1 Hücre Proliferasyonu ve Testleri
Normal Hücre Çoğalması Normal dokularda, hücre bölünmesi ve çoğalması organizmanın devamlılığı için bir gereklilik;r. Hücre çoğalmasının olması gerekenden farklı olması patolojik durumlara yol açar. Örneğin, kanser; hücrelerin kontrolsüz bir şekilde hızlı bölünmesi 2
Hücre Döngüsü Bir hücrenin bölünmeye başlamasından i;baren onu takip eden diğer hücre bölünmesine kadar geçen zaman aralığına hücre döngüsü denir. 3
Hücre Döngüsü Hücreye bölünmesi (replikasyonu) dış uyarılar sonucu biyokimyasal olarak başlailan bir seri işlem ne;cesinde gerçekleşir. Hücreye bölünmesi hem dış hem de iç büyüme faktörleri tarajndan düzenlenir. Hücre döngüsüne özgü proteinler hücre döngüsü boyunca senkronize bir şekilde ak;fleş;rilir ve ardından inak;fleş;rilirler. 4
Hücre Döngüsü a. G0 fazında (is;rahat fazı), hücreler genellikle spesifik bir işlevi görmek üzere programlanırlar. b. G1 fazında (ara faz, interfaz), spesifik hücre fonksiyonları için gereken proteinler ve RNA sentezlenir. Geç G1 fazında bol miktarda RNA sentezlenir. Ayrıca, DNA sentezi için gereken birçok enzim üre;lir. c. S fazında (DNA sentezi fazı) hücre içindeki DNA nın miktarı ikiye katlanır. d. G2 fazında DNA sentezi durur, protein ve RNA sentezi devam eder. e. M fazında (mitoz) protein ve RNA sentez hızı aniden yavaşlar, gene;k materyal oluşan iki yeni hücreye dağılır. Mitozisi takiben oluşan yeni hücreler ya G0 ya da G1 fazına girerler. 5
Hücre Döngüsü Kontrol Noktaları ( checkpoints ) Çoğalma kapasitesine sahip hücreler normal olarak belli kontrol noktalarında dururlar. Bunların en önemlileri, ilki DNA sentezinden hemen önce (G1/ S) ve ikincisi mitozdan hemen öncedir (G2/M). Bu geçiş dönemlerinde (kontrol noktalarında), varsa gene;k defektler düzel;lir. Sonuç olarak, hücre siklus boyunca ilerlerken iki kontrol noktasında durur ve kontrol edilmiş olur. 6
Hücre Proliferasyonu ve Canlılık Canlı hücre sayısının ve hücre çoğalmasının doğru ve hızlı bir şekilde değerlendirilmesi birçok deneysel yaklaşımda önemlidir. Büyüme faktörlerinin analizi Genlerin fonksiyonel analizleri İlaç denemeleri Sitotoksisite çalışmaları Biyouyumluluk İmplantlar Kozme;k Toksik ajanların belirlenmesi 8
Hücre Proliferasyonu ve Canlılık 9
Hücre Proliferasyonu ve Canlılık Hücre Canlılığı (Cell Viability); Örnekteki canlı hücre sayısı. Hemositometre ile sayım Metabolik testlerle ölçüm (MTT, XTT, WST1) Hücre Proliferasyonu (Cell Prolifera;on); Örnekte bölünmekte olan hücre sayısı DNA sentezi ölçümü 10
Hücre Canlılığı Hücreler hemositometre ile sayılarak canlı hücre sayısı belirlenir. Tripan blue boyaması yapılarak canlı hücre oranı belirlenir. Hücre sayımı hücrenin büyümesinin takip edilmesi için kullanılır. 11
12 Hücre Canlılığı
Hücre Canlılığı Metabolik AkQvite Ölmekte olan hücreler; hücre canlılığının devamlılığı için ve hücre fonksiyonu ve büyümesi için gerekli enerjiyi sağlayamaz. Ölen hücrelerde mitokondri enzimleri ak;vitesini kaybeder. Mitokondri enzimlerinin substrai olan maddeler hücrelere verilerek kolorimetrik analiz yapılır. 13
Hücre Canlılığı Metabolik AkQvite Tetrazolium tuzları substrat olarak kullanılır. WST-1, XTT ve MTT solüsyonlarının canlı veya apoptozun erken evresindeki hücrelerin mitokondrileri aracılığıyla ile oluşturduğu reaksiyonda, solüsyonlarda bulunan tetrazolium halkası hücre mitokondrilerinde bulunan dehidrogenaz enzimlerince parçalanarak renkli formazan kristalleri oluşturur. WST-1, XTT ve MTT yöntemi, sağlam hücrelerde mitokondrinin MTT boyasının tetrazolium halkasını parçalayabilmesi ilkesine dayanmaktadır. 14
15 Hücre Canlılığı Metabolik AkQvite
Hücre Canlılığı Metabolik AkQvite Tetrazolium halkasının parçalanması sonucu soluk sarı renkli MTT boyası koyu mavi-mor formazan ürününe dönüşmektedir. Sonuç olarak canlı ve mitokondri fonksiyonu bozulmamış hücreler mor renkte boyanmakta, ölü ya da mitokondri fonksiyonu bozulmuş hücreler boyanmamaktadır. 16
17 Hücre Canlılığı Metabolik AkQvite
Hücre Canlılığı Metabolik AkQvite MTT (570 nm) XTT (450-490 nm) WST-1 (420-480 nm) 18
Hücre Canlılığı Metabolik AkQvite 19
Hücre Canlılığı Metabolik AkQvite Bölünen hücreler bölünmeyen hücrelere göre metabolik olarak daha ak;f oldukları için WST-1, XTT ve MTT testleri hücre proliferasyonunun değerlendirilmesi için de uygundur. 20
Hücre Proliferasyonu Klonogenik Test (SoV Agar) Bir hücrenin bölünüp çoğalması ile bir koloni oluşturabilme kabiliye;nin test edildiği bir yöntemdir. 21
Hücre Proliferasyonu DNA sentezinin ölçülmesi (H-thymidine veya Bromodeoxyuridine) Radyoizotoplarla işaretlenmiş H-thymidine veya Bromodeoxyuridine hücrelerin büyüdüğü ortama eklenir, Bromodeoxyuridine ;min analogudur. Bu nukleo;t analogları bölünen hücrelerde kendini eşleyen DNA nın yapısına kailır. Sonrasında ne kadar radyoizotop işaretli nükleo;tlerden gelen ışıma hesaplanır. Kendini eşleyen DNA nın yapısına kailan nükleo;t analog miktarı hücre proliferasyonu ile doğru oranilıdır. 22
In Vitro Hücre Canlılık ve Proliferasyon Testlerinin Avantajları Kısa zamanda ve ekonomik olarak çok sayıda numune değerlendirilebilmesi, Kan;ta;f ve karşılaşirılabilir sonuçlara ulaşılabilmesi, Test yöntemlerinin standardize edilebilmesi, Hassasiyetlerinden dolayı, toksik materyalin hayvan deneylerine geçmeden elimine edilmesine imkân tanımaları, Hayvan ve kullanım testlerine göre daha genis kullanım alanına sahip olmalarıdır. 23
In Vitro Hücre Canlılık ve Proliferasyon Testlerinin Dezavantajları Kültür hücrelerinin konak hücrelerinden farklı olması, In vitro ortamın organizmada bulunan immün sistem, inflematuar sistem ve dolaşım sistemi gibi karmaşık koordinasyon mekanizmalarına sahip olamaması dolayısı ile in vitro test sonuçlarının in vivo şartlarla uyumluluğunu tarişmalı hale ge;rmektedir. 24