İçerik Giriş...2 Deney İçin Gerekli Olan Malzemeler...3 Deneyin Yapılışı... 4-9 Genomik DNA Kalıbının Hazırlanması...4 PCR Amplifikasyonu... 4-5 DNA Miktarının Belirlenmesi...6 Sekans Reaksiyonunun Hazırlanması...7 Ekstensiyon Ürünlerinin Saflaştırılması...8 Saflaştırılan Ürünün Kapiller Elektroforez Dizi Analizi Cihazına Yüklenmesi...9 1
Giriş DNA dizi analizleri ya da sekanslama DNA birincil yapılarının tayininde ve nükleotid baz diziliminin belirlenmesinde kullanılan yöntemdir. Analiz bir nükleik asit dizisinin diğerine hibridizasyonuna dayanır. Bu hibridizasyon sırasında radyoaktif ya da radyoaktif olmayan maddelerle işaretleme yapılır. Sıklıkla gen mutasyonları (delesyon, insersiyon vb.) tespiti ya da rekombinant DNAoluşum yapılarının tayininde kullanılır. Ayrıca gen regülasyonunda yer alan genetik kontrol bölgeleri, konsensus dizileri, epistatik genler ve etkileri belirlenebilmektedir. Preimplantasyon tanısı, kalıtsal hastalık tayininde oldukça kullanılır. Kalıtsal hastalık taşıyan çiftlerde tüp bebek embriyolarından alınan DNA lar bu yöntemle analiz edilerek taşıyıcı embriyolar elenip genetik hastalık taşımayanların doğması sağlanmaktadır. Yine aynı şekilde doku uygunluğu saptanmış embriyolardan sağlıklı doğacaklardan elde edilen kordon kanı ve kemik iliği hasta kardeşlerin tedavisinde kullanılmaktadır. Bu çalışmalar için artık günümüzde otomatik dizi analizi yöntemleri kullanılmaktadır. Otomatik dizi analizi için çoğaltılan PCR ürünleri çeşitli yöntemler kullanılarak temizlenir. En sık kullanılan temizleme yöntemi ticari kitlerin kullanıldığı silika temelli yöntemlerdir. Ticari olarak üretilen kitler kullanılır. En sık olarak ABI Prism Big DyeTM Terminatör Reaksiyon Kiti kullanılır. Bu PCR kitinin özelliği tüm PCR kimyasalları ile beraber, floresan boyalı ddntp ler ile Taq DNA Polimeraz enzimini de tek bir karışım halinde bulundurmasıdır. Big Dye Ready Reaction Mix olarak adlandırılan bu karışıma sadece primer ve temizlenmiş kalıp DNA eklenir ve PCR başlatılır. Sanger in DNA dizilimi çözme yöntemi geliştirilerek her bir tepkimede kullanılan ddntp ler değişik renkli floresanlarla etiketlenir. Bu teknoloji ile binlerce nükleotidlik bir DNA nın dizilimi birkaç saatte çözümlenmektedir. Böylece çok büyük DNA dizilim çözme projeleri geliştirilmektedir. Sanger yönteminde kullanılan her bir ddntp floresan molekülle bağlanır. ddntp ile sonlanan her bir parçacığın kendine özgü bir rengi bulunur. 4 ü de işaretli tüm ddntp ler bir tüp içine ilave edilir. Oluşan renkli DNA parçacıkları kılcal bir tüpte bulunan tek bir elektroforetik jelle uzunluklarına göre birbirinden ayrılır. 2
DENEY İÇİN GEREKLİ OLAN MALZEMELER Kalıp DNA dntp karışımı Distile su Enhancing tampon Primerler o İleri primer o Geri primer PCR karışımı Taq DNA polimeraz EXO-SAP saflaştırma enzimi Saflaştırma kolonu Sonlandırma boya karışımı Sefadeks Yürütme tamponu Sekans polimeri Sekans plate Plate septa 3
DENEYİN YAPILIŞI A. Genomik DNA Kalıbının Hazırlanması i. Genomik DNA Standard yüksek moleküler ağırlıkta DNA izolasyonu protokolüne göre elde edilir. ii. Genomik DNA konsantrasyonu spektrofotometrik yöntemlerle belirlenir. iii. Ölçülen konsantrasyon değerine göre, genomic DNA steril, deiyonize su ile ya da 10 mm Tris, ph 8.0 ile dilüe edilir. İnsan geni için: DNA 30 ile 60 ng/μl arasında olacak şekilde dilüe edilmelidir. iv. Dilüe edilen genomik DNA porsiyonlara ayrılıp -15 C/-25 C arasında saklanır. Not: Tekrarlayan çözdürüp dondurma işleminden uzak durun. v. DNA kalitesi, spektrofotometrede okunan A260 ve A280 değerlerinin oranlanmasıyla bulunur. (A260/A280) Not: Yüksek kalite DNA, A260/A280 oranı 1.7 ile 1.9 arasında ölçülür. B. PCR Amplifikasyonu a. PCR Reaksiyonunun Hazırlanması: i. Reaksiyon karışımı hazırlanır. 4
ii. Reaksiyon karışımı hazırlanırken çalışılacak numune sayısı fazla ise ortak kimyasallar- PCR mastır mix,g/c enhancer gibi- tek tüpte mastır mix halinde hazırlanılabilir. Mastır miks için gerekli olan miktar numune sayısına göre hesaplanır ve eşit olarak pcr tüplerine dağıtılır. b. Reaksiyona Karışımı a. PCR Mastır miks.... 12,5 μl PCR mastır miks içerisinde PCR reaksiyonu için gerekli olan MgCl2, dntp, Taq Polimeraz ve tampon solüsyonu bulunmaktadır. b. İleri (Forward) Primer 2,5 μl Çalışmada ilgilenilen genomik DNA bölgelerine özgü dizayn edilen ileri(forward) primer kullanılır. c. Geri (Reverse)Primer. 2,5 μl Çalışmada ilgilenilen genomik DNA bölgelerine özgü dizayn edilen geri (reverse)primer kullanılır. d. G/C Enhancer.. 5 μl Genomik DNA dizisine primerlerin bağlanmasını kolaylaştırır. e. Genomik DNA (30-60 μl). 2,5 μl Tüm kimyasallar eklendikten sonra pcr tüpleri kısaca vortekslenir. Tüm kimyasallar eklendikten sonraki toplam hacim 25 μl olmalıdır. f. PCR tüpleri PCR Termal saykıl cihazına yerleştirilir. g. Termal saykıl cihazına, aktivasyon, amplifikasyon ve elongasyon sıcaklık ve zaman ayarları yapılan deneye bağlı olarak kaydedilir. Aşağıda örnek ayarlar bulunmaktadır: 5
Aktivasyon: 1 döngü 95 C 10 Amplifikasyon: 40 döngü 95 C 40 62 C 1 72 C 50 Elongasyon: 1 döngü 72 C 7 Saklama: 4 C C. DNA Miktarının Belirlenmesi a. PCR reaksiyonu sonrasında ürün DNA miktarını belirlemek için 5 μl PCR ürünü DNAdan alınarak yükleme boyası ile karıştırılır ve önceden hazırlanan %2 lik agaroz jele yüklenir. Jelde boş bırakılan kuyucuklardan birine DNA markırı yüklenir. UV illüminasyon cihazında görüntüleme yapılır. b. PCR Ürünlerinin Temizlenmesi PCR reaksiyonu sonrasında pcr tüpleri, tüp çeperinde kalan olası ürünleri çöktürmek amacıyla kısaca santrifüj yapılır. I. Elde edilen pcr ürününden farklı bir pcr tüpüne 5 μl konulur. II. PCR reaksiyon artıklarını temizleme amacıyla, üzerine 2 μl işleme özgü bir enzim eklenir. III. Toplam hacim 7 μl dir. IV. Hazırlanan tüpler Termal Saykıl a yerleştirilir ve kullanılan enzim çeşidine bağlı olarak hazırlanan kondisyonlarda cihaz çalıştırılır. Örnek kondisyonlar aşağıdaki gibidir: Enzim İnkübasyonu: 37 C 30 Enzim deaktivasyonu: 80 C 15 Saklama: 4 C D. Sekans Reaksiyonunun Hazırlanması a. PCR reaksiyon artıklarından temizlenen ürünler sekans reaksiyonu için hazırlanır. Sekans reaksiyonunda kullanılan malzemeler aşağıdaki gibidir: 6
. 2 μl b. Toplam hacim 10 μl dir. Hazırlanan tüpler kimyasalların karışması için kısaca vortekslenip, santrifüjde çöktürülür ve Termal Saykıl cihazına yerleştirilir. Ornek termal saykıl koşulları aşağıdaki gibidir: Aktivasyon: 96 C 1 Saykıl: 25 tekrar 96 C 10 50 C 5 60 C 4 Saklama: 4 C 7
E. Ekstensiyon Ürünlerinin Saflaştırılması a. Ürünler SEPHADEX li kolonlar kullanılarak saflaştırılır. Kolonların Hazırlanışı: a. Sephadex li kolonlara 750 μl ultra saf su eklenir. b. Kolonlar toz Sephadex iyice çözünene kadar vortekslenir. c. Kolonlar 30 dakika oda sıcaklığında bekletildikten sonra 2 dakika 4600 rpm de santrifüjlenir. Kolon içinde silindir şeklinde matriks gözlenir. d. Kolon konteynerindeki toplanan suyun tamamen boşaltıldığından emin olunur. e. Sekans ürünlerinin tamamı dikkatlice sephadex matriksin merkezine pipetle konulur. f. Kolon tekrar 2 dakika 4600 rpm de santrifüj edilir. 8
F. Saflaştırılan Ürünün Kapiller Elektroforez Dizi Analizi Cihazına Yüklenmesi a. Kolon konteynerinde toplanan ürünün tamamı 96 kuyucuklu pleyte aktarılır. b. Pleyt Septa ile kapatılır. c. Pleyt cihaza ait olan pleyt tutucuya yerleştirilerek cihaza yerleştirilir. d. Kapiller elektroforez sonrası elde edilen data yorumlanır. 9