Genscreen HIV-1 Ag Assay 2 plaka

Genscreen HIV-1 Ag Assay 2 plaka - 192 71120 İNSAN SERUMU VE PLAZMASINDA VE HÜCRE KÜLTÜRLERİNİN YÜZEYİNDE YÜZEN SIVILARDA (HIV-1) TİPİ İNSAN İMMÜNYETMEZLİK VİRÜSÜNE AİT P24 ANTİJENİNİNALGILANMASINA YÖNELİK İMMÜNOENZİMATİK TEST (EIA) 883669-2014/01

İÇİNDEKİLER 1. KLİNİK ÖNEMİ 2. Genscreen HIV-1 ANTIGEN ASSAY KİTİNİN PRENSİBİ 3. Genscreen HIV-1 ANTIGEN ASSAY KİTİNİN BİLEŞİMİ 4. GEREKLİ OLAN ANCAK ÜRÜNLE BİRLİKTE VERİLMEYEN MALZEMELER 5. HİJYEN VE GÜVENLİK TALİMATLARI 6. ÖNLEMLER 7. NUMUNELER 8. REAKTİFLERİN YENİDEN OLUŞTURULMASI 9. SON KULLANMA TARİHİ - SAKLAMA 10. ÇALIŞMA ŞARTLARI 11. HESAPLAMALAR VE SONUÇLARIN DEĞERLENDİRİLMESİ 12. NUMUNE VE REAKTİF İLAVELERİNİN SPEKTROFOTOMETRİK YÖNTEMLE KONTROL EDİLMESİ 13. PERFORMANSLAR 14. TEST LİMİTLERİ 15. KAYNAKÇA 2 [TR]

1 - KLİNİK ÖNEMİ İmmünyetmezlik sendromunun (AIDS) etyolojik ajanı, İnsan İmmünyetmezlik Virüsü (HIV) adı verilen bir retrovirüstür. HIV, AIDS'e yakalanmış hastalarda ve AIDS açısından riskli bir popülasyona mensup bireylerde izole edilmiştir 1,2. Virüsün cinsel ilişki yoluyla, kontamine iğnelerin kullanılması, kontamine kan ürünlerinin aktarılması yoluyla ve virüs bulaşmış anneden fötüse veya yeni doğmuş bebeklere plasental yolla aktarıldığı bilinmektedir 1,8. Normal olarak, virüse maruz kalmış bir bireyin kanında veya plazmasında virüse maruz kaldığını gösteren virüse özel antikorlar algılamak mümkündür. Algılanabilir antikorların ortaya çıkışından önceki safhada, serbest viral antijenler kanda dolaşımda bulunur. Bu viral antijenlerden biri, nükleokapsidin ana proteinine tekabül eden p24 antjenidir. HIV antijeni tarama testleri viral antijenlerin varlığını saptamak ve dolayısıyla serokonversiyon gerçekleşmeden bir HIV enfeksiyonuna teşhis koymak için kullanılabilir. Anti-HIV antikorlarının ortaya çıkmasından önceki antijenemi dönemi değişkendir ve virüsün bulaştığı bireylerde birkaç günden birkaç haftaya kadar sürebilir. Serokonversiyon sırasında, virüsün özel antikorları dolaşımdaki antijenler ile birlikte immün kompleksler oluşturur, bunun sonucunda kandaki serbest antijen oranlarında büyük bir düşüş görülür ve muhtemelen bu antijenler tamamen ortadan kaybolur 9,11. Antijenemi daha sonra hastalığın ilerleyişi sırasında yeniden ortaya çıkabilir 12. Genscreen HIV-1 Antigen Assay testi HIV-1 enfeksiyonu teşhisi konulması ve bu enfeksiyonun ilerleyişinin belirlenmesi için kullanılmaya yönelik yardımcı bir araçtır. 2 - Genscreen HIV-1 ANTIGEN ASSAY KİTİNİN PRENSİBİ Genscreen HIV-1 Antigen Assay testi, insan serumu ve plazması ve hücre kültürlerinin yüzeyinde yüzen sıvı numunelerindeki serbest, tip 1 insan immünyetmezlik virüsü (HIV-1) kapsidine ait p24 antijeninin in vitro algılanmasına yönelik immünoenzimatik bir testtir. "Genscreen HIV-1 Antigen Confirmatory Assay" testi (kod 71121) reaktivitesi tekrarlanan numunelerde HIV p24 antijeninin varlığını doğrulamak amacıyla Genscreen HIV-1 Antigen Assay testine ek olarak kullanılan bir testtir. Genscreen HIV-1 Antigen Assay testi, anti-hiv-1 fare monoklonal antikorları ile hazırlanmış katı bir safha, anti p24 biyotinli koyun antikorları ile hazırlanmış bir konjugat ve peroksidazla (yabani turp) birleşik avidin ile hazırlanmış ikinci bir konjugatın kullanılmasına dayanır. Testin uygulanması aşağıdaki reaksiyonel aşamaları içerir: 1. İncelenecek numuneler ve kontrol serumları, numune sulandırıcısının önceden ilave edildiği haznelerine dağıtılır Test edilen numunede HIV-1 antijeni var ise, bu antijenler bu durumda kapların dibini kaplayan antikorlara bağlanır ve takip eden yıkama aşaması sırasında orada sabit kalır. Numune ilavesi numune sulandırıcısının renginin yeşilden maviye dönmesi ile doğrulanır. 2. Ardından konjugat 1 her kaba ilave edilir ve inkübe edilir. Bu işlem konjugat 1'de bulunan anti-p24 biyotinli koyun antikorlarının kaplara hapsedilen HIV-1 antikorlarına-antijenlerine bağlanmasını sağlar. Bu kompleks antijenler-antikorlar takip eden yıkama aşaması sırasında haznelere sabitlenmiş olarak kalır. 3. Bu durumda konjugat 2 dağıtılır ve inkübe edilir. Konjugat 2'deki avidin özellikle kaplara bağlanan kompleks HIV-1 antikorlarına-antjenlerine bağlanır. Konjugatın bağlanmayan artan kısmı yıkama ile elimine edilir. 3 [TR]

4. Reaksiyonun developmanı TMB çalışma solüsyonunun ilave edilmesi ve ardından inkübe edilmesi ile gerçekleştirilir. Numunedeki HIV-1 antijeni miktarıyla orantılı olarak mavi veya mavi-yeşil bir renk oluşur. Rengin mavi-yeşilden sarıya dönmesine neden olan asit ilavesi ile, kolorimetrik reaksiyon durdurulur. Numune ve kontrollerin optik yoğunluğu 450/620-700 nm dalga uzunluğunda spektrofotometri ile belirlenir. 3 - Genscreen HIV-1 ANTIGEN ASSAY KİTİNİN BİLEŞİMİ Etiketleme R1 Microplate R2 Concentrated washing solution (20X) R3 Specimen diluent C0 Negative control C1 Positive control R4 Concentrated conjugate 1 R5 Concentrated conjugate 2 R6 Conjugate diluent R8 Substrate buffer R9 Chromogen: TMB solution (11X) R10 Stopping solution Reaktiflerin niteliği Mikroplaka HIV-1 anti-p24 monoklonal murin antikorları ile duyarlılaştırılmış 8 kaptan oluşan şeritler Konsantre Yıkama Solüsyonu (20X) NaCl ph 7,4 Tris Tamponu Koruyucu: ProClin 300 (%0,04) Numune Sulandırıcısı Triton X-100 (2%) Lithium Chlorid (2%) Numune ilave göstergesi olarak yeşil renklendirici Koruyucu: ProClin 300 (%0,5) Negatif kontrol HIV antijeni ve AgHbs, anti-hiv-1, anti-hiv-2, anti- HCV ve anti-htlv-i antikorları, %0,005 gentamisin sülfat için, reaktif olmayan insan serumu Koruyucu: ProClin 300 (%0,5) Pozitif kontrol Saflaştırılmış ve ayrılmış HIV-1 antijeni Koruyucu: ProClin 300 (%0,5) Konsantre konjugat 1 (100X) Biyotinli anti-p24 koyun antikorları, % 0,005 gentamisin sülfat Sarı renklendirici - Koruyucu: ProClin 300 (%0,5) Konsantre konjugat 2 (100X) Peroksidaz (yabani turp) birleştirilmiş avidin, %0,005 gentamisin sülfat Yeşil renklendirici - Koruyucu: ProClin 300 (%0,5) Konjugat sulandırıcısı Protein stabilizörü içeren tampon Koruyucu: ProClin 300 (%0,5) Substrat Tamponu % 0,015 oksijenli su ve % 4 dimetilsülfoksit (DMSO) içeren sitrik asit ve sodyum asetat ph 4,0 solüsyonu Kromojen Tetrametilbenzidin (TMB) içeren solüsyon Durdurma solüsyonu 1 N sülfürik asit solüsyonu Sunum 71120 2 plaka 1 şişe 235 ml 1 şişe 20 ml 1 şişe 10 ml 1 şişe 7 ml 1 şişe 1 ml 1 şişe 1 ml 1 şişe 100 ml 1 şişe 60 ml 1 şişe 5 ml 2 şişe 2 x 28 ml 4 [TR]

4 - GEREKLİ OLAN ANCAK ÜRÜNLE BİRLİKTE VERİLMEYEN MALZEMELER Damıtık su Minimum %10'luk bir çamaşır suyu (veya %0,5 sodyum hipoklorit) elde edilecek şekilde sulandırılabilen çamaşır suyu (%5 ila 8 sodyum hipoklorit). Kullanılabilir diğer dezenfektanlar: %70'lik etanol veya %0,5'lik WescodyneTM (West Chemical Products, Inc.). 10 ila 200 µl, 1 ml, 5 ml ve 10 ml'lik (± %10 hassasiyetle) hacimleri dağıtmak için hassas pipetler. 100 µl veya 200 µl hacim dağıtmak için opsiyonel çok kanallı pipetleyici. 25 ml, 100 ml, 1.000 ml dereceli deney tüpleri. Kontamine atık konteyneri 37 C ± 1 C (veya 40 ± 1 C) termostatlı benmari veya mikroplaka inkübatörü.. Manüel, yarı otomatik yıkama tertibatı veya mikrotitrasyon plakası için yıkama cihazı (*). 450 nm ve 620-700 nm filtrelerle donatılmış, mikroplaka okuma cihazı (*). Eksik plakalar otomatlar üzerinde teste tabi tutulurken, duyarlılaştırılmamış olan şeritler. EIA reaktifleri için kaplar (opsiyonel). Tek kullanımlık eldivenler. Emici kâğıt. Konjugat çalışma solüsyonlarının ve TMB solüsyonunun hazırlanması için temiz plastik kaplar (polistiren veya polipropilen). Enfeksiyonlu hücre kültürleri için kullanılana eşdeğer, mesela %10 dana fötüs serumu içeren RPMI-1 640, hücre kültürü ortamı. (*) Teknik servislerimiz tarafından onaylanan cihazlar konusunda tam bilgi edinmek için bize danışınız. 5 - HİJYEN VE GÜVENLİK TALİMATLARI Kitteki tüm reaktifler "in vitro" teşhis amacıyla kullanılmaya yöneliktir. Reaktifler ve numuneleri kullanırken tek kullanımlık eldivenler giyin ve söz konusu maddeleri kullandıktan sonra ellerinizi özenle yıkayın. Ağzınızla pipetlemeyin. Negatif kontrolün hazırlanmasında kullanılan insan kaynaklı malzeme teste tabi tutulmuş ve HIV1 antijeni, anti-hiv1 ve HIV2 antikorları, HB antijeni, anti-hcv antikorları ve anti HTLV1/HTLV2 antikorları bakımından negatif bulunmuştur. Pozitif kontrol, ayrıştırıcı bir maddenin mevcut olduğu ortamda ısı ile etkisiz hale getirilmiştir Hiçbir yöntem HIV, Hepatit B veya Hepatit C virüslerinin veya diğer bulaşıcı ajanların bulunmadığını kesin bir şekilde garanti edemediği için, bu reaktifleri ve hasta numunelerini potansiyel olarak bulaşıcı malzeme addedin ve olağan önlemler ile kullanın. Numuneler ve reaktifler ile doğrudan temas eden malzemeyi ve ayrıca yıkama solüsyonlarını kontamine ürünler addedin. Numunelerin veya bunları içeren solüsyonların sıçramasına engel olun. Kirlenen yüzeyler % 10 sulandırılmış çamaşır suyu ile temizlenecektir. Bulaşan sıvı bir asit ise, kirlenen yüzeyler önceden sodyum bikarbonat ile nötrleştirilecek, ardından çamaşır suyu ile temizlenecek ve emici kâğıt ile kurutulacaktır. Temizleme işleminde kullanılan malzeme kontamine atıklar için öngörülmüş özel bir konteynere atılmalıdır. İnsan kaynaklı numunler ve reaktifler ve kontamine malzeme ve ürünler, bulaşıcı özellikleri giderildikten sonra atılacaktır: 5 [TR]

- Bu işlem, ya % 5 sodyum hipoklorit son konsantrasyonlu çamaşır suyuna (10 hacim kontamine sıvı veya su için, 1 hacim çamaşır suyu) 30 dakika boyunca batırılarak - Ya da minimum 2 saat boyunca 121 C'de otoklavlama vasıtasıyla gerçekleştirilir. Otokalvlama HIV ve HBV'yi etkisiz kılmanın en iyi yöntemidir. DİKKAT: SODYUM HİPOKLORİT İÇEREN SOLÜSYONLARI OTOKLAVIN İÇİNE SOKMAYIN. Güvenlik verileri fişi talep üzerine verilmektedir. Substrat tamponunun, kromojenin ve durdurma solüsyonunun cilt ve mukozalar ile hiçbir şekilde temas etmesine izin vermeyin (toksisite, tahriş veya yanık riski). Solüsyonları veya yıkama atık sıvılarını veya biyolojik numuneler içeren herhangi bir sıvıyı lavaboya atmadan önce, nötrleştirmeyi ve/veya otoklavlamayı unutmayın. Ayrıca, kimyasal ürünler doğru laboratuar uygulamalarına göre kullanılmalı ve atılmalıdır. Bu test kitinde bulunan kimyasal komponentlerle ilgili tehlikeler ve bunlardan korunma yöntemleri konusunda öneriler için lütfen etiketler üzerinde bulunan ve ayrıca bu kullanım talimatlarının sonunda yer alan resimli grafiklere başvurun. Güvenlik Veri Sayfası www.bio-rad.com adresinde bulunabilir. 6 - ÖNLEMLER Elde edilecek sonuçların kalitesi aşağıdaki laboratuar uygulamalarına tam olarak uyulmasına bağlıdır: Test ismi ve test özel tanıtım numarası her mikroplaka çerçevesinin üzerinde belirtilmiştir. Bu özel tanıtım numarası her şeridin üzerinde de yer alır. Genscreen HIV-1 Ag Assay: Özel Tanıtım Numarası = 49 Bu tanıtım numarası her kullanımdan önce kontrol edilmelidir. Test numarası bulunmayan veya gerçekleştirilen testin numarasından farklı olan hiçbir şerit, kullanılmamalıdır. Reaktifleri son kullanma tarihinden sonra kullanmayın. Çalışma şartlarını değiştirmeyin. Her türlü kontaminasyonu önleyerek, reaktifleri özenle tekrar oluşturun Aynı deney sırasında farklı partilere ait reaktifleri birbirine karıştırmayın. NOT: Aynı deney boyunca hep aynı partiyi kullanmak kaydıyla, kitte teslim edilenlerden farklı yıkama solüsyonu (etiketin üzerindeki yeşil 20X ibaresi ile tanıtılan, R2), substrat tamponu (mavi TMB buf. ibaresi ile tanıtılan, R8), kromojen (menekşe rengi TMB 11X ibaresi ile tanıtılan, R9) ve durdurma solüsyonu (kırmızı 1N ibaresi ile tanıtılan, R10) partileri kullanmak mümkündür. Bu reaktifler şirketimizin diğer ürünleri ile birlikte kullanılabilir. Ayrıca, belli bir deneyde bir tek karışımın kullanılması kaydıyla, yıkama solüsyonu (etiketin üzerindeki yeşil 20X ibaresi ile tanıtılan, R2) düzgün bir şekilde yeniden oluşturulan farklı Bio-Rad reaktif kitlerine dahil edilmiş diğer iki yıkama solüsyonundan biri ile (etiketin üzerindeki mavi bir 10X veya turuncu bir 10X ibaresi ile tanıtılan, R2) karıştırılabilir. Ayrıntılı bilgi edinmek için teknik servislerimizle irtibat kurunuz. Kullanımdan önce, reaktiflerin laboratuar sıcaklığında (18-30 C) dengelenmesi için 30 dakika bekleyin. Konjugatların enzimatik faaliyetini bozabilecek reaktif buharlar (asitler, alkaliler, aldehitler) veya tozlar ortamda mevcut iken test yapmayın. Mükemmel bir şekilde temizlenmiş ve damıtık su ile yıkanmış cam aletler veya tercihen tek kullanımlık donanım kullanın. 6 [TR]

Yıkama işleminin sonu ile reaktif dağıtımının başlangıcı arasında geçen sürede mikroplakanın kurumasına izin vermeyin. Pipetlerin doğruluğunu ve hassasiyetini ve kullanılan cihazların düzgün çalıştığını konrol edin. Yıkama: Testten azami performans elde etmek için, yıkama prosedürlerine mutlaka titizlikle uyulması gerekir. Konjugatı ve developman solüsyonunu dağıtmak için asla aynı kabı kullanmayın Enzimatik reaksiyon tüm metallere veya metal iyonlarına karşı çok duyarlıdır. Dolayısıyla, hiçbir metal unsur, konjugatları veya substratı içeren farklı solüsyonlar ile temas etmemelidir Developman solüsyonu (substrat tamponu + kromojen) pembeye boyanmalıdır. Yeniden oluşumu takip eden dakikalar içerisinde başka bir rengin ortaya çıkması reaktifin kullanılamaz durumda olduğunu ve değiştirilmesi gerektiğini gösterir. Bu preparat için tercihen, tek kullanımlık plastik kaplar ve dağıtım malzemeleri veya önceden 1 N hidroklorik asit, ardından damıtık su ile yıkanmış ve kurutulmuş cam kaplar kullanın. Bu solüsyonu güneş ışınlarına maruz bırakmayın. 7 - NUMUNELER Olağan uygulama yöntemleriyle bir kan numunesi alın. Kullanılabilir numuneler şunlardır: Serum, plazma veya hücre kültürü numuneleri. Antikoagülanlar, EDTA, heparin, sodyum sitrat, CPDA-1 ve ACD değerlendirmeye tabi tutulmuş ve kullanılabilir addedilmiştir. Antkoagülan tüpleri yardımıyla alınan numuneler yanlış bır sulandırma işlemi yapılmaması için belirtilen seviyeye kadar tüpün içine doldurulmalıdır. Hemolize engel olmak için en kısa sürede serumu veya plazmayı pıhtıdan veya alyuvarlardan çıkarın. Çok belirgin bir hemoliz test performanslarını etkileyebilir. Agrega içeren numuneler testten önce santrifugasyon ile arıtılmalıdır. Süspansiyon halindeki partiküller veya fibrin agregaları yanlış pozitif sonuçlar elde edilmesine yol açabilir. Kullanımdan önce sulandırma işlemi gerektiren hücre kültür numuneleri, kültür için kullanılan ortama eşdeğer bir hücre kültür ortamı ile sulandırılabilir. ISIYLA ETKİSİZ HALE GETİRİLMİŞ NUMUNELER KULLANMAYIN. Tarama 7 gün içerisinde yapılır ise, numuneler + 2-8 C sıcaklıkta muhafaza edilecektir; veya numuneler -20 C sıcaklıkta dondurulmuş olarak muhafaza edilebilir. Plazmalar birkaç dakika 40 C sıcaklıkta ısıtılarak hızlı bir şekilde çözdürülecektir (fibrinin çökelmesini sınırlı tutmak için). Ag HIV'in ısıtılma durumunda istikrarsız olması nedeniyle, 40 C'nin üzerindeki sıcaklıklar kullanılamayacaktır. Üç defadan fazla dondurulan ve çözdürülen numuneler kullanılmamalıdır. Eğer numuneler taşınacak ise, bunları etyolojik ajanların taşınması ile ilgili yürürlükteki mevzuata uygun şekilde ambalajlayın. Hemolize engel olmak için en kısa sürede serumu veya plazmayı pıhtıdan veya alyuvarlardan çıkarın. KONTAMİNE, HİPERLİPEMİK VEYA HİPERHEMOLİZE TABİ TUTULMUŞ SERUMLAR VEYA PLAZMALAR KULLANMAYIN. NOT: 80 mg/l bilirubin, 36 mg/l immünoglobülin M veya G içeren numunelerde ve ayrıca 5 gr/l'ye kadar lipit içeren lipemik numunelerde ve 2,5 gr/l'ye kadar hemoglobin içeren hemolizli numunelerde hiçbir etkileşimin varlığı ispatlanamamıştır. 7 [TR]

8 - REAKTİFLERİN YENİDEN OLUŞTURULMASI Konsantre konjugat 1 ve 2 hariç (R4 ve R5), tüm reaktifler kullanımdan önce ortam sıcaklığında (18 ila 30 C) olmalıdır. Kullanıma hazır reaktifler: Reaktif R1: Mikroplaka 12 şerit içeren her taşıyıcı çerçeve kapalı alüminyum poşet içine konulmuştur. Poşeti makas veya bıçak ile birleşme noktasının 0,5 ila 1 cm üzerinde kesin. Poşeti açın ve çerçeveyi poşetten çıkarın. Kullanılmayan şeritleri tekrar poşetin içine yerleştirin. Poşeti özenle kapatın ve yeniden +2-8 C sıcaklıkta muhafaza edin. Reaktif R3: Numune Sulandırıcısı Reaktif C0: Negatif kontrol Reaktif C1: Pozitif kontrol Reaktif R10: Durdurma solüsyonu Yeniden oluşturulacak reaktifler: 20X konsantre yıkama solüsyonu: R2 Solüsyonu damıtık su ile 20 kez sulandırın.. Bu şekilde, kullanıma hazır yıkama solüsyonu elde edilir. 12 şeritten oluşan bir plaka için 800 ml hazırlayın. Çalışma Solüsyonu Konjugat 1 (R4 + R6) ve Çalışma Solüsyonu Konjugat 2 (R5 + R6): Konjugat 1 (R4) ve 2 (R5) konsantre solüsyonlardır (100X). Çalışma solüsyonu konjugat 1 ile çalışma solüsyonu konjugat 2'nin her ikisini de konjugat sulandırıcısında (R6) 1/101 oranında sulandırarak ayrı ayrı hazırlayın. Bu solüsyonları temiz plastik kaplarda hazırlayın. Kabın üzerine parti numarasını, konsantre konjugatları (1 veya 2) hazırlama tarih ve saatini ve son kullanım saatini kaydedin (hazırlamadan 24 saat sonra). Kullanmadan önce, çalışma solüsyonlarını hafifçe karıştırın. Karıştırıldıktan sonra, konjugat 1 çalışma solüsyonu sarı ve konjugat 2 çalışma solüsyonu yeşildir. Her şerit için konjugat 1 veya 2 çalışma solüsyonunun hazırlanması Gerekli şerit sayısı 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12* 24** Konsantre konjugat miktarı (µl) 20 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 240 Konjugat sulandırıcısı miktarı (ml) 2 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 24 * bir tam plaka; **iki tam plaka Enzimatik developman solüsyonu (R8 + R9) R9'u R8 içinde 1/11oranında sulandırın (örnek: 1 ml reaktif R9 10 ml reaktif R8 içinde sulandırılır); 12 şeridi işlemden geçirmek için 10 ml gerekli ve yeterlidir. Homojenleştirin. 8 [TR]

9 - SON KULLANMA TARİHİ - SAKLAMA Kit +2-8 C sıcaklıkta muhafaza edilmelidir. Genscreen HIV-1 Antigen Assay kitinde bulunan ve +2-8 C sıcaklıkta muhafaza edilen her unsur, özel bir uyarı bulunmadığı takdirde, kitin ilk açılışından sonra kutunun üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar kullanılabilir. R1: Vakumlu poşetin açılmasından sonra, +2-8 C sıcaklıkta muhafaza edilen ve özenle kapatılan orijinal ambalajlarındaki şeritler 1 ay dayanabilir. R2: Sulandırılmış yıkama solüsyonu +2-30 C sıcaklıkta 2 hafta saklanabilir. Konsantre yıkama solüsyonu (R2) +2-30 C sıcaklıkta muhafaza edilebilir. R8 + R9: Yeniden oluşturulduktan sonra, karanlıkta saklanan reaktifler ortam sıcaklığında (18-30 C) 6 saat boyunca kullanılabilir. R4 - R5: Konjugatlar yeniden oluşturulduktan sonra ortam sıcaklığında (18-30 C) 24 saat kullanılabilir. 10 - ÇALIŞMA ŞARTLARI HIV-1 p24 antijeninin insan serumu veya plazmasında veya hücre kültürü numunelerinde saptanmasını sağlayan iki prosedür aşağıda verilmiştir: Prosedür İnkübasyon Konjugat 1 İnkübasyon 37 ± 1 C'de kuru havalı, statik inkübasyon, 30 ± 5 dak. 40 ± 1 C'de kuru havalı, statik inkübasyon, 30 ± 5 dak. Konjugat 2 İnkübasyon 37 ± 1 C'de kuru havalı, statik inkübasyon, 30 ± 5 dak. 40 ± 1 C'de kuru havalı, statik inkübasyon, 30 ± 5 dak. Kolorimetrik developman 18 ila 30 C'de karanlıkta, statik inkübasyon, 30 ± 5 dak. 18 ila 30 C'de karanlıkta, statik inkübasyon, 30 ± 5 dak. 37 C'de inkübasyon 37 ± 1 C'de kuru havalı, statik inkübasyon, 60 ± 5 dak. 40 ± 1 C'de kuru havalı, statik inkübasyon, 60 ± 5 dak. 40 C'de inkübasyon Başlangıçta 37 veya 40 C sıcaklıkta teste tabi tutulan numuneler için, her yeni test veya doğrulama aynı prosedüre göre yapılmalıdır. Bu testin tahmini süresi ilk inkübasyon aşamasının başlangıcından itibaren 2h30 saattir. Test kullanım prosedürünün her döngüsü başladıktan sonra tamamen ve kesintisiz olarak gerçekleştirilmelidir. Her plakada iki pozitif kontrol ve üç negatif kontrol yapılmalıdır. Hücre numuneleri üzerinde test gerçekleştirilmesi durumunda, kitteki negatif kontrolün (C0) yerine üç adet hücre kültür ortamı negatif kontrolü gerekir. Hasta numunleri için reaktivite eşiği her bireysel plakada kontrollerle elde edilen sinyallere bağlı olarak belirlenir. Plakaların son inkübasyon aşaması sırasında (TMB çalışma solüsyonunun ilave edilmesinden sonra) ışığa maruz kalmasına engel olun. Önerilen protokole tam olarak uyun ve doğru laboratuar uygulamalarını kullanın. 1. Numune dağıtım ve tanıtım planını özenle hazırlayın. 2. Sulandırılmış yıkama solüsyonunu hazırlayın. 3. Taşıyıcı çerçeveyi ve şeritleri (R1) koruyucu ambalajdan çıkarın. 4. Plakayı ön yıkama işlemine tabi tutmadan, aşağıdaki malzemeleri doğrudan ve art arda yerleştirin (plaka dağıtım planı önerisi): Her kaba 50 µl numune sulandırıcısı A1 - B1 - C1'e 150 µl negatif kontrol (C0) D1-E1'e 150 µl pozitif kontrol (C1) G1'e 150 µl numune, vs. 9 [TR]

Kullanılan sisteme bağlı olarak, kontrollerin konumu veya dağıtım sırası değiştirilebilir. Hücre numuneleri üzerinde test gerçekleştirilmesi durumunda, kitteki negatif kontrolün (C0) yerine üç adet hücre kültür ortamı negatif kontrolü gerekir. Numune sulandırıcısı ve numunenin (veya kontrolün) iyice birbirine karıştığını kontrol edin. Not: İşlemlerin bu aşamasında numune ve numune sulandırıcısı dağıtımı görsel olarak kontrol edilebilir: Numune veya kontrolün haznelere ilave edildiğini belirtmek için, numune sulandırıcısının rengi yeşilden maviye döner. Her haznedeki solüsyonlar iyice karışınca, tekdüze bir renge sahip olur. Hücre kültürü numuneleri kullanılan kültür ortamına bağlı olarak renk değiştiremez. (otomatik kontrol için bkz. bölüm 12: NUMUNE İLAVELERİNİN SPEKTROFOTOMETRİ İLE KONTROL EDİLMESİ). 5. Sızdırmazlık sağlamak için, mümkünse üstünü yapışkan bir film ile örterek, tüm yüzeyin üzerine iyice basın. 6. Plakayı kuru havalı statik inkübatörde 37 ± 1 C veya 40 ± 1 C sıcaklıkta 60 ± 5 dakika inkübe edin. 7. Yapışkan filmi çıkarın. Tüm kapların içeriğini kontamine atıklar için öngörülmüş (sodyum hipoklorit içeren) bir konteynere çekin ve kaplardan her birinin içine derhal minimum 0,370 ml yıkama solüsyonu ilave edin. 20 ila 60 dakikalık bir batırma süresi (bekleme süresi) uygulayın. Yeniden çekin. Yıkama işlemini 4 kez tekrarlayın (minimum 5 yıkama). Artık hacim 10 µl'den az olmalıdır (gerekirse plakayı emici bir kâğıt üzerinde ters çevirerek kurutun). Otomatik bir yıkayıcınız var ise, aynı işlem döngüsünü uygulayın. 8. Tüm kaplara konjugat 1 çalışma solüsyonundan hızlı bir şekilde 100 µl dağıtın. Konjugat kullanımdan önce çalkalanmalıdır. Not: Sarıya boyanmış olan konjugat 1 çalışma solüsyonunun dağıtılması işlemlerin bu aşamasında görsel olarak kontrol edilebilir. 9. Mümkünse, mikroplakanın üzerini yeni bir film ile örtün. Kuru havalı statik inkübatörde 37 ± 1 C veya 40 ± 1 C sıcaklıkta 30 ± 5 dakika inkübe edin. 10. Yapışkan filmi çıkarın. Tüm kapların içeriğini kontamine atıklar için öngörülmüş (sodyum hipoklorit içeren) bir konteynere çekin ve kaplardan her birinin içine derhal minimum 0,370 ml yıkama solüsyonu ilave edin. 20 ila 60 dakikalık bir batırma süresi (bekleme süresi) uygulayın. Yeniden çekin. Yıkama işlemini 4 kez tekrarlayın (minimum 5 yıkama). Artık hacim 10 µl'den az olmalıdır (gerekirse plakayı emici bir kâğıt üzerinde ters çevirerek kurutun). 11. Tüm kaplara konjugat 2 çalışma solüsyonundan hızlı bir şekilde 100 µl dağıtın. Konjugat kullanımdan önce çalkalanmalıdır. Not: Yeşile boyanmış olan konjugat 2 çalışma solüsyonunun dağıtılması işlemlerin bu aşamasında görsel olarak kontrol edilebilir. 12. Mümkünse, mikroplakanın üzerini yeni bir film ile örtün. Kuru havalı statik inkübatörde 37 ± 1 C veya 40 ± 1 C sıcaklıkta 30 ± 5 dakika inkübe edin. 13. Yapışkan filmi çıkarın; tüm kapların içeriğini çekerek boşaltın ve daha önce olduğu gibi en az 5 kez yıkayın. Artık hacim 10 µl'den az olmalıdır (gerekirse şeritleri emici bir kâğıt üzerinde ters çevirerek kurutun). 14. Önceden hazırlanmış 100 µl'lik enzimatik faaliyet developman solüsyonunu (R8+R9) tüm kaplara hızla dağıtın. Reaksiyonun ortam sıcaklığında (18 ila 30 C) 30 ± 5 dakika boyunca karanlıkta gerçekleşmesini sağlayın. Bu inkübasyon sırasında, yapışkan film kullanmayın. Not: Pembe renkte olan developman solüsyonunun dağıtılması, işlemlerin bu aşamasında görsel olarak kontrol edilebilir: Boş bir kap ile pembemsi renkteki developman solüsyonunu içeren bir kap arasında önemli bir renk farkı vardır. 10 [TR]

(Otomatik kontrol için paragraf 12'ye başvurun: NUMUNE VE REAKTİF İLAVELERİNİN SPEKTROFOTOMETRİ İLE KONTROL EDİLMESİ). 15. Developman solüsyonu ile aynı sıra ve dağıtım temposunu kullanarak 100 µl durdurma solüsyonu (R10) ilave edin. Reaksiyonel karışımı homojenleştirin. Not: Renksiz olan durdurma solüsyonunun dağıtılması, işlemlerin bu aşamasında görsel olarak kontrol edilebilir. Substratın pembemsi (negatif numuneler için) veya mavi (pozitif numuneler için) olan rengi, durdurma solüsyonu ilave edildikten sonra renksiz hale gelen (negatif numuneler için) veya rengi sarıya dönen (pozitif numuneler için) kaplardan kaybolur. 16. Plakaların alt kısmını özenle silin. Durdurma solüsyonunun dağıtılmasından en az 4 dakika sonra ve reaksiyonun sona ermesini takip eden 30 dakika içinde, bir plaka okuyucusu yardımıyla 450/620-700 nm'de optik yoğunluğu okuyun. 17. Sonuçları kayda geçirmeden önce, okuma işlemi ile plaka ve numune dağıtım ve tanıtım planının birbirleriyle uyumlu olduğunu kontrol edin. 11 - HESAPLAMALAR VE SONUÇLARIN DEĞERLENDİRİLMESİ 1 - Testin Geçerli İlan Edilmesi Bir test, aşağıdaki kritlerler yerine getirildiği takdirde geçerlidir: Negatif kontrollerin (ve gerekirse hücre kültürü ortam kontrollerinin) bireysel absorbans değerleri 0,000 UA değerinin üzerinde ve 0,100 UA değerine eşit veya bu değerin altında olmalıdır. Bir negatif kontrol kabının absorbans değerlerinden biri bu standartların dışında ise elenebilir. Bu durumda, negatif kontrollerin ortalaması kalan iki absorbans değerinden biri vasıtasıyla hesaplanabilir. İki veya daha fazla negatif kontrol bu kriterlere uymaz ise, yeni bir dozaj yapılmalıdır. Pozitif kontrollerin ortalama absorbansları 0,500 UA değerine eşit veya bu değerin üzerinde olmalı ve her pozitif kontrolün absorbans değeri pozitif kontrol ortalamasının 0,65 ila 1,35 katına eşit bir tekrarlanabilirlik aralığında bulunmalıdır. Tüm pozitif kontrol absorbans değerleri dikkate alınmalıdır. 2 - Absorbans Ortalamasının Hesaplanması Geçerli kontroller vasıtasıyla, absorbans değerlerinin toplamını kullanılan kontrol sayısı ile bölerek, negatif ve pozitif kontrol ortalama absorbanslarını belirleyin. 3 - Eşik Değerin Hesaplanması Eşik değer sabit bir çarpan (0,070) ile negatif kontrollerin ortalama absorbans değerinin (CNX) toplamı alınarak hesaplanır. Eşik Değer = 0,070 + CNX Örnek: CNX = 0,033 - Eşik Değer = 0,070 + 0,033 = 0,103 4 - Sonuçların Yorumlanması HIV-1 antijenlerinin var olup olmadığı, her numunede kaydedilen aborbansın hesaplanan eşik değer ile karşılaştırılması suretiyle belirlenir. Absorbans değerleri 0,000 değerinin altında olan numuneler yeniden teste tabi tutulmalıdır. Absorbans değerleri okuyucunun doğrusallık limitlerinin üzerinde olan numuneler reaktif addedilir. Absorbans değerleri eşik değerin altında olan numuneler Genscreen HIV-1 Antigen Assay testi çerçevesinde negatif addedilir ve HIV-1 antijeni açısından negatif addedilebilir. Bu durumda, başka bir test yapmak gerekmez. Absorbans değerleri eşik değere eşit veya bu değerin üzerinde olan numuneler başlangıçta Genscreen HIV-1 Antigen Assay testi için reaktif addedilir. 11 [TR]

Başlangıçta reaktif bulunan numuneler ilk test sonuçlarının geçerli ilan edilmesi amacıyla yeniden iki kez teste tabi tutulmalıdır. Yapılan bu yeni testler sonucunda elde edilen iki yeni absorbans değeri eşik değerin altında ise, ilk elde edilen sonuç farklı koşullarda tekrarlanabilir değildir ve ilk numune Genscreen HIV-1 Antigen testine göre HIV-1 antijeni için negatif ilan edilir. Farklı koşullarda tekrarlanabilir olmayan reaksiyonların kaynağı sıkça aşağıdaki nedenlere bağlıdır: mikroplakaların yeterli derecede yıkanmaması, reaktif olmayan numunelerin yüksek HIV-1 antijen titresine sahip bir numune ile çapraz kontaminasyonu. developman solüsyonunun oksitleyici kimyasal maddeler (çamaşır suyu, metal iyonları, vs.) vasıtasıyla bireysel olarak kontamine olması. durdurma solüsyonunun bireysel olarak kontamine olması. Testin tekrarlanmasından sonra, iki çiftten birinde ölçülen absorbans değeri eşik değere eşit veya bu değerin üzerinde ise, ilk elde edilen sonuç farklı koşullarda tekrarlanabilir ve numune aşağıda tanımlanan limitlere uygun olarak Genscreen HIV1 Antigen testine göre reaktıf ilan edilir. Reaktivitesi Genscreen HIV-1 Antigen Assay testi ile tekrarlanan numuneler Genscreen HIV-1 Antigen Confirmatory Assay testi ile doğrulanmalıdır (kod: 71121). Numune, ancak HIV-1 antijeni doğrulama prosedürü sırasında etkisiz hale getirilir ise, HIV-1 antijeni açısından pozitif addedilebilir. 12 - NUMUNE VE REAKTİF İLAVELERİNİN SPEKTROFOTOMETRİK YÖNTEMLE KONTROL EDİLMESİ Numune ilavelerinin spektrofotometrik yöntemle kontrol edilmesi Numune sulandırıcısının (R3), ardından numunelerin art arda dağıtılmasından sonra, 620 nm'de yapılan spektrofotometrik bir okuma ile teste tabi tutulacak numunelerin kaplarda bulunup bulunmadığı kontrol edilebilir: Bir numune içeren kabın optik yoğunluğu 0,250 değerinin üzerinde olmalıdır (daha düşük bir optik yoğunluk numunenin iyi dağıtılmadığını gösterir). NOT: Hücre kültürü numuneleri kullanılan kültür ortamına bağlı olarak renk değiştirmeyebilir. Bu durumda bu otomatik kontrolü uygulamayın. Developman solüsyonu ilavelerinin spektrofotometrik yöntemle kontrol edilmesi 490 nm'de yapılan otomatik bir okuma ile pembemsi developman solüsyonunun mevcut olup olmadığı kontrol edilebilir: Developman solüsyonunu içeren bir kabın optik yoğunluğu 0,100 değerinin üzerinde olmalıdır (daha düşük bir optik yoğunluk developman solüsyonunun iyi dağıtılmadığını gösterir). Boş bir kap ile pembemsi renkteki developman solüsyonunu içeren bir kap arasında önemli bir renk farkı vardır. 13 - PERFORMANSLAR Teşhis Hassasiyeti Enfeksiyonun farklı aşamalarında bulunan (AIDS, paraids ve diğerleri), HIV bulaşmış hastalardan alınan 138 numune teste tabi tutulmuş ve Genscreen HIV-1 Antigen Assay testi ile pozitif bulunmuştur. İyice belgelendirilmiş 20 serokonversiyon paneli incelenmiştir. Elde edilen sonuçlar diğer HIV antijeni dozaj testlerinde elde edilen sonuçlarla benzerlik arz etmektedir. En az 64 serokonversiyon numunesi Grescreen HIV-1 Antigen Assay ile test edildi. O grubuna mensup bir hücre kültürü yüzey sıvısına ait iki sulandırma hariç, 55 adet HIV1 hücre kültürü yüzey sıvısı (bunlardan 53'ü M grubu ve 2'si de O 12 [TR]

grubuna mensuptur) ve "Ag VIH SFTS 96" sulandırma paneli Genscreen HIV-1 Antigen Assay testi ile pozitif bulunmuştur. - M grubuna mensup 53 adet HIV1 hücre kültürü yüzey sıvısı aşağıdaki genotiplerden oluşmaktadır: 10 tanesi genotip A, 10'u B, 9'u C, 5'i D, 11'i E, 2'si F, 2'si G, 1'i H, 2'si J ve 1'i N. - "Ag VIH SFTS 96" sulandırma paneli aşağıdaki genotipleri içermektedir: M grubuna mensup A, B, C, D, E, F, G, H ve O grubuna mensup 1 genotip. Analitik Duyarlılık Tespit sınırı 2 IU/ml den düşük olduğu tahmin edilenler WHO 1 Uluslar arası Referans NIBSC kod 90/636 ile test edildi ve 3 farklı partide yapılan internal değerlendirme ile 0.36 IU/ml de %95 Cl (0.08-0.65 IU/ml) bulundu. Test hassasiyet eşiği, Fransız ulusal ölçüsü temel alınarak hazırlanmış bir sulandırma gamı ve BBI paneli (PRA 801) üzerinde incelenmiştir (negatif sitratlı plazma içinde sulandırılan genotip B saflaştırılmış viral lizatı). Bu testler sırasında, kullanılan protokol hangisi olursa olsun algılama eşiği 8 pg/ml HIV antijeni olarak belirlenmiştir. Kalibrasyon eğrisi HIV-1 Ag Standardı (kod:72217) kullanılarak oluşturuldu. Kalibrasyon örnekleri 0-5 IU/ml (0 100 pg/ml) aralığında lineer dir. Teşhis Özgüllüğü Tanısal özgüllük değerlendirildi: 4.038 kan donöründen oluşan bir popülasyonda %99,95 olarak değerlendirilir. Hastaneye yatırılmış 209 hastadan oluşan bir popülasyonda %100 olarak değerlendirilir. 105 hasta numunesinden oluşan bir panel teste tabi tutulmuştur. Bu panel aşağıdaki numuneleri içerir: HAV, HCV, HTLV, HSV, EBV, Rubella, Toksoplazma Gondii, Treponema pallidum, CMV'ye yönelik antikorlar içeren numuneler Hamile, sirozlu, birçok kez kan ve kan ürünleri verilmiş kadınlardan ve Sistematik Lupus Eritematozusa yakalanmış hastalardan alınan otoantikorlar ve yüksek romatoid faktör IgG, IgM oranları içeren numuneler. Lupus Eritematozusa yakalanmış bir hastadan alınan bir tek numune Genscreen HIV-1 Antigen Assay testi ile reaktif bulunmuş, ancak doğrulama testi ile pozitif olduğu doğrulanmamıştır. Hassasiyet Test içi tekrarlanabilirlik özelliği aynı test sırasında 3 pozitif numune ve 1 negatif numuneden her biri 30 kez teste tabi tutularak incelenmiştir. Testler arası tekrarlanabilirlik özelliği, 3 pozitif numune ve üç kopyası bulunan bir negatif numune 5 gün boyunca iki farklı teknisyen tarafından teste tabi tutulmak suretiyle incelenmiştir. Test sonucu pozitif çıkan numunelerden elde edilen değişim katsayıları %10'un altındadır. 14 - TEST LİMİTLERİ Genscreen HIV-1 Antigen Assay test prosedürü ve sonuçları yorumlama yöntemi serum, plazma veya hücre kültürlerine ait numunelerde HIV-1 antijeni bulunup bulunmadığı araştırılırken kullanılmalıdır. Bu kitin kullanıcılarının testi uygulamadan önce bu kullanım kılavuzunu dikkatle okumaları tavsiye edilir. Özellikle numune ve reaktiflerin pipetle alınması, plakaların yıkanması ve inkübasyon aşamalarının süreleri konusunda test prosedürlerine uyulmalıdır. 13 [TR]

Bir numune bir tek reaktif sonuca dayanılarak HIV-1 antijenine karşı reaktif addedilmemelidir. Bu teste göre her numunenin reaktivite özgüllüğünü belirlemek için, mesela bir doğrulama testi gibi yeni dozajların yapılması gerekir. Yüksek hassasiyete sahip her türlü immünoenzimatik test, yanlış pozitif sonuçlara yol açabilecek özgül olmayan reaksiyonlara tabi olabilir. Yanlış reaktif bulunan reaktif numunelerin oranı kullanılan kitin hassasiyetine ve özgüllüğüne bağlıdır. HIV antijen oranı testin algılama limitlerine göre fazla düşük olan numuneler için negatif sonuçlar elde edilebilir; aynı şekilde aranan markör numunenin alındığı hastalık aşamasında mevcut değil ise, negatif sonuçlar gözlemlenebilir. HIV virüslerinin değişkenliği yanlış negatif reaksiyon olasılığının dışlanmasına olanak tanımamaktadır. Bilinen hiçbir yöntem HIV virüsünün bulunmadığına dair bir garanti sunmamaktadır. Numune veya reaktif talimatlara uygun şekilde ilave edilmemiş ise, yanlış negatif bir sonuç elde edilebilir. Prosedür esnasında bir enfeksiyon veya hata ile ilgili klinik şüphe olması durumunda yeni bir dozaj yapılması düşünülmelidir. 0,000 UA'nın altındaki bir absorbans değeri prosedür sırasında yapılan bir hataya veya donanımla ilgili bir soruna işaret eder. Bu durumda, söz konusu numune yeniden teste tabi tutulmalıdır. Sonuçların geçerliliğini etkileyebilecek etkenler şunlardır: Hazneye numunenin doğru şekilde ilave edilmemesi, mikroplaka haznelerinin iyi yıkanmaması, belirtilen inkübasyon süreleri ve sıcaklıklarına uyulmaması, reaktif ilave edilirken yapılan hatalar, haznelerde metal veya çamaşır suyu bulunması. Bu testin performansları ölümden sonra alınan numuneler üzerinde veya serum veya plazma veya hücre kültürü numuneleri dışındaki biyolojik akışkanlar üzerinde değerlendirmeye tabi tutulmamıştır. Test değerlendirmeleri sırasında 8 pg/ml olarak bulunan analitik hassasiyet çalışma şartlarına ve partiler arasındaki değişkenliğe bağlı olarak değişebilir. Sonuç olarak, Bio-Rad sadece 15 pg/ml'den daha düşük bir analitik hassasiyet konusunda garanti vermektedir. Numune sulandırıcısının rengi kullanılan kültür ortamına bağlı olarak hücre kültürü numuneleri mevcut iken değiştirilemeyebilir Numune ve/veya konjugat ve/veya developman solüsyonu ilavelerini kolorimetri ile doğrulama yöntemi dağıtılan hacimlerin doğruluğunun kontrol edilmesini sağlamaz, sadece numune ve/veya konjugat ve/veya developman solüsyonunun ortamda mevcut olduğunu gösterir. Bu yöntemle elde edilen hatalı yanıt oranı kullanılan sistemin hassasiyetine bağlıdır (%10'un üzerindeki kümülatif pipetleme ve okuma varyasyon katsayısı değerleri bu kontrolün kalitesini büyük ölçüde azaltabilir). Konjugat inkübasyon aşamasından sonra yapılan yıkamanın yetersiz olması durumunda, developman solüsyonu dağıtımının otomatik olarak kontrol edilmesi (kaplardaki optik yoğunlukların 490 nm'de okunması vasıtasıyla) hatalı sonuçlar elde edilmesine yol açabilir ve developman solüsyonu bulunmaması durumunda 0,100'ün üzerinde optik yoğunluklar elde edilir. Bununla birlikte, teste tabi tutulan 939 numune üzerinde yapılan değerlendirmeler sırasında bu olguya rastlanmamıştır. 14 [TR]

15 - KAYNAKÇA 1. Barre-Sinoussi F, Chermann JC, Rey F, et al: Isolation of T-lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immune deficiency syndrome(aids). Science 220:868-871,1983. 2. Gallo RC, Salahuddin SZ, Popovic M, et al: Frequent detection and isolation of cytopathic retroviruses (HTLV-lll) from patients with AIDS and at risk for AIDS. Science 224:500-503,1984. 3. Coffin J, Haase A, Levy JA, et al: What to call the AIDS virus? Nature 321:10, 1986. 4. Van der Graff M, Diepersloot R: Transmission of human immunodeficiency virus (HIV/ HTLV-III/ LAV): a review, Infection 14:203-211,1986. 5. Weis R: Retrovirus and human disease. J Clin Pathol 40:1064-69,1987. 6. Tovo P, Gabiano C, Riva C, et al: Specific antibody and virus antigen expression in congenital HIV infection, Lancet 1:1201,1987. 7. Tegtmeier G: Current tests for serologic detection of HlV-1 infection. J Clin lmmunoassay 11:123-125,1988. 8. Schumacher R, Garrett P, Tegtmeier G, et al: Comparative detection of anti-hiv in early HIV seroconversion. J Clin lmmunoassay 11:130-134,1988. 9. Casey JM, Kim Y, Andersen PR, et al: Human T-cell lymphotropic virus type III: immunologic characterization and primary structure analysis of the major internal protein, p24. J Virology 55:417-423,1985. 10. Ritter J, Escaich S, Trepo C, et al: HIV antigen detection in antibody negative sera. Abstract 1627, IV International Conference on AIDS, 1988. 11. Veronese FD, Sarngadharan MG, Rahman R, et al: Monoclonal antibodies specific for p24, the major core protein of human T-cell Leukemia virus type III. Natl Acad Sci USA, 82:5199-5202,1985. 12. Schaeffler B, Flesher A, Shriver K, Tam MR: Monoclonal antibody detection of p25 HIV antigen in the serum and CSF of patients within the AIDS spectrum. Abstract 7759, IV International Conference on AIDS, 1988. 13. Bos ES, van der Doelen AA, van Rooy N, Schurs AHWM: 3,3',5,5' - Tetramethylbenzidine as an Ames test negative chromogen for horseradish peroxidase in enzyme immunoassay. J lmmunoassay 2:187-204,1981. 14. Garner RC, Walpole AL, Rose FL: Testing of some benzidine analogues for microsomal activation to bacterial mutagens. Cancer Letters 1:39-42,1975. 15. Resnick L, Veren K, Salahuddin SZ, et al: Stability and inactivation of HTLV- III/LAV under clinical laboratory environments. JAMA 255:1887-1891,1986. 16. Sarngadharan MG, Markham PD: The role of human T-Lymphotropic retroviruses in leukemia and AIDS, in Wormser GP (ed.): AIDS and Other Manifestations of HlV Infection. New Jersey, Noyes Publications 1987, pp 218-220. 17. Bond WW, Favero MS, Petersen NJ, et al: Inactivation of Hepatitis B virus by intermediate-to-high level disinfectant chemicals. J Clin Micro 18:535-538,1983. 15 [TR]

16 [TR]

17 [TR]

18 [TR]

19 [TR]

20 [TR]