Basıldığında KONTROLSUZ KOPYA niteliğindedir. ULUSAL MĠKROBĠYOLOJĠ STANDARTLARI (UMS) Giemsa Boyama (Klinik Örneklerin Mikroskobik Ġncelemesi) Hazırlayan Birim Klinik Parazitoloji Tanı Standartları ÇalıĢma Grubu Onaylayan Birim Türkiye Halk Sağlığı Kurumu Kategori Parazitoloji Bölüm Test prosedürleri Standart No P-TP-06 Sürüm No 1.1 Onay tarihi 01.01.2015 Geçerlilik tarihi 01.01.2018 Sürüm no Tarih Değişiklik
İÇİNDEKİLER KAPSAM VE AMAÇ... 3 KISALTMALAR VE TANIMLAR... 3 GENEL BĠLGĠ... 3 TEKNĠK BĠLGĠLER... 4 1 Test için asgari laboratuvar koģulları... 4 2 Giemsa boyamanın yapılması... 7 3 Preparatların değerlendirilmesi/yorumlanması... 8 4 Olası sorunlar/kısıtlılıklar... 9 EKLER... 10 Ek-1 Giemsa boyasının hazırlanması 4... 10 Ek-2 ph düzeltme solüsyonları (%2 lik) 4... 11 ĠLGĠLĠ DĠĞER UMS BELGELERĠ... 12 KAYNAKLAR... 12 Sayfa 2 / 12 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / P-TP-06 / Test Prosedürleri / Parazitoloji
Kapsam ve Amaç Giemsa boyama öncelikle bir eukaryot hücre boyasıdır ve klinik mikrobiyolojide özellikle kanda bulunan enfeksiyöz ajanların ya da dokulara invazyon gösteren enfeksiyonların incelenmesinde kullanılır. Bu UMS nin amacı Giemsa boyasının özelliklerini özetlemek ve en sık kullanıldığı durumları (Plasmodium spp ve diğer protozoon parazitler için kan yaymaları ve klamidyal inklüzyon cisimcikleri için sürüntü preparatları) esas alan bir prosedür vermektir. Preparatların yapılması ve sabitlenmesi amaca göre çeģitlenebildiği için, ilgili detaylara bu UMS de yer verilmemiģtir. Bu detaylar için etken tanısı veya örnek yönetimi grubundaki ye ilgili UMS ye baģvurulması önerilir. Kısaltmalar ve Tanımlar EDTA Etilen diamin tetra asetik asit Ökaryot Bir hücre çekirdeği (nükleus) ve organelleri olan hücrelerin genel adı. Memeli hücreleri ve parazit hücreleri ökaryot tur. Genel Bilgi Kan ve kemik iliği yaymalarının klasik boyası olan Giemsa, alkol-bazlı bir Romanowsky boyasıdır. Vücut sıvılarından ya da dokulardan hazırlanan yaymalarda en baģarılı boyalardan biridir. Özellikle lökositlerin, eritrositlerin, trombosit ve parazitlerin nükleus ve sitoplazma morfolojilerini ayırt etmek için kullanılır. Ana kullanım alanlarından biri sıtma Ģüphesinde Plasmodium spp aranması amacıyla kan yaymalarının boyanmasıdır. Ayrıca, yine parazitolojide diğer kan protozoonlarının (özellikle hemoflajellatların), mikroflaryaların tanısında, Chlamydia spp Ģüpheli örneklerde inklüzyon cisimciklerinin aranmasında da yararlanılır. Diğer bazı bakteriyel, viral, fungal ajanların doku invazyonlarında geliģen patolojilerin incelenmesi dahil klinik mikrobiyolojide pek çok durumda Giemsa boyası önemli bir tanı aracıdır (1,2). Bir eosin ve metilen mavisi karıģımı olan azure B içeriyor olması nedeniyle Giemsa, özellikle kan parazitleri için en güvenilir boyadır. Eosin parazit kromatinini kırmızı; metilen mavisi ise parazit sitoplazmasını maviye boyar. Beyaz kan hücreleri de genel olarak sitoplazmaları mavi ve nükleusları eflatundan siyaha değiģen koyu renklerde ayırt edilirler. Eritrositler ise soluk kırmızı-gri görünürler. Dolayısı ile -canlı pembe-kırmızı boyanmıģ parazit kromatinleri özellikle eritrositlerde küçük noktalanmalar Ģeklinde (Schüffner granülleri) kolayca ayırt edilebildiklerinden- Plasmodium spp enfeksiyonlarında Giemsa boya ile tanı duyarlılığı en yüksek sonuçlar elde edilir (1,3). Hematolojide kullanılan bir boya olan Wright boyası (Wright-Giemsa) kan parazitleri için yeterince uygun değildir. Wright rutin laboratuvarlarda yaygın, görece kolay hazırlanabilen bir boyadır ve eğer hızlı sonuç elde etmek isteniyorsa kullanılabilir; ancak -Schüffner granülleri bu boya ile gösterilemeyeceğinden dolayı- daha sonra mümkün olduğunda Giemsa boyama ile doğrulama yapılmalıdır (4). Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 3 / 12 Parazitoloji / Test Prosedürleri / P-TP-06 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Suyun oksijeni boyama reaksiyonunu baģlatıcı iģlev görmektedir. Bu nedenle stabilitesini sağlamak için stok boya nemden tam anlamıyla korunmalıdır. Giemsa stok solüsyonu ideal saklama koģullarında (nemden, sudan korunarak) yıllarca dayanır. Yine aynı nedenle boyama yapılırken stok Giemsa dan fosfat tamponlu suda taze hazırlanmıģ Giemsa boyasının kullanılması kuraldır; üzerinden bir saat geçmiģ ise ya da gün içinde takip eden boyamalar yapılacaksa yeni boya hazırlanması önerilir (1,3,4). Bir zorunluluk değilse de, tamponlu suya Triton X-100 de katılabilir. Triton X-100 bir iyonik olmayan yüzey-aktif ajandır ve Giemsa boyanma özelliklerini arttırdığı, parazitlerin bir lamdan diğerine taģınma olasılığını da ortadan kaldırdığı kabul edilmektedir (5). Ġyi bir boyama reaksiyonu belli bir ph da gerçekleģir; kan yaymalarının incelenmesinde ph 7.2 olmalıdır (özellikle Schüffner yapılarının gözlenmesini sağlayacak kalitede bir boyama için) (3). Chlamydia spp incelemesi için Giemsa boyamada ise nötral ph (7.0) önerilmektedir (6). Genel olarak Giemsa boyamada ph hafif asit hafif alkali (6.8-7.2 aralığında) olsa da ideali laboratuvarın, kendi uygulamasında, yapacağı incelemeye göre en iyi sonucu alacak Ģekilde tamponlu su ph ını test ederek bulmasıdır (1,2). Ġyi bir boyama ve doğru bir tanımlama için preparatların hazırlanması da çok önemlidir. Genel bir kural olarak yaymalar örnek alındıktan sonraki en kısa sürede boyanmalıdır; çünkü gecikmiģ boyamalarda hatalı sonuçlar alınabilir. Gerek kan yaymalarının, gerekse diğer vücut sıvılarından veya dokulardan preparatların tecrübeli personel tarafından hazırlanması sonuçların güvenilirliğini yakından etkileyen bir faktördür. BaĢarılı sonuç için ayrıca yaymaların tam kurumuģ olması gereklidir. Teknik Bilgiler 1 Test için asgari laboratuvar koģulları 1.1. Laboratuvar güvenliği Bu UMS de bahsi geçen organizmalar ile ilgili iģlemler asgari BGD2 laboratuvar Ģartlarında gerçekleģtirilmelidir. Bütün örnekler enfeksiyöz kabul edilmeli ve daima standart önlemler uygulanmalı, önlemler risk değerlendirmesi ile de desteklenmelidir. En ciddi risk kan alma iģlemi esnasında personele kan-kaynaklı patojenlerin (HIV, hepatit) bulaģma riskidir (ayrıca bkz. Ulusal Laboratuvar Güvenliği Rehberi ). Bu prosedür uygulanırken daima eldiven giyilmelidir. BoyanmıĢ olsun, olmasın bütün lamlar kesici-delici atık kabul edilir ve kesinlikle kesici-delici atık kutusuna atılırlar! Diğer biyolojik kirlilerin konduğu torbalara atılmaları halinde torbayı deler ve ciddi infeksiyöz risk oluģtururlar. Güvenlik uyarısı! Metanol yüksek düzeyde toksik ve parlayıcıdır. Eğer yutulacak olursa (herhangi bir miktarı) körlüğe ve hatta ölüme neden olabilir. Kullanım harici zamanlarda metanol ĢiĢesi kilitli bir dolapta tutulmalıdır! Sayfa 4 / 12 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / P-TP-06 / Test Prosedürleri / Parazitoloji
1.2. Sorumluluklar ve asgari personel gerekleri Bu UMS yi kullanacak laboratuvar personeli; (i) tekniğin uygulanmasından önce, amaçlanan kullanım ile ilgili eğitim almıģ olmalı; (ii) tekniğe tüm yönleriyle aģina olmalı, ve (iii) daima tüm laboratuvar güvenlik kurallarına uymalıdır. Bu UMS nin uygulanmasından analist; tekniğin prosedüre uygun yapılmasını sağlamaktan ve denetimi, değerlendirilmesi ve onaylanmasından (sonucun doğru ve güvenilir olmasından) Tıbbi Mikrobiyoloji/Parazitoloji Uzmanı sorumludur. 1.3. Örnek, Reaktif, Donanım İnceleme örnekleri Parmak ucundan alınmıģ tam kan ile hazırlanmıģ preparatlar: (a) ince yayma; havada iyi kurutulmuģ ve saf metanol ile sabitlenmiģ, (b) kalın damla; havada iyi kurutulmuģ, ancak sabitlenmemiģ, veya (c) hem ince yayma hem de kalın damla bir lamda olacak Ģekilde hazırlanmıģ (iyice kurutulmuģ) ve ince yayma kısmı sabitlenmiģ preparat. Kalın damla ve ince yayma hazırlanması için bkz. UMS, P-TP-07. Venöz kan - Kan örneği EDTA (0.02g/10mL kan) içeren tüpe de alınabilir ve preparatlar bu tüpteki kandan hazırlanmıģ olabilir. Eğer mikrofilarya veya tripanozomiyaz Ģüphesi varsa heparin (2mg/10mL kan) veya sodyum sitrat (0.05g/10mL kan) içeren tüplere kan alınmalıdır (7). ÖNEMLĠ: Antikoagülanlı kan kullanılacaksa, kan alındıktan sonraki 1 saat içinde preparat yapılmıģ ve sabitlenmiģ olmalıdır. Chlamydia trachomatis için göz ve genital (üretral, servikal) sürüntü örneklerinden yapılmıģ preparatlar havada kurutulduktan sonra saf metanol ile en az 5 dk sabitlenmiģ, sonra yine kurutulmuģ olmalı. Kemik iliği, biyopsi ve diğer doku örneklerinden yapılmıģ yaymalar Kala-azar, ġark çıbanı ve toksoplazmoz tanısında Giemsa ile boyanır (bkz. UMS, P-MT-04; 05 ve 08). Buffy-coat - tam kandan hazırlanan buffy-coat yaymaları Kala azar ve toksoplazmoz tanısı için Giemsa ile boyanır. Reaktifler Stok Giemsa boyası - Piyasadan hazır temin edilebileceği gibi laboratuvarda da hazırlanabilir. Özellikle sıtma programı kapsamında stok boyanın merkez (referans) laboratuvarda tecrübeli personel tarafından hazırlanıp sahadaki laboratuvarlara dağıtılması standardizasyon açısından idealdir (4). (Hazırlamak için bkz. Ek-1). NOT: Ek-1 de verilen formül, ticari formüllere göre daha tutarlı sonuçlar verdiği sınanmıģ bir formül olup son kullanma tarihi yoktur. Stok tamponlar (tamponlu su hazırlamak için) Tamponlu su (boyayı sulandırmak ve preparat yıkamak için), ph 7.2 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 5 / 12 Parazitoloji / Test Prosedürleri / P-TP-06 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
ÖNEMLĠ: ph kan yaymaları için 7.2, Chlamydia incelemesi için ise 7.0 olarak önerilmektedir (3,6). Laboratuvar, kendi uygulamasında, incelemeye göre en iyi sonucu alacak Ģekilde tamponlu su ph ını test ederek bulmalıdır. %5 lik Triton X-100 (stok); Triton tamponlu su (isteğe bağlı) Metanol, saf (%100 lük; aseton içermeyen) metanol nem (su) çekmesini önlemek için ağzı sıkı kapalı bir ĢiĢede saklanmalıdır! Ġmmersiyon yağı Diğer gereç, donanım Mikroskop, binoküler (rutin ıģık mikroskobu) 10 düģük, 40 yüksek kuru, 100 immersiyon objektifleri ve 10 oküleri olan tercih edilir. NOT: Bazı mikroskopistler 5 oküler tercih etmektedir. Ancak 5 oküler daha az büyütme sağlar ve inceleme duyarlılığını düģürür; bu nedenle 10 oküler kullanılması önerilmektedir (8). Önceden temizlenmiģ lamlar (25 75 mm) tercihen, kenarı rodajlı KurĢun kalem, lamın rodajlı kenarına örnek no vb. yazmak için, 3 veya 4 Ģale (Coplin jar), 50 ml (lam boyamak için) Mezür, erlen, pipetler; vidalı kapaklı ĢiĢeler (50 ml den 1 L ye) Cam veya plastik Pastör pipetleri, tek kullanımlık; pens ph metre Zaman alarmı (timer) Filtre kağıdı, Whatman no. 1 Biyolojik atık kapları, kesici-delici atık kabı ve toksik boya atıklarını toplamak için kap (kimyasal atık kabı) 1.4. Kalite kontrol Boyama sonuçlarının uygunluğundan emin olmak için, eğer elde (fazla) pozitif yayma örnekleri varsa, her Giemsa çalıģma solüsyonu partisi hazırlandığında bir kontrol yayması da boyanmalıdır. Boyanacak olan vaka yaymasındaki organizmalar ve/veya lökositler de dahili kalite kontrol olarak kabul edilebilirler. Ġyi kalite kontrol yaymaları (ticari olarak temin edilemeyeceği için) bilinen bir hastanın kanından aģağıda tarif edildiği gibi hazırlanabilir ve ileride kullanmak üzere saklanabilir (4): (a) Yeterli parazit yoğunluğuna sahip (her iki-üç inceleme alanında en az bir parazit olan) bir hasta seçilir ve kan örneği EDTA lı tüpe alınır. (b) Bu kandan, alındıktan sonraki tercihen 1 saat içinde ve yapılabilecek en fazla sayıda ince yayma preparat yapılır. (c) Yaymaların -oda sıcaklığında ve bir fan (sıcak olmamalıdır!) kullanarak- hızla kurumaları sağlanır. (d) Saf metanolde sabitlenirler ve kurumaya bırakılırlar. Sayfa 6 / 12 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / P-TP-06 / Test Prosedürleri / Parazitoloji
(e) Ġyice kurumuģ olan lamlar kağıt havlulara sarılarak bir kutuya yerleģtirilir. Kutunun üzeri türün adı, hazırlama tarihi ve Giemsa kontrol lamları yazarak etiketlenir. (f) Amaç kalite kontrol lamları veya eğitim lamları yapmak olduğu için kutu -70 C ye kaldırılır. (g) Kalite kontrol yapılmak istendiğinde kutudan bir yayma çıkarılır ve üzerindeki nemin kuruması beklenir; lam Plasmodium spp (+) ve tarih yazarak etiketlenir. Yayma, daha önceden sabitlenmiģ olduğundan, Ģimdi artık boyanmaya hazırdır. Stok tampon çözeltiler ve tamponlu su berrak olmalı, görünür bir kirlilik olmamalıdır. ph belirtilen sınırlar içinde olduğu sürece tamponlu su testte kullanılabilir. Her kullanımdan önce, tamponlu suyun ph ı kontrol edilmelidir. Eğer gerekiyorsa düzeltilmelidir (bkz. Ek-2). ph ın belirtilen sınırlar içinde olup olmadığını değerlendirmek için ayrıca "normal" kandan yaymalar hazırlanıp, boyanabilir ve hücreler mikroskopta incelenerek yorum yapılabilir: (a) Makroskobik olarak kan yayması morumsu görünür. Eğer mavi ise tamponlu su alkaliye kaymıģ; pembe-kırmızı ise tamponlu su asite kaymıģ demektir. (b) Mikroskobik olarak, eritrositler pembemsi gri, trombositler koyu pembe ve lökositler mor-mavi çekirdekler ile açık renk sitoplazmaya sahip görünür. Eozinofilik granüller parlak morkırmızı ve nötrofilik granüller mordur. Enfekte olmayan eritrositler içinde bazofilik noktalanma mavi gözlenir. (c) Bu tarif edilen renklerde kullanılan boya serisine ve kanın karakterine bağlı olarak küçük farklılıklar görülebilir, ancak morfolojik özellikler ayırt edilebiliyorsa boya tatmin edicidir. Mikroskop belirli aralıklarla (yoğun kullanılıyorsa yılda en az bir kez) kalibre edilmelidir. Mikroskoba herhangi bir parça eklenmesi veya değiģtirilmesi durumunda da kalibrasyon yapılmalıdır. Kalibrasyon için kullanılmıģ optikler mikroskobun üzerinde olmalıdır. Tüm objektifler için kalibrasyon faktörleri göz önündeki bir panoda asılı olmalıdır (bkz. UMS, P-TP-01 Mikroskop Kalibrasyonu). Tüm kalite kontrol sonuçları kaydedilmelidir. 2 Giemsa boyamanın yapılması NOT: Prosedür sıtma Ģüphesinde ince yayma ve kalın damla preparatlarının boyanması ön plana alınarak anlatılmıģtır. Bununla birlikte yeri geldikçe diğer organizmalar (Chlamydia sp vb.) için farklı uygulama hususları da not Ģeklinde verilmektedir. Bir boyama Ģalesine koymak üzere 40 ml Giemsa çalıģma solüsyonu (%2.5 luk) hazırlanır (hazırlanıģı için bkz. Ek-1). ÖNEMLĠ: ÇalıĢma solüsyonu günlük hazırlanır. Eğer aynı gün çok sayıda boyama yapılacaksa boyanın değiģtirilmesi gerekebilir. Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 7 / 12 Parazitoloji / Test Prosedürleri / P-TP-06 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
NOT: Standart bir Ģale 40 ml boya alır. Farklı büyüklükte bir Ģale kullanılacaksa volüm, oranlar aynı kalacak Ģekilde, ayarlanmalıdır. Ġkinci bir Ģalenin içine de 40 ml tamponlu su konur; 20 µl Triton X- 100 eklenir (mikroflarya incelemesinde 200 µl Triton X-100 eklenir). Yaymalar Giemsa çalıģma solüsyonu içeren Ģalenin içine konur ve 45-60 dk tutulur. NOT: Lamlar daha yüksek yoğunlukta (ör., %10 luk) Giemsa çalıģma boyası kullanılarak daha kısa sürede (10 dk) boyanabilir. Ancak daha fazla boya harcanmasına karģın sonuç kalitesi yeterince iyi olmayabilir. Ġnce yayma lamı Ģaleden çıkarılır ve tamponlu su içine batırılır; 3-4 kez batırıp çıkarılarak yıkanır. Kalın damla preparatı ise tampon içinde 5 dk kadar tutulmalıdır. NOT 1: AĢırı yıkama yaymaların fazla renksizleģmesine neden olabilir. Süreler aģılmamalıdır. NOT 2: Eğer ince yayma ve kalın damla aynı lamın üzerinde ise önce ince yayma kısmı tamponlu su içine 3-4 kez batırıp çıkarılarak yıkanır. Sonra lamın sadece kalın damla kısmı tampon solüsyona girecek Ģekilde Ģaleye yerleģtirilir ve 5 dk tutulur. Bu iģlem sırasında kalın damlanın tamamen tampon içinde olduğundan, ancak ince yaymanın hiçbir parçasının ise kesinlikle tampon içinde olmadığından emin olunmalıdır. NOT 3: Chlamydia spp nin bazofilik intrasitoplazmik inklüzyon cisimciklerinin görülmesi amacıyla göz veya genital sistem sürüntü örneklerine Giemsa boyama uygulanırken kullanılan reaktifler ve adımlar yıkama aģamasına kadar aynıdır. Yıkama ise %95 lik etanolde yapılır; preparat hızla etanol içine sokulup çıkarılarak fazla boya uzaklaģtırılır. Lamlar düģey pozisyonda dizilir ve havada kurutulur. NOT: Eğer ince yayma ve kalın damla aynı lamın üzerinde ise kurutulurken kalın damla kısmı aģağıda tutulmalıdır. Mikroskopta incelenir. 3 Preparatların değerlendirilmesi/yorumlanması Preparatlar önce küçük objektif altında (10 ) genel boyanma özellikleri ve yaymalarda hücrelerin dağılımını görmek için değerlendirilmelidir. Mikrofilaryaların varlığı da bu büyütmede kolay ayırt edilir. Daha sonra immersiyon objektifi (100 ) ile esas inceleme yapılmalıdır. Ġnce yayma preparatlar en az 25-30 dk incelenmeli ve en az 300 alan gözden geçirilmelidir. Ġncelemeye yaymanın uç bölgesinden, eritrositlerin tek tek düģtüğü bir alandan baģlanır. Kalın damla preparatlar en az 10 dk ve her biri en az 10-20 lökosit içeren 100 alan gözden geçirilecek Ģekilde incelenmelidir. Sayfa 8 / 12 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / P-TP-06 / Test Prosedürleri / Parazitoloji
Eğer Plasmodium lar mevcutsa sitoplazmaları mavi, nükleer materyal kırmızı, mor-kırmızı boyanmıģ olacaktır. Plasmodium ların enfekte ettiği eritrositlerdeki Schüffner granülleri ve diğer inklüzyonlar kırmızı boyanır. Sıtma parazitleri için ayırt edilen nükleer ve sitoplazmik renkler tripanozomada ve hücre içi yerleģim göstermiģ Leishmania larda da gözlenir. Leishmania amastigotları makrofajların içinde veya dıģında çok küçük (3 ila 5 µm) yuvarlak veya oval organizmalar Ģeklinde görülürler. Bir amastigotta kırmızı-mor nükleus, oldukça küçük daha koyu kırmızı-mor boyanmıģ kinetoplast ve açık mavi sitoplazma ayırt edilir. NOT: Preparatların incelenmesinde daha ayrıntılı bilgi için ayrıca Ģu ilgili UMS lere bakılmalıdır: i) Sıtmanın Mikrobiyolojik Tanısı (UMS, P-MT-06); ii) Kala-azar ın Mikrobiyolojik Tanısı (UMS, P-MT-04); iii) ġark çıbanının Mikrobiyolojik Tanısı (UMS, P-MT-05). Mikrofilaryalar genellikle mavi-mor görünürken, kılıfları boyanmayabilir. Göz veya ürogenital örneklerden yapılmıģ yaymaların Giemsa boyamasında, hücreler eğer enfekte iseler, Chlamydia spp inklüzyon cisimcikleri bazofilik boyanmıģ (koyu mavi-mor) olarak görülürler. 4 Olası sorunlar/kısıtlılıklar Kan yaymalarının kalitesi teknisyenin tecrübesi ve boyanın kalitesiyle doğrudan iliģkilidir. Bu nedenle hatalı yaymalardan kaçınılmalı ve kullanılacak Giemsa boyasının taze olmasına önem verilmelidir. ÇalıĢma solüsyonunda ph ayarlamasına gereken dikkat gösterilmez ise sonuçların doğruluğu ve güvenilirliği etkilenebilir. Stok Giemsa boyasına çok küçük miktarlarda bile su karıģması boyanın stabilitesini bozacaktır. Saklama koģullarına özen gösterilmelidir. Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 9 / 12 Parazitoloji / Test Prosedürleri / P-TP-06 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
Ekler Ek-1 Giemsa boyasının hazırlanması 4 100x Stok Tampon 0.67 M Na 2 HPO 4 NaH 2 PO 4 H 2 O Deiyonize su 59.24 g 36.38 g 1000 ml KarıĢtırılır ve 121 C de 15 dk otoklavlanır ya da filtrasyon ile (filtre por çapı 0.2 µm) sterilize edilir. Etiketlenir ve oda ısısında saklanır. Raf ömrü 1 yıldır. Çalışma Tamponu 0.0067M, ph 7.2 Stok Tampon Deiyonize su 10 ml 990 ml Kullanmadan önce ph kontrol edilir. ph7.2 olmalıdır. Etiketlenir ve oda ısısında saklanır. Raf ömrü 1 aydır. Triton X-100, %5 lik Deiyonize su (56 C ye ısıtılmıģ) Triton X-100 95 ml 5 ml Deiyonize su önceden ısıtılır ve Triton X-100 yavaģça eklenir; yavaģ çevrilerek karıģtırılır. Giemsa Stok Boya Güvenlik uyarısı! Metanol yüksek düzeyde toksik ve parlayıcıdır. Eğer yutulacak olursa (her hangi bir miktarı) körlüğe ve ölüme neden olabilir. Kullanım harici zamanlarda metanol ĢiĢesi kilitli bir dolapta tutulmalıdır! Cam boncuklar, 3.0 mm Metanol, saf, asetonsuz Giemsa boya, toz (sertifiye) Gliserol 30 ml 270 ml 3 g 140 ml Temiz, kuru, 500 ml lik bir kahverengi cam ĢiĢe alınır; içine önce cam boncuklar konur ve listedeki diğer maddeler veriliģ sırasına göre ĢiĢeye eklenir. Burgu kapak sıkıca kapatılır. ġiģe bir çalkalayıcının üzerine bir açıyla yerleģtirilir; orta hızda, en az 14 gün, günde 30-60 dk olacak Ģekilde çalkalanır. Kapak nem almayacak Ģekilde daima sıkıca kapalı tutulduğu sürece stok Giemsa oda ısısında süresiz stabildir (ayrıca stok boya zamanla daha da geliģir). Kullanmadan önce ĢiĢe çalkalanır. ÇalıĢma solüsyonu hazırlamak için kullanılacak kadar bir miktar Whatman No 1 filtre kağıdından süzülerek alınır. Sayfa 10 / 12 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / P-TP-06 / Test Prosedürleri / Parazitoloji
Giemsa Çalışma Boyası (%2.5 luk) ÇalıĢma tamponu 40 ml Giemsa stok boya 1 ml %5 Triton X-100 20 µl Günlük olarak taze hazırlanır (testten hemen önce). Eğer çok sayıda lam boyanacaksa boya gün içinde yenilenmelidir. Ġdeal olarak hazırlanmıģ bir çalıģma boyası 1 saatten sonra kullanılmamalıdır. Ek-2 ph düzeltme solüsyonları (%2 lik) 4 Tamponlu suyun ph ı, her Giemsa çalıģma boyasının hazırlanmasından önce, rutin olarak kontrol edilmelidir. ph ı ayarlamak için düzeltme solüsyonları kullanılır; eğer ph<7.2 (asite kaymıģ) ise %2 Na 2 HPO 4 solüsyonundan, eğer ph>7.2 (alkaliye kaymıģ) ise %2 KH 2 PO 4 solüsyonundan az miktarlarda eklenerek ayarlama yapılır. Bu düzeltme solüsyonlarının hazırlanıģı aģağıda verilmektedir. %2 Na 2 HPO 4 Bir erlende 100 ml deiyonize su ile 2 g Na 2 HPO 4 karıģtırılır, eritilir. Solüsyon bir burgu kapaklı ĢiĢeye aktarılır ve %2 lik Na 2 HPO 4 Ģeklinde etiketlenir. Gün ıģığından uzak, serin bir ortamda saklanır. Tampon suyu daha alkali yapmak için kullanılır. %2 KH 2 PO 4 Bir erlende 100 ml deiyonize su ile 2 g KH 2 PO 4 karıģtırılır, eritilir. Solüsyon bir burgu kapaklı ĢiĢeye aktarılır ve %2 lik KH 2 PO 4 Ģeklinde etiketlenir. Gün ıģığından uzak, serin bir ortamda saklanır. Tampon suyu daha asit yapmak için kullanılır. Ulusal Mikrobiyoloji Standartları Sayfa 11 / 12 Parazitoloji / Test Prosedürleri / P-TP-06 / Sürüm: 1.1 / 01.01.2015
İlgili diğer UMS belgeleri Bu prosedür belgesi (Giemsa Boyama) ayrıca aģağıda listelenen UMS lerle ilgilidir. Özellikle, preparatların incelenmesi hakkında daha ayrıntılı bilgi için bu UMS lere bakılması önerilir: UMS, P-ÖY-03 Kan ve kemik iliği örneklerinin parazitolojik incelemesi UMS, P-TP-01 Mikroskop kalibrasyonu (oküler mikrometre ile) UMS, P-TP-07 Kalın damla ve ince yayma UMS, P-MT-06 Sıtmanın mikrobiyolojik tanısı UMS, P-MT-04 Kala-azar ın mikrobiyolojik tanısı UMS, P-MT-05 ġark çıbanının mikrobiyolojik tanısı UMS, P-MT-08 Toksoplazmozun mikrobiyolojik tanısı UMS, B-MT-16 Chlamydia trachomatis in mikrobiyolojik tanısı Kaynaklar 1 Bullock-Iacullo S. Giemsa stain. In: Garcia LS, Isenberg HD (eds). Clinical Microbiology Procedures Handbook. 2nd ed. update, ASM Press, Washington D.C. 2007, p. 9.8.5.1-9.8.5.5 2 Fritsche TR, Selvarangan R. Medical parasitology. In: McPherson RA, Pincus MR (eds). Henry s Clinical Diagnosis and Management by Laboratory Methods. 22nd ed. Elsevier Inc., Philadelphia. 2011, p.1189-1238 3 WHO. Basic Malaria Microscopy Part I. Learner s Guide. Second edition, Switzerland. 2010. http://whqlibdoc.who.int/publications/2010/9789241547826_eng.pdf (son eriģim tarihi: 18.12.2013) 4 CDC. Laboratory diagnosis of malaria: Staining for malaria parasites. Laboratory identification of parasites of public health concern. DPDx. http://www.dpd.cdc.gov/dpdx/html/pdf_files/malaria_staining_benchaid.pdf (son eriģim tarihi: 17.11.2013) 5 Garcia LS. Laboratory methods for diagnosis of parasitic infections: Giemsa stain (Procedures 44.20-22). In: Finegold SM, Baron EJ (eds). Bailey and Scott s Diagnostic Microbiology. 7th ed., The C. V. Mosby Company, USA. 1986 p. 812-813 6 Finegold SM, Baron EJ (eds). Formulas for commonly used stains: Giemsa stain for Chlamydiae. Chapter 46. In: Bailey and Scott s Diagnostic Microbiology. 7th ed., The C.V. Mosby Company, USA. 1986, p. 905. 7 Garcia LS. Giemsa stain. http://www.medchem.com/pages/lab_procedures/pdf/giemsa_blood_stain.pdf (son eriģim tarihi: 17.11.2013) 8 Garcia LS. Calibration of microscope with an ocular micrometer. In: Garcia LS, Isenberg HD (eds). Clinical Microbiology Procedures Handbook. 2nd ed. update, ASM Press, Washington D.C. 2007, p. 9.3.2.1-4. Sayfa 12 / 12 Ulusal Mikrobiyoloji Standartları 01.01.2015 / Sürüm: 1.1 / P-TP-06 / Test Prosedürleri / Parazitoloji