KULLANIM AMACI ELEGANCE Neonatal IRT ELISA, neonatal spot insan kanından immunreaktif tripsinojenin (IRT) değerini in vitro diyagnostik kantitatif ölçümlerde kullanılmak için üretilmiştir ELEGANCE ELİZA PRENSİBİ ELEGANCE ELİZA enzim bağlı bir immuno testtir. İlk olarak IRT spot kandan alınır ve aynı zamanda da IRT bağlı anti IRT antikoru kuyucuğa alınır.numune antijeni, arasına, antikor mikro kuyucuğa bağlı antikor ve biotinlenmiş antikor reaktifi arasında sandviç haline gelir.kuyucuklar, bağlanmayan materyaller için yıkanır. Streptavidin peroksidaz (Amplifikasyon reaktifi)eklenir ve çok yerde biotinlenmiş antikora bağlanır. Yıkamadan sonra, substrat solüsyonu her bağlı peroksidazla, numunedeki antijen miktarına doğru orantılı olarak, renk oluşturmak için reaksiyona girer. Oluşan kalibrasyon eğrisinden konsantrasyon hesaplanır ELEGANCE SAĞLANAN REAKTİFLER, STABİLİTE VE SAKLAMA Kit ambalajı - 480 test ve 2400 test (parantez içinde). Kit ve tüm bileşenleri, açılmış ya da açılmamış olarak, miadı bitene kadar 2-8 C de saklanmalıdır.. Neonatal IRT: Kaplı kuyucuklar 1 x 96 kuyucuk Kat # ITA96 5 x 96 kuyucuk Kat # ITA5 (25 x 96 kuyucuk Kat # ITA25) Anti IRT antikoru kaplı kuyucuklar kullanıma hazırdır. Neonatal IRT: Antikor Reaktifi 1 şişe Kat # ITB480 (1 şişe Kat # ITB25) 50 (250) ml biotinlenmiş anti-irt antikoru bovin serum albümini içeren bufer solüsyonu içinde, non-immun hayvan numunesi ve mavi boya. Sodyum azid, 0.2% w/v ve tiomersal, 0.01% w/v içerir. Kullanıma hazırdır. Neonatal IRT: Amplifikasyon Reaktifi 1 şişe Kat # ITP480 (1 vial Kat # ITP25) BSA ve leylak rengi boya içeren bufer solüsyonunun içinde 50 (250) ml streptavidin-peroksidaz (streptavidin from S. avidinii). Bronidox L, 0.2% v/v ve tiomersal, 0.02% w/v içerir. Kullanıma hazırdır.. Yıkama Konsantresi 1 şişe Kat # EWC5 (2 şişe Kat # EWC25) 250 (500) ml 15 x konsantre yıkama solüsyonu. Tiomersal, 0.15% w/v içerir. Kullanılmadan önce dilüe edilmelidir. Substrat Solüsyonu TMB N 1 şişe Kat # TMBB5 (1 şişe Kat # TMBB25) 50 (250) ml stabilizasyon solüsyonunun içinde 3,3,5,5 - tetramethylbenzidine ve hidrojen peroksidaz. Kullanıma hazırdır. Stop Solüsyonu 1 şişe Kat # ESCL5 (1 şişe Kat # ESCL25) 30 (124) ml 2M HCl kullanıma hazırdır. Neonatal IRT: Kalibratörleri 6 şişe Kat # EITS7 Her biri 0.5 ml, bufer solüsyon içinde BSA ve sarı boya içerir.sodyum azid, 0.2% w/v ve thiomersal, 0.01% w/v. İçerir liofilizedir. KULLANICILAR İÇİN ÖNLEMLER VE UYARILAR Numunelerin ve kitlerin, kullanımlarının, saklanmasının ve berteraf edilmesinin yolu bölgesel ya da ulusal güvenlik prosedürlerine göre olmalıdır. Numuneler ve Kalibratörler Kan spotları hepatit C, hepatit B, HIV -1/2 (AIDS) e karşı test edildi ve güvenilir bir metotla da sonucun negatif olduğu ispatlandı. Yine de tüm numunelere, bulaşıcı hastalık bulaşabilme potansiyeline sahipmiş gibi davranılması önerilir.
Koruyucular Kit koruyucu olarak, sodyum azid, tiomersal ve Bronidox L içerir.reaktifler toksik koruyucular içerdiğinden, solumaktan, yutmaktan ve deri ile temasından kaçının. Sodyum azid, potansiyel patlayıcı oluşturmak için kurşun ve bakır ile reaksiyona girebilir. Substrat Solüsyonu ve Stop Solüsyonu Deri ile temasından sakınınız NUMUNE TOPLAMA VE SAKLAMA ELEGANCE Neonatal IRT ELİZA kitini kullanım amacı bebeklerin topuğundan filtre kağıdına kan alıp, NCCLS LA4A rehberine göre kurutup IRT çalışmaktır.filtre kağıdı, Schleicher ve Schuell Grade 903 olmalıdır, böylece numuneler in kağıdı da kontroller ve kalibratörlerle aynı özellikte olur.neonatal topuk kanı doğumdan 3-5 gün sonra alınır. Bir kan içeren filtre kağıdı bebeğin topuğundan alınıp, filtre kağıdına damlatılarak elde edilir.filtre kağıdı numune alanı tam olarak kan ile doldurulmalıdır. Test numunelerinin alınmasından sonra, filtre kağıtları kurutulmak üzere( 2 ya da daha fazla saat) yatay bir şekilde bırakılır. Kuruyan numuneler 2-8 C de saklanabilir. Sadece filtre kağıdına emdirilmiş kanlar yukarıdaki amaç için test edilir.kullanılmayan filtre kağıtları oda sıcaklığında tutulmalıdır. (20-25 C). GEREKLİ OLAN AMA SAĞLANMAYAN MATERYALLER VE EKİPMANLAR * Distile su veya deiyonize su * Disk zımbası (3mm) * pens * Çoklu pipet * 1L lik mezür * Emici doku (pamuksuz) * Saat * Mikrotitre pleyt çalkalayıcı * Mikrotitre pleyt yıkayıcı * Mikropleyt okuyucu. PROSEDÜR NOTLARI Tüm reaktifleri oda ısısına( 20-25 C)getiriniz ve kullanmadan önce karıştırınız.çift çalışma önerilir.kontaminasyon testin performansının düşmesine sebep olur.kalibrasyon eğrisi her çalışmadan önce çizilmelidir. İlk yıkamadan sonra, diskler alınmalıdır.tüm test basamakları eksiksiz yapılmalıdır, eğer kuyucuklar amplifikasyon reaktifiyle doldurulmazsa ya da subtrat solüsyonu yıkamadan hemen sonra koyulmazsa, amplifikasyon reaktifi için 30 dk, substrat için 30dk emici biz havlunun üzerine, kuyucuklar ters çevrilerek bırakılabilir. Kit kutusunun içindeki reaktifler bu kutuya özel lota sahiptir, diğer kutularla karışık kullanılmamalıdır. Fotometre ve tüm pipetler kullanılmadan önce kalibre edilmelidir. Yıkama Etkili yıkama Presizyon için çok gereklidir.kuyucuklar otomatik yıkayıcı kullanarak yıkanır. Bir kuyucuktan diğerine taşmasından sakınınız. Kalite kontrol Kontrol numuneleri çalışmayı doğrulamak için her seferinde çalışılmalıdır.test sonuçları onaylanmadan önce sınırların içinde bulunduğu görülmelidir. TEST PROSEDÜRÜ Reaktiflerin Hazırlanmasıa Yıkama solüsyonu Yıkama konsantresini 1/ 15 oranında dilüe ediniz. Yıkama solüsyonu oda sıcaklığında (20-25 C) 12 hafta stabil kalır. Kalibratörler Liofilize kalibratörleri, şişelerin üzerinde belirtilen miktar kadar deiyonize su ile çözünüz. Sulandırılan kalibratörleri bir yere çözülmeye bırakın(en az 30 dk) ve sonra yavaşça çalkalayınız. Tam konsantrasyonlar lottan lota değişir kitin içindeki etikette belirtilmiştir.kit çözüldükten sonra kalibratörler -20 C de 8hafta saklanabilir. Nemlenmesinden sakının,paketi oda ısısına gelmeden açmayınız.kullanılmamış kontrol ve kalibratör kağıtlarını paketleyip tekrar plastik kutusunun içine 2-8 C de saklanmak üzere bırakınız.
Protokol 1. Test için gerekli olan kuyucukları çerçeve içine yerleştiriniz. Kullanılmayan kuyucukları çantaya koyup 2-8 C de saklayınız.. 2. Uygun kuyucukların için 3 mm lik disklerini (kalibratör, kontrol, numune) çift çalışılacak şekilde bırakınız.numune kağıtlarını delerken kenardan alınmamasına özen gösteriniz. 3. 15 µl her birinden (kalibratör, kontrol) çift olarak kuyucuklara pipetleyiniz. Numuneleme süresi 20 dakikayı geçmemelidir. 4. 100 µl Neonatal IRT Antikor Reaktifi (mavi) kuyucuklara pipetleyiniz. 5. Üzerini kapatınız ve çalkalayıcı üzerinde 10 dakika oda sıcaklığında (20-25 C) inkübe ediniz. 6. Kuyucukları bir gece (16-24 saat) çalkalamadan, oda sıcaklığında inkübe ediniz. (20-25 C). 7. Ertesi gün 10 dakika karıştırıcı üzerinde ve oda sıcaklığında (20-25 C)10 dakika daha inkübe ediniz.. 8. İnkübasyondan sonra diskleri çıkarınız. 9. Kuyucukları çıkarınız,250 µl yıkama solüsyonu ile her kuyucuğu 4 defa yıkayınız.son yıkamadan sonra, emici bir bezin üzerine pleyti ters çeviriniz, kuyucularda hiç yıkama solüsyonu kalmamasına dikkat ediniz.kuyucuklarda hiçbir hava kabarcığı olmamasına dikkat ediniz. 10. Her kuyucuğa, 100 µl Neonatal IRT Amplifikasyon reaktifi (leylak rengi) eklenir. 11. Üzerini kapatınız ve çalkalayıcı üzerinde 10 dakika oda sıcaklığında (20-25 C) inkübe ediniz. 12. İnkübasyondan sonra, yıkama adımını tekrar ediniz. 13. Her kuyucuğa 100µL Substrat Solüsyonu ekleyiniz. İnkübasyon adımını substrat eklediğiniz ilk kuyucuğa göre yapınız. 14. Üzerini kapatınız ve çalkalayıcı üzerinde 10 dakika oda sıcaklığında (20-25 C) inkübe ediniz 15. 50 µl Stop Solüsyonunun tüm kuyucuklara, substrat eklediğiniz ilk kuyucuktan başlayarak ilave ediniz. 16. Son nokta okumayı 450 nm de eliza okuyucunun kullanım kılavuzunda tarif edildiği gibi yapınız.bu okuma adımı stop reaktifi eklendikten sonraki 30 dakika içinde yapılmalıdır SONUÇLARIN HESAPLANMASI Hesaplamalar, otomatik data hesaplayıcı yoksa manuel olarak hesaplanır. Her kuyucuğun OD si tespit edilir.log-log grafik kağıdı kullanılarak kalibratör konsantrasyonlarıyla birlikte x ekseni OD lerden y ekseni oluşturularak grafik çizilir.eğri noktadan noktaya ya da, eğri oluşturma modellerinde birisi (örneğin: spline interpolasyonu )kullanılabilir. Numunelerin konsantrasyonları, OD değerleri eğriye girilerek bulunur. Her numunenin değeri µg/l tam kan IRT olarak raporlanır.elegance Neonatal IRT tam kanda 0 -. 400µg/L aralığında okunur.ama maksimum konsantrasyon kullanılan okuyucunun performans karakterine bağlı olarak rapor edilir. Eğer en yüksek kalibratörün OD değeri fotometre OD değerini aşıyorsa bu kalibratör değeri kalibrasyon eğrisinden çıkarılır. Benzer olarak, numune OD fotometrenin okuyabileceği OD değerini aşıyorsa, sonuç en yüksek kalibratörden büyüktür diye raporlanır. MODEL HESAPLAMALARI Son Nokta Data ID Ort OD IRT (µg/l W.B) 0 0.057 19.1 0.695 38.3 1.202 93.9 2.060 203 2.953 423 3.393 Numune 1 0.598 15.9 Numune 2 1.329 44.3 Numune 3 0.985 29.4 KALİBRASYON Bu kit ile sağlanan kalibratörler, protein ölçümü esasına göre kalibre edilir ve tam kanda µg/l olarak ifade edilir. Filtre kağıdındaki, 3 mm kan 3 µl olup 55% (v/v) hematokrit değerine denk geldiği farz edilir. Çevirim faktörü: µg/l serum = µg/l tam kan x 2.2
BEKLENEN DEĞERLER ELEGANCE Her laboratuar ilgili numune popülasyonuna göre kendi referans değerini oluşturmalıdır. Tipik olarak, 3-5 günlük bebeklerde tam kanda cut-off değeri 50 µg/l dir. Pozitif cut off dan düşük olan değerler normal kabul edilir. Etkilenmeyen bebeklerde, tripsinojen konsantrasyonu normal olarak dağılmadığı bulundu, bu logaritmik transformasyon ile normal dağılıma çevrilebilir. PERFORMANS KARAKTERLERİ Intra-test Presizyon Numune n Ortalama ± 2SD %CV (µg/l tam kan) 1 20 33.1 ± 1.8 2.8 2 20 58.0 ± 5.7 4.9 3 20 14.9 ± 2.4 7.9 Inter-test Presizyon Numene n * Ortalama ± 2SD %CV (µg/l tam kan) 1 66 28.0 ± 2.8 7.0 2 66 56.4 ± 6.2 6.3 3 66 15.8 ± 3.5 3.7 * çift tekrarlı Özgüllüğü Maddeler Konsantrasyon Görünen IRT Çapraz reaksiyonlar (µg/l W.B) İnsan α 2 -Makroglobulin 50 mg/ml <1* N.D α 1-Antitripsin 3 mg/ml <1* N.D α-chymotrypsin A 780 ng/ml <1* N.D Bovin Trisinojen 500 ng/ml <1* N.D Kesinlik İyileşme test çalışılmadan önce ve eksogenus madde eklendikten hesaplanıldı. Numune Gözlemlenen IRT Beklenen IRT % Sapma (µg/l W.B) (µg/l W.B) 1 95.3 94.7 100.6 2 154.0 153.0 100.7 3 259.7 226.0 114.9 Bir numune sıfıra kadar dilüe edildi Numune Gözlemlenen IRT Beklenen IRT % Sapma (µg/l W.B) (µg/l W.B) Direk 196.7 1/2 98.0 98.4 99.6 1/4 49.7 49.2 101.0 1/8 24.5 24.6 99.6 Yüksek doz- Hook Etkisi Hook etkisi görülmez, testin karakterinde,irt test limitinin tam kanda 80000 µg/l e kadar olduğu görüldü. Hassasiyet Hassasiyet, üç farklı testte 20 replikasyon ile sıfır kalibratörün ortalama doz cevabı belirlenmesinden bulunan OD ile 2 SD doz cevabının belirlenmesi ile ilgili analitin konsantrasyonu olarak tanımlanmıştır..
SİPARİŞ BİLGİSİ ELEGANCE NEONATAL IRT ELISA Bioclone Australia Pty Limited tarafından üretilir. 71-73 Railway Parade, Marrickville NSW 2204, AVUSTURALYA Telefon +61 (0) 2 9517 1966 ücretsiz arama hattı 1800 251 138 Fax +61 (0) 2 9517 2990 Email Web sales@bioclone.com.au www.bioclone.com.au TEKNİK SERVİS Tam teknik servise Bioclone on +61 (0) 2 9517 1966 ya da ücretsiz arama hattından 1800 251 138 ulaşabilirsiniz. GARANTİ Üretici, diyagnostik kitin, kullanım prosedürü dışındaki kullanımlar için hiçbir garanti vermez. Diyagnostik kitin amacı dışındaki kullanımlarda, kullanıcı kendi riskini kendisi alır. Üretici, kitin amacı dışında kullanıldığı durumunda da tüm ticari garantiyi reddeder.kitin kullanımında direktiflere göre çalışıldığında oluşan her türlü başarısızlık durumunda kit değişimi sınırlıdır. Bioclone Australia Pty Limited ve onun distribütörleri kitin değişimini ya da alınan kitin para iadesini sınırlandırır. Bioclone Australia Pty Limited, malın zarar görmesinden, üründen kaynaklanan kişisel kaza ya da ekonomik kayıptan sorumlu değildir. BÖLÜM No.: EKBTN Ed. 7 Revizyon tarihi: 25 Mayıs 2004