INNOTEST FOSFO-TAU (181P) KEY-KOD: FRI30913 81574 INNOTEST FOSFO-TAU (181P) 28906 v0 2013-11-28 p 1/16 Türkçe Üretici: Fujirebio Avrupa N.V. Technologiepark 6 9052 Gent Belçika +32 9 329 13 29 BTW BE 0427.550.660 RPR Gent Dağıtıcı: Fujirebio Almanya GmbH Hans-Böckler-Allee 20 30173 Hannover Almanya + 49 511 857 39 31 Fujirebio Italya S.r.l. Via Vaccareccia 39/A 00040 Pomezia (Roma) Italya +39 06 965 28 700 Fujirebio Avrupa N.V. Technologiepark 6 9052 Gent Belçika Fujirebio Fransa SARL Les Conquérants, Bât. Le Kilimandjaro 8/10, avenue des Tropiques 91940 Les Ulis Fransa +33 1 69 07 48 34 Fujirebio Iberia S.L. Calle Tarragona 161, Planta 14 08014 Barselona İspanya +34 93 270 53 00 +32 9 329 13 29 Diğer dillere bakın / Autres langues voir / Andere Sprachen siehe / Altre lingue vedere / Ver otros idiomas / Outras línguas ver: www.e-labeling.eu/fri30913 AVRUPA +800 135 79 135 GR 00 800 161 220 577 99 IS 800 8996 LT 880 030 728 RO 0800 895 084 SK 0800 606 287 TR 0800 142 064 866 LI +31 20 796 5692 MT +31 20 796 5693 AVRUPA olmayan +31 20 794 7071 US +1 855 236 0910 CA +1 855 805 8539 AR, BR, CO, UY, AU, NZ, RU +800 135 79 135 8:00 17:00 GMT+1 M T W T F S S Fujirebio Avrupa N.V.
81574 INNOTEST FOSFO-TAU( 181P) / 28906 v0 / KEY-KOD: FRI30913 p 2/16 İÇERİK TABLOSU Kullanım amacı...3 Test prensibi...3 Sağlanan materyaller...4 Saklama ve stabilite...5 Gereken ama sağlanmayan materyaller...5 Güvenlik ve çevre...5 Analitik önlemler...7 Numune toplama, kullanma ve saklama (18)...8 Test prosedürü...9 Kontrol prosedürü... 10 Sonuçlar... 10 Performans özellikleri... 11 Test prosedürü sınırlamaları... 14 Ticari markalar... 14 Literatür referansları... 14 Kullanılan semboller Üretici In Vitro Diagnostik Medikal Cihaz Grup kodu Katalog numarası Tarafından kullanılır Kullanım talimatlarına bakın Sıcaklık sınırlaması <n> test için yeterli Konjugat 1 100x Konjugat 2 100x Konjugat Seyreltici 1 Konjugat Seyreltici 2 Kaplı Plak Örnek Seyreltici Durdurma Solüsyonu Substrat TMB 100x Substrat Buffer
81574 INNOTEST FOSFO-TAU( 181P) / 28906 v0 / KEY-KOD: FRI30913 p 3/16 Yıkama Solüsyonu 25x Kullanım amacı INNOTEST FOSFO-TAU (181P) insan beyin omurilik sıvısında (CSF) fosforillenmiş Tau (Fosfo-Tau (181P) ) kantitatif tespiti için katı-faz enzim immunoassaydir. Alzheimer hastalığı (AD) patolojide, fosforilasyonun yeni bölgelerinin hiperfosforizasyonu ve çıkmasına yol açan tau proteinin fosforilasyonu dağıtılır. Bu test pozisyon 181 treonin içinde spesifik olarak fosforilasyonu ölçer. CSF- β -amyloid (1-42) ve CSF-Tau markır konsantrasyonlarının kombine kullanımı Alzheimer hastalığı (AD) ve normal yaşlanma veya depresyon gibi diğer nörolojik hastalıklar arasında ayırım imkanı sağlar (1). AD tanı markırı gibi, bu testle elde edilen sonuçlar diğer klinik ve diagnostik bilgilerle birlikte yorumlanmalıdır (ör. INNOTEST htau Ag ve INNOTEST β AMYLOID ile elde edilen sonuçlar kullanılarak). Lewy Bodies ile bunama gibi bunamanın AD olmayan tiplerinden AD ayırımı CSF-fosfo- Tau (181) (2) kantifikasyonu kullanılarak daha fazla geliştirilebilir. Arkaplan AD, bunamanın en yaygın formu, kortikal ve limbik beyin bölgeleri boyunca hücre içi nörofibril yumakları ve hücre dışı amiloid lekelerinin birikimiyle histolojik olarak karakterize edilen nörodejeneratif bir hastalıktır. Eşleştirilmiş helikal liflerden yapılan nörofibril yumaklarının ince yapısı esas olarak anormal şekilde hiperfosforillenmiş Tau proteinden (Fosfo-Tau) oluşur. Amiloid yataklarının ana bileşenleri integral membranbağlı amiloid öncü proteinden türeyen 40- ve 42-amino asit-uzun β-amiloid peptidleridir (3). Test prensibi INNOTEST FOSFO-TAU (181P) fosforillenmiş Tau protein veya parçalarında ilk monoklonal insan spesifik antikor, HT7 (IgG1) tarafından yakalanan katı-faz enzim immunoassaydir. İnsan CSF örnekleri eklenir ve biyotinli AT270 (IgG1) monoklonal ile inkübe edilir. Bu antijen-antikor kompleksi sonra peroksidaz-etiketli streptavidin ile tespit edilir. Substrat çalışma solüsyonunun eklenmesinden sonra örnekler bir renk geliştirir. Bu renk yoğunluğu örnekteki fosforillenmiş Tau protein miktarı için bir ölçüdür. Şekil 1 Test prensibi INNOTEST FOSFO-TAU (181P) ; dahil olan sentetik peptid dizisi (SV= streptavidin; HRP= horseradish peroksidaz)
81574 INNOTEST FOSFO-TAU( 181P) / 28906 v0 / KEY-KOD: FRI30913 p 4/16 Sağlanan materyaller Sağlanan reaktifler: Bileşen Miktar Ref. Tanım Kaplı Plak 1x 96 56625 12 x 8 kaplı test kuyusu ve kurutucu olarak silika çantası ile strip tutucu içeren 1 kapalı çanta. Örnek Seyreltici 1x 30 ml 55706 Stabilize proteinler ve koruyucu olarak 0.01% MIT/<0.1% CAA ile fosfat buffer. Konjugat 1 100x Konjugat 2 100x Konjugat Seyreltici 1 Konjugat Seyreltici 2 Substrat TMB 100x Substrat Buffer 1x 0.3 ml 57206 Kullanımdan önce Konjugat Seyreltici 1 ile 100x seyreltilecek, stabilize proteinler ve koruyucu olarak 0.05% Proclin ile fosfat buffer içinde biyotinli anti- FOSFO-TAU (181P) (AT270bio) 1x 0.3 ml 55528 Kullanımdan önce Konjugat Seyreltici 2 ile 100x seyreltilecek, 0.02% MIT ve koruyucu olarak 0.02% bromonitrodioxane içeren peroksidaz etiketli streptavidin. 1x 20 ml 56627 Konjugat 1 seyreltmek için kullanılan, stabilize proteinler ve koruyucu olarak 0.01% MIT/<0.1% CAA ile renk-kodlu (mor) fosfat buffer 1x 20 ml 55825 Konjugat 2 seyreltmek için kullanılan, koruyucu olarak 0.05% Proclin 300 içeren renk-kodlu (yeşil) fosfat buffer. 1x 0.3 ml 55733 Dimethyl sulfoxide (DMSO) içinde çözünmüş tetramethyl benzidin (TMB). Kulanımdan önce Substrat Buffer içinde 100x seyreltin Konsantre TMB kristalleşebilir ve bu nedenle kullanımdan önce tamamen çözülmelidir (erime noktası 18 C). 1x 30 ml 55727 Substrate TMB seyreltmek için kullanılan 0.02% hidrojen peroksit içeren fosfat-sitrat buffer. Durdurma Solüsyonu 1x 30 ml 55523 0.9N sülfürik asit Yıkama Solüsyonu 25x 1x 60 ml 55742 Distile veya deiyonize su ile kullanımdan önce 25x seyreltilecek, 0.01% MIT/<0.1% CAA içeren fosfat buffer. Tuz kristalleri 2-8 C de saklama sonrası konsantre Yıkama Solüsyonunda oluşabilir. Bu kistaller dilüsyon öncesi tamamen yeniden çözülmelidir. Plak kapatıcılar 4 - - Minigrip çanta 1 - Kullanılmamış striplerin saklaması için. Ayrı bir kutuda, farklı saklama koşulları nedeniyle: Fosfo-Tau KAL-RVC paket REF 81575. Ptau Kalibratörler 2 x 6 şişe (0.4 ml) 12 KAL şişe, seyreltici içinde tutturulmuş analit içerir. Kullanın ve atın.
81574 INNOTEST FOSFO-TAU( 181P) / 28906 v0 / KEY-KOD: FRI30913 p 5/16 Bileşen Miktar Ref. Tanım Ptau Çalışma Validasyon Kontrolleri 2 x 2 şişe (0.4 ml) 4RVC şişe, yapay CSF-like matriks içinde tutturulmuş analit içerir. Kullanın ve atın. Saklama ve stabilite - 2-8 C de tutulduğunda ve orijinal şişelerde saklandığında reaktifler, açılmış veya açılmamış, kitin son kullanma tarihine kadar stabildir. Son kullanma tarihi geçmiş reaktifleri kullanmayın. - Stripleri içeren alüminyum folyo çantasını açtıktan sonra kullanılmamış test stripleri silika ile kapalı plastik minigrip çantasında 2-8 C de saklandığında 8 hafta stabil kalır. - Kullanıma hazır kalibratörler (KAL) ve Çalışma Validasyon Kontrolleri (RVC) varış üzerine -20 C veya daha altında saklanmalıdır. KAL ve RVC test kitinden ayrı paketlenir. - Seyreltilmiş Yıkama Solüsyonu 2-8 C de saklandığında 4 hafta stabildir. - Konjugat çalışma solüsyonu 1 ve 2, 24 saat oda sıcaklığında stabildir. - Substrat çalışma solüsyonu karanlıkta saklanırsa 24 saat oda sıcaklığında stabildir. Kalibratörlerin tanımı 15.6-1000 pg/ml hedeflenen konsantrasyon aralığında bir kalibratör seti sağlanır. Gereken ama sağlanmayan materyaller - Distile veya deiyonize su - 10 1000 µl aralığında hacimler dağıtmak için tek kullanımlık uçlara sahip kalibre hassas pipetler. 25 µl, 75 µl ve 100 µl dağıtmak için kalibre çok kanallı pipet örnekler, Konjugat çalışma solüsyonu 1 ve 2, Substrat çalışma solüsyonu ve Durdurma Solüsyonu eklenmesi için önerilir. - Vorteks karıştırıcı veya eşdeğeri. - Mikroplak yıkayıcı; alternatif olarak, yıkama 400 µl hacim dağıtan tekrarlayıcı pipet ve aspirasyon cihazı kullanılarak yapılabilir. - Zamanlayıcı - Emici dokular - 450 ± 5 nm filtreye sahip mikroplak okuyucu; isteğe bağlı olarak çift dalgaboyu analizi için 620 nm veya 690 nm filtre ve 0-3000 veya daha yüksek lineer emicilik aralığı ile. - Çalışma solüsyonlarının hazırlanması için tek kullanımlık şişeler - Olası kontamine materyaller için uygun biohazard atık konteynerleri - Mikroplak çalkalayıcı (1000 rpm); alternatif olarak, karıştırma plağın vurulan tarafıyla yapılabilir. - 25 ± 2 C de inkübatör Güvenlik ve çevre Olası tehlikeli bileşenler hakkında bilgi için lütfen Güvenlik Veri Kağıdına (SDS) ve ürün etiketlenmesine bakın. En son SDS versiyonu website www.fujirebioeurope.com da mevcuttur.
81574 INNOTEST FOSFO-TAU( 181P) / 28906 v0 / KEY-KOD: FRI30913 p 6/16 Tehlike ifadeleri H314 H315 H317 H319 H335 Önlem ifadeleri P260 P261 P280 Uyarı: 5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one ve 2-methyl-2Hisothiazol-3-one karışımı içerir: KONJ 1 100x, KONJ DIL 2 H317 P261 P280 P363 P333+P313 P302+P352 SUBS TMB 100x H315 H319 H335 P280 P261 P362 P312 P302+P352 Tehlike: DURDURMA SOL H314 P260 P280 P303+P361+P353 P305+P351+P338 P310 P363 Ciddi cilt yanıkları ve göz hasarına sebep olur. Cilt tahrişine sebep olur. Alerjik cilt reaksiyonuna sebep olabilir. Ciddi göz tahrişine sebep olur. Solunum sistemi tahrişine sebep olabilir. Duman/buhar/sprey solumayın. Duman/buhar/sprey solumaktan kaçının. Koruyucu eldivenler/koruyucu giysi/göz koruyucu/yüz koruyucu kullanın. P302+P352 CİLTTE: Bol sabun ve su ile yıkayın. P303+P361+P353 CİLTTE (veya saç): Bütün kontamine giysileri hemen çıkarın/kaldırın. Su/duş ile cildi durulayın. P305+P351+P338 GÖZLERDE: Birkaç dakika su ile dikkatli durulayın. Varsa ve kolaysa kontakt lensleri çıkartın. Durulamaya devam edin. P310 P312 P333+P313 P362 P363 Hemen bir ZEHİR MERKEZİ veya doktor/hekime başvurun. İyi hissetmiyorsanız bir ZEHİR MERKEZİ veya doktor/hekime başvurun. Cilt tahrişi veya kaşıntı oluşursa: Tıbbi yardım/tavsiye alın. Kontamine giysiyi çıkarın ve tekrar kullanmadan önce yıkayın. Tekrar kullanmadan önce kontamine giysiyi yıkayın. Numuneler her zaman potansiyel bulaşıcı gibi kullanılmalıdır. Tüm biyolojik materyaller potansiyel bulaşıcı olarak düşünülmelidir ve öyle kullanılmalıdır. Sadece yeterince eğitimli personel test prosedürünü yapmak için izinli olmalıdır. Tüm biyolojik materyaller belirtilen güvenlik prosedürleri ile uyumlu olarak atılmalıdır. - 121 C de en az 15 dk otoklavlayın. - Tek kullanımlık materyali yakın. - Sodyum hipoklorit ile sıvı atığı karıştırın böylece son konsantrasyon ± 1% sodyum hipoklorittir. Atmadan önce bir gece boyunca bekletin. DİKKAT: sodyum hipoklorit eklemeden önce asit içeren sıvı atığı nötralize edin. Açıklama: Transmissible Spongiform Encephalopathy (TSE)/Prion kontamine materyaller için özel önlemler:
81574 INNOTEST FOSFO-TAU( 181P) / 28906 v0 / KEY-KOD: FRI30913 p 7/16 - Örneklerin inaktivasyonu Klinik örnekler, ör. CSF, yakma ile son atım öncesi 1 saat için otoklavlanmalı veya 20,000 ppm free klorinle sonuçlanan sodyum hipoklorit solüsyonuna daldırılmalıdır. - Atık atımı Klinik atık olarak sınıflandırılan tüm materyaller yetkili yakma alanında yakmayla imha edilmelidir. Klinik atığın güvenlik kullanımı için, güvenlik sızıntı geçirmeyen konteynerler kullanın, ör. uygun olduğu yerlerde çift paketleme. Konteynerin dış kontaminasyonundan kaçının. - Referans: Advisory Committee on Dangerous Pathogens (UK) - Spongiform Encephalopathy Advisory Committee - Transmissible Spongiform Encephalopathy Agents: Safe Working and the Prevention of Infection World Health Organization (WHO): WHO Infection Control Guidelines for Transmissible Spongiform Encephalopathies. Karışımlardaki tehlikeli maddeler hakkında bilgi için Sağlanan reaktifler kısmına bakın. Kişisel koruyucu ekipman kullanımı gereklidir: tehlikeli veya bulaşıcı maddeleri işlerken eldivenler ve emniyet gözlükleri. Atık kurumun atık atma kurallarına göre kullanılmalıdır. Ayrıca tüm federal, eyalet ve yerel çevre düzenlemelerini dikkate alın. Analitik önlemler - Aşağıdaki reaktifler tüm INNOTEST Abeta(s) ve Tau(s) testleri arasında geneldir (aynı bileşim): Örnek Seyreltici, Yıkama Solüsyonu, Substrat, Substrat Buffer ve Durdurma Solüsyonu. Kullanılan reaktiflerin doğru izlenebilirliğini sağlamak için aynı kutudan bu genel reaktiflerin bir setinin kullanılması ve kullanılan her bileşen için grup numarasının kaydedilmesi önerilir. - Konjugat ve Substrat çalışma solüsyonları hazırlamak için kullanılan tüm kaplar kontaminasyondan kaçınmak için iyice temizlenmelidir. - Kuyuların kontaminasyonundan kaçınmak için kenarlara ELISA plaklarını tutun. - Reaktiflerin mikrobiyel kontaminasyonundan kaçının. - RVC ve KAL homojen halde örneklerin sağlanması için kullanımdan önce 10 saniye vorteksleyin. - Her numune için yeni bir pipet ucu kullanın. - Numunenin mikrokuyuya eklenmesini sağlayın. - Kontaminasyondan kaçınmak için örnek veya Konjugate çalışma solüsyonu eklerken pipet uçlarıyla kuyuların kenarına dokunmayın. - 1000 rpm de 1 dakika mikrotitre plağa hafifçe vurarak veya plak çalkalayıcı üstünde karıştırarak hava kabarcıklarını yok edin. - İnkübasyon veya saklama boyunca Substrat çalışma solüsyonunun güçlü ışığa maruz kalmasını önleyin. Substrat çalışma solüsyonu kullanıldığında renksiz olmalıdır. Renksiz değilse yeni Substrat çalışma solüsyonu hazırlanmalıdır. - Durdurma Solüsyonu, Substrat çalışma solüsyonu veya Konjugat çalışma solüsyonları istenmeyen renk oluşumlarını önlemek için metaller veya metal iyonlanlarıyla temas etmemelidir.
81574 INNOTEST FOSFO-TAU( 181P) / 28906 v0 / KEY-KOD: FRI30913 p 8/16 - Kuyular yıkamadan hemen sonra Konjugat veya Substrat çalışma solüsyonu ile doldurulamazsa stripleri en fazla 15 dakika Yıkama Solüsyonunda ıslatılmış emici bir doku üzerinde başaşağı koyun. - Reaktif çalışma solüsyonlarının hazırlanması için kan toplama tüplerini kullanmayın. Numune toplama, kullanma ve saklama (18) Uygun örnek kullanma doğru sonuçlar elde etmek için çok önemlidir. Örneklerin toplanması, saklanması ve işlenmesi için sadece polipropilen tüpler kullanın (4). Tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için örnek kullanma prosedürünün tüm aşamalarının standardize edilmesi önerilir. Bu test post-mortem CSF, ventriküler CSF, kan örnekleri (serum, plazma), beyin dokusu veya hücre kültür supernatantlarının test edilmesi için valide edilmez. CSF toplama (5, 6, 7) Lumbar delinmesi tercihen sabah yapılmalıdır. Lumbar delinmesi L3/L4 veya L4/L5 seviyesinde yapılmalıdır. İlk 20 CSF damlasını atın sonra polipropilen toplama tüpünde yaklaşık 2 ml CSF toplayın. Örneklerin ön işlemi tercihen lumbar delinmesinden sonra 4 saat içinde yapılmalıdır. CSF kullanma (8) Hemorajik CSF örneklerini hariç tutun. Hücreleri veya diğer çözünmeyen materyalleri hariç tutmak için kontrollü oda sıcaklığında ± 2000 g da 10 dakika CSF santrifüj edin. CSF polipropilen tüplere porsiyonlayın. Tüp içinde çok fazla hava boşluğu olmasından kaçının, ör. 500 µl tüpte tercihen 400 µl CSF dağıtın. Sevkiyat şartlarına uygun olarak porsiyonları kullanın. Uzaktaki test laboratuvarına gönderme Donmamış: ortam sıcaklığında 48 saat içinde örnekleri gönderin. Donmuş: kuru buz üstünde örnekleri gönderin; örneklerin ısınmasında kaçının. CSF porsiyonlarının saklanması Test edilene kadar tercihen -80 C de örnekleri saklayın. 2 ay içinde test edilirse örnekler -20 C de saklanabilir. Örneklerin ısınmasından kaçının; tekrarlanan dondurma/çözdürme döngüsü yanlış konsantrasyonlarla sonuçlanır (9). Yıkama talimatları Otomatik yıkama için önerilen protokol aşağıdaki gibidir: - - Seyreltilmiş Yıkama Solüsyonu ile yıkayıcıyı ön durulama yapın. - Aşağıdakileri sağlamak için 5 yıkama döngüsü yapın: doldurma hacmi 400 µl/kuyu dur. dağıtım yüksekliği kuyu tamamen dolacak şekilde ayarlanmalıdır. bir aspirasyon/yıkama/ıslatma döngüsünü tamamlamak için alınan süre yaklaşık 30 saniyedir. yıkama prosedüründen sonra plak ters çevrilir ve emici doku üzerinde kuru dokunulur.
81574 INNOTEST FOSFO-TAU( 181P) / 28906 v0 / KEY-KOD: FRI30913 p 9/16 Manuel yıkama aşağıdaki gibi yapılmalıdır: 1. Plak kapatıcısını çıkartın. 2. Solüsyonu atın, emici doku üzerinde plağı ters çevirin ve kuru dokunun. 3. Her kuyuya 400 µl Yıkama Solüsyonu dağıtın, yaklaşık 30 saniye ıslatın. 4. Solüsyonu atın. 5. Aşama 3 ve 4 ü 4 kez tekrarlayın. 6. Yıkama prosedüründen sonra plak ters çevrilir ve emici doku üzerinde kuru dokunulur. Tamamlanmayan yıkama test sonucunu olumsuz etkiler. Yıkama Solüsyonu ve yıkayıcının kontaminasyonu kapsamlı sorunlara sebep olabilir. Sorun oluşması halinde uygun dezenfektan solüsyonu ile yıkama şişelerini ve yıkayıcıyı bir gece dezenfekte edin ve suyla durulayın. Reaktiflerin hazırlanması Konjugat çalışma solüsyonu 1 ve 2 ve Substrat çalışma solüsyonu hazırlanması # kuyu 8 16 32 64 96 KONJ 1 µl 10 10 15 20 40 KONJ DIL 1 ml 1 1 1.5 2 4 KONJ 2 µl 20 30 40 80 120 KONJ DIL 2 ml 2 3 4 8 12 SUBS µl 20 30 40 80 120 SUBS BUF ml 2 3 4 8 12 Seyreltilmiş Yıkama Solüsyonunun hazırlanması Her test stribi için en az 40 ml seyreltilmiş Yıkama Solüsyonunda hazırlayın. # kuyu 8 16 32 64 96 YIKAMA SOL 25x ml 5 10 20 40 60 H 2 O ml 120 240 480 960 1440 Test prosedürü Lütfen testi yapmadan önce Analitik Önlemler kısmını okuyun. Not: - Her test çalışması dikkate alınarak gereken kuyuların toplam sayısını belirleyin, 6 kullanıma hazır kalibratörün çift kuyusu, 2 Çalışma Validasyon Kontrolü ve CSF örnekleri öngörülmelidir. - Tüm reaktifleri ve stripleri içeren alüminyum folyo çantasını kullanmadan önce yaklaşık 60 dakika oda sıcaklığına (18-30 C) getirin ve kullanımdan hemen sonra buzdolabına koyun. Kuyuların içine suyun yoğunlaşmasını önlemek için alüminyum folyo çantası stripler oda sıcaklığına erişene kadar kapalı tutulmalıdır. - Kullanmadan önce yaklaşık 60 dakika KAL, RVC ve CSF örneklerinin oda sıcaklığına erişmesine izin verin (18-30 C).
81574 INNOTEST FOSFO-TAU( 181P) / 28906 v0 / KEY-KOD: FRI30913 p 10/16 - Tüm reaktiflerin, KAL, RVC, ve CSF örneklerinin teste başlamadan önce hazır olduğundan emin olun. Test başladığında en güvenilir ve tutarlı sonuçların elde edilmesi için kesintisiz yapılmalıdır. - CSF örnekleri, RVC ve KAL testten önce 10 saniye vortekslenmelidir. 1. Gereken sayıda stribe sahip strip-tutucuyu alın. Silika kurutucuya sahip plastik minigrip çantasında kullanılmamış stribi koyun. 2. Kullanım için hazırlama yöntemlerine göre Konjugat çalışma solüsyonu 1 hazırlayın. 3. Antikor kaplı plağın her kuyusuna 25 µl Konjugat çalışma solüsyonu 1 ekleyin. 4. Antikor kaplı plağın çift kuyularına her KAL, RVC ve CSF örneğinden 75 μl ekleyin. 5. Kalibratörler, Çalışma Validasyon Kontrolleri ve CSF örneklerinin strip tutucuya dikkali dokunarak veya 1000 rpm de 1 dakika çalkalayarak yeterince karıştırıldığından emin olun. Yapışkan kapatıcı ile stripleri kapatın. 2-8 C de buzdolabında bir gece inkübe edin (14-18 saat). 6. Aşama beşin bitiminden hemen önce kullanım için hazırlama yöntemlerine göre Konjugat çalışma solüsyonu 2 hazırlayın. 7. Her kuyuyu 5 kez yıkayın ( Yıkama için talimatlar kısmına bakın). 8. Her kuyuya 100 µl Konjugat çalışma solüsyonu 2 ekleyin. Yeni yapışkan kapatıcı ile stripleri kapatın ve 25 ± 2 C de inkübatör içinde 60 + 3 dakika için inkübe edin. 9. Aşama sekizin bitiminden hemen önce Substrat çalışma solüsyonu hazırlayın. 10. Her kuyuyu 5 kez yıkayın ( Yıkama için talimatlar kısmına bakın). 11. Her kuyuya 100 µl Substrat çalışma solüsyonu ekleyin. Karanlıkta 25 ± 2 C de 30 ± 3 dakika için inkübe edin. 12. Reaksiyonu durdurmak için aynı dizi içinde ve Substrat Solüsyonu gibi aynı zaman aralıklarında her kuyuya 50 µl Durdurma Solüsyonu ekleyin. Optimum karışım sağlamak için dikkatlice strip tutucuya vurun. 13. 450 nm de (tek dalgaboyu) absorbans okuyun (aşama 12 den sonra 15 dakika içinde). Çift dalgaboyu analizi için, 690 nm veya 620 nm referans dalgaboyu olarak kullanılabilir. Kontrol prosedürü İç kontrol Akredite edilmiş laboratuvarlar her çalışmada bir iç kontrol dahil etmelidir. Lütfen akreditasyonunuzun uygulanabilir kalite standardını izleyin. Sonuçlar Validasyon - KAL 6 nın 450 nm deki absorbansı 0.300 den düşük olmalıdır. - Kal 1 in 450 nm deki absorbansı 1.700 den büyük olmalıdır. - RVC, Fosfo-Tau KAL-RVC paketinin ekli etiketinde belirtilen tanımlı konsantrasyon aralığında olmalıdır.
81574 INNOTEST FOSFO-TAU( 181P) / 28906 v0 / KEY-KOD: FRI30913 p 11/16 Not: Çift dalgaboyu (450 nm ve 620 nm) analizi için absorbans değerleri tek dalgaboyu değerlerinden yaklaşık 50 mod farklıdır. Bu farklılık testin son sonucunu etkilemez. Sonuçların hesaplanması KAL, RVC ve bilinmeyen CSF örnekleri için ortalama absorbansı hesaplayın. Tek tek OD değerleri arasındaki % farklılık (( abs (V 1 - V 2 )) / ((V 1 + V 2 )/2) * 100 v = değer) %20 den fazlaysa testi tekrarlayın. Yatay (X) eksenindeki ilgili Fosfo-Tau (181P) konsantrasyonlarına karşı dikey (Y) eksenindeki Fosfo-Tau (181P) kalibratörlerinin her biri için elde edilen ortalama absorbans değerlerini çizerek kalibrasyon eğrisini oluşturun. Bu noktalarla en uygun eğriyi çizin. Not: Sigmoidal 4 parametre eğri fitting önerilir. Bir blank çalışma içinde dahil edilmişse, eğri fitting içinde onu kullanmayın. Kalibrasyon eğrisinden pg/ml de Fosfa-Tau (181P) ilgili konsantrasyonunu belirlemek için her bilinmeyen CSF örneğinin ortalama absorbans değerini kullanın. Örneklerin konsantrasyonu sadece absorbans kalibrasyon eğrisinin sınırları içindeyse belirlenebilir. En yüksek kalibratörden daha yüksek veya en düşük kalibratörden daha düşük, OD değerlerinden sonuçların ekstrapolasyonu yanlış sonuçlara sebep olabilir. Performans özellikleri Analitik performans özellikleri Seçicilik ve özgüllük Antikor HT7 (10) ve AT270 (11) izolasyonu ve tanımlamasının detayları tarif edilmiştir. mabs epitopları bacaklar üzerinde sentezlenen veya immunoassay formatlarda kullanılan küçük biyotinli peptidlerle tanımlandı. AT270 için epitop P 176 PAPKT(p)P 182 olarak tanımlanırken mabs HT7 minimum epitop P 159 PGQK 163 olarak tanımlandı. En uzun Tau izoformunun numaralandırmasına karşılık gelen numaralandırma (12). INNOTEST ürünleri içinde kullanılan tüm Tau mabs tüm farklı Tau izoformları teorisinde tanımlandığı gibi Tau nun prolin açısından zengin bölgesinde bir epitopa sahiptir (11). Şekil 2 Tau nun prolin açısından zengin bölgesinde Fujirebio Avrupa antikorlarının epitoplarına genel bakış
81574 INNOTEST FOSFO-TAU( 181P) / 28906 v0 / KEY-KOD: FRI30913 p 12/16 Özgüllük (diğer P-Tau proteinlerinin aksine P-Tau 181P tespiti) Thr181 de fosforile veya fosforile olmayan sentetik biyotinli peptidler (dizi Q 165 ANATRIPAKTPPAPKTPPSSGEPPKS 191 ) kullanılarak değerlendirildi. AT270 mab treonin 181 de fosforile Tau tanıdı. Diğer bölgelerde fosforile olmayan peptidler veya fosforile Tau kullanılarak reaktivite elde edilmedi (12). Sağlıklı ve etkilenen bireylerle ilgili konsantrasyon aralıklarında ölçülen CSF içinde rekombinant Tau ile çapraz-reaktivite elde edilmedi. Analitik duyarlılık Blank örnek (= örnek seyreltici) Tespit Sınırını (LoD) belirlemek için farklı çalışmalar üzerinden 16-kat test edildi. Ortalama + blank örneğinin reaktivite seviyesinin 2*Standart Sapması (SD) hesaplandı ve daha sonra ters sigmoid ilişkisi yoluyla bir konsantrasyona dönüştürüldü. Elde edilen LoD 13 pg/ml idi. Test aralığı Bu test aralığı kesinlik ve tahmini sapmanın %20 geçmediği yerlerde alt ve üst noktalar olarak belirlenen Kantitasyon Alt Sınırı (LLoQ) ve Kantitasyon Üst Sınırı (ULoQ) ile belirlenir. Toplam 16 CSF örneği ve 2 RVC örneği farklı günler üzerinden ve iki kez (2 raporlanan değer) 4 operatör tarafından test edildi. Bu örnek seti kullanılarak elde edilen test aralığı 20 pg/ml (LLoQ) (ör. en düşük konsantrasyonla CSF) - 199 pg/ml dir (ULoQ) (ör. RVC1 örneği, en yüksek konsantrasyonla değerlendirilen örnek). Doğruluk Günümüzde, AD biyomarkırlarının tespiti için doğruluğun referans materyal (uluslararası tanımlı altın standart) şu anda mevcut olmadığı için araştırılması zordur. Farklı kaynaklardan proteinler üretim ve/veya arıtma süreçlerinden dolayı immunoreaktivitelerinde değişebilir. Ek olarak referans materyal post-translasyonel modifikasyonlardaki farklılıklardan dolayı doğal protein için doğru temsilci olmayabilir (ör. fosforilasyon, dimerizasyon, glikosilasyon, deamidasyon, izomerizasyon). Dünya Sağlık Örgütü (WHO) veya Amerika Birleşik Devletleri Farmakopesi (USP) gibi herhangi organizasyonla şu anda yerleştirilmiş standart yoktur. Kesinlik Kesinlik (intra-test ve inter-test değişkenlik) değerlendirildi. Toplam 16 CSF örneği, 2 RVC ve 6 RTU kalibratör farklı günler üzerinden ve iki kez (2 raporlanan değer) 4 operatör tarafından test edildi. CSF örnekleri ve RVC örneklerinin kesinliği Tablo 1 de gösterilmiştir. Tablo 1: CSF ve RVC örnekleri üstünde kesinlik genel bakış Intra-test varyasyon Inter-test varyasyon CSF örnekleri (n=16) 1,7% (aralık 0.0% - 8.9%) 11,4% (aralık 6.6% - 19.2%) RVC 1 (yüksek konsantrasyon) 3,3% (aralık 2.1% - 3.9%) 6,9% n.a. RVC 2 (düşük konsantrasyon) 2,8% (aralık 0.7% - 4.5%) 5,2% n.a.
81574 INNOTEST FOSFO-TAU( 181P) / 28906 v0 / KEY-KOD: FRI30913 p 13/16 6 RTU kalibratörleri üstünde değişkenlik kesinlik profilinde şematik olarak gösterilmiştir (Şekil 3). 40 RTU kalibrasyon eğrilerinin tek tek reaktivite seviyesi ortalama kalibrasyon eğrilerine karşı analiz edildi. Kalibratörlerin her biri için arka hesaplanan konsantrasyonları üzerinden değişkenlik tespit edildi. RTU kalibratörlerinin her seviyesinde %CV (kombine inter- ve intra-test varyasyonu) en yüksek kalibratör noktası için hariç %15 geçmez (= anchor noktası). kons. (pg/ml) %CV KAL 1 936 > 25% KAL 2 247 14,8 KAL 3 113 8,8 KAL 4 59,9 8,0 KAL 5 31,8 13,1 KAL 6 15,6 10,4 Şekil 3 Tanımlı kalibratör konsantrasyonunun fonksiyonundaki değişkenlik. Kalibratörlerin ortalama reaktivite seviyeleri sol Y eksenine karşı çizilir, % CV değerleri sağ Y eksenine karşı çizilir. KAL1 şekil üstünde yoktur (% CV > 25%). Biyolojik referans aralığı Bir dış çalışma (15) 129 nörolojik ve psikiyatrik olarak sağlıklı bireyden elde edilen biyolojik referans aralıklarında INNOTEST Fosfo-Tau (181P) ile yapıldı. Aşağıdaki referans değerleri yaşa göre bölünmüş olarak belirlenmiştir (parantezler arasındaki 25%-75% yüzdeyi takiben medyan): Yaş CSF Fosfo-Tau (181P) (pg/ml) 18-44 yaş 29.58 (19.66-45.67) 45-77 yaş 46.66 (35.84-66.26) Her laboratuvarın başka bir laboratuvarda elde edilen bir referans aralığının aktarımının kabul edilebilirliğini değerlendirmesinin şiddetle önerildiği unutulmamalıdır; yukarıda verilen referans aralıkları sadece in- house validasyonu başlatmak için rehber değerler olarak düşünülmelidir.
81574 INNOTEST FOSFO-TAU( 181P) / 28906 v0 / KEY-KOD: FRI30913 p 14/16 Klinik sonuçlar Bir dış validasyon çok merkezli çalışma Alzheimer hastalığına sahip (AD) 76 hasta, 53 kontrol deneği (CS) ve Lewy bodies (DLB) sahip bunaması olan 52 hastanın saklı CSF örneklerindeki FOSFA- Tau (181P) konsantrasyonlarını belirlemek için yapıldı (2). FOSFO-Tau (181P) konsantrasyonları CS-grup ve DLB-gruba kıyasla AD-grup içinde önemli ölçüde arttırıldı. Cut-off of 61 pg/ml de, aşağıdaki sonuçlar elde edildi: AD vs CS: Özgüllük = 87% Duyarlılık = 80% AD vs DLB: Özgüllük = 79% Duyarlılık = 80% Bu sonuçlar ilk iç değerlendirmede bulunduğu gibi testin ayırt edici değerini onaylar (13). β-amyloid (1-42), Tau protein ve CSF-fosfo-Tau181 değeri sürekli %80ni aşan duyarlılık, özgüllük ve diagnostik doğruluk seviyeleri sağlayarak otopsi-onaylı bunama vakalarında gösterilmiştir (14). Test prosedürü sınırlamaları INNOTEST FOSFO-TAU (181P) test prosedürü insan beyin omurilik sıvısında FOSFO- TAU (181P) ölçmek için tasarlanmıştır. Diğer vücut sıvıları veya beyin dokusu örneklerinde yapılan testleri yorumlamak için yeterli veri yoktur. Bu tip örneklerin test edilmesi bu nedenle önerilmez. Tedavinin izlenmesi için testin olası kullanımı, test tasarımına müdahale edebilecek tedavinin türüne büyük ölçüde bağlıdır. Ticari markalar INNOTEST Avrupa, ABD, Japonya, Çin de olduğu gibi dünya çapında tescilli markadır Literatür referansları 1. Hulstaert et al. Improved discrimination of AD patients using beta-amyloid (1-42) and Tau levels in CSF. Neurology 1999 12;52:1555-62 2. Vanderstichele et al. Analytical performance and clinical utility of the INNOTEST FOSFO-TAU (181P) assay for discrimination between Alzheimer's disease and dementia with Lewy bodies. Clin Chem Lab Med.2006;44:1472-80 3. Ballatore C, Lee V M-Y, Trojanowski JK. Tau-mediated neurodegeneration in Alzheimer s disease and related disorders. Nat Rev Neurosci 2007; 8:663-672 4. Andreasen et al. Cerebrospinal fluid beta-amyloid (1-42) in Alzheimer s disease: differences between early- and late-onset Alzheimer disease and stability during the course of disease. Arch Neurol. 1999;56:673-80 5. Peskind et al.
81574 INNOTEST FOSFO-TAU( 181P) / 28906 v0 / KEY-KOD: FRI30913 p 15/16 Safety of lumbar puncture procedures in patients with Alzheimer's disease. Curr Alzheimer Res. 2009;6:290-2 6. Peskind et al. Cerebrospinal fluid: when is it worthwhile to do a lumbar puncture? CNS Spectr. 2008;13:25-7 7. Peskind et al. Safety and acceptability of the research lumbar puncture. Alzheimer Dis Assoc Disord. 2005;19:220-5 8. Schoonenboom et al. Effects of processing and storage conditions on amyloid beta (1-42) and Tau concentrations in cerebrospinal fluid: implications for use in clinical practice. Clin Chem. 2005;51:189-95 9. Vanderstichele et al. Standardization of measurement of β -amyloid (1-42) in cerebrospinal fluid and plasma. Amyloid: Int J Exp Clin Invest 2000; 7: 245-258 10. Mercken et al. Immunocytochemical detection of the growth-associated protein B-50 by newly characterized monoclonal antibodies in human brain and muscle. J Neurobiol 1992;23:309-321 11. Goedert et al. Epitope mapping of monoclonal antibodies to the paired helical filaments of Alzheimer s disease: identification of phosphorylation sites in tau protein. Biochem J 1994;301:871-877 12. Vanmechelen et al. Quantification of tau phosphorylated at threonine 181 in human cerebrospinal fluid: a sandwich ELISA with a synthetic phosphopeptide for standardization. Neurosci Lett.2000;285(1):49-52 13. Vanmechelen et al. CSF-Phospho-Tau (181P) as a promosing marker for discriminating Alzheimer s disease from dementia with Lewy bodies In: Alzheimer s Disease: Advances in Etiology, Pathogenesis and Therapeutics. Edited by K Iqbal, SS Sisodia an B. Winblad, John Wiley and Sons, Ltd;, Chichester, 2001: 285-291 14. Engelborghs et al. Diagnostic performance of a CSF-biomarker panel in autopsy-confirmed dementia. Neurobiol Aging. 2008;29:1143-59 15. Jaworski et al. Total-tau and phospho-tau(181thr) in cerebrospinal fluid of neurologically intact population increase with age. Folia Biol (Praha). 2009;55:126-31 16. Andreasen et al. Evaluation of CSF-tau and CSF-Abeta42 as diagnostic markers for Alzheimer disease in clinical practice.arch Neurol. 2001;58:373-9 17. Goedert et al. Multiple isoforms of human microtubule-associated protein tau: sequences and localization in neurofibrillary tangles of Alzheimer s disease. Neuron 1989;3:519 26.7) 18. Vanderstichele et al. Standardization of preanalytical aspects of cerebrospinal fluid biomarker testing for
81574 INNOTEST FOSFO-TAU( 181P) / 28906 v0 / KEY-KOD: FRI30913 p 16/16 Alzheimer s disease diagnosis: A consensus paper from the Alzheimer s Biomarkers Standardization Initiative. Alzheimer s & Dementia 8 (2012);65-73