MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER I DNA&RNA
Moleküler biyoloji Moleküler düzeyde biyolojik olayları, çeşitli hücresel sistemler arasındaki etkileşimleri inceler DNA, RNA, proteinler Arasındaki ilişkiler Etkileşimler Etkileşimlerin nasıl düzenlendiği çalışma konularıdır.
Moleküler biyologlar Genetik Biyokimya Biyofizik tekniklerini kullanırlar. Bu farklı disiplinler iç içedir.
Moleküler biyoloji - diğer biyolojik bilimler ilişkisi işlev Biyokimya Genetik proteinler Moleküler biyoloji genler
1950-1960 lar Moleküler hücre bileşenlerinin Tanımlanması İzolasyonu Kullanımları olası hale gelmiştir.
Moleküler hücre bileşenleri; DNA genetik bilgi deposu RNA transkripsiyon, translasyon Proteinler yapısal ve enzimatik bileşenler
Moleküler hücre bileşenleri (DNA,RNA ve Proteinler) ile moleküler çalışmalar Biyolojik olayların mekanizmalarının anlaşılması Biyoteknoloji - Tıp - Tarım & Hayvancılık - Gıda - Çevre & Enerji
Nükleik Asitlerin İzolasyonu Yapı ve işlevlerinin aydınlatılması Gen anlatımı Gen anlatımının düzenlenmesi Genetik mühendisliği Genomik ve proteomik çalışmaları Bu amaçlar için öncelikle nükleik asitlerin yüksek saflıkta izole edilmeleri gerekir.
DNA İzolasyonu DNA hücrede proteinler, katyonlar yardımıyla yoğunlaşmış durumda bulunur. Proteinlerle ilişkisi işlevleri gereğidir. ÖR: gen anlatımı - düzenleyici proteinler transkripsiyon - RNA polimerazlar hasar onarımı - DNA polimeraz, DNA ligaz bakteriyofaj - protein kılıf
DNA saflaştırılmasının temel aşamaları 1) Hücre çeperi ve membranlarının parçalanarak yüksek molekül ağırlıklı DNA nın serbestleştirilmesi 2) Denatürasyon veya proteoliz yoluyla DNA-protein kompleksinin çözülmesi 3) DNA nın diğer moleküllerden ayrılması Çalışma amacına (klonlama, dizi analizi vb.) bağlı olarak ileri saflaştırma yöntemlerinin uygulanması Farklı DNA moleküllerinin (kromatografik, spektrofotometrik yöntemlerle) fraksiyonlandırılması
Prokaryotik DNA İzolasyonu Bakteri DNA sı asal (kromozomal) ya da ekstrakromozomal (plazmit, bakteriyofaj) oluşuna bağlı olarak farklı yöntemlerle izole edilir.
Prokaryotik kromozomal DNA İzolasyonu AŞAMA 1 Hücre duvarının zayıflatılması: Fiziksel yöntem: dondurup-çözme Kimyasal yöntem: lizozim uygulaması kelatör (EDTA) kullanımı Lizozim: Kelatör: metal iyonlarının bağlanmasını artırarak çökelmeyi hızlandıran kimyasal ajanlar
Prokaryotik kromozomal DNA İzolasyonu AŞAMA 2 Hücre zarının parçalanması: 1. Fiziksel yöntemler: Homojenizasyon Ultrasonikasyon Ozmotik şok
Prokaryotik kromozomal DNA İzolasyonu AŞAMA 3 Hücre zarının parçalanması: 2. Kimyasal yöntemler: Deterjan kullanımı SDS (sodyum dodesil sülfat) SDS ph ve uygun iyon konsantrasyonunda lipoproteinlerle birleşir, membranların lipoprotein kısımlarını suda çözünür hale getirir HÜCRE PARÇALANIR (LİZİZ)
Prokaryotik kromozomal DNA İzolasyonu AŞAMA 4 RNA nın parçalanması için RNAaz Proteinlerin parçalanması için Proteazlar Kalan proteinler ve oligopeptitler için fenolkloroform ekstraksiyonu
Prokaryotik kromozomal DNA İzolasyonu AŞAMA 5 DNA içeren fazın alkolle (Etanol) çöktürülmesi DNA gözle görülebilir, cam çubuğa sarılır!!!
Prokaryotik kromozomal DNA İzolasyonu İleri saflaştırmalar Diyaliz ile kalıntıların uzaklaştırılması CsCl 2 derecelenme santrifügasyonu Kromatografik ayırım
Ekstrakromozomal DNA İzolasyonu Kromozomal DNA uzaklaştırılır!!! Bakteriyofaj DNA sı izolasyonu: 1. İnfekte olmuş bakteriden faj partiküllerinin izolasyonu ile kromozomal DNA nın eliminasyonu 2. Proteaz ve/veya fenol uygulaması 3. İleri saflaştırmalar
Ekstrakromozomal DNA İzolasyonu Plazmit DNA sı izolasyonu: Kromozomal DNA izolasyonuna benzer! 1. (Hücre çeperi ve membranlarının parçalanarak yüksek molekül ağırlıklı DNA nın serbestleştirilmesi) ve 2. (Denatürasyon veya proteoliz yoluyla DNAprotein kompleksinin çözülmesi) aşamalar aynıdır.
Ekstrakromozomal DNA İzolasyonu Plazmit DNA sı izolasyonu: FARK; kromozomal ve plazmit DNA sı konfigürasyonlarının farkı nedeniyledir. Plazmit DNA sı: halkasal ve süper dönümlüdür. Kromozomal ve plazmit DNA larının denatürasyonlarını (yüksek sıcaklık, ph gibi) takiben renatürasyon sürelerinin farkları ayırma için kullanılır. ÖR: ph 12-12.5 plazmit DNA sı denatüre olmaz.
Plazmit DNA sı
Ökaryotik Kromozomal DNA İzolasyonu Ökaryotlardan DNA izolasyonunun zorluğu: organel (mitokondri, kloroplast) DNA larının varlığı Total hücresel DNA izolasyonu için; modifiye alkali-lizis yöntemi kullanılır. (Alkali-lizis yöntemi: plazmit DNA sı izolasyonu için kullanılır)
Ökaryotik Kromozomal DNA İzolasyonu 1. Hücre zarının lizisi 2. Parçalanmamış organellerin izolasyonu 3. Boyut, yoğunluk, deterjan duyarlılık farklarına göre nukleus ve organel DNA larının ayrılması 4. Organeller için; organel zarı lizisi RNA ve proteinlerden arındırma (organel DNA ları plazmit DNA sı gibi halkasal, kapalıdır ve izolasyonları plazmit DNA izolasyonuna benzer)
Bitki Hücre DNA sı izolasyonu İzolasyonda en önemli ayırıcı özellik; kalın hücre çeperidir. Çeperin parçalanması için genellikle Homojenizasyon Sıvı nitrojenle dondurup parçalama Bunun dışındaki aşamalar diğer ökaryotik hücrelerden DNA izolasyonuna benzer.
Sıvı Fazdan DNA nın Saflaştırılması ve Konsantre edilmesi Yöntemleri Fenol ekstraksiyonu, etanolle çöktürme: Küçük hacimlerden (0.4 ml den az) 1mg/ml den az konsantrasyonlarda DNA izolasyonu için (çoğunlukla tercih edilen yöntem) İzopropanolle çöktürme: DNA solusyonu ile eşit hacimde kullanılarak çöktürme yapılır.
Sıvı Fazdan DNA nın Saflaştırılması ve Konsantre edilmesi Yöntemleri Cam boncukla saflaştırma: Süspansion halindeki cam boncuklar DNA, RNA ve protein çöktürmede hızlı ve etkin yöntemdir. Oligonükleotidlerin ve trifosfatların etanolle çöktürülerek uzaklaştırılması: 30 bç den kısa oligonükleotidler ve nükleotidlerin DNA solüsyonundan uzaklaştırılması için amonyum asetat ile etanol çöktürmesi (2 aşamalı) uygulanır.
Anyon Değiştirici Kromatografi ile DNA saflaştırması Seçici olarak nükleik asitlere bağlanan anyon değiştirici reçine içeren kolon kullanılır DNA nın RNA, protein, karbohidrat ve metabolitlerden hızlı olarak ayrılması sağlanır. Kolon dolgu maddesi
DNA örneklerinin saklanması : İzole edilmiş DNA örnekleri, degredasyonun en aza indirgenmesi amacıyla uygun koşullar altında saklanmalıdır. Uzun dönem saklamada, deamidasyon u engellemek için, DNA nın içinde bulunduğu tamponun ph sı 8.5 dan büyük olmalıdır ve en azından 0.15 M NaCl ve 10 mm EDTA içermelidir. Aşağıdaki faktörler saklama sırasında DNA nın parçalanmasına yol açabilirler.
DNaz kontaminasyonu: DNaz kontaminasyonun ana kaynağı insan derisidir. Bu tip kontaminasyon lastik eldiven kullanmak, steril solüsyon ve tüpler kullanılmak suretiyle önlenebilir. DNA cam yüzeylere kolayca absorbe olabildiğinden dolayı saklama için sadece steril plastik tüpler kullanılmalıdır. Ağır metallerin varlığı: Ağır metaller fosfodiester bağlarının kopmasını kolaylaştırır. Bu nedenle uzun dönem saklamada DNA tamponu 10 mm veya daha fazla EDTA içermelidir.
Etidyum bromür varlığı: Moleküler oksijen varlığında, etidyum bromür görünür ışıkla birlikte DNA nın fotooksidasyonuna neden olur. Bu madde ile muamele edilmiş DNA örneklerinden etidyum bromürün tamamen uzaklaştırılması mümkün olmadığından, örnekler daima karanlıkta saklanmalıdır. Sıcaklık: Yüksek molekül ağırlıklı DNA nın kısa dönem saklanması için en uygun sıcaklık 4 C ile 6 C arasındadır. Bu sıcaklıkta, DNA örnekleri DNA nın parçalanmasına sebep olan dondurma ve çözdürme işlemleri olmaksızın saklanabilir. Uzun dönem saklamada ( 5 yıl veya daha uzun), DNA -70 C veya altında muhafaza edilmeli ve dondurma ve çözdürme işlemi yapılmamalıdır. Dondurma ve çözdürme işleminden kaçınmak için, DNA örnekleri küçük hacimlerde ayrı tüplere paylaştırılmalıdır.
RNA İzolasyonu Bakteri hücresinin %6 sı Memeli hücresinin %1.1 i Total 10-15mg RNA nın RNA dır %80-85 i rrna %15-20 si trna ve nukleusa ait küçük RNA lar %1-5 i mrna
RNA Protein translasyonu için geçici olarak bilgi iletir. Sinyalin işlevi bitince durdurulması kritik önem taşır. Riboz rezidüleri 2 ve 3 pozisyonunda halkasal grup taşıdıklarından kimyasal olarak DNA dan daha reaktiftir ve Rnaz ile kolayca yıkılır.
RNA Rnaz tüm dokularda bulunup çevresel etkilere karşı çok dayanıklıdır. Disülfit bağlarından dolayı uzun süre kaynatmaya, denatüranlara dirençlidir ve denatüre olduğunda hızla yenilenebilir. Aktivitesi için katyonlara gereksinim duymadığından EDTA gibi şelatörlerle inhibe olmaz.
RNA İzolasyonu Gen anlatımı Gen anlatımının analizi Gen anlatımının düzenlenmesi İşlenme Klonlama çalışmalarının önemli kısmı RNA izolasyonuna dayanır. Klonlama çalışmalarında cdna kitaplığının kurulması ve kitaplıktan istenen genin izolasyonu için total RNA dan mrna izolasyonu gereklidir.
RNA Analizi Northern Analizi (Gen ekspresyonu için) cdna kütüphanesi için kaynak RT-PCR RNase koruma metotları Splicing defects
GEN EKSPRESYONU ANALİZİ 5 3 PROMOTOR exon 1 intron exon 2 Reporter gene analysis hnrna 5 transcription 3 RNA processing RNA analysis mrna 5 m 7 GpppN 3 AAAAAA degradation protein
RNA Ekstraksiyonu Hücre çeperi ve membranının parçalanması (LİZİS) Hücre lizatının santrifüjlenmesi (diğer makromoleküllerden ayrılması) Genomik DNA dan ayrılması için asidik solüsyonlarla muamele Trizol, Guanidinium HCl veya guanidinium tiyosiyanat (güçlü denaturanlar) homojenatı, ile fenol:kloroform ekstraktı uygulanabilir. Pürifikasyon RNA nın yoğunlaştırılması Kalite ve saflığının tespiti
RNA ekstraksiyonu için çok sayıda protokol ve ticari kit mevcuttur.
Manuel RNA İzolasyonu 1. RNA Homojenizasyon bufferında hücrelerin süspansiyonu (NaCl, MgCl2, Tris, Nonidet P-40, DTT, RNase Inhibitor) 2. RNA ekstraksiyon bufferı eklenir (Tris ph 8, EDTA, NaCl, SDS, Proteinase K -37C/30min) 3. Fenol kloroform ekstraksiyonu 4. RNA nın yoğunlaştırılması (presipitasyonu) 5. Dnaz I den free RNaz, Rnaz inhibatörü, MgCl 2 ve DTT (37C/60min) ekleyerek yeniden süspanse edilir. 6. 3-4 stepler tekrarlanır ve TE de yeniden süspanse edilir.
RNA İzolasyonu Örnek prosedür (bitki total RNA izolasyonu Fenol yöntemi) 1) Homojenizasyon 2) Fenol-kloroform (proteinlerin uzaklaştırılması) 3) NaOAc ile nükleik asitlerin çöktürülmesi 4) NaOAc ile RNA nın çöktürülmesi 5) Polisakkaritlerin uzaklaştırılması için CsCl 2 derecelenme santrifüjlemesi 6) mrna izolasyonu için oligo dt / poli U sefaroz ile kromatografi (yüksek tuz konsantrasyonunuda polia kuyruğu bağlanır, tuz konsantrasyonu düşürüldüğünde mrna kolonda elde edilir)
RNA Extraksiyonu (Column) Total RNA kitleri (Qiagen ve Ambion) Hücreler guanidine tiyosiyanat ile muamele edilerek lizat etanol ile dilüe edilir. RNA matrixi yada cama uygulanarak protein ve diğer kontaminantlar uzaklaştırılır. Böylece Total RNA elde edilir.
RNA İzolasyonu BAŞARILI BİR RNA İZOLASYONU, diğer moleküllerle kontamine olmamış ve yıkılmamış RNA ların saflaştırılması demektir RNA saflaştırılmasının en güç yanı endojen RNaz ların RNA yı parçalamalarıdır!!!
Endojen ve Eksojen RNaz ile Savaşı Kazanım Yolları; Endojen RNaz için; Guanidinium isothiocyanate (GITC) RNAzol/Trizol/Ultraspec (14M GITC and urea salts) Qiagen RNeasy kullanılmalı Eksojen RNaz profilaktik tedbirlerin dikkatli kullanılması ile ortadan kaldırılabilir. Eksojen Rnaz kontaminasyonu en sık; - Kontamine bufferlar - Otomatik pipet uçları ile olur.
Eksojen RNaz ile Savaşı Kazanım Yolları; Mutlaka eldiven (tam koruma??) Özel pipet seti Mümkünse tüm kimyasallar, elektroforez tankları, diğer tüm malzemeler sadece RNA çalışması için kullanılmalı Tüm çözeltiler (DEPC=dietilpirokarbonat), cam ve plastik eşyalar Rnaz aktivitesini yok etmek amacıyla özel hazırlanmalı **Tris DEPC I inaktive ettiğinden Tris li çözeltiler DEPC ile hazırlanmamalı
Eksojen RNaz ile Savaşı Kazanım Yolları; Bazı cam eşyalar %0.1 oranında çözünmüş DEPC bulunan suda 2 h 37 C de bekletilip steril dh 2 O ile yıkanarak 15 d. otoklavlanır. Cam eşyalar 180 C de 8 h, 300 C de 4h veya kloroform ile yıkanarakda Rnaz inaktive edilebilir. DEPC ciddi karsinojen maddedir!!
Başarılı RNA İzolasyonu için; Kelatörler (EDTA, EGTA) Deterjanlar (SDS) Guanidium izotiosiyanat kullanılmalıdır. RNaz inhibitörleri CAM EŞYA İÇİN; DEPC (dietilpirokarbonat) ın %0.002 lik solusyonu DEPC den geçişilmiş cam eşyanın otoklavlanması Çok temiz çalışma koşulları (İzolasyon sırasında da solusyonlar için %0.005 lik DEPC kullanılır) RNA deterjan varlığında -20 o C -80 o C da saklanır.
NÜKLEİK ASİTLERİN SAFLIK KONTROLÜ İzole edilen DNA ve RNA nın saflık kontrolü ve miktarının belirlenmesi daha sonra yapılacak çalışmalar için gereklidir!!! Bu amaçla kullanılan iki temel yöntem: 1) Spektral yöntem 2) Elektroforetik yöntem kullanılır.
Spektral Yöntem DNA ve RNA miktarının ve saflığının belirlenmesi için kullanılır. Nükleotidlerin bazları UV ışığı 260 nm de maksimum düzeyde absorbe etme özelliğinden yaralanarak ölçüm yapılır.
Spektral Yöntem A 260 = 260nm deki absorbsiyon değeri miktar belirlemede kullanılır. Çift zincirli DNA için 1 A 260 = 50mg/ml Tek zincirli DNA/RNA için 1 A 260 = 40mg/ml
Spektral Yöntem Miktar belirlemek için Çift iplikli DNA (mg/ml)=a 260 x sulandırım oranı x 50 Tek iplikli DNA ya da RNA (mg/ml)=a 260 x sulandırım oranı x 40
Spektral Yöntem Saflık belirlemek için; A 260 /A 280 oranından yararlanılır. Proteinler UV ışığı 280nm de maksimum absorbe ederler. A 260 /A 280 =1.95 (saf DNA için), E.coli için A 260 /A 280 =2 (saf RNA için) Fenol, protein gibi safsızlıklar varlığında değerler düşer.
spektrofotometre Spektral Yöntem
Elektroforetik Yöntem Avantajlar Basit Hızlı Güçlü Nükleik asit fragmentlerinin gösterilebilmesi
Elektroforetik Yöntem Elektroforez; çözünmüş haldeki yüklü moleküllerin elektriksel bir alanda kitlelerine bağlı oranda hareket etmeleri (göç) ve buna bağlı olarak birbirlerinden ayrılmalarıdır. _ +
Jel Elektroforezi Elektrik akımı varlığında jele uygulanmış negatif yüklü DNA nötral ph da anoda doğru hareket eder.
Jel Elektroforezi Nükleik asitleri ayırmada sıklıkla kullanılır. Nükleik asitler bir destek materyaline (matriks) uygulanırlar. Matriks materyalleri Agaroz Poliakrilamid Nişasta Agaroz-poliakrilamid
Jel Elektroforezi Kullanılan matriks tipine göre Agaroz jel elektroforezi - DNA Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) - Protein Matriks konumuna göre Yatay elekroforez- DNA Dikey elektroforez - Protein
Jel Elektroforezi Jele uygulanmış nükleik asitler UV ışık altında fluoresan veren boya etidyum bromid (EB) varlığında gözle görülebilir (bant) parlak bantlar halinde ayrılırlar. EB kanserojen!!! UV göze zararlı!!!
Jel Elektroforezi 1-10 ng kadar az miktardaki DNA nın jeldeki Yerini belirlemek Jelden kesip almak mümkündür.
Jel Elektroforezi 1) Matriks materyali tarak yerleştirilmiş olan elektroforez kasetine dökülür. 2) Matriks donduktan sonra tarak çıkarılır. 3) Örneklerin yükleneceği kuyucuklar oluşur. 4) Örnek yükleme işi kaset içinde elektroforez tamponu bulunan tankta yapılır. 5) EB genellikle jel hazırlanırken eklenir. 6) Sistemin kapağı kapatılır. 7) Elektrodlar yerleştirilir. 8) Güç kaynağından istenen güçte akım geçirilir.
Jel Elektroforezi AGAROZ JELLER Hazırlaması kolay Genellikle yatay Çözünürlüğü düşük Ayırma alanı fazla 200bç 50.000 bç POLİAKRİLAMİD JELLER Hazırlaması zor Genellikle dikey Çözünürlüğü yüksek 1bç lik fark Ayırma alanı dar 5-500 bç
Agarozun DNA ayırım etkinliği Agaroz miktarı (% w/v) Linear DNA nın etkin bir biçimde ayrılabileceği boyut (kb) 0,3 0,6 0,7 0,9 1,2 1,5 2,0 5-60 1-20 0,8-10 0,5-7 0,4-6 0,2-3 0,1-2
Poliakrilamid jellerin DNA ayırma etkinlikleri Akrilamid Etkin Ayırma (% [w/v]) a Alanı (bp) Ksilen Siyanol FF b Bromofenol mavisi b 3,5 1000-2000 460 100 5,0 80-500 260 65 8,0 60-400 160 45 12,0 40-200 70 20 15,0 25-150 60 15 20,0 6-100 45 12 a) N,N' metilenbisakrilamid akrilamidin 1/30 u kadar b) Boya ile birlikte göç eden çift iplikli DNA moleküllerinin baz çifti sayısı
Agaroz jel elektroforezi Göç oranı çeşitli faktörlere bağlıdır. 1) DNA nın molekül büyüklüğü Büyük molekül yavaş hareket eder. 2) Agaroz konsantrasyonu Yüksek agaroz konsantrasyonu küçük, düşük ise büyük moleküllerin ayrılmasında kullanılır.
Agaroz jel elektroforezi 3) DNA konformasyonu DNA süper dönümler yapar Süper dönüm Aynı molekül ağırlığına sahip DNA molekülünün süperdönümlü halkasal (form 1) Kesilmiş halkasal (form 2) Doğrusal (form 3) formları agaroz jelde farklı hızda hareket ederler.
Agaroz jel elektroforezi 1. DNA ağırlık standartı 2. Farklı plazmit formları 3. B. subtilis genomik DNA sı
Agaroz jel elektroforezi tamponun iyonik kuvveti, elektrik akımı, süper kıvrım yoğunluğuna EB e bağlı olarak bu formların birbirlerine göre hareketlilikleri değişir.
Agaroz jel elektroforezi 4) Uygulanan voltaj Düşük voltajda doğrusal DNA hareketi voltajla doğru orantılıdır, güç artışı harekette farkılaşmaya yol açar. 2kb den büyük DNA için 5V/cm den fazla olmalı 5)Elektrik alanının yönü 50-100 kb lik DNA lar için elektrik alan yönü aynı kaldıkça DNA ayrılma oranı aynıdır, ama yön değişirse DNA harekete karşı koyar (pulse field jel elektroforez)
Agaroz jel elektroforezi 6) Baz içeriği ve temparatür Poliakrilamid jel elektroforezinin aksine baz içeriği göçü etkilemez. Oda sıcaklığında uygulanır. %0.5 lik jel kullanımında 4 0 C
Agaroz jel elektroforezi 7) Boya EB baz çiftleri arasına yerleştiğinden DNA hareketini %15 azaltır. 8) Elektroforez tampon kompozisyonu Tamponunu iyonik kuvveti göçü etkiler. İyon kuvveti az/yok göç yavaş/yok İyon kuvveti çok ısınma, erime
Elektroforez tamponları Tris-asetat (TAE) ph 8.0 Tris-fosfat (TPE) ph 8.0 Tris-borat (TBE) ph 8.0 Alkalin ph 8.0
Jel yükleme tamponu DNA örneği kuyuya yüklenmede önce tamponla karıştırılır. Kullanım amaçları: 1. Kuyuya çökmeyi sağlar. 2. Örneği boyar, görünür yapar. 3. Yürüme yerini belirler.
Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE) Akrilamid polimeri Hazırlanması agarozdan güç Hazırlamada hassasiyet ve deneyim gerekli
Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE) İki cam arası kullanım Dikey kullanım Jel boyu 10-100cm
Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE) Agaroza üstünlükleri 1) Ayırma gücü yüksek 1bç bakımından birbirinden ayırır. farklı DNA ları 2) Daha fazla miktarda DNA (10mg dan fazla) uygulanabilir. 3) Jelden geri kazanılan DNA daha saftır ÖR: fare edilebilir. embriyosuna enjekte
Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE) Poliakrilamid jellerin moleküler biyolojide iki tipi kullanılır. 1) Non-denatüre poliakrilamid jeller: Çift iplikli DNA nın ayrılması ve saflaştırılması için kullanılır. Jel düşük voltajda (1-8V/cm) yürütüldüğünden çift ipliğin açılması engellenir.
Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE) 2) Denatüre poliakrilamid jeller: Tek iplikli DNA parçalarının ayrılması ve saflaştırılması için kullanılır Jeller hazırlanırken eklenen üre/formamid; Nükleik asitlerin baz çifti oluşturmasını engeller
Pulse Field Jel Elektroforezi (PFGE) Büyük DNA moleküllerinin ayrılması için kullanılır. 2Mb büyüklüğündeki DNA lar (kromozomlar) bile ayrılabilir. Elektrik akımının yönü periyodik olarak değiştirilerek uygulanır. Genom projesinde kullanımı çok yararlı olmuştur.
Pulse Field Jel Elektroforezi (PFGE) PFGE Shigella sonnei nin XbaI kesiminin PFGE analizi
DNA nın Jelden Geri Kazanılması Jel elektroforezi ile ayrılıp, saflaştırılmış DNA nın, çeşitli amaçlar için (klonlama, dizi analizi vb.) jelden geri kazanılması gerekebilir.
DNA nın Jelden Geri Kazanılması JELDEN GERİ KAZANMADA KARŞILAŞILAN GÜÇLÜKLER: 1. Agarozun daha sonraki işlemler için istenmeyen maddeler içermesi (saf agaroz kullanımı sorunu ortadan kaldırır) 2. Büyük DNA moleküllerinin etkin biçimde geri kazanılamaması (5kb den büyük DNA moleküllerinin geri kazanımı zordur)
DNA nın Jelden Geri Kazanılması JELDEN GERİ KAZANMADA KARŞILAŞILAN GÜÇLÜKLER: 3. Az miktardaki DNA nın etkin biçimde geri kazanılamaması (500ng dan daha aza miktarlar geri kazanım için yeterli değildir) 4. Farklı DNA moleküllerinin aynı anda geri kazanımlarının güçlüğü
DNA nın Jelden Geri Kazanılması Yöntemleri DEAE-selüloz membran üzerinde elektroforez 1. Jel parçalarının kolona yüklenmesi 2. Elüsyon tamponu ile kolondan DNA nın alınması Diyaliz tüpünde elektroelüsyon 1. Yürütme tamponu içeren diyaliz tüpüne jel parçasının konması 2. DNA nın jelden tüp içindeki dilüsyon tamponuna geçişi Low melting temperature agoroz jel kullanımı 65 o C nin altında eriyebilen agaroz jeller kullanarak erimeden sonra DNA nın saflaştırılması