T.C. Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi İç Hastalıkları Anabilim Dalı İNDÜKLENMİŞ PLURİPOTENT KÖK HÜCRELER VE DİŞ HEKİMLİĞİNDEKİ KULLANIM ALANLARI BİTİRME TEZİ Stj. Diş Hekimi Ece AVCI Danışman Öğretim Üyesi: Doç. Dr. Fahri ŞAHİN İZMİR-2013
İÇİNDEKİLER SAYFA 1. GİRİŞ VE AMAÇ...1 2. HÜCRE DEDİFERANSİYASYONU VE PLURİPOTANSİYELİ...2 3. IPKH ÜRETİMİ...7 4. YENİDEN PROGRAMLAMA İÇİN HÜCREYE VEKTÖR VERİLMESİ...9 4.1. Bütünleştirme Yaklaşımları...9 4.1.1. Retrovirüsler...9 4.1.2. Lentivirüsler...10 4.2. Çıkarılabilir Yaklaşımlar...11 4.3. Bütünleşme İçermeyen Yaklaşımlar...12 4.3.1. Adenoviral Vektörler...12 4.3.2. DNA-içermeyen Metotlar...13 4.4. Kimyasal Yeniden Programlama...14 4.5. Yeniden Programlamada MikroRNA lar...15 5. IPKH DİZİLERİNİN KARAKTERİZASYONU...17 6. HASTALIĞA ÖZGÜ İPKH LERDEKİ GELİŞMELER VE UYGULAMALARI...18 7. DOKU MÜHENDİSLİĞİ VE İPKH: TANIMI VE GENEL KONSEPTLERİ...19 8. DENTAL ARAŞTRMALARDA İPKH TEKNOLOJİSİ...20 9. İNSAN İPKH ÜRETİMİ İÇİN MUHTEMEL KAYNAK OLARAK DENTAL KÖK HÜCRE KAYNAKLARI...21
10. TÜM ORGAN BİYOMÜHENDİSLİĞİNDE İPKH TEKNOLOJİSİ İÇİN DENTAL SİSTEMİN POTANSİYELİ...25 11. HASTALIĞA ÖZGÜ İPKH LERİN GENETİK ORODENTAL HASTALIK VE BOZUKLUKLARDAKİ TEDAVİ POTANSİYELİ..29 12. ÖZET...33 13. KAYNAKLAR...34 14. ÖZGEÇMİŞ...49
1. GİRİŞ VE AMAÇ İndüklenmiş pluripotent kök hücre (İPKH), pluripotent özellik kazanmış somatik hücrelere denir. Bu terim ilk olarak 2006 yılında Takahashi ve Yamanaka isimli bilim adamlarının çalışmalarıyla gündeme gelmiştir (1). Pluripotent özellik, organizmadaki üç germ tabakasından köken alan bütün hücreleri oluşturabilme özelliğidir. Embriyonik kök hücre (EKH) ler bu özelliğe sahiptir. EKH ler blastosist aşamasındaki embriyonun iç hücre kitlesinden elde edilir. Hücre kültürlerinde uygun koşullarda üretilen EKH ler, kalp hücresinden yağ hücresine vücuttaki bütün hücreleri oluşturabilme yeteneğindedir (2,3). İnsan embriyonik kök hücreleri (iekh) tanımlı kültür ortamında üç germ tabakasından herhangi bir hücreye dönüşmek için az bulunan bir proliferasyon yeteneğine sahip pluripotent hücrelerdir. Bu yüzden embriyonik kök hücreler; deneysel çalışmalar, ilaç incelemeleri ve rejeneratif tıp için en yatkın araç olarak kabul edilmiştir (4). Ancak, insan embriyolarının bağışı ve tahribatı ile ilgili etik sorunlarla, embriyonik kök hücrelerin immünolojik uyumsuzluğu bu hücrelerin hücre temelli tedavilerde kullanılmasına engel olmuştur (4). Bu sorunların üstesinden gelmek amacıyla somatik hücreleri pluripotent hücre benzeri şekle dönüştüren yeniden programlama teknikleri ortaya çıkmıştır. Indüklenmiş pluripotent kök hücrelerin (ipkh) çaresiz hastalıkların hafifletilmesindeki ve organ nakline katkılarındaki potansiyelinin kanıtlanacağına inanılmaktadır (5). ipkh lerin pek çok insan hücresi tipinden verimli bir şekilde elde edilebildiği gösterilmiştir (6-11). ipkh lerin transkripsiyonal ve epigenetik özelliklerinin iekh lere benzer olduğu gözlemlenmiştir (12-14). iekh ve ipkh lerin doğalarındaki benzerlik ve farkların kavranması; iekh lerin klinik ve pratik uygulamalarının kısıtlılığının anlaşılmasına avantaj sağlayacaktır (15.16).
2. HÜCRE DEDİFERANSİYASYONU VE PLURİPOTANSİYELİ Hücresel dediferansiyasyon, biyolojide doku rejenerasyonu ve klonlanması gibi önemli konularının temelini oluşturur ve belirli bir dediferansiye durumdaki hücrelerin, pluripotentliği gösteren kök hücre benzeri bir duruma geçmesinin altını çizer. İn vivo pluripotentlik, organizmadaki bütün dokulara farklılaşabilen erken embriyolardaki hücrelerle ilişkilidir. Embriyonik kök hücreler (EKH) implantasyon öncesi embriyodan kökenli hücrelerdir ve üç özelliğe sahiptir: kendi kendini yenileme, pluripotentlik ve primer kimera şekillenmesi (17). Embriyonik kök hücreler doku formasyonunun mekanizmasının araştırılması için kıymetli bir araç teşkil etmektedir. İn vitro pluripotentlik, blastosist safhasındaki embriyonun iç hücre kütlesinden toplanan EKH lerden elde edilebilir. EKH ler andiferansiye durumlarını en az 80 pasaj boyunca sürdürerek kültürde uzun ömürlülüklerini göstermişlerdir. Dahası, eğer embriyonik kök hücreler hazırda uygun besinlerle kültür edilirse, bu hücreler potansiyel olarak pluripotent germinal hücreler ve bunların bir dokuya uyum sağlayabilen ve bu yeni doku çevresinin karakter ve davranışlarını benimseyen ürünleri de dahil olmak üzere vücudun bütün hücrelerini meydana getirebilirler. Ancak, aynı zamanda insan embriyonik kök hücrelerinin kullanımıyla ilişkili kayda değer problemler mevcuttur: i. Eldeleri insan embriyolarının manipülasyonunu ve dolayısıyla ciddi yasal ve etik sorunlarını içermektedir (18) ii. Eğer nakledilen hücreler genetik olarak hastanın hücrelerinden farklılaşmışsa, kişinin immün sistemi reddedebilir ve bu hücreleri yok edebilir ve hasta ömrü boyunca immünsüprese durumda olacaktır 2
iii. Pluripotent kök hücreler (PKH ler) tümör oluşturma potansiyellerinden ötürü bir güvenlik sorunu içermektedir. Bu hücreler andiferansiye durumda nakledilirse teratoma yani üç germ yaprağından birden köken alan tümörler oluşturmaktadır. Şu an teratoma oluşmayacağından emin olmanın tek yolu embriyonik kök hücreleri farklılaştırmak, istenen hücre tipine yükseltmek ve andiferaniye hücre varlığını tespit için incelemektir (19). Bu problemlerin ilk ikisi, otolog (hastaya özgü) pluripotent kök hücre dizileri elde etmek yoluyla somatik hücrelerin dediferansiyasyonu ile çözülebilir. Dediferansiyasyon kapasitesi memeli somatik hücrelerinde korunmuştur ve yeniden programlama teknolojisi yetişkin farklılaşmış hücrelerden pluripotent kök hücre üretimi için iki strateji sunmuştur: 1. Tedavi edici klonlama veya nükleer klonlama (NK) da denilen, Somatik hücre nükleer transferi (SHNT): bu araştırma alanının alamet-i farikası 1996 da yetişkin farklılaşmış hücre çekirdeğinin çekirdeği çıkarılmış bir döllenmemiş oosite aktarılmasıyla oluşturulan bir koyun olan Dolly nin doğumuyla gündeme gelmiştir (20). Bu çığır açan buluş ileri derecede farklılaşmış somatik hücrelerin bile içten içe bir zigot aşamasına dönüşme yeteneğini koruduğunu ve dolayısıyla embriyonik kök hücreler için potansiyel ve tükenmez bir kaynak olduğunu kanıtlamıştır. 2. İndüklenmiş pluripotent kök hücre veya IPKH olarak bilinen, yeniden programlanmış farklılaşmış hayvan hücrelerinden pluripotent kök hücre eldesi: Dolly nin doğumundan on yıl sonra, başka bir belirleyici buluş yetişkin farelerin somatik hücrelerinde OCT3/4, SOX2, KLF4 v c-myc adlı dört transkripsiyon 3
faktörünün transgenik baskılanması ile ipk hücrelerinin ortaya çıkışını gösterdi (1). Bu protokol OCT3/4, SOX2, KLF4 (16) ve c-myc veya OCT-4, SOX-2, LIN28 ve NANOG (21) kullanımıyla aynı zamanda yetişkin insan hücreleriyle de işe yaradı. Somatik hücre nükleer transferi (SHNT) bir oosit çekirdeğinin çıkarılmasını ve ardından yetişkin bir somatik hücreden alınan çekirdeğin yerleştirilmesini gerektirmektedir (22). SHNT nin sınırları vardır, araştırma için üretilen insan embriyolarının klonlanmasıyla ilgili ciddi etik meselelere ek olarak (23), araştırmaya uygun kalitede taze bağışlanmış olgun insan metafaz-ii oositlerin kıtlığı da önemli bir engeldir (24). Şu an, hayvan klonlamadan elde edilen embriyolarının çoğunun transplantasyon sonrası hayatta kalmamalarından ötürü bütün klonlama sürecinin etkinliği epey düşüktür (25). Günümüzde, SHNT lerin tıp uygulamaları sürecin altında yatan mekanizmayla ilgili bilgilerin yetersizliğinden ve etik sorunlardan ötürü sekteye uğramıştır (26). Ancak, nükleer transfer göstermiştir ki bir bütün organizma yaratmak için gerekli olan genlerin hepsi farklılaşmış hücrenin nükleusunda mevcuttur ve oosit içindeki yeniden programlama faktörlerine maruz kalma sonucu aktive edilebilirler (27). Buna ek olarak, SHNT hücrenin gelişim potansiyelini araştırmak için önemli bir araçtır ve bu bulguların asıl sonucu hücre farklılaşması sırasında genomu geri dönüşümlü epigenetik yerine geri dönüşümsüz genetik değişikliklere zorlamaktır (28). Ancak embriyonik kök hücrelerden tetraploid embriyo tamamlama yolu ile doğrudan embriyo üretimi, SHNT ye popüler bir alternatif olmuştur. Somatik hücreler embriyonik kök hücreler ile birleşme yolu ile yeniden programlanabilir ve Takahashi ile Yamanaka embriyonik kök hücrelerin pluripotentliği indükleyen faktörler içerdiği ve bu faktörlerin aynı zamanda 4
embriyonik kök hücrelerdeki pluripotentliğin sürdürülmesiyle de ilişkide olduğu sonucuna varmıştır. Bu hipotez temel alındığında, fare embriyonik fibroblastlarının ve yetişkin fibroblastlarının embriyonik kök hücre kültür şartlarında Oct3/4, Sox2, c- MYC ve Klf-4 adlı dört transkripsiyon faktörünün retroviral aracılı transdüksiyonuyla pluripotent embriyonik kök hücre benzeri hücrelere yeniden programlanması için tanımlanmış transkripsiyon faktörlerinin ektopik baskılanmasının yeterli olduğunu göstermiştir (1). Belirlenmiş bu ipk hücreleri, embriyonik kök hücrelerin morfoloji ve büyüme özelliklerini göstermekte ve embriyonik kök hücre belirteç genlerini baskılamaktadır. Tüysüz farelere subkutan olarak ipkh nakli teratomalarla sonuçlanmıştır. Blastosistlere ipkh enjeksiyonu kimera iki zigottan oluşan canlı- oluşumuna yol açmaktadır. İPK hücreleri pluripotentliklerinden dolayı in vitro sınırsız bölünme göstermiştir. Dört faktörün aşırı baskılanmasıyla elde edilen hücreler yetişkin kimera oluşturma ve fonksiyonel germ hücreleri yaratma kabiliyetindedir (13,29-31). Oct-4, Sox-2, c-myc ve Klf-4 veya Oct-4, Sox-2, Nanog ve Lin-28 in baskılanmasıyla elde edilen insan ipk hücreleri insan embriyonik kök hücrelerine belirgin bir şekilde benzemektedir (32). Ancak, embriyonik kök hücreler ve ipk hücreleri arasında farklı gen baskılanma profillerinden (gen işaretleri) dolayı uyumsuzluk mevcuttur (33,34). Bununla birlikte, ipk hücreleri, embriyonik kök hücreler ile karşılaştırıldığında, azalmış farklılaşma potansiyeli göstermiştir (35,36). Yeniden programlama stratejilerinin ana kısıtlayıcısı, potansiyel olarak zararlı genom birleştirici virüslerin yeniden programlama faktör transgenlerini elde etmek için kullanılmasıdır. Çoğu ipk hücresi viral vektörlerle hazırlanmaktadır, bunlar arasında konak genomuna yeniden programlama faktörlerini birleştiren ve tümör 5
oluşum riskini arttıran retrovirüsler (1) ve lentivirüsler (37) vardır. İPK hücrelerinin eldesinden sonra birleşik transgenlerin rezidüel varlığı kesinlikle istenmemektedir. Yeniden programlanmayı indükleyen dört faktör kesinlikle onkogendir, dolayısıyla bir kanser fenotipi oluşturma riskini taşırlar. Hücre genomuna Virüs yardımcılı faktör yerleştirilmesi yolu ile Nükleer yeniden-programlama sürecinin karsinogenez riskini arttırdığı hakkında mevcut dayanaklar vardır (38). Bunu destekleyecek şekilde, yeniden programlamanın verimi, p53 tümör baskılayıcı genlerin yok edildiği hücrelerde daha yüksektir (39,40). Bu yüksek karsinogenez riski sadece c-myc transgenlerin entegrasyonuna bağlı olmamakla birlikte bununla oldukça ilişkilidir (41,42). Alternatif gen faktör teslimi sistemleri; entegre-olmayan adenovirüsleri (43), plasmidlerin hücre içine alımını (44), doksisiklinle uyarılabilen çıkarılabilir piggybac (PB) transpozon sistemini (45) ve entegre olmayan epizomal vektörleri (46) kapsamaktadır. Başka bir değişik strateji de genler yerine, rekombinant proteinlerin yeniden programlanacak hücrelerin içine teslimine dayanır (47,48). Ayrıca, kimyasal uyarı kullanılarak yeniden programlama yolu ile indüksiyon ve etkili küçük moleküllerin tespit edilip seçilmesi ile hücrelere verilen faktörlerin azaltılması yolları araştırılmıştır (49). Bu son yaklaşımın kullanımı ile multipotent nöral kök hücrelere (50), saç foliküllerinden dermal papilla hücrelerine (51) sadece bir yeniden programlama faktörünün verilmesi ile ipkh yaratılmasıyla ilgili başarılı denemeler olmuştur. Daha önce tanımlanan dört faktörün yerini, artık başka faktörler veya belli küçük moleküller alabilmekte ama asıl buluş, bir grup faktörün gerekliliği, geçerliliğini korumaktadır ve OCT-4 gibi belli anahtar gen faktörleri atlanamamaktadır. 6
Hastaya özgü ipk hücreleri elde etme ihtimali, gelecekte hücre nakliyle doku mühendisliği rejeneratif tedavileri ile ilgili beklentilere büyük umut getirmiştir, çünkü bu yeni pluripotent hücreler öteden beri insan pluripotent kök hücre kaynaklarıyla ilişkilendirilen temel problemlerin önüne geçmektedir: insan embriyolarının manipülasyonunun gerekliliğinden doğan ciddi etik sorunlar ve konak immün sistemi tarafından nakledilen hücrelerin reddedilme olasılığı. Ancak, karsinogenezisin indüklenmesi hala geçerli bir tehdit oluşturmaktadır. İPK hücre teknolojisinin potansiyeli muazam olmakla birlikte ipk hücre üretimiyle ilgili metodolojilerin geliştirilmesi ve ipk hücrelerinin her klon ve subklonunun güvenlik ve etkinliğinden kesin olarak emin olunması gerekecektir. Pluripotent durumdayken somatik hücrelerin ilerlemeleriyle ilgili olarak detaylı bir hücresel ve moleküler çalışma yapılması gereklidir (52). Pek çok açıdan hala aydınlatılması gereken çok şey vardır ve hücre yeniden programlama sürecinin verimi hala oldukça düşüktür (53). 3. İPKH ÜRETİMİ Ilk İPKH eldesi 2006 yılında Takahashi ve Yamanaka tarafından sunulmuştur (1). Fareden elde edilmiş hücre dizilerinde bir grup transkripsiyon faktörünün eş zamanlı olarak baskılanmasıyla ipkh elde edimiştir. Benzer bir genetik manipulasyon yaklaşımı insan fibroblast hücrelerinden pluripotent hücre elde etmede kullanılmıştır (14, 16, 21). Bu yaklaşıma ek olarak, ipkh üretimi için tek polisistronik vektör (54), entegre olmayan adenoviral aps yaklaşımı (43, 44), pluripotentlik indüklendikten sonra transgenleri yerleştirilen ipkh dizilerinden çıkaran PiggyBac transpozon sistemi (45, 46), Cre/lox ön-kombinasyon sistemi (55) 7
ve vektörden ve transgen DNAsından arındırılmış ipkh üreten entegre olmayan epizomal vektörler (56) gibi başka yollar da bulundu. Bu yöntemler sadece hedef hücrelere yabancı DNA transferine dayandığından, güvenlik meselesini ele alan protein-temelli metodlar geliştirilmiştir. Bu metodlarda çeşitli yeniden-programlama proteinleri, HIV tat geni ve poliarjinin gibi protein transdüksiyonuna aracı olan kısa bir peptit ile birleştirilerek hücrelere iletilmiştir (47,48 ). Ayrıca, pluripotentliği ve farklılaşmayı indüklemek için sentetik mrna kullanan alternatif bir yaklaşım da tanımlanmıştır (57). Bu yeni yaklaşım daha önce tanımlanan protokollere kıyasla üstün dönüşüm verimi ve dinamiği göstermiştir. Bu hücreyi yeniden-programlama şekli, verici hücredeki tüm düzenleyici komponentleri hedef hücreye aktaran bütünleyici bir yaklaşımdır. Dahası, hücrenin yeniden programlanmasına ana genlerin küçük bir takımıyla değil bütün genom sisteminin manipulasyonuyla ulaşılmıştır. Dolayısıyla, ipkh üretiminin güvenli ve verimli bir şeklini bulmak, hücrenin yeniden programlanma biyolojisinin daha iyi anlaşılmasını gerektirmektedir. Canlı hücreler genomik durumlarının (gen-regülasyonu, epigenetik modifikasyonlar, hücre fizyolojisi) fenotipik temsilleri olmalarına rağmen, istikrarlı bir moleküler durumda değillerdir (58). Bu nedenle hücrelerin pluripotent bir şekle dönüştürülmesi veya yeniden programlanması, farklılaşmış hallerindeyken bile mümkündür. 8
4. YENİDEN PROGRAMLAMA İÇİN HÜCREYE VEKTÖR VERİLMESİ İPKH ler, vericinin klinik geçmişinin bilgisi ile hastalığa ve hastaya özgü hücreler sunar ve bunlar yaşlı hastalardaki kronik hastalıklar gibi her yaş ve koşulda alınan hücrelerden yapılabilir. İPKH üretiminde kullanılan teknik yeniden programlamanın verimini ve meydana gelen ipkh lerin kalitesini etkileyebilir. Yeniden programlama metotları, eksojen genetik materyalin alıcı genomuna birleştirilme şekli veya entegrasyonsuz yaklaşıma bağlı olarak pek çok sınıfa ayrılabilir (28) 4.1. Bütünleştirme yaklaşımları 4.1.1. Retrovirüsler Fare veya insan fibroblastlarına Yamanaka faktörlerinin (Oct4, Sox2, Klf4, c- Myc, OKSM) verilmesi aslen Moloney sıçan lösemi virüsü (MSLV) kökenli retrovirüslerin kullanılmasıyla sağlanmıştır. Bunlar kararlı bir biçimde konak hücre genomuyla bütünleşmişlerdir (1, 13, 30). MSLV kökenli retrovirüslerin kullanımıyla ipkh üretiminin verimi fare embriyonik fibroblastlarında yaklaşık %0,1 ve insan fibroblastlarında yaklaşık %0.01 dir (59). Yatıştırma, iyi huylu ipkh lerin eldesi için önemlidir. Sadece endojen pluripotentlik gen ağı uyandırılmış ve transgenlerin ekspresyonu kısıtlanmış bir ipkh gerçekten tamamı ile yeniden programlanmış sayılır (59). Ancak, retroviral kökenli ipkh ler alıcı genomunda sayısız transgen bütünleşme sahalarına sahiptir. Tamamlanmamış transgen baskılanması ipkh lerin gelişimsel potansiyelini tehlikeye atar (37). İlaveten, kalıcı transgen ekspresyonu 9
veya eksojen olarak uygulanmış transkripsiyon faktörlerinin sonradan yeniden aktivasyonu tehlikeli bir hızla tümör oluşumuna sebep olabilir (13, 38). 4.1.2. Lentivirüsler MSLV-kökenli retrovirüslerden daha yüksek kopyalama kapasitesi ve bulaşma verimine sahip olmasıyla lentiviral taşıyıcı vektörler de yeniden programlama faktörlerinin ekspresyonunda kullanılmıştır (21, 60). Avantaj olarak, hem bölünen hem de bölünmeyen hücreleri enfekte edebilirler. Her ne kadar yeniden programlama verimi MSLV kökenli retrovirüslerle kıyaslanabilirse de, lentivirüsler üretilen ipkh lerdeyken daha az verimle baskılanabilir (61). Temel lentiviral vektörler problemi çözememiştir çünkü onlar daha bile az verimle baskılanmış ve bir farklılaşma engeline neden olmuşlardır (60,61). İndüklenebilir lentivirüs sistemleri, hedefe doğrudan faktör aktarımına dayanmaz. İkincil yeniden programlama sistemleri, doksisiklin (Dox)- indüklenebilir lentiviral vektör veya transpozonlarıyla üretilmiş birincil ipkh klonlarını kullanır. Bu birincil ipkh ler daha sonra ya in vitro insan hücresi farklılaşması kullanarak ya da farede blastosist enjeksiyonuyla genetik olarak homojen somatik hücrelere farklılaşırlar (62, 63). Birincil hücreler Doxindüklenebilir operatörün kontrolü altında bir lentivirüs içerikli transkripsiyon faktörleri ekspresyon kasetiyle indüklendiği için, ikincil ipkh şekillenmesi doksisiklin içeren ortama ekildiklerinde tetiklenir (62,63). Her ne kadar sistemin verimi kullanılan hedef hücre tipine göre değişiyorsa da, genellikle birincil bulaşmanınkinden daha yüksektir (28). Stadtfeld ve Hochedlinger ayrıca ikincil sistemin iki ana avantajı olduğunu sunmuştur: genetik olarak homojen hücrelerin büyük miktarlarını yeniden programlama, özellikle ekilmesi ve transdüksiyonu zor 10
olanların ve farklı somatik hücrelerden kökenli genetik olarak eşleşmiş ipkh lerin karşılaştırılmasının kolaylaşması (28). Ancak, hala bir dezavantaj mevcuttur ki lentiviral transgenlerden dolayı ikincil hücrelerdeki heterojen ekspresyon kalıpları, birincil ipkh lerin elverişsiz taranmalarına yol açar (28). İstenen mutant geçmişi taşıyabilecek olan yeniden programlanabilir fare suşları, hastalık patolojilerinin mekanik çalışmalarında dikkat çekici etkiye sahip olabilir (28,64). Tekli vektör sistemi: Bütün OKSM faktörlerini kodlayan polisistronik kasetleri ifade etmek için tasarlanmış olan lentiviral veya retroviral vektörler, farklı somatik hücrelere bulaşmada tek faktörü ifade eden vektörlerden daha verimliydi (54). Her ne kadar bu metot genomik bütünleşmeyi en aza indirse de, nakil sonrası hala tümör riski mevcuttur. Özellikle c-myc iyi bilinen bir onkojen olup yeniden faaliyeti kimerik farelerde transgen-kökenli tümör oluşumuna sebep olabilir (13). C-Myc transgeninin yeniden programlama karışımından çıkarılması verimi belli belirsiz düşürse de, c-myc siz ipkh lerle üretilmiş kimerik fareler artmış bir tümör oluşumuna sebep olmadılar (41). Ancak, Oct4 ve Klf4 ün aşırı ekspresyonu hala tümör oluşumuna sebep olabilir ve retroviral ekleme konak gen yapısını rahatsız edip tümör riskini arttırabilir (29). Lipozom kullanımı veya elektroporasyon gibi standart DNA hücre-içine alım teknikleri viral vektörlerin kullanımına iyi birer alternatif olabilirler. Ancak transdüksiyon verimi viral transfeksiyonlardan çok düşüktür (59). 4.2. Çıkarılabilir yaklaşımlar OriP/EBNA1 (Epstein-Barr nükleer antijen-1) temelli epizomal vektörler veya bir piggybac (PB)- temelli tekli vektör yeniden programlama sistemini kullanan, 11
virüs içermeyen bir metot başarılı bir biçimde insan fibroblastlarını yeniden programlamada kullanılmıştır (46,56). Bir diğer çıkarılabilir metot lentiviral vektörleri ve Cre delesyonundan sonra bir genomik iz bırakan Cre/loxP çıkarılabilir lineer transgenlerini kullanır. Polisistronik vektörler kullanıldığında bu yaklaşım farklı hücre tiplerinden verimli ipkh üretimini sağlamıştır (65). Bütünleşmeli metodolojilerde, her ne kadar sadece PB sistemi kesin bir delesyonu garanti etse de, hala atılmış dizilerin kanıtlanması gerekmektedir (14). Cre-silinebilen veya indüklenebilen lentivirüslerin kullanımı bazı problemleri çözse de viral sistemler hala tedavi uygulamaları için gereken güvenliğe sahip değildir. 4.3. Bütünleşme içermeyen yaklaşımlar Kromozomal bozulma riskini en aza indirmek için, yeniden programlama protokolleri genetik bütünleşmeyi ortadan kaldıracak şekilde düzenlenmiştir. Bu amaçla, üç farklı yaklaşım geliştirilmiştir. İlki daha önce de bahsettiğimiz gibi sonradan genomdan çıkarılabilen bütünleşme vektörlerini kullanır. İkincisi bütünleşme içermeyen vektörler kullanır ve sonuncusu nükleik asit temeli vektörleri kullanmaz (28). Maalesef bunların hepsi genelde verimsiz ve zayıf üretkenliktedir (59). 4.3.1. Adenoviral vektörler Bütünleşme olmadan yeniden programlamayı sağlayan yöntemler içinde genomik bütünleşmeye neden olmadan eksojen yeniden programlama faktörlerinin geçici ekspresyonuna aracı olan adenoviral vektörler bulunur. Yetişkin fare hepatositlerinden bütünleşme olmadan ipkh üretiminin ilk girişimlerinden biri, bütünleşme içermeyen adenoviral vektörler kullanan Stadtfeld ve arkadaşları tarafından sunulmuştur (43). Benzer vektörleri kullanarak Okita ve arkadaşları (44) ) 12
ile Zhou ve Freed(66) sırasıyla fare embriyonik fibroblastlarından ve insan fetal fibroblastlarından bütünleşme içermeyen ipkh dizileri üretmişlerdir. Bu sistemlerle genomik bütünleşme olmadığından bu, somatik hücrelerden ipkh üretimi için yeniden programlama faktörlerinin geçici ekspresyonunun yeterli olduğu prensibinin kanıtıdır (28). Dahası, retrovirüslerle veya lentivirüslerle elde edilmiş ipkh lerde ortak bütünleşme alanlarının yokluğunu gösteren güncel deneylerden kesin destekleyici neticeler çıkmıştır (67,68). Daha güncel olarak, insan fibroblastlarından Sendai viral gen aktarım sistemi kullanılarak (69), polisistronik mini-döngü vektörler kullanılarak (70) ve kendi kendine replike, seçilebilir epizomlarla (56) başarıyla ipkh ler elde edilmiştir. 4.3.2. DNA-İçermeyen Metotlar Plasmid veya viral vektörleri tamamen elimine etmek için güncel olarak ipkh ler saflaştırılmış rekombinant protein formunda dört yeniden programlama faktörünün sunumuyla elde edilmiştir (47, 48). Ancak, belki düşük transdüksiyon veriminden ve istikrarlı olmayan ekspresyondan dolayı bunun verimi oldukça düşüktür (29). Daha güncel olarak Warren ve ark (57) genomu modifiye etmeyen sentetik modifiye mrna kullanarak daha verimli yeniden programlamayı göstermişlerdir. Elde edilen ipkh ler RNA-indüklenen pluripotent kök hücreler (RiPKH ler) olarak adlandırılmıştır. Her ne kadar protokol teknik olarak epey karışık olsa da, bu teknoloji RNA temelli olduğu için, DNA temelli metodolojilere özgü olan genomik bütünleşme ve yerleştirme ile ilgili mutagenez riskini tamamen ortadan kaldırmıştır. Bu teknoloji günümüzde en yüksek verime ve kinetiğe sahiptir (71). 13
Her ne kadar bütünleşme içermeyen vektörler, çıkarılabilir genetik elementler, küçük kimyasallar ve/veya proteinler kullanan metotlar geride hiçbir genetik iz bırakmasa da, bunlarla ipkh üretiminin verimi %0,0001 ile 0,0018 arasında değişir yani bütünleşen faktörler kullanıldığında erişilenin üçüncü kuvveti kadar düşüktür (% 0,1-1) (28). Dolayısıyla yeniden programlama verimi tanımlanan destekleyici faktörlerle eklenen genlerle veya küçük kimyasallarla arttırılmaya çalışılmaktadır (72). 4.4. Kimyasal Yeniden Programlama Küçük moleküller doğal olarak oluşmuş maddeler veya tamamen insan eliyle üretilmiş bileşiklerdir. Çeşitli organizmalardaki, hücre kültürü sistemlerinde ve moleküler yolaklardaki aktiviteleri için üretilip gözlemlenmişlerdir. Kullanım kolaylıkları, özgün, dozdan bağımsız, hızlı ve geri dönüşümlü etkileri ve kesin zamansal ve fonksiyonel in vivo kontrolleri onları biyomedikal araştırmalardaki en etkili araçlardan biri haline getirmiştir (73). Son olarak somatik hücre yeniden programlanmasında kullanılmışlardır. Efe ve Ding (2011) küçük moleküllerin nasıl yeniden programlamayı geliştirdiğini açıklamıştır: bazıları hücre plastisitesinde küresel bir etkiye sahipken diğerleri bir veya daha fazla yeniden programlama faktörünün yerini alması için özgün bir sinyal yolağı ayarlayabilmektedir. Diğer yandan da, iki kategoride birden çalışan bileşikler de bulunmaktadır (73). Onkogenleri dahil etmemek (Klf4 ve cmyc) (39, 41, 50) veya bir ya da iki transkripsiyon faktörünü VPA (bir histon deasetilaz inhibitörü)(74) gibi küçük kimyasallarla değiştirmek sadece daha güvenli klinik potansiyel sunmakla kalmaz aynı zamanda ipk hücreleri üretiminin verimini belirgin olarak arttırır. Daha da 14
çarpıcı olarak, Mali ve ark (2010) göstermiştir ki bütiratın (bir HDAC inhibitörü) düşük seviyeleri yeniden programlama verimini 50 kata kadar arttırmıştır (75). Dahası, Lin ve ark (2009) fibroblastların Alk5 inhibitör SB431542, MEK inhibitörü PD0325901 ve tiazovivin ile kombine uygulamalarının OKSM yeniden programlama etkinliğinde büyük bir gelişme (200 katından fazla) olduğunu bulmuşlardır (76). 4.5. Yeniden Programlamada MikroRNA lar (mirna) mirna lar, mesajcı RNA (mrna) destabilizasyonu ve translasyonal inhibisyonla hedeflerin ekspresyonunu düzenleyen 22 nt kodlama yapmayan küçük RNA lardır (77). Bunlar global bir gen-yatıştırma fonksiyonu yürütmeleri için RNAindüklenmiş yatıştırıcı komplekse (RIYK) yüklenmişlerdir (78). Çeşitli mirna lar sıklıkla salkımlar halinde genomda bulunur ve transkripsiyon faktörleri gibi, hücre tipine özgü bir şekilde ifade edilirler. Tek bir mirna yüzlerce mrna yı hedef alabildiği için, tek bir mirna nın ekspresyonu hücrenin kaderini güçlü bir şekilde etkileyebilir (79). Küçük bileşiklere benzer şekilde, mirna ların ayrıca yeniden programlama verimini etkileyebildiği gösterilmiştir. Anokye-Danso ve ark (2011) yakın zamanda, mirs-302a-d ve mir-367 de içeren lentiviral kökenli mir-302 kümesinin tek başına fibroblastlardan fare ve insan ipkh leri üretebildiğini göstermişlerdir (80). Buna ek olarak, Miyoshi ve ark (2011) fare ve insan adipoz stromal hücrelerini tekrar tekrar mir-302, mir-200 ve mir-369 ailelerine ait yedi mirna nın karışımını hücre içine alarak yeniden programlamıştır (81). Ancak, Anokye ve arkadaşlarının çalışmasındaki mirna prekürsörlerinin viral aktarımıyla karşılaştırıldığında bu araştırmanın yeniden programlama verimi oldukça düşüktür. Yeniden programlama sürecindeki popüler aktivitelerine ek olarak hücre tipine özgü 15
mirna lerin farklılaşma aktivitelerinin taranmasının nesil dönüşüm olaylarının ayarlanmasında çok işe yarayabileceği önerilmiştir (79). Yeniden programlama için pek çok alternatif teknik vardır. Örneğin Zhong ve ark (2011) indüklenebilen intihar genleri veya basitçe intihar genleri diye adlandırılan iki apoptozis-indükleyen geni, güvenli ipk hücreleri için potansiyel bir metoda elverişli olup olmadıklarını görmek amacıyla test etmişlerdir. İki intihar gen/ilaç sisteminin, YCD/5-FC ve icaspaselap20187, hücre ölüm-anahtarı kapasitesini insansı olmayan maymunların (Macaca nemestrina) ipk hücrelerinde hem in vitro hem de in vivo değerlendirmişlerdir. Araştırmanın sonuçları göstermiştir ki, bir intihar geni/ön-ilaç kombinasyonu güvenli ipkh lerle olası bir onkojenik transformasyonunun ve/veya ipkh-ilişkili hücre terapisinden pluripotent hücrelerin kalmasının üstesinden gelebilir (82). Yamanaka nın takımı yakın zamanda HLA-homozigot ipkh leri yeniden programlamak için, epizomal plazmid vektörler ile p53 baskılanmasını ve dönüşmeyen L-Myc kullanarak bütünleştirici olmayan bir metot sunmuşlardır. Bunun için en büyük HLA konumunda Japon toplumunun yaklaşık %20 sine uyduğu kabul edilen iki insan lökosit antijeni (HLA) homozigot donörünün dental pulpa hücre dizileri kullanılmıştır. Çalışmada da gösterildiği gibi dental pulpa hücreleri, allograftlar özellikle de transplantların hemen cerrahi sonrası yerleştirilmesi gerektiği vakalar için önemli güvenli kaynaklar teşkil etmektedir (83,84). 16
5. İPKH DİZİLERİNİN KARAKTERİZASYONU İPKH dizilerinin üretilmesini daima yaratılan hücrelerdeki saflık ve kalite ile onların pluripotentlik potansiyellerini garantilemek amacıyla sonraki karakterizasyonlar takip eder. En kullanışlı ve doğrudan metodlardan biri, canlı immünositokimya yoluyla ipkh tespiti ve yalıtılması için geliştirilmiştir (85). Bu tekniğin kullanılması ile pluripotentliğin karakterizasyonu, SSEA-3, SSEA-4, Tra-1-60 ve Tra-1-18 gibi hücre içi ve hücre-yüzeyi biyolojik göstergelerinin kullanımı ile mümkündür (86). Ek olarak, akış sitometrisi analizleri özgün hücre düzeylerinde bu göstergelerin değerlendirilmesine yardımcı olmaktadır. Canlı boyamaya ek olarak; yeniden programlama faktörleri için alkalen fosfataz (AF) boyama kullanılarak yedek tanımlama gösterilmiştir, alkalen fosfatazın ipkh lerin tanınmasında yaygın bir gösterge olmasından dolayı (86). Pluripotentliğin daha ileri değerlendirmesi, hem endojen genlerin hem de transgenlerin baskılanması sayesinde, yarı nicel ve nicel polimeraz zincir reaksiyonları (PCR) yoluyla gerçekleştirilmektedir (87). Bunu, CpG adalarının bisülfit dizilimi ile pluripotent genlerin promotör bölgesindeki metilleme durumunun analizi izler (86). Karyotip analizi ayrıca ipk hücre dizilerinin kromozom stabilitesini saptamak amacıyla standart G-şeridi kromozom analizi ile de yürütülür (86). Ayrıca, pluripotent kök hücrelerin in vitro farklılaşması embiriyoid gövdenin oluşumu ve ardından teratoma yoklaması ile karakterizedir (87). Bu test üç embriyonik germ tabakasının oluşumunu teyit etmek için kullanılır (87). 17
6. HASTALIĞA-ÖZGÜ İPKH LERDEKİ GELİŞMELER VE UYGULAMALARI İnsanla-ilişkili hastalık çalışmalarının çoğu kemirgen modeller kullanılarak yapılmasına rağmen, insanda oluşan genetik bir kusur veya hastalığın aynısı kemirgenlerde de aynı semptomlara yol açmayabilir. Dolayısıyla, insan dokularından hücre kültürleri hayvan modellerine en uygun yapılardır. İPKH teknolojisi olası vericinin genomunu taşıyan ve hayvan modellere kıyasla insan hastalıklarını daha güvenilir bir biçimde taklit eden hastalığa-özgü kök hücrelerin üretimini gerçekleştirmiştir. İn vitro bir model üretiminden ayrı olarak, farklı bireylere ait hastalığa-özgü ipk hücre dizileri bir hastalığın doğası ve karmaşıklığının daha iyi anlaşılmasına olanak sağlamaktadır. Şu an bu tip bir insan hastalık modelinin en acil gereksinimi, insan vücudunun farklı dokularında hastalığın gerilemesinin araştırılması ve hastalar arasındaki değişkenliğin karşılaştırılması içindir (5). Hastalığa özgü ipkh ler hakkında birkaç çalışma yürütülmüştür ve bunların bazıları hastalık mekanizmalarının anlaşılmasını sağlamıştır. İPKH teknolojisini kullanarak bu çalışmalara başlamak için en ikna edici gerçek şuydu ki; ipkh dizilerinin benzer karakteristik kapasiteye sahip olduğu, normal bir bireyinkilere eşit olduğu çeşitli genetik bozukluklara sahip hastalardan başarılı bir şekilde hastalığa özgü pluripotent kök hücre elde edilebilirdi (14). Dahası, bu ipkh dizileri ilgili hastalıkların istenen hücre tiplerine farklılaşma ve hayvan modellerinde gözlemlenemeyen in vitro olarak hastalığa özgü etkilerini tekrarlama yeteneğine sahiptiler (88,89). 18
7. DOKU MÜHENDİSLİĞİ VE İPK HÜCRELERİ: TANIMI VE GENEL KONSEPTLERİ Doku mühendisliği, pek çok organın fonksiyonunun tamirinde kullanılmak üzere yaşayan dokular üretmeyi amaçlar (90). Doku mühendisliği, hasta veya hasarlı dokuları tamir veya yerine koymada kullanılan biyomateryallerin kullanımından, implantasyon öncesi hücrelerin yerleştirilebildiği kontrollü üç boyutlu şablonların kullanımına ilerlemiştir (91). Organ yetmezliği ve vasat protetik veya biyolojik materyallerin, hastalıklı veya haraplanmış insan organ ve dokularının tamirinde kullanımı veya yerine koyulması rejeneratif tıpta doku mühendisliği alanının gelimesi için asıl motivasyonu sağlamıştır (92-94). Kemik ve deri gibi dokular belli bir zamanda küçük yaralanmaları etkin bir şekilde tamir edebiliyorken, miyokard, kıkırdak ve sinir dokuları gibi pek çok doku müdahale olmadan tam olarak yenilenememektedir (95). Pluripotent kök hücre kaynaklarına erişim, tıpta hücre tedavisi potansiyelini oldukça arttırmış ve hastalıkların tedavisinde yeni bir perspektif oluşturmuştur (96,97). ipk hücreleri çoğalabilir, belirli bir hücre tipine farklılaşmaları için indüklenebilir ve seçilmiş hücreler belirli bir kalıp veya şablona yerleştirilip in vitro üretilebilir. Şablonlar (doğal veya sentetik), polimerlerden, metalden, seramikten veya kompozitten meydana getirilebilir (98,99). Şablonlarda doku veya organ tam olarak oluşuncaya dek hücre yetiştirilmesinde Biyoreaktörler kullanılmaktadır (90). Hücreler kültür ortamında çoğaltılabilir ve ardından hastaya nakledilebilir (100,101). Hücreler aynı bireyden(otolog) alınabilir veya aynı türün farklı bireylerinden (allojen) alınabilir veya başka türlerden (heterolog) elde edilebilir. Ancak, hücre 19
yeniden programlama sürecinin doğasında var olan kısıtlamalar nedeniyle, doku mühendisliği alanında ipk hücreleri ile ilgili araştırmaların, yeniden programlanan hücrelerin uzun süreli davranışlarının güven arz ettiği uygun doku ve organ sistemleriyle yürütülmesi tavsiye edilmektedir. 8. DENTAL ARAŞTIRMALARDA İPKH TEKNOLOJİSİ Başlangıçta, ipkh teknolojisinin hastalık modellemesinde kullanımını konseptinde çoklukla nöral dejeneratif hastalıklar üzerinde durulmuş, sonra immün sistem, kas sistemi, dolaşım, pankreas, cilt, kemik iliği, karaciğer, akciğer, retina, erken yaşlanma, ayrıca diğer fiziksel ve entelektüel bozuklukları da kapsayacak şekilde genişletilmiştir. Ancak, ipkh teknolojisinin orodental bozukluk ve hastalıklarda kullanımı hala başlangıç aşamasındadır. Kronik dejeneratif dental hastalıklar insan popülasyonlarında yaygındır ve halk sağlığı açısından belirgin bir problem teşkil etmektedir. İPKH teknolojisi ve orodental hastalıkların tedavisindeki uygulamaları diş hekimliğinde güçlü bir tedavi edici araç olabilir. Hastalık ve bozuklukların çoğu majör genetik bir bileşene sahiptir. İnsan hastalık ve bozuklukları tek gen mutasyonlarının sonucu olabileceği gibi, daha yaygın olarak multipl gen-gen veya gen-çevre etkileşimi sonucunda oluşup karmaşıktırlar (102). Orodental hastalıkların çoğunluğunun sebebi enfeksiyon ve travmatik etkenler göz önüne alınmazsa genetik kökenlidirler. Bu hastalıkların karakteristik belirti ve semptomları, hepsi açıkça tanımlanmamakla birlikte genetik bir kökeni işaret etmektedir (103-105). 20
Dünya çapında çocukların her yıl ortalama %7 si bazı zihinsel veya fiziksel defekte sahip olmaktadır. Bunların %75 i kraniyofasiyal defekt ve maformasyonlarla ilişkidedir (106). Yine altta yatan asıl bozukluğa ait klinik ipuçları gösteren dental anomaliler bu genetik hastalıkları tamamlayan bir şekil oluştururlar. İyi belgelenmiş bazı spesifik örnekler; dental bulguları oligodonti ve konik şekilli diş olan ektodermal displazi (107) ve çok sayıda süpernümerer ve sürmemiş dişle beraber görülen kleidokranial displaziyi içermektedir (108,109). Dolayısıyla, diş hekimlerinin hastalara multidisipliner ve en iyi olası tedavileri önerebilmeleri için genetik sendromlara ait klinik karakteristikleri ve olası bozuklukları bilmeleri gerekmektedir. Muhtemelen ipkh, hasta kişiden uygun hastalığa-özgü, çoğalma, destekleme ve kayıp veya hastalıklı bölgeyi düzeltme yeteneği olan ipkh lerin kullanılabilirliği sınırlı olarak bu genetik orodental bozuklukların tedavisi için potansiyele sahip olabilir. insan vücudundaki organ fonksiyonlarını tamir/rejenerasyon ve kısmen eski haline getirme yeteneklerine göre pek çok kök/progenitör hücre tanımlanmışsa da artan kanıtlar göstermektedir ki kök hücreler temelde nişlerde bulunmakta ve belli bazı dokular diğerlerinden daha çok kök hücre içermektedirler 9. İNSAN İPKH ÜRETİMİ İÇİN MUHTEMEL KAYNAK OLARAK DENTAL KÖK HÜCRE KAYNAKLARI Kişiselleştirilmiş tıbbın bulunuşu temelde en uygun hücre kaynaklarının teminine dayanmaktadır. İnsan vücudunda pek çok hücre kaynağının ipkh lere yeniden programlandığı gösterilmiştir. Bunların arasında ipkh lere ilk yeniden- 21
programlanan hücre tipi olan dermal fibroblastlar, devamında amniyon sıvısı kökenli hücreler, cilt keratinositleri, embriyonik kök hücreden kökenli fibroblastlar (EKF ler), CD34 kan hücreleri, mezenşimal kök hücreler (MKH ler) ve dental pulpa vardır (10). Ancak, çalışmalar göstermiştir ki somatik hücrelere kıyasla, daha olgunlaşmamış hücreleri yeniden programlamak daha kolaydır. Dolayısıyla, teknik, verimlilik ve hücre tipi seçimi açısından ipkh teknolojisi metodolojisini geliştirmek amacıyla büyük araştırmalar yapılmıştır. İnsan fibroblastlarının yeniden programlanma veriminin göreceli olarak düşük olduğu rapor edilmiştir; hâlbuki keratinositlerin yeniden programlama sürecinde insan fibroblastlarına kıyasla yüz kat daha verimli ve iki kat daha hızlı olarak ipkh kolonileri üretilmiştir (110). Etkinlikteki bu farkın muhtemel sebebi keratinositlerin kök hücre lişkili genlerinin baskılanma seviyesinin EKH lere fibroblastlara kıyasla daha yakın olmasıdır (110). Benzer bir karşılaştırılabilir çalışma göstermiştir ki dental dokulardan kökenli mezenşimal-benzeri kök hücreler; neonatal sünnet derisi fibroblastları, yetişkin MKH ler ve yetişkin dermal fibroblastlar gibi insan vücudunun diğer olgun somatik hücrelerine kıyasla ipkh lere daha verimli bir şekilde yeniden programlanabilir (10). Bunun nedeni muhtemelen zamanlama ve somatik bir hücrenin ipkh lere yeniden programlanması için gereken diğer faktörlerin hücresel içeriğe bağlı olarak epey değişkenlik göstermesidir. Örneğin, yukarda bahsedilen hücre kaynaklarından MKH lerin yeniden programlanması ve ipkh lere dönüşmesi için htert(telomeraz revers transferaz) ve SV40 geniş-t eklenmesi gerekmektedir, halbuki dental doku kökenli hücrelerde böyle bir sınırlama yoktur (10). Muhtemelen bu durum rejeneratif tedavinde kullanılmak üzere dental pulpanın, diğer somatik hücrelerin can sıkıcı 22
süreç derlemeleriyle kıyaslandığında mezenşimal kök hücreler için en uygun ve en zengin kaynak olduğunu vurgulamaktadır. Dental kök hücreler, dökülmüş süt dişlerinin pulpasından veya çekilmiş süt ve daimi dişlerden, apikal papilladan(apkh), diş germlerinden ve insan periodontal ligamentlerinden kolaylıkla elde edilebilir. Aslında, bütün bu hücreler başarılı bir şekilde ipkh lere yeniden programlanabilir (111). İnsan olgunlaşmamış dental pulpa kök hücrelerinin (hidpscs) yeniden programlanmasının insan fibroblastları, dökülmüş süt dişinden elde edilen ve dental pulpa kaynaklıkök hücreler ile karşılaştırıldığında kısa zaman çerçevesinde başarılı olduğunu gösteren güncel bir çalışma dental kaynaklı kök hücrelerin potansiyelini güçlendirmektedir. Dahası, primer hidpsc ipkh kolonileri, yabancı çevreden olası bir bulaşmayı engellemek için besleyicisiz koşullarda kolaylıkla elde edilmiştir (110). Fizyolojik olarak bozulmamış dental pulpa kök hücreleri üç primer germ tabakasının gelişmiş ürünlerine (odontoblast, osteoblast, kondrosit, miyosit, nörosit, adiposit, kornea epitel hücresi, melanoma hücresi, ipkh) başarıyla farklılaşabilir (111). Sonuçta, multipotentliği, yüksek çoğalma oranı ve ulaşılabilirliği dental kök hücreleri ipkh üretiminde mezenşimal kök hücreler için ilgi çekici bir kaynak haline getirmektedir. Dolayısıyla dental-kökenli kök hücreler gelecekteki rejeneratif tedaviler için bir taktik olarak kabul edilmelidir. Dişler, şaşırtıcı bir şekilde multipotent ektomezenşimal kök hücrelerce (EMKH) zengin olduğu kanıtlanmış organlardır. Yaşayan yetişkin diş dokularının çoğunluğu nöral kret hücrelerinden köken alır, ve dolayısıyla buradaki bütün dental kök hücreler genel olarak EMKH olarak adlandırılır. Dişler karmaşık cerrahi girişimlere ve invaziv izolasyon metodlarına gereksinim olmadan kolaylıkla dental 23
kliniklerde çekimle alınabilir. Miktar ve ulaşılabilirliklerinden dolayı dental dokular günümüzde bulunabilen en tutarlı insan kök hücre kaynaklarından birini oluşturmaktadır. çoğunluğu genç hastaların ortodontik sebeplerle çekilen üçüncü molarlarına karşılık gelen insan dişleri dünya genelinde binlerce dental klinikte çekilip atılmaktadır. Dental kök hücrelerin ayrıştırılıp tanımlanan beş farklı tipi mevcuttur: dental pulpa kök hücreleri (DPKH) (112), dökülmüş insan süt dişlerindeki kök hücreler (113), periodontal ligament kök hücreleri yani PDLKH (114), apikal papilla kök hücreleri yani APKH (115) ve dental folikül kök hücreleri (116). Bunların hepsi, odontoblast, sementoblast, osteoblast, kondroblast, adiposit, kas hücreleri, ve nöronlar gibi çeşitli hücrelere dönüşmeyi sağlayan, kök hücrelere özgü çok-nesilli farklılaşma potansiyeli gösterirler (117). Nöral kret orijinlerine rağmen, dental kök hücreler nöral ve glial hücre türetmek için iyi bir kök hücre seçeneği kabul edilmektedir. Bu hücrelerin bazıları örneğin düşmüş süt dişlerinden elde edilen kök hücreler, temel şartlarda, nörojenik stimülasyonun yokluğunda bile erken olgunlaşmamış glial ve nöronal hücre belirteçlerini baskılar (113). Çok güncel bir araştırma, dental pulpa içinde pluripotent kök hücrelere endojen dental kaynak teşkil edip etmediği tartışılan OCT-4+, NANOG+, LIN28+ ve SOX- 2+ hücre popülasyonu tanımlamıştır (118). Bu hücreler endoderm ve mezoderm hücre türevlerine farklılaşmaları için indüklenebilirler. Eğer bu buluş yakın gelecekte diğer araştırma gruplarınca da tasdik edilirse, dental kök hücre araştırma sahası hiç şüphesiz gerçek bir patlama yaşayacaktır. Dental hücrelerden kök ücre elde etmek için test edilmiş diğer stratejiler, dental multipotent EMKH leri, olgun gingival ve 24
periodontal fibroblastları ipkh lere yeniden programlamayı içermektedir. Bu, değişik araştırma gruplarında başarıyla gerçekleştirilmiştir (10, 119,120). 10. TÜM ORGAN BİYOMÜHENDİSLİĞİNDE İPKH TEKNOLOJİSİ İÇİN DENTAL SİSTEMİN POTANSİYELİ Dental kök hücreler dentin pulpa kompleksinin tamamen üretimi ve hatta ayrıştırılmış hücrelerden tüm diş oluşumunun (komple organ restorasyonu) mümkün olduğunun kanıtlandığı doku mühendisliği araştırmalarında başarıyla test edilmiştir (121). Diş oluşumunda rol alan iki hücre tipi farklı embriyonik kökene sahiptir: yüzey epiteli (ektoderm) ve ektomezenşimal (nöral kret). Bu dokular, sırasıyla diş minesini ve dentin pulpa kompleksini oluşturacak olan mine organının ve dental papillanın öncüsüdür. Diş gelişimi farklı morfogenetik safhalardan oluşur (doku kalınlaşması, tomurcuk, takke, çan, apozisyon) ve karmaşık epiteyal-mezenşimal hücresel indüksiyon serileri tarafından yönlendirilir. Devam eden çift taraflı sinyallerin neticesinde ameloblast ve odontoblast öncüleri, olgun diş hücre tiplerini mineralleyen iki anahtar, uzayacak, kutuplaşacak ve epiteli-mezenşim ara yüzünde farklılaşacaktır. Bu ameloblastik (mine üreten) ve odontoblastik (dentin üreten) hücreler sonuçta geç çan- erken apozisyon safhasında farklılaşacaktır, bu da diş tüberküllerinden başlayan sekresyon başlangıcını ve sert mine ve dentin dokularının birikimini belirleyecektir (122). Önemlidir ki, diş minesinin birikim ve olgunlaşması tamamlandığında, ameloblastik hücreler güçlü bir gerileme sürecine girer, uzamış şekillerini ve kutuplaşmış konumlarını kaybeder, bitişik epiteli hücreleriyle karışarak indirgenmiş 25
mine epiteli adını alan, diş sürmesi sırasında kaybolacak olan geçici bir koruyucu yapı şeklini alır. Olgun diş yapısında kalacak olan tek epitelyal hücre, diş kökü oluşumuyla ilişkili bir başka geçici yapı olan Hertwig epiteli kök kını (HEKK) kökenli olan Malassez epiteli artıkları (MEAH) hücreleridir. MEAH ler olgun bir dişte bilinen herhangi bir role sahip değildir ve periodontal ligament içinde küçük hücre salkımları şeklinde görünürler. Bunların tersine, ektomezenşimal kökenli odontoblastlar ve dental pulpa dokuları dişin ömrü boyunca mevcut kalacaktır. Tamamen fonksiyonel dentin-pulpa kompleksinin ve periodontal dokuların de novo üretimi, endojen EMKH lerin mineralize hidroksiapatit/trikalsiyum fosfat şablon taşıyıcılarla beraber deney hayvanlarına nakliyle başarıyla gerçekleştirilmiştir (123). Nakledilen hücreler sonuçta asimile olmuştur ve tamamen biyolojik yapıları oluştururken şablonun şeklini değiştirmişlerdir. Bu koşullar altında, hassas çalışmalarla da gösterildiği gibi, sentetik bir kronun yerleştirilmesine olanak sağlayan biyolojik bir diş kökü tasarlamak da mümkündür (124). Bu tekniğin gelişimi ve uyarlamalarıyla, gelecekte insanlarda sentetik implantların yerini biouyumlu tasarlanmış diş kökü dokularının alması mümkün olacaktır. Dolayısıyla, endojen EMKH ler rejeneratif diş hekimliğindeki kullanımları için büyük bir potansiyele sahiptir. Ayrıştırılan dental kök hücrelerden elde edilen fonksiyonel fare dişlerinin üretimi raporları daha da dikkat çekici olmuştur. Ses getiren bir çalışmada Tsuji ve ark (125) E14.5 takke safhasındaki fare dişinden ayrıştırdıkları dental epiteli hücrelerini ektomezenşimal DPKH ile kollajen jelde kombine edip biotasarımlı molar diş germi yaratmışlardır. Dikkate değer bir nokta da, biomühendislikle yapılan diş, bütün farklı morfogenetik safhalardan normal bir biçimde geçmiştir ve 26
sonrasında konak farenin çene kemiğine yerleştirilebilmiştir. Böylece, çevre dokularla güzelce uyum sağlayıp doğru bir oklüzyon sunan, çiğneme kuvvetlerini destekleyen, ortodontik hareketlere olanak sağlayan, normal bir innervasyon sağlayan ve ağrı uyarılarına yeterli cevabı veren tamamen fonksiyonel bir diş yaratılmıştır. Bu olumlu deneyim gelecekte hiç şüphesiz diş hekimliğinde devrim yaratacak tam dental organ rejenerasyonu sahasında büyük bir umut vadetmektedir. Ancak, dental kliniklerde dental kök hücre rekombinasyonuyla diş germi mühendisliği yaklaşımının uygulanmasından önce şüphesiz pek çok deney gerekmektedir ve temel sorunların çözülmesi gerekmektedir. Muhtemelen en önemli kısıtlayıcı faktör yetişkin insan bireylerinde endojen dental mezenşimal kök hücrelerle birleştirilmek üzere odontojenik potansiyele sahip epitelyal kök hücre kaynaklarının yokluğudur. PDL kökenli MEAH ler (126) ve postnatal oral mukozal epitelyal hücreler (127) kullanılarak, olası epitelyal yedeklerin tanımlanmasında önemli gelişmeler olmuştur. Bu hücre tiplerinin ikisi de in vitro kültür edilebilir ve ameloblastik hücre nesillerine farklılaşmak üzere indüklenebilirler. Bir başka gerçekçi olasılık da, epitelyal kök hücre yuvası içeren kemirgen kesicilerinin kullanımıdır (128). Ancak, endojen dental epitelyal kök hücre kaynakları nadir de olsa, cazip bir alternatif olarak otojen ipk hücrelerden in vitro tam olarak farklılaşarak elde edilebilirler. Bu basamak tamamlandığında, kollajen şablon matrise rekombinasyon sürecinin kalanı in vitro organ kültürü ve in vivo nakil işlemi aşırı bir teknik zorluk çıkarmayacaktır. Sonuç, ayrışmış otojenik EMKH lerden ve diş sürmesinden sonra neredeyse tamamen kaybolacak olan ipk hücrelerinden elde edilmiş, tamamen gelişmiş biyotasarımlı insan dişi olacaktır. 27
Dahası, tam organ restorasyonu tedavileri kapsamında dişleri ipk hücrelerini test etmek için uygun bir sistem olarak kabul eden pek çok görüş vardır. i. Öncelikle, epitelyal (ipk kökenli) ve ektomezenşimal (endojen) otojen veya allojen hücre rekombinasyonlarıyla diş gelişimi iki haftaya kadar olan erken dönemde in vitro olarak gözlemlenebilir ve takip edilebilir, dolayısıyla nakil öncesi en uygun veya iyi görünümlü biyotasarımlı dişin seçilmesine izin verir. ii. İkinci olarak, diş mühendisliği kapsamında ipk hücrelerine çoğunlukla dental epitelyal hücre ve sonrasında mine üreten ameloblast kaynağı olarak ihtiyaç duyulmaktadır. Bu epitelyal hücre türevleri sadece geçici olarak mevcut olup MEAH ler hariç diş sürmesi gerçekleştikten sonra ortadan kaybolacaklardır. Dolayısıyla, ipkh lerin indüklediği tümör oluşumu riski dental sistemle goldukça azaltılmış olacaktır. iii. Üçüncü olarak, dental hücre ve dokulardan otojenk ipk hücreleri üretmek mümkün olacaktır böylece immün red olasılığı azalacaktır. iv. Dördüncü olarak, biyolojik dişlerin uzun dönemli sonuçları rutin dental ve periyodik kontrollerde sadece gözle muayene yolu ile takip edilebilecektir. v. Son olarak, kök hücre veya ipk hücre kullanımıyla tümör oluşturucu veya başka komplikasyonların çoğalması durumunda, dişin çekimi non-invaziv olarak ve hastaya hayati tehlike yaratmadan, göreceli olarak basit bir şekilde gerçekleştirilebilecektir. Şu an gelecekte ipkh teknolojisinin hücre tedavisi yoluyla insan hastalıklarını tedavi edeceğini öngörmek için imkânımız olmasa da yakın zamanda keşfedilen olgun hücrelerin yeniden programlanma süreci araştırma dünyasının ilgisini çekmeye devam etmektedir. Şüphesiz güvenli, tümör oluşturmayan ipk hücre dizilerinin 28
geliştirilmesi çok büyük başarı getirecektir (129,130). Dişlerin ipk hücrelerinin birbiriyle koordinasyon sağlayıp iletişimde olması gereken farklı soylara ait (ipk ve konak) multipl hücrelerle doku rejenerasyonu amacıyla uygulanmasında önemli bir test sahası olup olmadığını zaman gösterecektir. 11. HASTALIĞA ÖZGÜ İPKH LERİN GENETİK ORODENTAL HASTALIK VE BOZUKLUKLARDAKİ TEDAVİ POTANSİYELİ Genetik kökenli hastalıklar ipkh teknolojisinden en çok yararlanabilecek hastalıklardandır. Güncel kök hücre tedavisinin asıl odaklarından biri, kalıcı bir çözüm sağlayabilecek olan genetik düzeltmedir. Örneğin, altta yatan genetik defekti düzelterek bu hastalıkları tedavi yeteneği olan ipkh ler, orak hücreli anemili fare modellerinde başarıyla gösterilmiştir (131). Bozuk gen homolog rekombinasyonla yabani tip β-globin ile yer değiştirmiştir. Şaşırtıcı olarak, genetik olarak düzeltilmiş ipkh kökenli hematopoetik progenitör, hasta hayvanın fizyolojik fonksiyonlarını geliştirmede ve tamirde etkili olmuştur. Bu ilkenin kanıtı aynı zamanda yaygın genetik değişikliklerle karakterize bir hastalık olan fanconi anemili insan bireylerinde de tanımlanmıştır (132). Bundan dolayı bu yaklaşım insan vücudunun temelinde yatan her genetik hastalığa uygulanabilir. Güncel çalışmalar aynı zamanda insan endoderm doku kökenli ipkh dizileri geliştirme olasılığını göstermektedir. Bu, saptanan diğer insan ipkh dizileriyle birlikte, hücresel yeniden programlamanın mekanizmasının izahında ve farklı kökenli insan ipkh lerinde verimliliğin olduğu kadar güvenliğin de incelenmesinde bir temel oluşturmaktadır (58). IPKH teknolojisi kullanılarak karaciğer patogenezinin incelenmesi, karaciğer hastalığına özgü hücre dizilerinin yaratılmasında daha makul bir sistem sunmuştur. Bu tip 29