helena www.helena-biosciences.com BioSciences Europe Kullanım Talimatları SAS-1 ALKALINE PHOSPHATASE - 12 Katalog No: 200800
KULLANIM AMACI SAS-1 Alkaline Fosfataz izoenzim kiti, agaroz jel elektroforezi tarafından Alkaline fosfataz izoenzimlerinin miktarının belirlenmesi ve ayrılması için tasarlanmıştır. Alkaline Fosfataz (ALP) (EC 3.1.3.1) alkaline ph da fosfat esterlerin hidrolizini katalizleyen bir enzimdir. ALP in en iyi konsantrasyonu karaciğer, kemik, bağırsak ve plasenta da bulunur. Ancak, hemen hemen her vucut dokusu ALP in küçük bir miktarını en az içerir.bu geniş dağılımdan dolayı, total bir ALP miktarının yararlılığı sınırlıdır. Ne yazık ki, ALP in her kaynağı bir baskın izoenzim üretir ve serumda yükseltilmiş ALP in doku kaynağı izoenzim tipi tespit ediliyorken belirlenebilir. Fizikokimyasallarında ve elektroforetik özelliklerde ALP farklı izoenzimler ve bu farklılıkların avantajlarını alarak tek tek izoenzimler tespit edilidi 1. Karaciğer (makrohepatik yada hızlı karaciğer içerir), kemik, bağırsak ve plesanta izoenzimlerine ek olarak diğer ALP izoenzimler serumda tespit edilmiştir. Bunlar Regan, Nagao, PA ve renal izoenzimler bunlar arasındadır. SAS-1 ALP prosedürü karaciğer ve makrohepatik (hızlı karaciğer) ayrımı için jelde bir deterjan ve neroaminidez 2,3 için izoemzimlerin tepkisinde farklılıkları kullanan yüksek çözünürlüklü bir elektroforez yöntemidir. Sonuç, karaciğer, kemik, paratiroid ve bağırsak bozuklukları tedavisinde ve teşhisinde kullanılmak için bağırsak ALP izoenzimleri, kemik, makrohepatik ve karaciğer ayırabilen ayırmadır. Bu sistem, 3 ayrı bantta bağırsak izoenzimi ayırabilir ve bu klinik önemini tespit edemez. UYARILAR VE ÖNLEMLER Tüm kitler sadece in-vitro diagnostik kullanım içindir. Herhangi bir kit bileşenini ağzınızla pipetlemeyin, ağzınıza sürmeyin. Tüm kit bileşenlerinin işlemi sırasında eldiven giyin. Risk, güvenlik koşulları ve atım bilgisi için ürün güvenlik kağıdına bakın. BİLEŞENLER 1.SAS-1 ALP Izoenzim Jel Koruyucu olarak sodyum azid ve thimersal ile bir Tris/Barbital tamponunda agaroz içerir. Paket içindeki jel kullanım için hazırdır. 2. SAS-1 ALP Izoenzim Ayırma Fazlalığı Vibrio koleradan nöraminidaz içerir. Ayırma fazlalığı paketlenmiş olarak kullanıma hazırdır. 3. SAS-1 ALP Izoenzim Substrate BCIP (5-Bromo-4-kloro-3-indolil fosfat) 2-amino-2-metil-1,3-propanediol tampon içerir. Substrat paketlenmiş olarak kullanıma hazırdır. 4. SAS-1 ALP Izoenzim kromajen NBT (nitromavi tetrazolium) toz içerir. Çözündürme kılavuzu için ADIM-ADIM PROSEDURE bakın.
5. Diğer Kit Bileşenleri Her kit kullanımı için talimatlar ve 10 jeli tamamlamak için yeterli Kağıt kurutucu ve Reaktif Yayılım Filmi içerir. SAKLAMA VE RAF ÖMRÜ 1 - SAS-I ALP Isoenzim Jel Jeller 15-30 derecede saklanmalıdır ve paket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. DOLABA KOYMAYIN VEYA DONDURMAYIN. Jelin bozulma belirtileri,1) jelin dondurulması sonucu oluşan kristal görünüm, 2) çatlama ve kuruluk jelin kurumasını gösterir veya 3) bakteriyal ya da fungal kaynaklı agarozun görülür kontaminasyonunu jelin bozunma belirtileridir. 2. SAS-1 ALP Isoenzim Ayırma yükseltici Ayırma yükselticisi 2...6 C de saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. 3. SAS-1 ALP Isoenzime Substrat Substrat 2...6 C de saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. Substrat solüsyonunun kontaminasyonu önlenmelidir. 4. SAS-1 ALP Isoenzime kromagen Kromajen şişeleri 2...6 C de saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanım tarihine kadar stabildir. SAĞLANMAYAN FAKAT GEREKSİNİLEN ÖĞELER Katalog No.210200 Aplikatör Ucu (1 x 10) Katalog No.210300 Aplikatör Ucu (5 x 10) Katalog No.210100 Tek kullanımlık numune kapları (100) Katalog No. 3100 REP Prep Katalog No.210500 Elektrotlar 60-70 derece hava üfleme kapasiteli kurutma fırını 45 C kapasiteli inkübatör 50 ml glisial asetik asit ve 950 ml saf suyu karıştırın. Sıkı kapatılmış şişede saklanır. Saf su NUMUNE TOPLANMASI VE HAZIRLANMASI Tercih edilen numune taze toplanmış serumdur. Serum kan toplandıktan sonra en kısa zamanda kan hücrelerinden alınmalıdır. Oksalat, sitrat veya EDTA içeren numuneler bu maddelerin alkalin fosfataz aktivitesi inhibe olarak kullanılamaz 4.Total ALP düzeyi uygun bir yöntem tarafından belirlenmelidir. Hastalar aç olmalıdır. O veya B kan gruplu hastalar yağlı bir yemekten sonra 2 saat civarında bağırsakta ALP yükseltilmiş olabilirler 4-6. Serum toplandıktan sonra en kısa zamanda test edilmeli ve 2..6 C de saklanmalıdır. Eğer gerekirse, serum 24 saatten az olmayacak şekilde - 20 C de dondurularak saklanmalıdır 7,8.
Etkileyici Faktörler: 1) Fosfat, oksalat, sitrat ve siyanür ALP aktivitesini engelleyebilir 4,8, 2) Aşırı glisin kompleks Magnezyum iyonları tarafından ALP yi inhibe edebilir, 3) EDTA bazı ALP izoenzimleri inhibe edebilir 4, 4) Bir kaç ilaç ALP düzeyini etkileyebilen enzimatik dengesizliğe neden olur 4,9. Eğer yüksek aktivite izoenzim türleri arasında ayırımcılık yeteneğini etkilerse, yüksek total ALP aktiviteli numuneler dilüe edilebilir. İsoenzimin yer değiştirmesini etkilediği için dilüsyonlar saline yada su da yapılmamalıdır. Dilüsyonlar, endojen ALP aktivitesini yok etmek için ısıtılan (15-20 dakika boyunca 56 C) erkek donörden alınan serumda yapılmalıdır. Bir dilüent olarak kullanmak için serumun kararlılığını kullanım öncesi kontrol edin. ADIM-ADIM PROSEDÜR 1. Her 30μL numune/kontrol için 10μL ALP Ayırma Yükseltici ekleyin ve iyice karıştırın. Kullanım öncesi 10 dakika boyunca 15...30 C de inkübe edin. 2. Numune tepsisine veya tek kullanımlık numune kaplarının uygun kuyusuna numunenin 35 μl pipetleyin. i) SAS-1 Plus kullanıcıları: SAS-1 numune tepsisi kullanın. Aplikatör çekmecesinde numune tepsisini dikkatlice yerleştirin. Tepisinin yerine kuvvetlice itildiğinden emin olun. ii) SAS-3 kullanıcıları: SPIFE / SAS-3 numune tepsisi kullanın. Kullanılan numune dikkatlice numune tepsisine yerleştirin. Tepsinin güvenli bir şekilde yerleştirilmiş olduğundan emin olun. 3. Jeli paketinden çıkarın ve: i) SAS-1 Plus kullanıcıları: Soğutucu üzerine 400 μl REP Prep boşaltın. Soğutucu üzerine jeli, Agaroz düzgün ve hava kabarcığı kalmayacak şekilde yerleştirin, uygun elektrot çubukları pozitif ve negatif kısımlara yerleştirin. ii) SAS-3 kullanıcıları: Havuza ayarlama kılavuzunu yerleştirin ve 400μL REP prep odanın merkezine boşaltın. Jeli agarozun toplandığı kuyuya yerleştirin, kılavuzu kullanın, uygun elektrot uçları ile negatif ve pozitif uçları ayarlayın, jelin altında hava kabarcığından kalmamasına dikkat edin. 4. Jelin yüzeyi kurutma kağıdı C ile kurutulur, kurutma kağıdı alınır. 5. i) SAS-1 Plus kullanıcıları: Elektrot kollarına elektrotlar (Kat. No. 210500) eklenir böylece jel blokları ile temasa girerler. Jelin ve elektrotların üzerine kapak yerleştirilir ve teması sağlamak için 5 sn kuvvetlice bastırılır. ii) SAS-3 kullanıcıları: elektrot kollarına elektrotlar (Kat. No. 311600) eklenir böylece jel blokları ile temasa girerler. 6. Cihaz üzerindeki üst pozisyonda 1 aplikatör ucu bir araya getirilerek yerleştirilir (SAS-3 kullanıcıları: kısım 8) 7. Alkaline Fosfataz elektroforez yapılır:
i) SAS-1 Plus kullanıcıları: Elektroforez: 220 volt, 13 dk, 23 C, 6 aplikasyon Inkübasyon adımı 1: 30 dakika, 45 C ii) SAS-3 kullanıcıları: Adım Zaman(dk:sn) Sıcaklık( C) Voltaj Diğer Numune Yükleme 00:10 21 Hız 1 Numune Uygulama 00:10 21 Hız 1* 6 uygulama toplamı için numune yükleme, numune uygulama adımlarını tekrarlayın. Elektroforez 13:00 23 220 Kurutma 30:00 45 * Yerleştirme 1 kullanılır 8. Elektroforez sonlandırılmadan önce yaklaşık 10 dakika 1ml ALP izoenzim substrat ekleyerek 1 şişe ALP Izoenzim kromajeni çözündürün. 30 saniye boyunca vorteksleyin ve bırakın. 9. Elektroforezin ardından: SAS-1 Plus kullanıcıları: kapağı çıkarın. 10. Jelin ortasına doğru ALP Izoenzim Kromajen içeren şişeyi dökün. Hava kabarcıkları oluşmasını önleyerek reaktifi yaymak için reaktif yayma filmlerinin tek parçasını dikkatlice uygulayın. (SAS-1 Plus kullanıcıları: kapağı tekrar takın). 11. Jeli inkübe edin. 12. (SAS-1 Plus kullanıcıları: kapağı çıkarın) Reaktif yayma filmlerini çıkarın. 13. Gel Block Remover kullanılarak her iki jel bloklarını çıkarın. 14. Boyama tank tutucusuna jeli ekleyin. 15. Boyama biriminde Alk Phos test programı seçilir ve iletiler izlenir: a) SAS-2 (Oto-boyayıcı) Adım Solüsyon Zaman(dk:sn) Kapı Sıcaklık( C) Kurutma - 05.00 55 Boya arındırma Boya arındırma 05.00 3 Solüsyonu Yıkama Saf su 01.00 1 Kurutma - 15.00 65 Boya arındırma Boya arındırma 05.00 3 Solüsyonu Yıkama Saf su 01.00 1
Kurutma - 05.00 65 b) SAS-4 (Oto-boyayıcı) Adım Zaman(k:sn) Sıcaklık( C) Diğer Kurutma 05.00 55 Boya arındırma 05.00 Dolaşım AÇIK Yıkama 01.00 Dolaşım AÇIK Kurutma 15.00 65 Boya arındırma 05.00 Dolaşım AÇIK Yıkama 01.00 Dolaşım AÇIK Kurutma 05.00 65 c) Manuel Boya arındırma ve yıkama adımları için bir boyama banyosu ve kurutma adımları için 60...70 C de üfleme kapasiteli bir kurutma fırını kullanarak SAS-2 Otoboyayıcı için listelenen adımları izleyin. 16.Boyama döngüsünün sonunda, boyama alanından jeli alın. Jel şimdi incelenmek için hazırdır. SONUÇLARIN YORUMLANMASI ALP izoenzim paternlerinin yorumlanması hastanın serumunda total ALP düzeyini bilmeden denenmemelidir. Normal bireyler alınan serum küçük miktarlarda karaciğer, kemik ve bağırsak ALPsi içerebilir 6,10,11. ALP düzeyleri yaş ve cinsiyet bağımlıdır 12,13. Hamile kadın plasental bir bant gösterilebilir. Neoplazmlerde görülen makrohepatik (hızlı karaciğer) band toplam ALP düzeyine bakılmaksızın hastalık durumuna bir uyarı olarak yorumlanmalıdır. Bu sistem ile nadiren Nagao, Regan ve PA izoenzimlerinin performansı şu aralar bilinmemektedir. Anormal bantlar normal ALP düzeyli hastalarda rapor edilmiştir. Şekil 1 ana ALP izoenzim bantlarının göç özelliklerini bir şematik gösterimini gösterir.
Karaciğer bandı tüm bantların en anodik olanına göç eder.yüksek toplam ALPli hastaların karaciğer bandı normal seviye hastalardan daha anodal olana göç edecektir. Toplam ALP düzeyleri yüksek olduğunda karaciğer en sık yükselen enzimdir 6,10. Karaciğer ALPsi karaciğer hastalığında diğer karaciğer fonksiyon testleri anormallikler göstermeden önce ilk olarak artar. Artan karaciğer ALP neden olan koşullar akut hepatit, siroz, yağlı karaciğer, karaciğer hastalığına indüklenen ilaç, pankreas başında kanser tarafından safra akışının tıkanıklığı, safra kanalı daralması, primer biliyer siroz ve karaciğerin metastatik karsinomu içerir 8. Karaciğer bandının yanında, çalıştırılan sonraki katholdal kemik bandıdır. Kemik izoenzimin yüksek faaliyetleri içeren numunede, kemik bandı normal bir hastadan daha yavaş çalışır. Kemik bandı elektroforetik bantların normal dikdörtgen şekline karşı karakteristik bir kare şekline sahiptir. Kemik izoenzim artan osteoblast bir aktivitenin sonucu olarak artar. Bu izoenzim normalde büyüyen çocuklarda ve 50 yaşın üzerindeki erişkinlerde yükselir. Yüksek toplam ALP değerleri, Paget s hastalığı veya renal raşitizm de artan kemik izoenzime neden olmuştur 14. Anormal yüksek kemik izoenzim düzeyi de kemik kanseri, kemik yumuşaması veya çölyak tropik bir hastalık göstergesi olabilir 8. Çocuklarda azalan bir kemik ALPsi kretinizm veya hipofosfatazya neden olabilir. Kemik bandı kathodal çalışması makrohepatik (hızlı karaciğer) bandıdır. Makrohepatik ALP karaciğerde metastatik karsinom vakasında izole edilmiştir ve bu gibi durumlarda tanımlanan bir teşhis aracı olarak önerilmektedir. Ayrıca, viral hepatit, alkolik siroz ve diğer karaciğer hastalıklı hastalarda izole edilmiştir. Viot tarafından oluşturulan veri göstermektedir ki makrohepatik ALP yüksek olarak karaciğer metastazı varlığı ile ilişkilidir ve bu izoenzimin varlığı karaciğer metastazın varlığını tahmin edebilir. Viot de rapor edilen makrohepatik ALP hastalarda herhangi bir hastalık durumunda zaman zaman serbest olarak görünür 15. Bağırsak ALP izoenzim bant(ları) makrohepatik için kathodu çalıştırır. En fazla üç bandın görünümü aç olmayan hastalardan alınan numunelerde daha yaygındır. 1.Kalitatif Değerlendirme: Jeller ilgili belirli bantların yokluğununu veya varlığını görsel olarak kontrol edebilir. 2.Kantitatif Değerlendirme: 2 saat içinde SAS-1 ALP izoenzim jellerini (jel yüzü aşağı) tarayın. Her iki durumda da belirli serum bileşenleri veya olağandışı serum bileşenlerinin tespitinde bir artış veya düşüş araştırma gerektirir. Tamamlanmış SAS-1 ALP izoenzim jeli karanlıkta artan arka plan renklenmesini önlemek için saklanmalıdır. KALİTE KONTROL Alkaline fosfataz İzoenzim Kontrol (Kat. No.3059) karaciğer ve kemik izoenzimlerin normal düzeylerini içerir ve prosedürün bütün fazlarını doğrulamak için kullanılabilir ve her plate çalışmasında kullanılmalıdır. Kabul edilebilir test değerleri için ek paketlere bakın. SINIRLAMALAR Regan, Nagao ve PA gibi ALP izoenzimin tanımlanması ısı inaktivasyonu 16, amino asit inhibasyonu 17-19, üre denaturasyonu 17,18 veya poliakrilamid jellerde ayırma 20,21 gibi ek test protokollerin kullanımını gerektirir.
Hassasiyet Yöntem, tamamlanmış jel üzerinde ayrık bir bant gibi görünen ALP izoenzimin en düşük konsantrasyonu olarak belirlendi ve bant başına 3U/L için hassasiyete sahiptir. Doğrusallık Metodun doğrusallığı, jel performansı gibi densitometre özelliğinin bir fonksiyonudur. Laboratuarda kullanılan densitometreye dayalı metodun doğrusallığının belirlenmesi her müşteriye tavsiye edilir. REFERANS DEĞERLERİ Jellerin değerlendirmesi her bir laboratuarda bu test için üretilen normal değerlere karşı yapılmalıdır. PERFORMANS ÖZELLİKLERİ Tekrarlanabilirlik Çalışama içinde (n=12) Çalışma arasında(n=60) Ortalama CV (%) Ortalama CV (%) Karaciğer 65.6% 4.4 65.6% 4.8 Kemik 34.4% 8.4 34.4% 9.2 BİBLİYOGRAFİ 1. Fishman, W.H. Am. J. Med., 1974; 56 : 617-650. 2. Moss, D.W. and Edwards, R.K. Clin. Chim. Acta, 1984; 143 : 177-182. 3. Moss, D.W. et al. Biochem. J., 1966; 98 : 32C-33C. 4. Young, D.S. et al., Effects of Drugs on Clinical Laboratory Tests, 3rd Ed., AACC Press, Washington D.C., 1990. 5. Sundblad, L. et al Clin. Chim. Acta, 1973; 45 : 219-223. 6. Rhone, D.P. et al., Clin. Chem., 1973; 19(10) : 1142-1147. 7. Massion, C.G. and Frankenfeld, J.K., Clin. Chem., 1972; 18(4) : 366-373. 8. Wolf, P.L., Arch. Pathol. Lab. Med., 1978; 102 : 497-501. 9. Ahmad, I., Clin. Chem., 1978; 24(10) : 1850-1851. 10. Fritsche, H.A. and Adams-Park, H.R., Clin. Chem., 1972; 18(5) : 417-421. 11. Lee, L.M. and Kenny, M.A., Clin. Chem., 1975; 21(8) : 1128-1135. 12. Eastman, J.R. and Bixler, D., Clin. Chem., 1977; 23(9) : 1769-1770. 13. Cherian, A.G. and Hill, J.G., Am. J. Clin. Pathol., 1978; 70(5) : 783-789. 14. Nerenburg, S.T. Medical Technology, Lea and Febiger Inc., Philadelphia, 122-123, 1973. 15. Viot, M. et al., Biomedicine, 1979; 31 : 74-77. 16. Posen, S. et al., Ann. Int. Med., 1965; 62(6) : 1234-1243. 17. Stepan, J. and Vecerek, B., Acta Univ. Carol., 1977; Mono 77 : 135-140. 18. O Carroll, D. et al., Am. J. Clin. Pathol., 1975; 63 : 564-572. 19. Rhone, D.P. and Mizuno, F.M., Am. J. Clin. Pathol., 1973; 59 : 531-541. 20. Johnson, R.B. et al., Clin. Chem., 1972; 18(2) : 110-115. 21. Rosalki, S.B. and Foo, A.Y., Clin. Chem., 1985; 31(7) : 1198-2000.