attomol bacterial respiratory panel- DNA-LINA II Swab numunelerinde Bordetella pertussis-, Bordetella parapertussis-, Mycoplasma pneumoniaeve Legionella pneumophila-dna nın tespitine yönelik test Sadece araştırma kullanımı içindir! 20 tespit sipariş numarası: 1121 1.Giriş Boğmaca, bronşit, farenjit veya bronşiyolit gibi solunum yolu enfeksiyonlarının en sık komplikasyonu ölüme neden olan zatürreedir. Hastalığa Bordetella pertussis, Bordetella parapertussis, Legionella pneumophila ve Mycoplasma pneumoniae gibi solunum patojenli enfeksiyonlar neden olur. Bordetella pertussis daha az sık görülür ve boğmacanın daha hafif formunda meydana gelir, bu nedenle boğmacaya neden olur (Locht, 1999, Internatl Microbiol, 2:137-144). Hastalığın en önemli klinik özelliği güçlü enspirasyon ile oluşan şiddetli öksürüktür. Boğmaca, çocuklarda en sık görülen hastalıklardan biri olarak dünya da yılda 600,000 ölüme neden olmaktadır. Boğmacanın ölüm oranı bebeklerde % 5 civarındadır ve yaşla birlikte azalır. Legionella pneumophila farklı klinik devreleri iki farklı hastalığın nedenidir. Bir grip-gibi akciğere bulaşmadan oluşan Pontiac ateş en fazla bir hafta içinde iyileşir. Lejyonerin hastalığı, legionellosis in diğer klinik formu olan baş ağrısı, zihinsel karmaşa, göğüs ağrısı ve kuru öksürük ile akut yüksek ateşli atipik zatürreyi ifade eder. Hastalık, tüm vakaların % 25-50 sinde ishal ile ve % 20-60 sinde ise hidrotoraks ile görülür. İçme su kirliliği yanında diğer risk faktörleri de Legionella pnömoni oluşumunda bir rol oynamaktadır. Bu risk faktörleri kronik hastalıklar, immunsüpresyon, sigara, alkol ve yaşa bağlıdır. (Ruef et al.,1997, Swiss-NOSO 4(2):9-12). Mycoplasma pneumoniae farenjit, tracheobronchitits ve pnömoni oluşumuna neden olabilen solunum yolunun iyi bilenen patojenidir. Mycoplasma pneumoniae enfeksiyonlu zatüree % 15-20 oranında çocuk ve yetişkinlerde görülür. Bunların çoğunluğu hafif durumlar olabilir, ancak aynı zamanda ölümcül zatürreye de neden olabilir. Her iki patojenin rolü astım oluşumunda da tartışılmıştır(honda et al., 2000, Journal of Clinical Microbiology, 38:1382-1384, Johnston et al., 2005, Am J Respir Crit Care Med, 172:1078-1089).
Hızlı ve güvenilir bir tanı tedaviye başlamak ve solunum yolu hastalıklardan enfeksiyonu ayırt etmek için gereklidir. Bu amaçla, moleküler tanı yöntemleri serolojik test sistemlerine ek olarak son yıllarda kurulmuştur(grimprel et al., 1993, J Clin Microbiol 31:2745-2750). Test endikasyonu: Şüpheli bakteriyel zatüree ve öksürük halinde swab numunelerinde (faringeal ve rhinopharyngeal yolu) insan patojeni B. pertussis, B. parapertussis, M. Pneumoniae ve L. pneumophila'in direk patojen tespiti. Kullanıma hazır test kiti kullanımı için endikasyon spesifik hedef dizileri ile listelenen bakteriyi ayırt etmek için ve tespit etmek içindir: B. pertussis (IS481 hedef dizi), B. parapertussis (hedef dizi IS1001), M. pneumoniae (hedef dizi ATPaz operon gen) ve L. pneumophila (hedef dizi 16S ribosomal RNA). B. pertussis yanında, test kiti B. holmesii DNA yı da tespit eder çünkü B. holmesii in bütün izolitleri bakteri ekleme dizisi IS481 in bazı kopyalarını içerene kadar analiz edilir. Avrupa'da patojonik olmayan B. holmesii in belirtileri düşük olduğundan dolayı, bu hedef dizinin kullanımı kabul edilebilir (Reischl, U., October 2005, evaluation of INSTANDproficiency test bacterial genome detection PCR/NAT). 2. Genel Açıklamalar Belirtilen saklama sıcaklığında her kit bileşenini tutun. Plastik çantayı açmadan önce oda sıcaklığına adapte olması için test şeritlerine izin verin. Parmaklarla test şeritlerine dokunmayın, bir pens kullanın. Bir bıçak veya neşter kullanarak bloktan şeritleri kesin Bu kit sadece in vitro diagnostik uygulamalar için kullanılmalıdır. Bu kiti son kullanma tarihinden sonra kullanmayınız. Özetle kullanmadan önce sıvıların küçük miktarlarını içeren tüm tüpleri santrifüjleyin Ilımlı ısıtma ile 5 kez yıkanan solüsyon da çökeltileri çözün Test çalışması için iyi eğitimli personel ve uygun laboratuar ekipman hususuna dikkat edin Test uygulamasının tüm adımlarında steril filtre uçlarını kullanın ve eldiven giyin Hasta numuneleri, potansiyel enfeksiyonlu madde olarak dikkate alınmalı ve mevcut yasalara göre hareket edilmelidir. PCR* a yönelik reaktifleri, DNA numuneleri ile amplifikasyon ürünlerinden ayrı saklayın. PCR reaksiyonları ile amplife edilmiş numuneleri pipetlerken farklı filtre uçlu pipet setleri kullanın.
Hibridizasyon solüsyon(# 127) kullanırken dikkatli olun. Bu solüsyon aşağıdaki R ve S- sınıflandırmaya bağlı olan formamit içerir: R61, S53-24/25-37-45 (yeni: H- ve P- sınıflandırma: H360, P201, P202, P281, P308+P313, P405, P501). 3. Dahil olan malzemeler Sipariş numarası Reaktif Hacim/ Miktar Saklama Isısı 38 deiyonize PCR-H 2 O 0.2 ml -20 C 118 PCR buffer E 0.7 ml -20 C 219 BRP primer Bir 8.5 μl internal standart solüsyonlu 2 tüp. Primer mix hazırlamak için 300 μl PCR buffer E (# 118) ile her birini doldurun. 220 İnternal standartı BRP (mor renkli tüpler) 125 Denatürasyon solüsyonu Bir 8.5 μl internal standart solüsyonlu 2 tüp. 300 μl primer mix ile her birini doldurun. -20 C -20 C 0.75 ml 4 C 234 BRP* II test strip 20 strip 4 C 127 Hibridizasyon solüsyonu (2 x konsantre) 211 Yıkama solüsyonu D** (5 x konsantre) 212 Konjuge buffer (kullanıma hazır) 214 Konjuge C** (500 x konsantre) 14 ml 4 C 24 ml (2 x 12 ml) 4 C 14 ml 4 C 40 μl 4 C 75 Substrate 12 ml 4 C *BRP:bakteriyel solunum paneli **Terim yıkama solüsyonu ve konjugata bu manuelde yukarıdaki tabloda açıklanan ürüne bakınız. a dahil olan üreticiden sipariş edilebilir yada defalarca kullanılabilir(# 124). Kitteki tüm reaktiflerin miyadı, kutunun dış yüzeyinde bulunan esas etikette bulunmaktadır 4. İlave Reaktifler ve Dahil olmayan malzemeler Qiagen dan uygun DNA kitleri kullanılarak hazırlanan hastaların swablarından (faringeal-veya rhinopharyngeal yolu) alınan hastaların DNA numuneleri
Qiagen tarafından sağlanan HotStarTaq DNA Polimeraz Kontrol template (B. pertussis, B. parapertussis, M. pneumoniae ve L. Pneumophila pozitif DNA hazırlama) Eppendorf-tüpler (0.2 ml; 1.5 ml) Mikropipetler (hacim aralığı 0.5-1000 μl) ve steril filtre uçları Thermocycler Thermoshaker Pens, beher, Falcon tüpler, distile su 5. Test Prensibi, Test sonuçlarının yorumlanması DNA LINA, saflaştırılan DNA numunenin PCR amplifikasyonuyla ve aynı reaksiyon karışımının içindeki DNA iç standartlıyla başlar. Amplifiye olan DNA nın tespiti sonraki etiketleme reaksiyonu ile test şerit yüzeyinde sonda hareketsiz tutulmasıyla ters hibridizasyon aracılığında yapılır. Test şeritlerinin değerlendirilmesi (Şekil 2): Eğer hastanın numunesi B. pertussis-dna içerirse, B. Pertussis için patojen-spesifik bantları test şeridinde görünür (strip No.6). B. parapertussis-dna içerirse, B. parapertussis için patojenspesifik bant görülür (strip No.3). M. pneumonia pozitif numunede, spesifik bir M. pneumoniabant oluşur (strip No. 4), ve eğer numune L. pneumophila-dna içerirse, L. pneumophila için test şeridi üzerinde patojen-spesifik bant görülür(strip No. 5). Tüm şeritler üzerinde ek bir bant olarak bir kontrol bandı görebilirsiniz (amplifikasyon kontrol olarak internal standart). İnternal standart bant tüm örnekler ve kontrollerde renkli olmalıdır. Ancak, patojen-pozitif numunelerde, kontrol bandında koyulaşan ya da daha düşük sonuçlanan iç standardın DNA amplifikasyonu kısmen veya tamamen yarışabilen bir şekilde inhibe olabilir(strips No. 1 ve 6). Bu durumda sadece kuvvetlice koyulaşan patojen-özel bant görünür. Tek başına bir diagnostik metodun sonuçlarından klinik tanıya gidilmemelidir. Doktor mevcut tüm laboratuar ve klinik sonuçları dikkate almalıdır. Özellikle, sınırlı test sonuçlarıyla ciddi bulaşıcı hastalıklardan dertli olan hastalar için numuneler diğer metotlarla ya da bu test tahlillerle defalarca analiz edilmelidir.
Şekil 1: bütün patojenik spesifik bantlar ve internal standart bantlar ile tespitinden sonra test şeridi (pozitif Kontrol) Şekil 2: Test şerit değerlendirme örneği 6. Manuel Test protokolü için gerekli iki adım: (6,1) patojen DNA amplifikasyonu ve (6.2) test şeritleri için amplifiye olan DNA nın ters hibridizasyonudur. Hastaların numunelerine ek olarak PCR reaksiyonlarını kontrol etmek için aşağıdaki kontrolleri eklemeniz önerilir:
1. Negatif kontrol (PCR-blank) 2. Pozitif kontrol (B. pertussis, B. parapertussis, M. pneumoniae ve L. pneumophila pozitif kontrol template) Kontrol template ayrı olarak üreticisinden de sipariş edilebilir (#222, B. pertussis, B. parapertussis, C. pneumoniae M. Pneumoniae ve L. pneumophila için pozitif). 6.1 Amplifikasyon Hastaların swablarından DNA hazırlama (pharyngeal- and rhinopharyngeal tract) Primer karışımı hazırlama: kısaca primer solüsyonu içeren renksiz reaksiyon tüpleri santrifüjleyin (#219) ve 300 μl PCR buffer E ile her bir tüpü doldurun(#118). Primer mix. hazırlamak için pipet kullanarak uygun şekilde karıştırın Premix hazırlama: kısaca internal standart solüsyonu içeren mor reaksiyon tüpleri santrifüjleyin (#220) ve 300 μl primer karışımıyla her tüpü doldurun. Primer mix. hazırlamak için pipet kullanarak uygun şekilde karıştırın Dikkat: 300 μl den daha az PCR premixe ihtiyacınız varsa geri kalanı -20 C de saklayabilirsiniz. PCR premix e hot start Taq DNA polimeraz ilavesiyle PCR mix hazırlama Bir reaksiyon için kullanılacak toplam PCR premixin miktarını hesaplamak için her bir numune ve kontrol sayıları ile premix miktarı (25 μl) çarpılmalıdır ve bir miktar fazla hacim eklenmelidir (5 reaksiyon için örnek: 5 x 25 μl + 15 μl fazladan hacim = 140 μl PCR premix). Daha sonra, hot start Taq DNA polimeraz (5 U / μl) premix içine son dilüsyon 1:100 olacak şekilde ilave edilmelidir. (örneğin: 140 μl PCR premix + 1,4 μl 5 U / μl polimeraz). Şimdi, PCR mix iyice karıştırılmalıdır. PCR mixi 0.2 ml lik tüplerde eşit hacimlere ayırma: Negatif kontrol: Pozitif Kontrol: Hasta numuneleri: 25 μl PCR mix 25 μl PCR mix 25 μl PCR mix + 10 μl PCR-H2O + 10 μl kontrol template + 10 μl DNA PCR termocyclerde aşağıda listelenen sıcaklık rejimi kullanılarak yapılmaktadır: İlk aktivasyon:15 dakika 95 C 45 döngü: 35 s 95 C 35 s 95 C 30 s 57 C 45 s 72 C Durdurma: 4 C zaman sınırı yok
Dikkat: a)bu testin PCR premixi dutpi içerir, bundan dolayı urasil-dna glycosylase (UDG)- temizlemesi, 8 mu/μl reaksiyonu karışımının tavsiye edilen UDG enzim konsantrasyonu kullanılarak yapılabilir. Bu durumda iki başlangıç inkübasyon adımları 10 min için 37 C'de, (UDG-reaksiyon) ve ondan sonra 10 min için 95 C'de (UDG de inactivati), PCR-sıcaklık profiline eklenmelidir. b) Amplificatelerin tespiti hemen her zaman tavsiye edilen PCR inkübasyonundan sonra PCR tepkileri için UDG ile ele alınmalıdır. Ayrıca UDG'in kalan aktivitesi PCR ürünlerinin bozulmasına ve amplifikasyon ürünlerinin tespitinin imkansız olmasına neden olur. PCR sonrası hemen PCR ürünlerinin tespiti (UDG işlemi olmadan!) bir istisna olmamalıdır. Bu durumda amplifikatler -20 C'de saklanmalıdır. 6.2 Test şeritleri için reverse hibridizasyon tarafından amplifikasyon ürünleri tespit etme Aşağıda listelenen indüksiyon adımları için reaktiflerin miktarları, başlayıcı kit ile sağlanan indüksiyon larının türü için geçerlidir. Diğer indüksiyon ları kullanılırsa, reaktif miktarı ona göre adapte edilmelidir. Bu durumda üretici firmadan toptan eşya gibi ek reaktifler sipariş etmek mümkündür. Protokol adımları 1.2xhibridizasyon solüsyonun 1:2 seyreltilmesi 2. 5xyıkama solüsyonun 1:2 seyreltilmesi İhtiyaç duyulan solüsyonlar ve bileşenler Reaksiyon ampül Sıcaklık Zaman Aletler 14ml 2xhibridizasyon solüsyonu + 14ml distile su=28 ml kullanıma hazır 1xhibridizasyon solüsyonu (4 C de saklayın,4 ay sonra kullanım süresi dolar) Her test şeriti 1 ml 1xhibridizasyon solüsyonuyla inkübe edilmelidir. 12 ml 5xyıkama solüsyonu + 48ml distile su=60 ml kullanıma hazır 1xyıkama solüsyonu (4 C de saklayın,4 ay sonra kullanım süresi dolar) Her test şeriti için 4.5 ml 1xyıkama solüsyonunun toplam miktarına ihtiyaç vardır. 3. Solüsyonun RT dengesi 1xhibridizasyon solüsyonu 1 kullanıma hazır (line 1 bak ) 1xyıkama solüsyonu kullanıma hazır (line 2 bak ) konjugat buffer kullanıma hazır Falcon tüpü gibi RT
4.Amplifikasyon ürününün denatürasyonu 5.hibridizasyon 30 μl amplifikasyon ürünü + 30 μl denatürasyon solüsyonu 6. Hibridizasyon solüsyonu başka bir yere boşaltın 7.Yıkama adımaları (iki Her şerit için 1 ml 1xyıkama kez) solüsyonu(rt)ekleyin, inkübe edin ve sonra tekrar yıkama döngüsünden önce yıkama solüsyonu başka yere boşaltın 8.Konjugat dilusyonu Konjugat buffer da 1:500 (RT) (5 şerit için örnek: 5.4 μl konjugat + 2.7 ml konjugat buffer [RT]) 9. Konjugat Her şerit için 500 μl inkübasyonu konjugat dilusyonu ekleyin 10. Konjugat dilusyonunu başka bir yere boşaltın 11. Yıkama Her şerit için 1 ml adımaları (iki 1xyıkama kez) solüsyonu(rt)ekleyin, inkübe edin ve sonra tekrar yıkama döngüsünden önce yıkama solüsyonu başka yere boşaltın Falcon tüp yada küçük beher 12. Substrat Her şerit için 500 μl reaksiyonu substrat ekleyin 13. Substrat başka bir yere boşaltın 14. Stop substrat Şeritler için 1 ml reaksiyonu distile su ekleyin 15. Test şeritlerini kurutun(ışıktan koruyun) ve test sonuçlarını yorumlayın 42 C 5 dak. Termo Çalkalayıcı (0 rpm) 42 C 60 dak. Termo Çalkalayıcı 42 C 2x6 dak. Termo Çalkalayıcı RT RT 20 dak. Çalkalayıcı RT 2 x 1 dak. Çalkalayıcı RT 20 dak. Çalkalayıcı RT 5 dak. Çalkalayıcı İlk kez her test kiti kullanmadan önce, sadece bir kez gerçekleşmesi için istenen protokol adımları gri ile vurgulanmıştır. RT = oda sıcaklığı *) Eğer 3x konsantre yıkama solüsyonunda çökelti oluşmuşsa hafif ısıtma ile seyreltmeden önce çözün. (30-50 C, su banyosu için). Test uygulaması sırasında sorunlar ile ilgili olarak üretici veya distribütör firmayla bağlantı kurmakta tereddüt etmeyin.
EK 1 Kit etiketlerinde kullanılan sembollere genel bakış Sembollerin açıklaması Üretici Lot numarası Son kullanma tarihi 2 C ve 6 C arasında saklayın Max. -20 C de saklayın Katalog numarası In vitro diagnostik medikal ürünler <n> tespiti için yeterli içerik Kullanım talimatına bakınız