bir süre bir arada tutulması durumu biyoadezyon olarak tanımlanmaktadır. Biyolojik yüzey epitelyal doku veya bir dokunun yüzeyindeki mukus tabakası ise mukusa veya mukoz bir membrana adezif olarak bağlanma mukoadezyon olarak tanımlanmaktadır. Mukoadezyon, ilaç immobilizasyonu veya lokalizasyonu için pratik bir metottur (Ahuja ve ark., 1997, Huang ve ark., 2000, Smart, 2005). Mukoadezif ilaç salım sistemlerinin avantajları şu şekilde sıralanabilir: - ilacın adsorbsiyon bölgesinde uzun kalış süresi, - salım sisteminin belirli bir hedef bölgede lokalizasyonu, - salım sisteminin mukozal yüzey ile yoğun temasından dolayı ilaç konsatrasyon gradyanındaki artış.

27 1.5.3.1. Mukus Mukoadezif Polimer Etkileşimi Mukus Tabakası Mukoadezyonda adezif yüzeyin oluşumundan sorumlu doku tabakası mukustur. Mide, bağırsak, bronşlar gibi bölgelerde bulunan tek tabakalı epitelyum, mukusu doğrudan epitel yüzeylerin üzerine salan goblet hücrelerini içerirken, özefagus, kornea, vajina gibi bölgelerde bulunan çok tabakalı epitel ise tükrük bezleri gibi mukusu epitel yüzeylerin üzerine salan özel bezleri içeren dokuları içerir veya bu dokulara bitişiktir (Smart, 2005). Vajinal epitelyum goblet hücrelerinin bulunmamasına ve müsinin doğrudan olarak salındığı bir bölge olmamasına rağmen, vajinaya uterus sıvısı aracılığıyla veya ovülasyonda foliküler sıvı aracılığıyla ulaşan sekresyonlardan dolayı mukozal bir yüzey olarak nitelendirilmektedir (Valenta, 2005). Mukusun başlıca komponentleri su, glikoproteinler (müsinler), lipitler, mineral tuzlar ve serbest proteinlerdir (Ahuja ve ark., 1997, Valenta, 2005). Servikal mukus, sözü edilen komponentlerin yanı sıra kolesterol, inorganik iyonlar, üre ve yağ asitlerini (laktik ve asetik asitler) de içermektedir (Burruano ve ark., 2002). Mukusun bileşimi canlı türüne, anatomik lokasyonuna ve organizmanın normal veya patolojik durumuna göre değişebilmektedir. Mukusun jel benzeri davranışından sorumlu temel bileşeni glikoproteindir ve bu jel yapı glikoprotein molekülleri arasındaki non-kovalan etkileşimler (disülfit bağları, elektrostatik ve hidrofobik etkileşimler) ile stabilize edilmiştir (Jabbari ve ark., 1993). Mukus glikoproteinleri (müsinler) bir protein çekirdek ve buna kovalan bağlar ile bağlı karbonhidrat yan zincirlerinden oluşmaktadır (Şekil 1.6). Karbonhidrat yan zincirler glikoproteinler için yoğun bir hidrofilik örtü oluşturmuştur. Bir müsin molekülünde yüzlerce oligosakkarit ünitesi vardır ve her oligosakkarit ünitesi ortalama 8-10 monosakkarit artığından (L-fukoz, D-galaktoz, N-asetil-Dglukozamin, N-asetil-D-galaktozamin ve siyalik asit) oluşmaktadır. Oligosakkarit üniteleri polipeptid zinciri boyunca hidroksiamino asitler serin ve treonine kovalan

28 bağlar ile bağlanmıştır. Oligosakkarit zincirlerinin terminal uçlarında siyalik asitler ve L-fukoz bulunmaktadır (Leung ve Robinson, 1988). a) b) Şekil 1.6. a) Müsinin şematik yapısı, b) Disülfit bağları ile stabilize olmuş protein çekirdek (Leung ve Robinson, 1988, Ahuja ve ark., 1997). Müsinin yapısına bağlı olarak mukoz tabakaya mukoadezif özellik sağlayan faktörler aşağıda yer almaktadır: - lineer, esnek ve ara ara katlanmış makromoleküller olan müsin molekülleri arasındaki disülfid bağlarından dolayı çapraz bağlı bir ağın oluşması, - ph 2,6 nın üstünde siyalik asit ve sülfat artıklarının tamamen iyonlaşmasından dolayı molekülün önemli bir negatif yük taşıması ve negatif yükten dolayı bu yüksek yük dansitesinin biyoadezyona önemli katkıda bulunması (Peppas ve Sahlin, 1996, Ahuja ve ark., 1997), - mukusun yüksek oranda hidrate bir sistem olması (Leung ve Robinson, 1988). Mukoadezif Polimerler Mukoadezif sistemler mukusun majör komponentleri olan glikoprotein zincirleri ile etkileşme kapasitesine sahip polimerleri içermektedirler. Mukoadezifler içinde en çok araştırılan grup, ilk jenerasyon olarak da adlandırılan ve adezyonda etkili olan hidrojen bağlarını oluşturabilen karboksil, hidroksil, amin ve sülfat grupları gibi

29 hidrofilik fonksiyonel grupları içeren makromoleküllerdir. Bu tür polimerler su ile temasları kısıtlanmadıkça, kaygan bir müsilaj oluşturana kadar aşırı hidrate olabilirler. Bu grubun tipik örnekleri karbomerler, kitozan, sodyum aljinat ve selüloz türevleridir (Şekil 1.7) (Smart, 2005). Mukoadezif polimerin molekül ağırlığı, konsantrasyonu, yapısındaki hidrofilik fonksiyonel grupların tipi ve yapısı, polimer zincirlerinin esnekliği ve konformasyonu polimer tarafından su çekme hızını ve miktarını ve dolayısıyla adezif özellikleri önemli ölçüde etkilemektedir. Polimerdeki yüklü grupların (akrilik asit gibi) yüzdesi azaldıkça hidrasyon derecesi düşmektedir. Yüksek molekül ağırlıklı ve büyük miktarlarda polar gruplar içeren makromoleküller daha yoğun mukoadezif bağlar oluşturmaya eğilimlidirler. Poliakrilik asit, hidroksialkilselüloz, hyaluronik asit, kitozan, polialkilsiyanoakrilat ve kollajen gibi polimerler bu tür mukoadezif özelliklere sahiptir. Ek olarak, polimer zincirleri ile müsinin glikoprotein zincirleri arasında difüzyonun gerçekleşmesi için biyoadezif polimer ve mukusun benzer kimyasal yapılara sahip olması önemlidir; polimerin yapısı mukusa ne kadar benzer ise o kadar kuvvetli bir mukoadezif bağın oluşumundan bahsetmek söz konusu olabilir (Saiano ve ark., 2002). a) Poli(akrilik asit), R=allil sukroz veya allil pentaeritritol (Karbopoller); veya divinil glikol (polikarbofil) b) Kitozan c) Sodyum aljinat d) Selüloz türevleri Sodyum karboksimetilselüloz R1, R4= CH 2 OH; R2,R3,R5=OH; R6=OCH 2 CO 2- Na + Hidroksipropilmetilselüloz R1=CH 2 OCH 3 ;R2=OH, R3=OCH 2 CHOHCH 3 ; R4=CH 2 OH; R5,R6=OCH 3 Şekil 1.7. Vajinal dozaj formlarında da tercih edilen bazı yaygın ilk jenerasyon mukoadezif polimerlerin yapısı (Smart, 2005).

30 Vajinal preparatlarda sıklıkla tercih edilen biyoadezif polimerler poliakrilik asit türevleri (Gavini ve ark., 2002, Baloğlu ve ark., 2003, Sharma ve ark., 2006, Valenta ve ark., 2001), kitozan, sodyum aljinat (Kast,2002, El-Kamel, 2002, Bonferoni, 2006), selüloz türevleri (Karasulu ve ark., 2004), hyaluronik asit ve türevleri, pektin, nişasta (Voorspoels ve ark., 2002), polietilen glikol, sülfatlanmış polisakkaritler, karragen ve jelatindir (Valenta, 2005). 1.5.3.2. Mukoadezyon Mekanizmaları Mukoadezyonu tek bir model veya teori ile açıklamak mümkün değildir. Gözlenen etkili mekanizma, mukoadezif ve biyolojik substratın ara yüzeyinde zincir etkileşiminin yanı sıra elektrostatik etkileşmeler, adsorbsiyon ve ıslanma işlemleri gibi çeşitli olasılıkların bir kombinasyonudur (Saiano ve ark., 2002). Ağız boşluğu ve vajina gibi ince/süreksiz mukus tabakası içeren yüzeylere temas eden kuru veya kısmen hidrate edilmiş dozaj formlarının (tablet gibi) mukozaya adezyonu genel olarak polimerin hidrasyonu, mukusa difüzyon ve glikoproteinler ile kimyasal bağlanma aşamaları ile açıklanmaktadır (Smart, 2005). Mukoadezyon esnasında ilk olarak adezif polimer ile mukus arasında, ara yüzeyde atomlar arası ve moleküller arası kuvvetlerin oluşması ile çok yakın bir temas kurulmakta ve polimer mukus ile hidrate olmaktadır (Şekil 1.8). Şekil 1.8. Dozaj formu ve mukozanın temas ve etkileşim basamakları.

31 Yakın temas basamağından sonra mukoadezifin doku yüzeyine penetrasyonu veya mukoadezif polimer zincirlerinin mukus ile etkileşimi meydana gelmekte, adezif polimerin segmentleri ve müsin glikoproteinleri ara yüzey boyunca difüze olmaktadır (Şekil 1.9). Bu etkileşim sırasında müsin ve polimer zincirleri arasında mukoadezyonun gücünü de belirleyen fiziksel ve zayıf kimyasal bağlar oluşmaktadır (Saiano ve ark., 2002). Polimer zincirlerinin müsin tabakasına penetrasyon hızı her bir polimer zincirinin esnekliği ve difüzyon katsayısına bağlıdır. Arayüzeyden difüze olan zincirler, polimerin biyoadezif olarak o bölgede kalmasını sağlayan bağlar gibi görev yapmaktadırlar. İyi bir biyoadezyon için gerekli olan etkileşim mesafesi yaklaşık olarak makromoleküler zincirlerin uç noktaları arasındaki uzaklığa eşittir (Huang ve ark., 2000). Zincir etkileşimi mukoadezyon işleminde yer alan çeşitli mekanizmalar arasında en temel mekanizmadır (Saiano ve ark., 2002). Bu nedenle, ideal bir biyoadezif polimer yeterli yüzey enerjisi, mukusun içine yayılmasını ve difüzyonunu sağlayacak zincir esnekliği ve ikincil kimyasal bağları (iyonik ve hidrojen bağları gibi) oluşturacak fonksiyonel gruplara sahip olmalıdır (Cilurzo ve ark., 2003). Şekil 1.9. Mukoadezif polimer zincirleri ve müsin glikoproteinleri arasındaki etkileşimin basamakları. İyi bir biyoadezyon için polimerin viskozluğu ve ıslanabilirliği en önemli faktörlerdir. Adezyonun gücünü etkileyen diğer parametreler, ortamda suyun varlığı ve ph, materyaller arasındaki temas süresi ve ilaç şeklinin uygulanması sırasında uygulanan baskı kuvvetidir.