Kullanım Kılavuzu Giriş 1.Kullanım Amacı 2 2. Klinik Uygulamalar ve Test prensibi 2 3. Kit İçeriği 3 4. Saklama ve Raf Ömrü 3 5. Kullanım önerileri 4 6. Numune toplama, hazırlama ve saklama 4 7. Test prosedürü 5 8. Kantitatif ve Kalitatif Yorumlama 6 9. Teknik data 7 10. Performans datası 7 11.Literatür 8 A:Pipet Şeması 9 B:Test Prosedürü 10
1.Kullanım Amacı AESKULISA HiT II heparinle indüklenen trombositopeni tip II ye neden olan IgG antikorlarını kantitatif ve kalitatif olarak tespit etmek için kullanılan solid-faz bir immunotesttir. 2. Klinik Uygulamalar ve Test prensibi Heparinle indüklenen trombositopeni (HiT) heparin tedavisinin ağır yan etkisidir ve tedavi görmüş hastaların % 1-3 de görünür. Heparinle indüklenen trombositopeninin iki ayrı tipi oluşabilir: HiT tip I, hiçbir klinik uygunluğa sahip değildir ve trombosit sayılarında geçici bir azalma ile karakterizedir. Heparin verilmesi devam etse bile bir kaç gün sonra iyileşir. HiT tip II bir immün-mediated formudur. Heparin verilmeye ilk başladıktan 5 ile 14 gün sonra trombosit sayısı 50% oranından daha fazla düşer. Trombosit faktör 4 ve heparin komplekine maruz kalan neoepitopesi etkilenmiş hastalar da antikor geliştirir. Antikorlar, IgM ve IgA sınıfı antikorsuz veya antikorlu olan IgG altsınıfının en yaygınıdır. IgG antikorsuz IgM ve IgA nadiren bulunur. Ancak, IgM ve IgA antikorun etkisi hala tartışılırken patojen etki IgG altsınıfı için kanıtlanmıştır. HiT antikorun Fc bölümü trombosit Fc reseptörüne bağlanabilir ve bu etkileşim trombositlerin aktivasyonunu ve birikimini tetikler. Aktive edilmiş trombositlerden PF4 bırakılır, böylece heparin-indüklenen trombosit aktivasyonunun döngüsü devam eder. Trombosit aktivasyonu protrombotik trombosit mikroparçacıkların ve trombosit faktör 4 ün üretimine neden olur. Endotel hücrelerin yüzeyinde heparin-gibi moleküller(heparan sülfat) de Hit antikorlar tarafından tanınan trombosit faktör 4 ile kompleks form oluşturabilir. Buna karşılık pıhtılaşma kaskatının ve trombin üretiminin daha fazla aktivasyonuyla doku faktör ifadesine sebep olur. Bu, hastaların %10-15 de öldürücü olan yeni arteriyel ve venöz tromboembolik komplikasyonlar için yüksek bir riske yol açar. Erken bir tanı ve uygun alternatif bir antikoagülanla değiştirme bir komplikasyon oranını en aza indirilebilir. Test Prensibi 1:101 seyreltilmiş serum örnekleri spesifik antijen kaplı mikropleytlerde inkübe edilir. Örnek içinde bulunan antikorlar antijenlere bağlanır. Bağlanmamış kısımlar yıkama ile uzaklaştırılır. Sonra horseradish peroxidase konjugatlı anti-human immunoglobulinler (konjugat) inkübe edilir ve mikropleytteki örneğin antijen-antikor kompleksi ile reaksiyona girer. Bağlanmamış konjugatlar yıkanarak uzaklaştırılır. TMB-substrat eklenmesi enzimatik kolorimetrik (mavi) reaksiyon oluşturur, seyreltilmiş asit ile durdurulur (renk sarıya değişir). Kromojenden kaynaklanan renk oluşumunun oranı, konjugata bağlanan antijen-antikor kompleksinin bir fonksiyonudur ve bu hasta serumunda görülen antikor konsantrasyonu ile orantılıdır. 2
3. Kit İçeriği Hazırlanacak: 5x Örnek Buffer 50x Yıkama Buffer Kullanıma hazır: Negatif kontrol Pozitif kontrol Cut-off kalibratör Kalibratör Konjugatlar TMB Substrat Stop Solusyonu Mikrotiterplate 1 şişe, 20 ml - 5x konsantre (beyaz kapaklı: sarı solüsyon) İçerik: Tris, NaCl, BSA, sodium azide < 0.1% (koruyucu) 1 şişe, 20 ml - 50x konsantre (beyaz kapaklı: yeşil solüsyon) İçerik: Tris, NaCl, Tween 20, sodium azide < 0.1% (koruyucu) 1 şişe,1.5 ml (yeşil kapaklı: renksiz solusyon) İçerik: İnsan serumu (diluent), sodium azide < 0.1% (koruyucu) 1 şişe, 1.5 ml (kırmızı kapaklı: sarı solusyon) İçerik: İnsan serumu (diluent), sodyum azit < 0.1% (koruyucu) 1 şişe, 1.5 ml (mavi kapaklı: sarı solusyon) İçerik: İnsan serumu (diluent), sodyum azit < 0.1% (koruyucu) 6 şişe, 0, 3, 10, 30, 100, 300 U/ml her biri için 1.5 ml (konsantrasyonla renk artar: sarı solüsyon) İçerik: İnsan serumu (diluent), sodyum azit < 0.1% (koruyucu) 1 şişe 15 ml IgG (mavi kapaklı: mavi solusyon) İçerik: Anti-human immünoglobulin horseradish peroxidase için konjugat 1 şişe, 15 ml (siyah kapaklı) İçerik: stabilize TMB/H 2 O 2 1 şişe, 15 ml (beyaz kapaklı: renksiz solusyon) İçerik: 1M Hidroklorik Asit Kırılabilir mikrokuyucuklu 12x8 kuyucuklu stripler Paragraf 1e bakınız Kiti içeriğinde bulunmayan gerekli materyaller: Mikrotiter plate okuyucu, 450 nm okuma filtresi ve opsiyonel 620 nm referans filtresi (600-690 nm) ile. Cam eşya (silindir 100-1000ml), dilusyon için test tüpleri. Vorteks mikser, pipetler (10, 100, 200, 500, 1000 µl) ya da ayralanabilir multipipet (100-1000ml). Mikroplate yıkama cihazı (300 µl tekrar ya da multikanal pipet ya da otomatik sistem), emici kağıt. Testimiz United States Pharmacopeia (USP 26 - NF 21) ve European Pharmacopeia (Eur.Ph. 4th ed.) göre belirlenmiş purifiye su kullanılmak üzere dizayn edilmiştir. 4. Saklama ve Raf Ömrü Tüm reaktifleri ve mikropleyti kendi orjinal ambalajında 2-8 C/35-46 F de saklayın. Hazırlanan solusyonlar 4 C/39 F de en az 1 ay saklanabilir. Reaktifler ve mikroplate herbir komponentin üzerinde yazan son kullanma tarihlerine kadar kullanılabilir. TMB solusyonunu güçlü ışıkta bırakmayın. Mikropleyti folyosunda, kurutucu ile ve sıkı bir şekilde kaplı olarak saklayın. 3
5. Kullanım Önerileri 5.1 Sağlık tehlike bilgisi BU ÜRÜNLER SADECE İN VİTRO DİAGNOSTIK KULLANIM İÇİNDİR. Bu yüzden, bu kiti sadece eğitimli ve deneyimli personel kullanması tavsiye edilir. Bu ürün, normal kullanımda toksik ya da zaralı olmamasına rağmen aşağıdaki maksimum güvenlik önlemlerini yapmanız önerilir: Öneriler ve Uyarılar Bu kit potansiyel zararlı komponentler içerir. Kit reaktifleri gözler ve deri için tahriş edici olmamasına rağmen, göz ve deri ile temasından kaçınmanızı ve eldiven kullanmanızı öneririz. UYARI! Kalibratörler, Kontroller ve Bufferlar koruyucu olarak sodium azide (NaN 3 ) içerir. NaN 3 yenildiğinde ya da deri ve gözler tarafından emildiğinde toksik olabilir. NaN 3 kurşun ve bakır borular ile reaksiyona girerek patlayıcı metal azidelere dönüşebilir. Atılımlarında bol su ile azide oluşumu önlenmelidir. Lütfen, CDC ve diğer yerel/ulusal yasalara göre belirlenen dekontaminasyon prosedürlerini uygulayın. Kit ile çalışırken sigara içmeyin, yemek yemeyin yada birşey içmeyin. Ağız ile pipetleme yapmayın. Bu kitteki bazı reaktifler (kontroller, standardlar gibi) için kullanılan tüm insan kaynaklı materyaller kabul görmüş metodlar ile test edilmiş ve HbsAg, Hepatit C ve HIV 1 için negatif bulunmuşlardır. Buna rağmen, hiçbir test materyallerde tamamen viral ajanların yok olduğunu garanti edemez. Bu nedenle, kit kontrolleri, standartlar ve hasta örnekleri sanki enfeksiyon ajanı taşıyormuş gibi ve uluslararası gerekliliklere göre kullanılmalıdır. 5.2 Kullanım için genel talimatlar Farklı lot numarasındaki reaktifler ya da mikroplate ile karıştırmayın ya da değiştirmeyin. Bu sonuçlarda varyasyona neden olabilir. Kullanmadan önce tüm komponentlerin oda ısısına (20-32 C/68-89.6 F) ulaşmasını sağlayın, iyice karıştırın ve optimum test performansı için önerilen inkübasyon şemasını uygulayın. İnkübasyon: Otomatik sistemler ile 30 C/86 F de test performası öneririz. Asla komponentleri 37 C/ 98.6 F den yüksek ısılara maruz bırakmayın. Daima substrat solusyonlarını yeni bir pipet ucu ile pipetleyin. Bu reaktifleri ışıktan koruyun. Asla bir önceki reaktifi pipetlediğiniz ucu konjugatlarda kullanmayın. Kesin klinik tanı sadece bu test performansına dayanmamalıdır, doktor tarafından tüm klinik ve laboratuar bulguları araştırıldıktan sonra konulmalıdır. Konulan tanı farklı diagnostik metodlar kullanılarak doğrulanmalıdır. 6. Örnek Toplama, Hazırlama ve Saklama Tercihen bir antikoagülan olarak 3.2% veya 3.8% sodyum sitratla toplanan taze plazma numunelerini kullanın. Ulusal gerekliliklere göre kan toplanmalıdır. İkterik, lipemik, hemolizli ya da bakteriyolojik kontaminasyonlu örnekleri kullanmayın. Kan örnekleri temiz, kuru ve boş tüplere alınmalıdır. Ayırdıktan sonra serum örnekleri hemen kullanılmalıdır, 2-8 C/35-46 F de 3 güne kadar ya da -20 C/-4 F de dondurularak daha uzun süre saklanabilir. Bu testte heparin ile antikoagülan edilmiş numuneleri kullanmayın! 4
7. Test Prosedürü 7.1 Pipetlemeden önce hazırlık Konsantre reaktifleri seyreltin: Konsantre örnek buffer 1:5 distile su ile seyreltin ( 20 ml ye 80 ml gibi). Konsantre yıkama buffer 1:50 distile su ile seyreltin (20 ml e 980 ml gibi). Örnekler Serum örneklerini 1:101 örnek buffer (1x) ile seyreltin. Örnek: 1000 µl örnek buffer (1x) + 10 µl serum. İyice karıştırın! Yıkama Herbir 8 kuyucuk için 20 ml seyreltilmiş yıkama buffer (1x) ya da 96 kuyucuk için 200 ml hazırlayın. Örnek: 4 ml konsantre + 196 ml distile su. Otomatik yıkama: Cihazın gerektirdiği miktarda ve robot pipetin ölü miktarı göz önüne alınmalıdır. Manual yıkama: Pleyti ters çevirerek içindeki sıvıyı boşaltın. Temiz emici kağıt üzerinde pleyti sertçe vurun. Herbir kuyucuğa 300 µl seyreltilmiş yıkama buffer ekleyin ve 20 saniy bekleyin. Tüm prosedürü iki kez tekrar edin. Microplateler Test için yeterli miktarda kuyucuk ayırın. Kullanılmayan kuyucukları çerçevesinden ayırın, kurutucu ile birlikte plastik posetine geri koyun ve sıkıca kapatın. (2-8 C/35-46 F). 7.2 Çalışma Akışı Pipetleme şeması için Ek A ya bakın, test prosedürü için Ek B ye bakın: Örnekleri ve kalibratörleri iki kopya olarak çalışmanızı tavsiye ederiz. Cut off kalibratör sadece kalitatif çalışmalar için kullanılmalıdır. Uygun mikrokuyucuklara 100 µl seyreltilmiş hasta serumlarından koyun. Uygun kuyucuklara 100 µl kalibratörlerden ya da cut-off kalibratör ve negatif, pozitif kontrol koyun. 20-32 C/68-89.6 F de 30 dakika inkübe edin. 300 µl yıkama buffer (seyreltilmiş 1:50) ile 3x yıkayın. Herbir kuyucuğa 100 µl konjugat ekleyin. 20-32 C/68-89.6 F de 30 dakika inkübe edin. 300 µl yıkama buffer (seyreltilmiş 1:50) ile 3x yıkayın. Herbir kuyucuğa 100 µl TMB substrat ekleyin. 20-32 C/68-89.6 F de 30 dakika inkübe edin, direk ışıktan koruyarak. Herbir kuyucuğa 100 µl stop solusyonu ekleyin, substrat ile aynı sırada. 5 dakika inkübe edin. Pleyti 5 saniye dikkatlice sallayın. 30 dakika içinde 450 nm de (opsiyonel 450/620 nm) absorbanslarını okuyun. 5
8. Kantitatif ve Kalitatif Yorumlama Kantitatif yorumlama için, herbir kalibratörün optik densitesi (OD) (y-aksis) ile U/mL olarak konsantrasyon değerleri (x-aksis) olacak şekilde standart eğrisi çizin. En iyi sonuçlar için log/lin koordinatlarını ve 4-Parameter Fit öneririz. Herbir örneğin OD sinden U/ml olarak antikor konsantrasyonlarını okuyun. Normal Aralık Belirsiz Aralık Pozitif Sonuçlar < 12 U/ml 12-18 U/ml > 18 U/ml Standart eğri örneği Her bir çalışma için kalibratörleri paralel pipetlemenizi öneririz. Kalibratörler IgG OD 450/620 nm CK % (Varyasyon) 0 U/ml 0.025 0.0 3 U/ml 0.139 3.5 10 U/ml 0.283 4.3 30 U/ml 0.598 4.0 100 U/ml 1.224 3.6 300 U/ml 2.123 2.8 Hesaplama örneği Hasta Replikat (OD) Ortalama (OD) Sonuç (U/ml) P 01 0.793/0.801 0.797 47.7 P 02 0.308/0.333 0.321 12.1 Tüm spesifik bilgilere göre kalite kontrol ekine bakın. Medikal laboratuarlar, EU düzenlemelerine göre kendi kontrol ve/veya iç serum havuzlarından in-house Kalite Kontrollerini kullanabilirler. Bu örnekleri hastalarınızı yorumlamak için kullanmayın! Herbir laboratuar kendi tekniklerine, kontrollerine, ekipman ve hasta populasyonlarına göre kendi normal aralıklarını belirlemelidirler. 6
Kalitatif yorumlama için cut-off kalibratör ve hasta örneklerinin optik densitesini okuyun. Hasta OD lerini cut-off kalibratör OD leri ile karşılaştırın. Kalitatif yorum için cut-off değerini 20% oranında bir aralık içinde serumu iki değerli olarak düşünün. Daha yüksek ODs 'li bütün numuneler pozitif düşünülür ve daha düşük ODs 'li numuneler negatif düşünülür. Negatif: İki değerli: Positif OD patient < 0.8 x OD cut-off 0.8 x ODcut-off OD patient 1.2 x ODcut-off OD patient > 1.2 x OD cut-off 9. Teknik Bilgi Örnek materyal: Örnek miktarı: Total inkübasyon zamanı: Kalibrasyon aralığı: Analitik duyarlılık: Saklama: Belirleme sayısı: serum 10 µl örnek,1:101 1x örnek buffer ile seyreltilmiş 90 dakika 20-32 C/68-89.6 F de 0-300 U/ml 1.0 U/ml 2-8 C/35-46 F de, orjinal şişesinde 96 test 10. Performans Bilgisi 10.1 Analitik duyarlılık Örnek bufferın AESKULISA DGP HiT II ile 30 kez test edilmesi sonucu analitik duyarlılık 1.0 U/ml bulunmuştur. 10.2 Özgünlük ve Duyarlılık AESKULISA HiT II in duyarlılığı, bilinen bağışıklık durumu ile plazma numuneleri ile karşılaştırıldığında % 100 olarak belirlenmiştir. Klinik olarak tanımlanan plazma numuneleri 96% bir özgünlük gösterir. 10.3 Doğrusallık Seçilen serumlar bu kit ile çalışılmıştır ve doğrusal seyreltildiği bulunmuştur. İnsan otoantikorlarının heterojen doğasından dolayı, örnekler bu kuralları izlemeyebilir. Örnek No. Dilusyon Faktör ölçülen konsantrasyon (U/ml) beklenen konsantrasyon (U/ml) Düzeltme (%) 1 1 / 100 77.6 80.0 97.0 1 / 200 37.5 40.0 93.8 1 / 400 18.8 20.0 94.0 1 / 800 9.1 10.0 91.0 2 1 / 100 7.7 8.0 96.3 7
1 / 200 3.8 4.0 95.0 1 / 400 2.2 2.0 110.0 1 / 800 1.0 1.0 100.0 10.4 Kesinlik Test kesinliğini belirlemek için değişkenlik (test-içi ve arası), standart eğrinin üzerinde bir aralık gösteren üç serum örneği çoğalabilirliği test edilmiştir. Test-içi Testler-arası Örnek No. Ortalama (U/ml) VK (%) Örnek No. Ortalama (U/ml) VK (%) 1 9.8 1.3 2 120.2 9.8 3 210.2 10.0 1 10.2 1.0 2 106.6 9.5 3 208.6 6.3 10.5 Kalibrasyon Uluslararası referans kalibrasyon eksikliğinden bu test isteğe bağlı ünitede (U/ml) kalibre edilmiştir. 11.Literatür 1. Warkentin T.E. (2005). New approaches to the diagnosis of heparin induced thrombocytopenia. Chest 127: 35-45. 2. Franchini M. (2005). Heparin induced thrombocytopenia: an update. Thrombosis Journal 3: 14. 3. Warkentin T.E. (2004). Heparin induced thrombocytopenia. Diagnosis and treatment Circulation 110: 454-458. 4. Lindhoff-Last E., Gerdsen F., Ackermann H., Bauersachs R. (2001). Determination of heparin-platelet factor 4-IgG antibodies improves diagnosis heparin induced thrombocytopenia. British Journal of Haematology 113: 886-890. 5. Warkentin T.E., Chong B.H., Greinacher A. (1998). Heparin induced thrombocytopenia: Towards consensus. Thrombosis and Haemostasis 79: 1-7 6. Ziporen L., Li Z.Q., Park K.S., Sabnekar P., Liu W.Y., Arepally G., Shoenfeld Y., Kieber-Emmons T., Cines D.B., Poncz M. (1998). Defining an antigenic epitope on platelet factor 4 associated with heparin-induced thrombo cytopenia. Blood 92, 9: 3250-3259. 7. Greinacher A., Poetzsch B., Amiral J., Dummel V., Eichner A., Mueller-Eckhardt (1994). of 8
Heparin-associated thrombocytopenia: isolation of the antibody and characterization of a multimolecular PF4-heparin complex as the major antigen. Thrombosis and Haemostasis 71: 247-251. 8. Chong B.H., Fawaz I., Chesterman C.N., Berndt M.C. (1989). Heparin induced thrombocytopenia: mechanism of interaction of the heparindependent antibody with platelets. British Journal of Haematology 73: 235-240. EK A: Pipetleme Şeması Kalibratörleri, kontrolleri ve örnekleri aşağıdaki şekilde pipetlemenizi öneririz: Kantitatif yorumlama için standart eğeri oluşturmak için kalibratörleri kullanın. Kalitatif yorumlama için standart eğeri oluşturmak için cut-off kalibratörü kullanın. 9
EK B: Test prosedürü 10
11
In vitro diagnostik medikal gereç Katalog numarası Lot numarası EC Declaration of Conformity/Uyumluluk Bildirisi 96 Testler Kullanım bilgileri İle Kullanım Sıcaklık sınırlamaları Üretici Cut-off kalibratör Pozitif kontrol Negatif kontrol Kalibratör Recovery/düzelme Konjugat Kaplı microtiter plate Kaplı pinplate Yıkama buffer Substrat Buffer Stop Solusyonu Numune buffer 12