Embriyonik kök hücreler ve tedavi amaçl kullan mlar

DERLEME Hacettepe T p Dergisi 2007; 38:15-19 Embriyonik kök hücreler ve tedavi amaçl kullan mlar Lale Karakoç Sökmensüer 1 1 Yrd. Doç. Dr., Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Histoloji-Embriyoloji Anabilim Dalı, Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı, Tüp Bebek Ünitesi, Ankara EMBR YON K KÖK HÜCRELER N ÖZELL KLER Kök hücreler bölünerek kendini yenileyebilen ve özelleşmiş fonksiyonel hücrelere dönüşebilme yeteneği olan farklılaşmamış hücrelerdir. Kök hücre tipleri arasında yer alan embriyonik kök hücreler, her çeşit hücre ve dokuya dönüşebilme kapasitesi nedeniyle doku mühendisliği ve rejeneratif tıp alanında önemle üstünde durulan kök hücre grubudur. Özellikle insan embriyonik kök hücreleri yeni ilaç tasarımı deneylerinde, ilaç toksisitelerinin araştırılmasında ve erken embriyonik gelişim çalışmalarında model olabilecek hücrelerdir [1,2]. Bununla birlikte insan embriyonik kök hücre çalışmaları canlı embriyoların kullanımını gerektirdiğinden birtakım etik problemleri de beraberinde getirmektedir [1-5]. Embriyonik kök hücre ilk kez 26 yıl önce farede in vitro geliştirilmiş blastokistlerden iç hücre kitlesinden izole edilip, fibroblast hücre tabakası üzerinde kültür edilmesiyle elde edilmiştir [6,7]. İnsan embriyonik kök hücre elde edilmesi ise bundan 17 yıl sonra gerçekleşmiştir [1]. İnsan embriyonik kök hücreleri beş-altı günlük preimplantasyon blastokistlerinden izole edilmektedir [8] (Resim 1). Blastokistler genellikle infertilite nedeniyle in vitro fertilizasyon tedavisine alınan çiftlerin artan embriyolarından elde edilmektedir. Bundan başka somatik hücre çekirdek transferi yöntemiyle elde edilen embriyolardan gelişmiş blastokistlerden de embriyonik kök hücre elde edilebilir. Bu hücreler uygun kültür şartlarında çoğalarak, tekrarlayan pasajlarla pluripotent özelliklerini koruyabilir. EMBR YON K KÖK HÜCRELER N ELDE ED LMES Blastokist iç hücre kitlesinden embriyonik kök hücre eldesi mekanik veya immünocerrahi izolasyon yöntemiyle yapılmaktadır. İmmünocerrahi izolasyonda blastokist zona pellusidası pronaz enzimiyle eritildikten sonra fare veya insan embriyosu insana veya fareye karşı geliştirilmiş serum antikorlarıyla inkübe edilmektedir. Antikorun blastokist içine geçişi trofoblast hücrelerinin hücre-hücre bağlantılarıyla engellenmekte ve iç hücre kitlesine antikor teması olmamaktadır. Antikor yıkandıktan sonra blastokist kompleman içeren solüsyon içine alınıp hücre lizisi belirgin hale gelinceye kadar inkübasyon yapılır. İnaktive olmuş iç hücre kitlesi mitotik olarak inaktive edilmiş fare embriyonik fibroblastları üzerinde kültür yapılır (Resim 2). 15

Karakoç Sökmensüer Resim 3. Fare embriyonik kök hücre kolonileri (birinci gün). Resim 1. İç hücre kitlesi belirgin insan blastokisti. Resim 4. Fare embriyonik kök hücre kolonileri (ikinci gün). Resim 2. Fare embriyonik fibroblastları (feeder hücreler). Mekanik izolasyonda ise embriyonik kök hücre dizileri kültürdeki blastokistlerin direkt mekanik diseksiyonu ve trofoblast tabakasının iğne ile kısmi uzaklaştırılması veya zonasız embriyoların doğrudan mitotik olarak inaktive edilmiş fibroblastlar üzerine yerleştirilmesiyle elde edilmektedir. Trofoblast hücreleri uzaklaştırılmadığında veya kısmen çıkarıldığında iç hücre kitlesi trofoblastlarla birlikte tek tabaka halinde büyür. İç hücre kitlesi yeterli büyüklüğe ulaştığında, ayrılarak kültüre edilir [9-11]. Fibroblastlar üzerinde çoğalan embriyonik kök hücre kolonileri iki-üç günde bir pasajlama yapılarak yeni kültür kaplarına ekim yapılır (Resim 3,4). Elde edilen bu embriyonik kök hücreler uygun kültür ortamında farklılaşmadan çoğalabilir ve altı ay-bir yıl kadar pluripotent özelliklerini koruyabilir. Karyotip olarak normal olduğu gösterilmiş bu hücrelere embriyonik kök hücre dizileri adı verilir. Embriyonik kök hücreler belli hücre tiplerine diferansiye edileceğinde, önce hanging drop tekniğiyle embriyonik cisimcikler elde edilir (Resim 5). Bu embriyonik cisimciklerin kültür ortamında büyüme faktörleri ve hormonlar aracılığıyla fonksiyonel hücrelere dönüşmesi mümkün olmaktadır. EMBR YON K KÖK HÜCRELER N YÜZEY fiaretley C LER Embriyonik kök hücrelerin fonksiyonel veya fenotipik özelliklerine bakıldığında insanda ve farede yüksek alkalen fosfataz aktivitesi, yüksek telomeraz aktivitesi ve yüksek nüklear-sitoplazmik oran göstermektedir [12]. Alkalen fosfataz aktivitesi insanda TRA-2-49 ve TRA-2-54 antikorlarıyla saptanırken, kemirgenlerde enzime bağlı reaksiyonla görüntülenir [13]. Yüksek telomeraz aktivitesi hücre dizilerinin immortalitesiyle ilişkilidir. Pluripotent hücrelerin her zaman yüksek telomeraz aktivitesi gösterdiği bilinmektedir [1,12,14]. 16 H ACETTEPE T IP D ERG S

Embriyonik kök hücreler ve tedavi amaçl kullan mlar EMBR YON K KÖK HÜCRELER N TEDAV POTANS YEL Embriyonik kök hücrelerin başta kalp kası ve sinir hücresi gibi iyi farklanmış ve yaşamsal önemi fazla olan hücreleri de oluşturma gücüne sahip olmaları Alzheimer, Parkinson, Tip 1 diyabet, santral sinir sistemi hastalıkları, osteoartrit ve miyokard infarktüsü gibi hastalıklarda tedavi potansiyeli vadetmektedir. Embriyonik kök hücrelerin in vivo tedavi potansiyeli bu hücrelerin ölümcül dozda radyasyon almış farelere enjeksiyonunun, kayıp kemik iliği kök hücrelerinin yeniden yapımını sağlamasıyla gösterilmiştir [21]. İnsan embriyonik kök hücrelerin in vitro bağırsak epiteli, kıkırdak, kemik, kas, nöron ve diğer hücre tiplerine diferansiasyonu da bildirilmiştir [1,22]. Hayvan modellerinde embriyonik kök hücrelerden elde edilmiş nöronların ve nöron prekürsör hücrelerinin, kardiyomiyositlerin, mast hücrelerinin ve insülin-salgılayan hücrelerin transplantının başarılı olduğu, bu hücrelerin nakledildikleri dokuda yaşadığı ve bölgeye entegre olduğu yapılan çalışmalarla gösterilmiştir [23-31]. Bu çalışmalardan bazılarında transplante edilen embriyonik kök hücreler alıcıda fonksiyon göstermiştir [23,24,27,28,30]. Resim 5. Fare embriyonik kök hücrelerinden elde edilen embriyonik cisimcik. Stage Specific Embryonic Antigen (SSEA) in SSEA- 1, SSEA-3 ve SSEA-4 formlarının insan ve farede embriyonik kök hücrelerde farklı gelişimsel dönemlerde ve farklı paternlerde ekspresyonu gösterilmiştir [15]. Pluripotent insan embriyonik kök hücrelerinde Oct-4 ekspresyonuna ek olarak SSEA-4, TRA-1-60, GCTM-2, TRA-1-81 ve SSEA-3 ekspresyonu bilinmektedir [1,14,16]. Fare embriyonik kök hücrelerinin tanımlanmasında kullanılan SSEA-1, insan embriyonik kök hücrelerinde ekspresyon göstermemektedir [1,16,17]. Bundan başka CD90, CD133 ve CD117 ekspresyonu da insan embriyonik kök hücrelerinde tanımlanmıştır [15]. Oct-4 ün fare embriyonik kök hücrelerinde sınırlı ekspresyon paterni göstermesi ve fonksiyonel önemi, bu molekülü pluripotent hücreler için güçlü bir işaretleyici yapmaktadır [18-20]. EMBR YON K KÖK HÜCRELER N REPRODÜKT F TIPTA KULLANIMI Embriyonik kök hücrelerin üreme tıbbında kullanımıyla ilgili çalışmalar oosit veya spermi olmayan hastalar için umut vadetmektedir. Embriyonik kök hücrelerden gamet hücresi diferansiye etmeye yönelik çalışmalar henüz deneysel aşamada olmakla birlikte başarılı sonuçlar bildirilmiştir. Fare embriyonik kök hücre kültüründe embriyonik cisimciklerin oluşmaya başlamasıyla birlikte buradaki hücrelerde germ hücre işaretleyicilerinin ekspresyonu gösterilmiştir. Erkek germ hücresi elde etmek için germ hücre işaretleyicileri eksprese eden hücreler in vitro ortamda retinoik asit içeren solüsyonla kültüre edildiğinde veya in vivo fonksiyonel testis içine implante edildiğinde presperm hücrelere dönüştürülmüştür. Yine aynı çalışmada embriyonik cisimciklerin yenidoğan testis dokusu kültürü ile elde edilen solüsyonla kültürü yapıldığında oosit içeren over dokusu benzeri yapılara dönüştüğü gösterilmiştir. Bu oosit benzeri yapıların oosit için özgün işaretleyicileri eksprese ettiği ve mayoz bölünmenin indikatörü olan SPC3 ekspresyonunu gösterdiği bildirilmiştir [32]. Benzer bir başka çalışmada da fare embriyonik kök hücrelerinden in vitro erkek gamet hücresi diferansiasyonu ve elde edilen sperm/prespermin oosit içine enjeksiyonuyla blastokist eldesi başarılı olmuştur [33]. Farede embriyonik kök hücrelerden kuyruğu olmayan sperm elde edildiği, bu spermlerin oosite enjekte edildiğinde fertilizasyon oluşturduğu bir başka grup tarafından yayınlanmıştır [34]. İnsan embriyonik kök hücreleriyle yapılan bir çalışmada bu hücrelerin %0.1 kadarının primordial germ hücrelere diferansiasyon gösterdiği yüzey işaretleyicileri ve gen ekspresyon işaretleyicileriyle bildirilmiştir [35]. Bir başka çalışmada farede embriyonik kök hücreden oosit eldesi başarılı olmuştur [36]. Bunlardan başka insan embriyonik kök hücrelerinden elde edilen embriyonik cisimciklerden trofoblast diferansiasyonu ve bu trofoblastlardan human koryonik gonadotropin sekresyonu da bildirilmiştir [37]. 17

Karakoç Sökmensüer Embriyonik kök hücrelerin tedavide kullanımlarını sınırlayan birtakım sorunlar mevcuttur. Embriyonik kök hücrelerin in vitro olarak pek çok hücreye dönüşme potansiyeli bilinse de, bu dönüşümde rol oynayan moleküler mekanizmalar tam olarak açıklığa kavuşmamıştır. Hücrelerin tedavi amaçlı kullanımlarından önce diferansiasyon mekanizmalarının detaylı olarak araştırılması, farklanan hücrenin in vivo olarak akıbetinin, doku ile bütünleşmesinin yani işlevsel ya da tedavi edici potansiyelinin ve olası yan etkilerinin doku uyum probleminin detaylı olarak araştırılması gereklidir. İnsanda embriyonik kök hücre çalışmalarıyla ilgili yasal kısıtlamalar ve etik sorunlar ülkeler arasında değişiklik göstermekle birlikte, ülkemizde insan embriyonik kök hücre çalışmaları yasaklanmıştır. Embriyonik kök hücrelerin insanlarda kullanımından önce hayvan modellerinde yapılacak çalışmaların gösterdiği yolda adım adım ilerlemek gereklidir. Kaynaklar 1. Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, et al. Embryonic stem cell line from human blastocysts. Science 1998; 282:1145-7. 2. Stojkovic M, Lako M, Stojkovic P, et al. Derivation of human embryonic stem cells from day 8 blastocysts recovered after three-step in vitro culture. Stem Cells 2004; 22:790-7. 3. Landry DW, Zucker HA. Embryonic death and the creation of human embryonic stem cells. J Clin Invest 2004; 114: 1184-6. 4. Mitalipova M, Calhoun J, Shin S, et al. Human embryonic stem cell lines derived from discarded embryos. Stem Cells 2003; 21:521-6. 5. Strelchenko N, Verlinsky O, Kucharenko V, et al. Moruladerived human embryonic stem cells. RBM Online 2004; 9:623-9. 6. Martin G. Isolation of a pluripotent cell line from early mouse embryos cultured in medium conditioned by teratocarcinoma stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 1981; 78: 7634-8. 7. Evans MJ, Kaufman M. Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos. Nature 1981; 292:154-6. 8. Sadler TW. Langman s medical embryology. 10 th ed. 2006; 40. 9. Robson P, Stein P, Zhou B, Schultz RM, Baldwin HS. Inner cell mass-specific expression of a cell adhesion molecule (PECAM-1/CD31) in the mouse blastocyst. Dev Biol 2001; 234:317-29. 10. Amit M, Itskovitz-Eldor J. Isolation and maintenance of primate ES cells. In: Lanza R, Gearhart J, Hogan B, Melton D, Pedersen R, Thomson J, West M (eds). Handbook of stem cells. Vol 1. USA: Elsevier Academic Press, 2004: 419-36. 11. Evans M. Isolation and maintenance of murine embryonic stem cells. In: Lanza R, Gearhart J, Hogan B, Melton D, Pedersen R, Thomson J, West M (eds). Handbook of stem cells. Vol 1. USA: Elsevier Academic Press, 2004: 413-8. 12. Wobus AM. Potential of embryonic stem cells. Mol Aspects Med 2001; 22:149-64. 13. Draper JS, Fox V. Human embryonic stem cells: multilineage differentiation and mechanisms of selfrenewal. Arch Med Res 2003; 34:558-64. 14. Donovan PJ, Gearhart J. The end of the beginning for pluripotent stem cells. Nature 2001; 414:92-7. 15. Verfaillie CM, Pera MF, Lansdorp PM. Stem cells: hype and reality. Hematology 2002; 1:369-91. 16. Reubinoff BE, Pera MF, Fong CY, Trounson A, Bongso A. Embriyonic stem cell lines from human blastocyst: somatic differantiation in vitro. Nat biotechnol 2000; 18:399-404. 17. Kaufman DS, Hanson ET, Lewis RL, Auerbach R, Thomson JA. Hematopoietic colony-forming cells derived from human embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 2001; 98:10, 716-10, 721. 18. Xu C, Inokuma MS, Denham J. Feeder-free growth of undifferantiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 2001; 19:971-4. 19. Nichols J, Zevnik B, Anastassiadis K. Formation of pluripotent stem cells in the mammalian embryo depends on the POU transcription factor Oct4. Cell 1998; 95:379-91. 20. Niwa H, Miyazaki J, Smith AG. Quantitative expression of Oct-3/4 defines differantiation, dedifferantiation or self-renewal of ES cells. Nat Genet 2000; 24:372-6. 21. Hollands P. Differantiation of embryonic haematopoietic stem cells from mouse blastokist growing in vitro. Development 1987; 99:69-76. 22. Shamblott MJ, Axelman J, Littlefield JW, et al. Derivation of pluripotent stem cells from cultured human primordial germ cells. Proc Natl Acad Sci USA 1998; 95:13,726-13, 731. 23. Brustle O, Jones KN, Learish LD, et al. Embryonic stem cell-derived glial precursors: a source of myelianting transplants. Science 1999; 285:754-6. 24. McDonald JW, Liu X-Z, Qu Y, et al. Transplanted embryonic stem cells survive, differantiate and promote recovery in injured rat spinal cord. Nat Med 1999; 5:1410-2. 25. Arnhold S, Lenartz D, Kruttwig K, et al. Differantiation of gren fluorescent protein-labeled embryonic stem cell-derived neural precursor cells into Thy-1 positive neurons and glia after transplantation into adult rat striatum. J Neuro- Surg 2000; 93:1026-32. 26. Kawasaki H, Mizuseki K, Nishikawa S, et al. Induction of midbrain dopaminergic neurons from ES cells by stromal cell-derived inducing activity. Neuron 2000; 28:31-40. 27. Liu S, Qu Y, Steward TJ, et al. Embryonic stem cells differantiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation. Proc Natl Acad Sci USA 2000; 97:6126-31. 28. Björklund LM, Sanchez-Pernaute R, Chung S, et al. Embryonic stem cells develop into functional dopaminergic neurons after transplantaion in a Parkinson rat model. Proc Nath Acad Sci USA 2002; 99:2344-9. 29. Klug MG, Soonpaa MH, Koh GY, Field LJ. Genetically selected cardiomyocytes from differantiating embryonic stem cells form stable intracardiac grafts. J Clin Invest 1996; 98:216-24. 18 H ACETTEPE T IP D ERG S

Embriyonik kök hücreler ve tedavi amaçl kullan mlar 30. Tsai M, Wedemeyer J, Ganiatsas S, Tam SY, Zon LI, Gali SJ. In vivo immunological function of mast cells derived from embryonic stem cells: an aproach for the rapid analysis of even embryonic lethal mutations in adult mice in vivo. Proc Nath Acad Sci USA 2000; 97:9186-90. 31. Soria B, Roche E, Berna G, Leon-Quinto T, Reig JA, Martin F. Insulin-secreting cells derived from embryonic stem cells normalize glycemia in streotozotocin-induced diabetic mice. Diabetes 2000; 49:157-62. 32. Lacham-Kaplan O, Chy H, Trounson A. Testicular cell conditioned medium supports differentiation of embryonic stem cells into ovarian structures containing oocytes. Stem Cells 2006; 24:266-73. 33. Geijsen N, Daley GO. Male germ cells. Methods Enzymol 2006; 418:307-14. 34. Daley GO. Customized human embryonic stem cells. Nat Biotechnol 2005; 23:826-8. 35. Aflatoonian B, Moore H. Germ cells from Mouse and human embryonic stem cells. Reproduction 2006; 132:699-707. 36. Hubner K, Fuhrmann G, Christenson LK, et al. Derivation of oocytes from mouse embryonic stem cells. Science 2003; 23:1251-6. 37. Golos TG, Pollastrini LM, Gerami-Naini B. Human embryonic stem cells as a model for trophoblast differantiation. Semin Reprod Med 2006; 24:314-21. 19