KULLANICI KILAVUZU PCP ref. 03-20A Pneumocystis carinii DNA Belirlemek için kit PCR amplifikasyonu ve agaroz jel elektroforezi İçin tüm reaktifleri içerir
1. KİT İÇERİĞİ 3 2. REAKTİFLERİ SAKLAMA KOŞULLARI 4 3. KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER 4 4. GÜVENLİK KURALLARI 5 4.1. Genel güvenlik kuralları 5 4.2. Safety rules about the kit 6 5. KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER 7 5.1. Reaktifler 7 5.2. Cihazlar 7 5.3. Materyaller 7 6. REAKTİFLERİ HAZIRLAMA 8 7. GİRİŞ 9 8. TEST PRENSİBİ 10 9. ÜRÜN TANIMI 10 10. ÖRNEK TOPLAMA, MANİPULASYON VE ÖN-MUAMELESİ 12 10.1. Solunum örneği 12 10.2. Histolojik örnekler 13 10.3. Kan 13 11. AMPLİFİKASYON PROTOKOLÜ 13 11.1. DNA EKSTRAKSİYONU 13 11.2. DNA AMPLİFİKASYONU 15 11.2.1. TST DNA Amplifikasyonu 15 11.2.2. Pneumocistis carinii DNA amplifikasyonu 15 11.3. AMPLİFİKASYON ÜRÜNLERİ 15 11.3.1. Agaroz jel elektroforezi 16 11.3.2. Örnek yükleme 16 11.3.3. Sonuçların yorumlanması: TST ve Pneumocistis carinii DNA amplifikasyonu 17 1
12. SORUN GİDERME 19 13. TEST LİMİTLERİ 21 14. TEST PERFORMANSI 21 14.1. Özgünlük 21 14.2. Diagnostik ve analytik duyarlılık 21 15. BİBLİYOGRAFYA 21 16. SİPARİŞ İÇİN BİLGİLER 23 16.1. İlgili ürünler 23 2
1. KİT İÇERİĞİ AÇIKLAMA KUTU P Tekdoz premiks tüp PCP Tekdoz premiks TST (thiosulfate sulfurtransferase -rhodanese) tüpleri Taq DNA polymerase termostabil ETİKET AB Taq 5 U/μL TÜP (T) RENGİ YA DA KAPAK Yeşil (T) 20 C DE SAKLANIR 25 test 50 test 8 test 25 50 8 Mavi (T) 25 50 8 Kırmızı 1 x 40 μl 1 x 80 μl 1 x 15 μl KÜÇÜK ÇANTA P.carinii genom parçası İçeren plazmid DNA Pozitif kontrol PCP 20 C DE SAKLANIR Mavi 1 x 30 μl 1 x 50 μl 1 x 10 μl KUTU F +2 / +8 C DE SAKLANIR Örnek yükleme için elektroforez buffer Ethidium Bromide solusyonu (2,5 mg/ml) 6X Blue Mavi 1 x 200 μl 1 x 350 μl 1 x 100 μl Ethidium Bromide toksik R 23 68 S 36/37 45 Kırmızı 1 x 150 μl 1 x 250 μl 1 x 80 μl DNA Moleküler Ağırlık Markır MW Markır Sarı 1 x 150 μl 1 x 250 μl 1 x 50 μl KUTU A +15 / +25 C DE SAKLANIR Moleküler biyoloji için agaroz AGAROZ 1 x 15 g 1 x 27 g 1 x 5 g Elektroforez buffer TRIS-Borate-EDTA ph: 8,00 TAE 50X 1 x 60 ml 1 x 100 ml 1 x 20 ml 3
2. REAKTİFLERİ SAKLAMA KOŞULLARI Kitin herbir komponenti, tekli kutuların etiketlerinde belirtilen talimatlara gore saklanmalıdır. Özellikle: KUTU P Küçük çanta KUTU F KUTU A 20 C de saklanır 20 C de saklanır 2 / 8 C DE SAKLANIR 15 / 25 C DE SAKLANIR Önerilen sıcaklıkta saklandığında, tüm test reaktifleri son kullanım tarihine kadar stabil kalır. 3. KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER Kit; moleküler biyoloji tekniklerini diagnostikte uygulama eğitimi almış ve tecrübesi olan araştırmacı tarafından kullanılmalıdır; Kit prosedürüne başlamadan önce kullanım kılavuzunu dikkatlice ve tamamen okuyun; Ürünleri ısı kaynağından uzakta tutun; Son kullanım tarihi geçmiş kit parçalarını kullanmayın; Saklama koşulları, kutu bütünlüğü ya da metod uygulaması ile ilgili herhangi bir şüpheniz olduğunda, AB ANALITICA teknik destek ile bağlantı kurun: laboratorio@abanalitica.it. Nükleik asitlerin amlifikasyonunda, araştırmacı aşağıdaki özel önlemleri almalıdır: Filtreli uç kullanın; Biyolojik örnekler, ekstrakte edilmiş DNA, kit içeriğindeki pozitif kontrol ve tüm amplifikasyon ürünleri, amplifikasyon reaktiflerinden farklı bir yerde saklanmalıdır. 4
PCR öncesi ve sonrası için farklı alanlar hazırlayın ve iki alan arasında materyal (pipetler, uçlar, tüpler, vs.) paylaşımı yapmayın. Sık sık eldiven değiştirin. Benç yüzeyini %5 sodyum hipoklorit ile temizleyin. Kullanımdan önce reaktifleri oda ısısında eritin. Taq polymerase ve ekstrakte DNA yı hızlı bir şekilde oda ısısında ve buzkalıbı üzerinde ekleyin. 4. GÜVENLİK KURALLARI 4.1. Genel Güvenlik Kuralları Reaktifler ve klinik örnekler ile çalışırken tek kullanımlık eldiven kullanın ve çalışma bitiminde ellerinizi yıkayın. Ağızla pipetleme yapmayın. Bilinen hiçbir diagnostik metod enfeksiyon ajanlarının yokolduğunun garantisini vermediğinden, herbir klinik örneğin potansiyel enfeksiyonlu olduğu göz önünde bulundurulup, bu şekilde çalışılması gereklidir. Klinik örnekler ile direk temasta olan cihazların kontaminasyonlu olduğu ve bu şekilde kullanılması gerektiği göz önüne alınmalıdır. Örneklerin kazara etrafa dökülmesi durumunda, %10 Sodyum Hipoklorit ile temizleyin. Temizlenmiş materyaller, kontamine ürünler için olan özel konteynerlere atılmalıdır. Klinik örnekler, materyaller ve kontamine ürünler aşağıdaki dekontaminasyondan sonra atılmalıdır: 30 dakika %5 Sodyum Hipoklorit (1 volüm %5 Sodyum Hipoklorit solusyonu herbir 10 volüm kontaminasyonlu sıvı için) solusyonuna batırılmalı YA DA en az 2 saat 121 C de otoklavlanmalı (NOT: Sodyum Hipoklorit içeren solusyonları otoklavlamayın!!) 5
4.2. Kit Hakkında Güvenlik Kuralları Bu kit kullanımı için riskler tekli komponentler ile ilişkilidir: Tehlikeli Komponentler: ETHIDIUM BROMIDE 3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridiumbromide (Ethidium Bromide) <2% Risk tanımı: T (Toksik) RİSK İBARESİ VE S İBARESİ R 23 ve R 68 S 36/37 45 İnhalasyon için toksik. Geri dönülmez etkiler riski. Laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven kullanın. Kaza veya rahatsızlık durumlarında, doktora başvurun ve paket etiketini gösterin. R ve S ibareleri kit ile sağlanan konsantre ürünlere işaret etmektedir. Özellikle Ethidium Bromide için, agaroz jelde dilusyona kadar. Konsantre Ethidium Bromide uygulamasında kimyasal dağıtıcı buharlı kabin kullanın. Seyreltilmiş Ethidium solusyonu ile çalışırken daima laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven giyin. Bu ürünler genel çöplere atılamaz. Kurutucu system kullanılmamalıdır. Atılım için yasal kuralları uygulayın. Ethidium Bromide kaza ile dökülmesi durumunda Sodyum Hipoklorit ve su ile temizleyin. İstenildiğinde Ethidium Bromide Güvenlik data sheet (MSDS) gönderilebilir. 6
5. KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER 5.1. Reaktifler Steril DNase ve RNase free su; Distile su; 5.2. Cihazlar Laminar flow kabini (kontaminasyondan korunmak için amplifikasyon premikse TAQ polymerase eklenirken kullanılması önerilir; ekstrakte DNa eklenirken başka bir laminar flow kabini kullanılması önerilebilir); Mikropipetler (aralık: 0,2-2 µl; 0,5-10 µl; 2-20 µl); Thermalcycler; Tartı; Manyetik ısıtıcı ya da mikrodalga; Mikrosantrifüj (max 12-14.000 rpm); Kimyasal kabin (Ethidium Bromide uygulamasında kullanılması önerilir); Agaroz minijel için yatay elektroforez haznesi; Güç kaynağı (50-150 V); UV Transilluminator; Foto kamera ya da imaj analizör. 5.3. Materyaller Tek kullanımlık eldivenler; Tek kullanımlık filtreli uçlar (aralık: 0,2-2 µl; 0,5-10 µl; 2-20 µl); TBE dilusyonu için dereceli silindirler (1L); Agaroz jel hazırlamak için pyrex şişe ya da Becker; Parafilm. 7
6. REAKTİFLERİ HAZIRLAMA 1 L TAE Buffer (1X) hazırlamak için: 20 ml 50X TAE ile 980 ml distile suyu karıştırın. 8
7. GİRİŞ Pneumocystis carinii immunbaskılı hastalarda (organ nakli olmuş, onkolojik ya da AIDS hastaları) pnömoninin en sık etiyolojik ajanı olan her yerde bulunan bir patojendir. P.carinii birinci yaşındaolan çocukları etkileyen (doğumda asla) belirli ve ciddi interstisyel pnömoni formundan da sorumludur (H. M. Ginzburg, 1996). P.carinii etrafında nötral mukopolisakaritten zengin bir kapsül ile sferoid ya da küçük yumurta-şekilli hücreler ile korpuskular bir forma sahiptir. İlk stadyumda (hücreiçi faz) patojen pulmoner alveolide deskuamat olan ve proliferasyonu stimule eden alveolar hücreler tarafından fagosite edilmiştir. İkinci stadyumda alveolar hücrelerin disgregatif fenomenine göre gözenekli bir durum ile keskin bit eozinofil reticulum endoalveolar ve endobronşiyal seviyede bulunmuştur. Parazit kültür analizi genellikle zordur ve histolojik metodlar çok spesifik ve duyarlı değildir (Grocott-Gomori, toluidine blueo, Giemsa ya da Wright boyası ile boyanan sito-histolojik örnekler). Monoklonal antikor kullanımı (immunofloresanda), duyarlılık hala şüpheli olmasına rağmen test özgünlüğünü artırır. Yıllardır P. carinii enfeksiyonları invaziv prosedürlerle elde edilen örneklerin analizi ile klinik olarak tanımlanmıştır; PCR tekniklerinin gelişmesi elde edilmesi ve spesifik DNA dizilerinin amplifikasyonu kolay olan patolojik örneklerin kullanılabilmesini sağlamıştır. Metod bu parazitin belirlenmesi için oldukça duyarlı ve özgündür (A. E. Wakefield ve ark., 1990). Bu kitte PCR tekniği farklı biyolojik dokularda P.carinii enfeksiyonu belirlemesi için kullanılır: Pulmoner biyopsi (taze, donmuş ya da parafine gömülü), bronkoalveolar lavaj (BAL), çekilmiş tükürük, bronkoaspirat, balgam, nazofaringeal aspirat, kan ve serum (ekstrapulmoner enfeksiyon için). 9
8. TEST PRENSİBİ PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) literatürlerde ilk DNA amplifikasyonu metodudur. (Saiki RK ve arkadaşları, 1985). Thermostable DNA polymerase ile DNA nın spesifik bir parçasının (hedef dizi) in vitro amplifikasyon reaksiyonu olarak tanımlanabilir. Reaksiyonda nükleik asitin üç segmenti yer alır: Amplifiye olması için çift iplikli DNA kalıbı (hedef DNA) ve iki tek iplikli oligonükleotid primerler kalıp DNA ya spesifik olarak dizayn edilmiştir. DNA polymerase primerler tarafından işaretlenen bölgeden sentez işlemine başlar ve solusyonda serbest olarak bulunan tamamlayıcı nükleotidlerin (dntpler) eklenmesi ve bağlanması ile orjinal çift iplikli hedef DNA bölgesi ile aynı olan yeni çift iplikli DNA molekülünü sentezler. Çeşitli sikluslardan sonra, hedef diziye uygun olan milyonlarca DNA molekülü oluşturabilir. Bu testin duyarlılığı, laboratuar tanısında uygulamaya olanak sağlar. Amplifikasyon reaksiyonunun geniş biyolojik örneklerde uygulanabilmesinin yanında, PCRın oldukça küçük DNA segmentlerini de amplifiye edebilmesinden başlangıç DNAsı kısmi olarak yıkılabilir. 9. ÜRÜN TANIMI PCP kit metodu, bu patojenik mikroorganizmanın belirlenmesi için spesifik P. carinii genomunun yüksek korunan rrna 5S bölgesinin amplifikasyonundan ibarettir. Bu kit, TST- thiosulfate sulfurtransferase -rhodanese geni (amplifikasyonun kontrolü) amplifikasyonu ile amplifikasyon için ekstrakte DNAnın uygunluğunu da değerlendirmeyi sağlar. TST gen amplifikasyonunda negatif bir sonuç ya amplifikasyon reaksiyonunun inhibitörlerinin görüldüğünü ya da DNAnın oldukça yıkıldığını işaret eder. Bu metod, olası yanlış negatif sonuçları tanımlamakta kullanıcıya yardımcı olur. Kit, amplifikasyon için bir de amplifikasyonun pozitif kontrolünü sağlar. Pozitif kontrol amplifikasyonu başarılı ise bu rekasiyonun doğru çalıştığını garanti eder. Bu kontroller kullanıcı için tehlikeli değildir, çünkü P. carinii genomunun sadece bir parçasını içeren plazmid DNAdırlar. 10
PCP kit premiks formatındadır: Amplifikasyon için tüm reaktifler pre-mikstir ve Taq polymerase ve ekstrakte DNA eklenebilecek şekilde tekdoz test tüplerinde alikuatlanmıştır. Bu premiks formatı, kullanıcı için zaman kazancı ile amplifikasyon öncesi manipulasyon aşamalarını azaltır; reaktiflerin tekrar tekrar dondurup çözülmesini engeller ve hepsinden öte, bu format kontaminasyon riskini minimize eder, risk yanlış pozitif sonuçlara neden olur. Bu nedenle, daima uygun amplifikasyon kontrollerini kullanmayı önerir. 11
10. ÖRNEK TOPLAMA, MANİPULASYON VE ÖN- MUAMELESİ Mikrobiyoloji analizi ve moleküler biyoloji ile P. carinii enfeksiyonunun belirlenmesi için kullanılan örnekler solunumsal örnekler (bronkoalveolar lavaj (BAL), çekilmiş tükürük, balgam, salgı, bronkoskopiile elde edilen bronşiyal sekresyon) ve diğer solunumsal olmayan örneklerdir (pulmoner ve limfonodal biyopsiler, kan ve serum). 10.1. Solunumsal örnekler Biyolojik örnek toplama sırasında kullanıcının güvenliği için her bir klinik örneği potansiyel enfeksiyon ajanı olarak kabul etmek ve bu şekilde uygulamak iyi bir kuraldır. Balgam toplama ve enfekte mikroorganizmanın etrafından diffuzyona neden olan bronkoskopi uygun bir odadada yapılmalı ve çalışan uygun koruyucu bariyerler kullanmalıdır. Solunumsal örnekler (salgı) N-acetil-L-cysteine (1,5%) ya da dithiothreitol (0,1%) dilusyonu ile akışkan olmalıdır, solvent salgı ile eşit miktarda eklenmelidir (direk toplama kutusuna) ve materyalin tutarlılığına göre 37 C de 15-30 dakika bırakılmalıdır. Genellikle solunumsal örnekler 4% NaOH solusyonu eklenmesi ile dekontamine edilir, santrifüjden sonra HCl ile nötralize edilir. Elde edilen pellet PBS de suspense edilir. Toplama kutusu steril, çevirmeli kapaklı ve tek kullanımlık olmalıdır. Önemli bir deneyime sahip olmak için örnek tükürük olmamalıdır, fakat derin solunumsal bölgeden bir örnek olmalıdır. Taze ya da dekontamine örnekler kısa bir süre için (48 saaatten uzun değil) + 2 / + 8 C de ya da uzun periyotlar için (birkaç ay için) -20 C de saklanmalıdır. 12
10.2. Histolojik örnekler Histolojik örnekler pulmoner ve lenfonodal biyopsiler, taze, donmuş formalin fikse ve parafine gömülü örneklerdir. Biyopsi örneği toplanması rutin olarak yapılmalıdır. Taze biyopsiler toplamadan birkaç dakika içinde çalışılmalı veya likit nitrojen ile hızlıca dondurulmalıdır ve sonra enzimatik sindirimi takiben steril kesici kullanarak mekanik kesilmeye kadar -80 C de saklanmalıdır. Fikse ve parafine gömülü biyopsilerde Lilie formülü olarak %10 sodyum ve potasyum tuzları ile ph 7 de formalin buffer kullanmanızı öneririz. Buffer olmayan Bouin, Holland ve diğer asidik fiksatifler (osmik asit gibi) olan formalinde fikse edilmiş dokular sonraki nukleik asit ekstraksiyonu için uygun değildir, çünkü bu maddeler dokuda sindirilemeyen çapraz-bağlar meydana getirirler. Taze ya da donmuş histolojik örneklerde (yaklaşık 50 mg a kadar), steril kesici kullanarak dokunun hemen mekanik sindiriminin yapılması önerilir. Bu operasyonu cam slayt üzerinde yapın ve 1XPBS buffer alikuatı ekleyin. Sonra Pasteur pipeti kullanarak doğranmış dokuyu tüpe aktarın ve örnek sindirimi ile devam edin. Bu durumda, histolojik örnek fikse edilir ve parafine gömülür, ilk olarak parafin uzaklaştırılır ve enzimatik sindirim yapılır. 10.3. Kan P. carinii araştırması ekstrapulmoner ya da diffüz enfeksiyonlarda en iyi materyal olan kandan başlayabilir. Örnek toplama tüm genel sterilite önlemlerini takip etmelidir. Aktarım için transport medyum içermeyen steril kutular kullanın. Kan EDTAlı olarak alınmalıdır. Heparin gibi diğer koagülasyon ajanları TAQ polymerase ın güçlü inhibitörleridir ve bu yüzden amplifikasyon reaksiyonunun verimliliğini bozar. Taze kan +2/+8 C de saklanmalıdır (toplamadan 4 saat içinde uygulayın), eğer DNA kısa süre sonar ekstrakte edilmeyecekse örneği dondurmak gerekir. DNA ekstraksiyonundan önce, Ficoll-Hypaque sistem ya da eritrosit lizis ile lenfosit izolasyonu için ilk aşama gereklidir. 13
11. AMPLİFİKASYON PROTOKOLÜ 11.1. DNA EKSTRAKSİYONU Solunumsal ve histolojik örneklerden DNA ekstraksiyonu için AB ANALITICA CLEAN DNA kiti (AB ANALITICA, kod. 05-41), kit ile standardize edilmiş, kullanmanızı önerir. Bu metod, taze, donmuş ya da fikse ve gömülü dokuların sindirimi için Proteinaz K kullanımını gerektirir. Doku sindirimi bütün gece yapılmalıdır. Başka bir ekstraksiyon metodu kullanılabilir. Bu durumda, TST (10 μl) ve P.carinii (10 μl) amplifikasyonu için paragraf 11.2.1 ve 11.2.2 de belirtilen ekstrakt miktarı AB ANALITICA metodu ile elde edilen ekstrakta referanstır. Alternatif ekstraksiyon metodları kullanıldığında, eğer amplifikasyon için DNA solusyon miktarı 10 μl den düşükse su ekleyerek amplifikasyon miks miktarı ayarlanmalıdır. 14
11.2. DNA AMPLİFİKASYONU 11.2.1. TST DNA amplifikasyonu Her bir premiks tüpüne (mavi tüpler) ekleyin: AB Taq Ekstrakte DNA 0,5 μl 10 μl Analiz etmek için örneklerin yanında daima bir negatif kontrol (mikse DNA yerine su ekleyin) ve 10 µl pozitif kontrol (bir genomik DNA) amplifiye edilmelidir. 11.2.2. Pneumocistis carinii DNA amplifikasyonu Her bir premiks tüpüne (yeşil tüpler) ekleyin: AB Taq Ekstrakte DNA 0,5 μl 10 μl Analiz etmek için örneklerin yanında daima bir negatif kontrol (mikse DNA yerine su ekleyin) ve 10 µl pozitif kontrol (bir genomik DNA) amplifiye edilmelidir. Kısa bir süre santrifüj edin ve test tüplerini (TST ve Pneumocistis carinii) aşağıdaki programda thermalcyclera koyun: 1 cycle 95 C 5 min 40 cycles 95 C 60 C 72 C 1 min 1 min 2 min 1 cycle 72 C 5 min Amplifikasyon fragman uzunluğu: TST: 202 bp Pneumocistis carinii:: 120 bp 15
11.3. AMPLİFİKASYON ÜRÜNLERİNİN GÖRÜNTÜLENMESİ 11.3.1. Agaroz jel elektroforezi %3 agaroz jel hazırlanması: 1,5 g Agaroz tartın ve 50 ml 1X TAE içine dökün. Solusyonu berrak oluncaya kadar manyetik ısıtıcı ya da mikrodalga içine bırakın. Jeli el ile dokunabilecek kadar soğumaya bırakın (3-5 dakika) ve 10 µl Ethidium Bromide (2,5 mg/ml) ekleyin. NOT: Ethidium Bromide güçlü bir mutajenik ajandır: Daima eldiven kullanın ve bu reaktifle ya da içeren jel ile çalışırken tercihen kimyasal güvenlik kabini altında çalışın. Jeli tarakları ile birlikte uygun bir dökme tankına koyun ve oda ısısında soğuyana kadar bekleyin ya da jel katı hale gelene kadar buzdolabına koyun. Jel katılaştığında, dikkatlice tarakları çıkarın (jel kuyucuklarına zarar vermemeye dikkat edin), tankı elektroforez haznesine alın ve jelin üzerini tamamen kaplayana kadar uygun miktarda TAE buffer ekleyin (yaklaşık jel yüzeyinin 1-2mm üzerinde). 11.3.2. Örnek yükleme Test tüpünde ya da direk parafilmde aşağıdakileri karıştırın: 2 μl 6X Blue 10 μl PCR ürünü Ya da moleküler ağırlık markır (MW markır) Miski jel kuyucuklarına yükleyin; güç kaynağını açın ve voltajı 80-100 V arasına ayarlayın. 30-45 dakika jeli yürütün ve sonra UV transilluminatore koyun; amplifikasyon ürünlerinin boyutunu referans Moleküler Ağırlık Markırı ile karşılaştırarak analiz edin. *DNA Moleküler Ağırlık Markır (MW): 501-489, 404, 353, 242, 190, 147, 110, 89, 67, 34, 26 bp. NOT: %3 agaroz jelde 501-489 bp bantlar genellikle tam olarak çözülmez ve tek bir bant olarak görülür; 26 ve 34 bp bantları bazen görünmek için çok küçük olur (düşük moleküler ağırlıklarından dolayı). 16
NOT: UV ışınları deri ve en önemlisi gözler için tehlikelidir: daima eldiven ve koruyucu gözlük kullanın ya da UV transilluminatorün koruyucu ekranını kullanın. 11.3.3. Sonuçların yorumlanması: TST ve Pneumocistis carinii DNA amplifikasyonu Kontroller aşağıdaki sonuçları göstermelidir: KONTROL SONUÇ YORUM Pozitif kontrol POZİTİF Amplifikasyon doğru çalışır. Negatif kontrol NEGATİF Kontaminasyon yokluğu Agaroz jelde bandların yorumları aşağıdaki tablodaki gibi olmalıdır: SONUÇ YORUM TST band yokluğu Örnek amplifikasyon için uygun değildir (DNA ekstraksiyonunu tekrar edin) TST band varlığı Amplifiye olabilir örnek P. carinii band yokluğu TST band varlığı P. carinii band varlığı P. carinii negatif Amplifiye olabilir örnek P. carinii pozitif Pozitif örneğin tarama için aspesifik fragman vermesi olasıdır; bu analiz ile alakası olmayan başlangıç klinik örneğinin (örneğin parafine gömülü materyal) tipolojisine bağlı olabilir. Daha fazla detaylı bilgi için AB ANALITICA teknik destek ile irtibata geçin(email: laboratorio@abanalitica.it; faks N +39 049-8709510. 17
120 bp Figür 1: Agaroz jel elektroforezi 1. DNA Moleküler Ağırlık Markır 2. Pozitif kontrol 3. P. carinii için pozitif örnek 18
12. SORUN GİDERME 1. Hem amplifikasyon ürünü hem de pozitif control DNA bandı yoksa TAQ polymerase premikse doğru eklenememiştir -Uygun volümde pipet ve uçlar kullanın (pipet aralığı 0,2-2 μl); -Görsel olarak TAQ polymerasın premikse difüze olduğunu gözleyin: Bu basittir, çünkü enzim, yüksek bir densiteye sahip olan gliserolde çözülür; Alternative olarak, tüp duvarına konulmuş olan TAQ polymerasın görsel olarak teyit edin, sonra kısa bir süre santrifüj edin. Thermalcycler doğru olarak programlanmamıştır Thermalcycler programının uygunluğunu ve kullanıcı kılavuzundaki sıcaklık profilini kontrol edin. Kit uygun şekilde çalışmaz -Premiks, TAQ polymerase ve pozitif kontrolü -20 C de saklayın; -Premiks ve reaktifleri tekrar tekrar dondurup/çözdürmekten sakının. 2. Test edilen örnekte pozitif kontrol için iyi bir bant vardır fakat ne TST ne de P. carinii için amplifikasyon bandı yoktur Ekstraksiyon aşaması sırasında olası problemler: Ekstraksiyon metodunun uygun olduğundan ve tüm bilgileri doğru şekilde takip ettiğinizden emin olun; Ekstraksiyon kitinin sorun giderme bölümüne başvurun; Yeni bir örnek ile doğru şekilde tekrar DNA ekstraksiyonu yapın. Amplifikasyon inhibe olmuştur Başlangıç örneğini distile su ve TE ile seyreltin; Küçük miktarda klinik örnekten DNA ekstraksiyonunu tekrar edin; Uygun ekstraksiyon sistemi kullanın. 19
3. Agaroz jel elektroforezinden sonra aspesifik ya da ekstraband görülmesi Thermalcycler sıcaklık değişimlerini çok yavaş yapın Thermalcycler değişikliklerini uygulayın. Amplifikasyon reaksiyonunun hazırlanması oda ısısında çok uzun zaman alır. Oda ısısında çalışma zamanınızı hızlandırın; Buz kalıbı üzerinde çalışın. Ekstrakte DNA purifiye edilmiştir İyi bir örnek purifikasyonu sağlayan ekstraksiyon sistemi kullanın. Başlangıç örnekleri yıkılmış DNA içerir Ekstraksiyon aşamasını başka bir başlangıç klinik örneği kullanarak tekrarlayın; Örneğin uygun yolla toplanıp saklandığından emin olun. Daha fazla detaylı bilgi için AB ANALITICA teknik destek ile irtibata geçin(email: laboratorio@abanalitica.it; faks N -8709510 8709510. 20
13. TEST LİMİTLERİ Kit performansı aşağıdaki durumlarda azalır: Klinik örnekler bu analize uygun değildir (doğru saklanmamış histolojik örnekler için nötral formalin fiksatifinden farklı bir fiksatif kullanın). Amplifikasyon reaksiyonunun inhibitörlerinin görülmesi ya da uygun olmayan ekstraksiyon sistemi kullanılması nedeniyle DNA amplifiye olmaz. Kit önerilen sıcaklıkta saklanmamıştır. 14. TEST PERFORMANSI 14.1. Özgünlük En önemli bilgi bankasındaki primer dizi sıralaması spesifik olmayan dizilerin yokluğunu gösterir ve Pneumocistis carinii amplifikasyonunu garanti eder. Diğer patojenik mikroorganizmaların genomik DNA ya da nukleik asitleri ile çapraz reaksiyon görülmemiştir. 14.2. Diagnostik ve analitik duyarlılık Moleküler analiz (PCR) için Pneumocistis carinii araştırması için optimal klinik örnek bronkoalveolar lavaj (BAL) ve pulmoner biyopsilerdir. Bu durumda testin duyarlılığı ve özgünlüğü yaklaşık %100 dür. Çekilmiş tükürük (IS) ve trakeobronşiyal aspiratlar gibi klinik örneklerde testin duyarlılık ve özgünlüğü % 86,2-60 a kadar düşer. 21
15. BİBLİYOGRAFYA H. M. Ginzburg, Emerging Infectious Diseases; Vol. 2, No. 2, April-June, 1996 A. E. Wakefield et al., Detection of Pneumocistis carinii with DNA amplification; Lancet, Vol. 36, 336: 451-53, 1990 22
16. SİPARİŞ İÇİN BİLGİLER PCP: rrna 5S bölgesinde amplifikasyon ile Pneumocystis carinii DNA belirlemesi için kit. Kod Ürün Pkg 03-20A-25 PCP - Pneumocystis carinii 25 test 03-20A-50 PCP - Pneumocystis carinii 50 test 16.1. İlgili ürünler CLEAN DNA: CLEAN DNA: Taze, donmuş ve formalin-fikse ve parafine-gömülü histolojik örneklerden, farklı biyolojik sıvılardan, katı ve likit medyumda mikrobiyal hücresel kültürden fenol-kloroform kullanmadan spin-kolon yöntemi ile hızlı DNA ekstraksiyonu ve purifikasyonu için kit. Kod Ürün Pkg 05-41-50 CLEAN DNA 50 test 05-41-100 CLEAN DNA 100 test 23
24
AB ANALITICA srl - Via Svizzera 16-35127 PADOVA, (ITALIA) Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510 e-mail: info@abanalitica.it