ÖZEL EGE LİSESİ OSTEOMİYELİT TEDAVİSİNDE KULLANILMAK ÜZERE MANYETİK NANOPARTİKÜLLERE ADSORPSİYON TEKNİĞİ İLE ANTİBİYOTİK YÜKLENMESİ VE FORMÜLASYONUN İLAÇ SALIM POTANSİYELİNİN İNCELENMESİ Şeniz Şenol Özel Ege Lisesi, 2012 0
İÇERİK LİSTESi PROJENİN AMACI... 2 GİRİŞ... 3 YÖNTEM... 9 Materyal... 9 Protein tayini... 9 Albumin nanopartiküllerinin sentezlenmesi... 10 Manyetik albumin nanopartiküllerinin hazırlanması... 11 Amoksisilin ticari formundan ekstraksiyonu ve standart grafiğinin çizilmesi... 11 Albumin nanopartiküllerine amoksisilinin adsorpsiyon yolu ile yüklenmesi... 12 Optimum Adsorpsiyonun Süresinin Tayini... 12 Optimum Adsorpsiyon ph sının Belirlenmesi... 12 Optimum İlaç Konsantrasyonunun Saptanması... 13 İn Vitro İlaç Salımı... 13 SONUÇLAR VE TARTIŞMA... 14 Albumin Standart Grafiği... 14 Amoksisilin Tayini... 14 Nanopartikül Hazırlama ve Hazırlanılan Nanopartiküllere İlaç Yükleme Koşullarının Optimizasyonu... 16 Albumin Konsantrasyonunun Etkisi... 16 İnkübasyon Süresinin Etkisi... 17 ph Etkisi... 17 Amoksisilin Konsantrasyonunun Adsorpsiyon Verimi Üzerine Etkisi... 18 DEĞERLENDİRME... 21 TEŞEKKÜR... 22 KAYNAKLAR... 22 1
PROJENİN AMACI Osteomiyelit, mikroorganizmaların neden olduğu kemik ve kemik iliği enfeksiyonudur. Bu enfeksiyon bölgesel kalabildiği gibi kemik iliği, kemik zarı ve yumuşak dokuya da yayılım gösterebilir. Osteomiyelit gelişen antibiyotikler ve tedavi yöntemlerine rağmen kronikleşme eğilimi ile önemini koruyan bir hastalıktır. Antibiyotiklerin özellikle enfeksiyon bölgesinde yüksek konsantrasyonlara ulaşmasını sağlamak için lokal antibiyotik uygulamaları ve taşıyıcı sistemler geliştirilmiştir. Bunlar kemik çimentosu, poliglikolat membranlar, hidroksiapatit gibi taşıyıcılardır. Günümüzde en çok uygulanan gentamisin içeren metakrilat boncukların kullanımıdır. Literatürde yer alan birçok çalışmada ilaç taşıyıcı partiküller olarak nanopartiküller kullanılmaktadır. Nanopartiküller, büyüklükleri 10-1000 nm arasında değişen, çözünmüş, hapsedilmiş veya adsorbe olan etkin maddeyi kontrollü olarak salan katı koloidal partiküllerdir. Nanopartiküllerde istenen özellikler; ilacı kontrollü olarak salması, etki etmeleri istenen bölgede toplanması, stabilite sorunu olmaması, taşıyıcının fizyolojik ortamda parçalanma ürünlerinin toksik olmaması ve sterilize edilebilmesi gibi özellikler sıralanabilir (Çokkuş, 2010). Polimerik nanopartiküller, kontrollü ilaç salımı ve hastalığa spesifik lokalizasyon sağlaması amacıyla karakteristikleri ve yüzey kimyası değiştirilerek üretilebilir (Singh ve Lillard, 2009). Polimerik nanopartiküllerin hazırlanmasında doğal ve sentetik polimerler kullanılmaktadır. Doğal polimerler, proteinler (albumin, jelatin vb.) ve polisakkaritler (aljinat, kitosan, dekstran vb.) olmak üzere iki gruptan oluşmaktadır. Sentetik polimerler ise önceden sentezlenen (polianhidrit, polikaprolakton-pcl, poli(laktik asit)-pla, poli(laktik-ko-glikolik asit)-plga vb.) veya hazırlama sırasında sentezlenen polimerlerden (poli(siyanoakrilat)- PACA vb.) oluşmaktadır (Ak, 2010). Doğal polimerler biyolojik olarak parçalanabilir olması, metabolize edilebilmeleri, stabiliteleri ve büyüklük dağılımlarının kontrol edilebilir olmaları ve suda çözünen ilaçlar için yüksek yükleme kapasitesi vermeleri nedeniyle tercih edilirler (Çokkuş, 2010). İlaç taşıyıcı olarak nanopartiküllerin kullanılma nedeni: yükleme kapasitesinin fazla olması, immün sistem tarafından tanınmaması dolayısıyla hedefe daha etkili bir biçimde ulaşmak amacıyla yüzeylerinin çeşitli moleküller ile modifiye edilebilmesi, polimer kaplı süperparamanyetik materyallerin manyetik rezonans görüntülemeye olanak sağlayarak partiküllerin hastalık teşhisinde kullanılabilmesi, bir ligand ile konjugasyon aracılığıyla oldukça spesifik doku hedeflendirmesinin mümkün olmasıdır. Kullanılan materyale ve üretim metoduna bağlı olarak şekil ve büyüklükleri değişen partiküller farklı özellikler kazanmaktadırlar. 2
Bu çalışmada osteomiyelit tedavisinde kulanılmak üzere ilaç taşıyıcı olarak biyobozunur manyetik albumin nanopartikülleri hazırlanılarak, amoksisilin adsorpsiyonunda kullanılması hedeflenmiştir. Günümüzde biyobozunur polimerlerin kullanımı sistemden daha sonra çıkarılmaları gerekmediğinden ve fizyolojik ortamda parçalanma ürünlerinin toksik olmaması nedeni ile daha avantajlıdır. Bu ilaç taşıyıcı sistemlerin dışarıdan manyetik alan uygulanmasıyla istenilen bölgeye etkin maddeyi taşıyabildiği ve bölgesel rahatsızlıkların tedavisinde daha etkin olduğu gösterilmiştir (Widder ve Senyei,1984). GİRİŞ Osteomiyelit, mikroorganizmaların neden olduğu kemik ve kemik iliği enfeksiyonudur. Bu enfeksiyon ve enflamasyon lokalize olarak kalabileceği gibi kemik iliği, korteks, periost ve yumuşak dokuya da yayılım gösterebilir. Gelişen antibiyotikler ve tedavi yöntemlerine rağmen kronikleşme eğilimi ile önemini koruyan bir hastalıktır. Yıllar geçmesine rağmen bazı hastalıklar olduğu gibi kalmaktadır (GILMOUR) Tarihteki ilk osteomiyelit kayıtlarına, MÖ 2500 yıllarındaki Hindu yazıtlarında rastlanmıştır. 1834'de Nelaton, osteomiyelit terimini ilk olarak kullanan kişidir. Yıllar geçmesine karşın günümüzde de osteomiyelit, ortopedistleri ve enfeksiyon hastalıkları uzmanlarını korkutan bir hastalıktır (Öztuna, 2005). Tedaviden 40 yıl sonra bile tekrar alevlendiğini gösterir bulguların olması tedavinin tamamen sağlanmasının söylenemeceğini göstermektedir. Osteomiyelitin meydana geliş nedenlerinden biri enfeksiyondur. Enfeksiyon etkeni nerden gelirse gelsin meydana gelebilecek klinik tablo akut, subakut veya kroniktir. Akut osteomiyelit, daha çok çocuklarda görülen osteomiyelit şeklidir. Sistemik dolaşıma yayılıp kemiğe gelen mikroorganizmalardan kaynaklanmakla birlikte bakteri bulaşması, çocukluk çağında neredeyse her gün gerçekleçen bir olaydır. Sadece diş fırçalamakla bile ağız florası mikroorganizmalarının dolaşıma karışması olasıdır. Enfeksiyonun oluşmasında kemik dokudaki lokal nedenler (travma) ve hastanın bağışıklık sistemindeki düşüklük, diyabet vb. rol oynar. Genellikle 2 yaşın altında ve 8-12 yaş arasında tutulum daha fazla görülür. İlgili bölgede kan akım hızı azalır ve bakteri kolonizasyonunu kolaylaşır, bir trombus oluşur ve medüller kanaldan lökosit migrasyonu yavaşlar. Ayrıca bu venlerde endotelin fagositoz yeteneği çok azdır. Bütün bu etkenler nedeni ile enfeksiyon odağı oluşur ve abseleşme süreci başlar (Şekil 1). Osteomiyelitin bu erken fazı uygun antibiyotik tedavisine çok iyi yanıt verebilir. 3
Şekil 1: Akut Osteomiyelit(McNally and Nagarajah, 2010) Kronik osteomiyelit akut enfeksiyonun ilerlemesiyle ortaya çıkar. Kronik olgularda enfekte ve nekroze kemiğin reaktif olarak gelişen kemik dokuyla çevrelenmesi söz konusudur. Bu bölge kanlanması bozulmuş bir mikroorganizma yatağı halindedir. Kronik osteomiyelitte son dönem oluşan doku bozukluğunun cilde fistülize olmasıdır. Böylece hastalık başka bir boyut kazanır (Şekil 2). Şekil 2: Kronik Osteomiyelit (McNally and Nagarajah, 2010) 4
Osteomiyelit tedavisinin ana prensipleri, radikal bir şekilde ölü dokuların temizlenmesi ve ölü boşlukların doldurulmasının yanında uzun süreli antibiyotik tedavisidir. Abse oluşmuş akut olgularda ve kronik osteomiyelitte cerrahi şarttır. Birçok mikroorganizma osteomiyelite neden olabilir. Olguların %40-%80 inden sorumlu S.aureus tur. S.aureus yanında, bazı durumlarda S.agalactiae, E.coli, S.piyogenes ve H.influenza da olgularda izole edilen mikroorganizmalardır(oto, 2008). Gram (+) ve Gram (-) bakterileri yok eden antibiyotikler kullanılarak özellikle akut fazda antibiyotik tedavisi önemlidir. Antibiyotik tedavisinde oral ve parenteral antibiyotik tedavisi kullanılmaktadır. Sefalosporinler hem gram (+) hem de gram (-) bakterilerin çoğunda etkilidir. S.aureus a karşı penisilinlerin etkinliği ispatlanmıştır. Sistemik uygulamalarda toksik etkileri ortaya çıkabilen antibiyotiklerin özellikle enfeksiyon sahasında yüksek konsantrasyonlara ulaşmasını sağlamak için lokal antibiyotik uygulamaları ve taşıyıcı sistemler geliştirilmiştir. Bunlar kemik çimentosu, poliglikolat membranlar, hidroksiapatit gibi taşıyıcılardır. Günümüzde en çok uygulanan gentamisin içeren metakrilat boncukların kullanımıdır. Şekil 3 de uygulama görülmektedir. Cerrahi müdehale ve sonrasında tekrar bölgenin açılarak preparatın çıkarılması gerekmektedir. Şekil 3: Gentamisin İçeren Metakrilat Boncukların Kullanımı (McNally ve Nagarajah, 2010) Günümüzde biyobozunur polimerlerin kullanımı sistemden daha sonra çıkarılmaları gerekmediğinden daha avantajlıdır. Bu nedenle son yıllarda polimer geliştirme çalışmaları devam etmektedir. 5
Literatürde yer alan birçok çalışmada ilaç taşıyıcı partiküller olarak nanopartiküller kullanılmaktadır. Nanopartiküller büyüklükleri 10-1000nm arasında değişen, çözünmüş, hapsedilmiş veya adsorbe olan etkin maddeyi kontrollü olarak salan katı koloidal partiküllerdir. İlaç taşıyıcı olarak nanopartiküllerin kullanılma nedeni: yükleme kapasitesinin fazla olması, immün sistem tarafından tanınmaması dolayısıyla hedefe daha etkili bir biçimde ulaşmak amacıyla yüzeylerinin çeşitli moleküller ile modifiye edilebilmesi, kan beyin bariyeri ve hücreler arası sıkı bağlantılar gibi fizyolojik bariyerlerden geçişi sağlayabilecek şekilde dizayn edilebilmesi, polimer kaplı süperparamanyetik materyallerin manyetik rezonans görüntülemeye olanak sağlayarak partiküllerin diagnostik uygulamalarda kullanılabilmesi, bir ligand ile konjugasyon aracılığıyla oldukça spesifik doku hedeflendirmesinin mümkün olmasıdır. İlaç taşıyıcı sistemler olarak nanopartiküller, polimer, metal veya seramik materyallerinden oluşabilir. Kullanılan materyale ve üretim metoduna bağlı olarak şekil ve büyüklükleri değişen partiküller farklı özellikler kazanmaktadırlar. Lipozomlar, katı lipid partkülleri, miseller, küreler, dendrimerler, konjugatlar, hidrojeller vb. bu konuda araştırılan sistemlerdendir (Wang ve arkadaşları, 2008) (Şekil 4). Şekil 4: Araştırmaları süren terapötik nanopartiküler platformlardan bazıları (A) polimerik nanopartikül (B) katı lipit nanopartikül (C) polimerik misel (D) dendrimer (E) lipozom (F) manyetik nanopartikül. 6
Polimerik nanopartiküller, kontrollü ilaç salımı ve hastalığa spesifik lokalizasyon sağlaması amacıyla karakteristikleri ve yüzey kimyası değiştirilerek üretilebilir (Singh ve Lillard, 2009). Polimerik nanopartiküllerin hazırlanmasında doğal ve sentetik polimerler kullanılmaktadır. Doğal polimerler, proteinler (albumin, jelatin vb.) ve polisakkaritler (aljinat, kitosan, dekstran vb.) olmak üzere iki gruptan oluşmaktadır. Sentetik polimerler ise önceden sentezlenen (polianhidrit, polikaprolakton-pcl, poli(laktik asit)-pla, poli(laktik-ko-glikolik asit)-plga vb.) veya hazırlama sırasında sentezlenen polimerlerden (poli(siyanoakrilat)- PACA vb.) oluşmaktadır (Ak, 2010). İlacı hedef hücreye göndermenin bir yolu fiziksel hedeflemedir. Fiziksel hedefleme dıştan gelen uyarılar ile ilacın vücut içerisinde spesifik bir bölgeye hedeflenmesini sağlayan yeni bir hedefleme tekniğidir) (Vasir ve Labhasetwar, 2005). Manyetik alan ve ultrases uygulanarak gerçekleştirilir. Manyetik hedeflendirme yaklaşımı manyetik ilaç taşıyıcısına bağlı veya taşıyıcıya enkapsüle edilmiş bir terapötik ajanın enjeksiyonu ve dışarıdan lokalize manyetik alan uygulamasıyla tümör dokusuna yönelmesini kapsar (Şekil 5). Manyetik hedeflendirme: toksik, dayanıksız,pahalı ve tedavi amacıyla belirli bir bölgeye yönlendirilmesi amaçlanan ilaçların istenilen bölgede yoğunlaşmasını sağlamak ve salınımı kontrol etmek amacıyla manyetik partiküller ve manyetik alan kullanarak yapılan hedefleme yöntemidir (Widder ve Senyei, 1984). Manyetik cevap veren ilaç taşıyıcıları genellikle magnetit, demir, nikel, kobalt vb. gibi materyaller içerir. İlaç taşıyıcıları ise manyetik lipozomlar, mikroküreler, nanoküreler ve koloidal demir oksit solüsyonları olabilmektedir. Manyetik hedefleme yöntemi ile enjekte edilen dozun en az %60 ını hedef dokuya taşıması, serbest ilacın dolaşımdaki konsantrasyonunun 100 kat azalması, normal doku hücrelerinin hasarının azalması, dokuda kontrollü bir şekilde ilaç bulunmasının sağlanması gibi üstünlükleri bölgesel rahatsızlıkların tedavisinde daha etkin olduğu gösterilmiştir (Widder ve Senyei, 1984) Nanopartiküllerin kandan manyetik olarak geri kazanılması Manyetik nanopartiküllerin kan dolaşımına enjekte edilmesi Şekil 5: Manyetik hedefleme stratejisi 7
Çalışmamızda, biyobozunur albumin nanopartiküller hazırlanılarak antibiyotik adsorpsiyonunda kullanılması hedeflenmiştir. Osteomiyelit tedavisinde penisilin türevi antibiyotiklerin etkisi bilinmektedir. Bu nedenle Amoksisilin antibiyotiği seçilmiştir. Amoksisilin, ampisilinin analogudur (Şekil 6). Gram pozitif ve gram negatif mikroorganizmalara karşı etkili bir penisilin olup, bakterisid etkiye sahip geniş spektrumlu bir antibiyotiktir. Geniş spektrumlu yarı sentetik bir penisilindir. Bakterilerin hücre duvarı sentezini inhibe ederek bakterisid etki gösterir. Kan proteinlerine düşük oranda bağlanarak vücut doku ve sıvılarına etkili yoğunluklarda dağılır. Kanıtlanmış bir toksisitesi yoktur. Amoksisilin etki ettiği bakteriler: Gram-pozitif bakteriler Staphylococcus aureus (beta laktamaz üretmeyen) ß hemolitik streptokok Streptococcus faecalis Streptococcus pneumoniae Clostridium türleri Corynebacterium diphtheriae Gram-negatif bakteriler Haemophilus influenzae Escherichia coli Salmonella Shigella Proteus mirabilis Neisseria meningitidis dir. Şekil 6: Amoksisilin Kimyasal yapısı Amoksisilin içeren nanopartiküller hazırlanılarak hedef bölgeye manyetik özellik kazandırılarak gönderilecektir. 8
Şekil 7 de uygulanması düşünülen sistemin şekli görülmektedir. Albumin nanopartiküller osteomiyelit yerine bağlı olarak intravenöz yada lokal uygulanabilecektir. Şekil 7: Manyetik Hedefleme YÖNTEM Materyal Sığır serum albumini (BSA) Sigma ve glutaraldehit Merck ve amoksisilin ticari olarak sağlandı. Çalışmada kullanılan ultra saf su Milli Q Advantage A10 cihazından elde edildi ve kullanılan diğer kimyasallar analitik saflıktadır. Manyetik ajan (Fe 3 O 4 ) ise E.Ü. Biyokimya Bölümü nde sentezlendi. Protein tayini Çalışmamızda protein miktar analizleri Bradford yöntemi kullanılarak yapıldı (Bradford, 1976). Bradford reaktifi 40 mg Coomassie-Brilliant Blue G-250 nin tartılıp % 98 lik 50 ml etanolde çözülmesi ve üzerine 55 ml % 88 lik fosforik asit ilave edilerek distile su ile 1 litreye tamamlanmasıyla hazırlandı. 0,02, 0,05, 0,10, 0,15, 0,20 mg/ml konsantrasyonlarda sığır serum albumini (BSA) çözeltileri oluşturuldu ve 0,05 ml çözelti üzerine 1 ml Bradford reaktifi eklenerek 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edildi. Süre sonunda Perkin Elmer UV/VIS spektrofotometrede 595 nm de absorbanslar ölçülerek konsantrasyonlara karşılık absorbansların esas alındığı standart grafiği çizildi. Örnek analizlerinde de aynı yöntem uygulandı ve standart grafiği denklemi kullanılarak ölçülen absorbanslara karşılık albumin konsantrasyonları hesaplandı. 9
Albumin nanopartiküllerinin sentezlenmesi Albumin nanopartikülleri Langer ve arkadaşlarının geliştirdikleri yöntemin modifikasyonu ile desolvasyon metodu kullanılarak gerçekleştirildi (Langer ve arkadaşları, 2003). Albumin 1 ml distile suda çözüldü ve 480 rpm hızla orbital karıştırıcı üzerinde 4 ml etanol, pompa (ERC HPLC Pump 64) yardımıyla 1 ml/dk akış hızında eklendi. Elde edilen karışım içerisine % 8 lik glutaraldehit çözeltisinden 0,588µl/ mg BSA olacak şekilde eklendi. 24 saat oda sıcaklığında çalkalamaya bırakılan albumin nanopartikülleri süre sonunda eppendorf tüplerine alınarak 13000 rpm de 3x20 dk Beckman Mikrofuge E cihazında santrifüjlendi. Üst faz bir tüpe alınarak ayrıldı ve eppendorf tüplerinin içerisine 1 er ml distile su eklenerek 13000 rpm de 2x20 dk santrifüjlenerek yıkama işlemi yapıldı. Santrifüj sonrasında üst faz 1.yıkama suyu olarak ayrı bir tüpe alındı ve nanopartiküller aynı işlemlerle ikinci defa yıkandı. 2. yıkama suyu da bir tüpe koyulup nanopartiküller +4 ºC ye kaldırılarak depolandı. 10
Albuminin nanopartikül oluşum verimi (% desolvasyon) ise desolve albumin miktarının eklenen toplam albumine bölünüp 100 ile çarpılmasıyla aşağıdaki formülde gösterildiği gibi hesaplandı. % Desolvasyon = Desolve albumin miktarı (mg) Eklenen albumin miktarı (mg) x 100 Şekil 8: Albumin nanopartiküllerin Sentezlenmesi(Pınarbaşlı, 2010). Manyetik albumin nanopartiküllerinin hazırlanması Manyetik ajan olarak seçilen Fe 3 O 4 Chen ve arkadaşlarının çalışmasında belirtilen oranlar (Chen ve arkadaşları, 2010) dikkate alınarak kullanıldı. Buna göre 25 mg albumin ve 10 mg Fe 3 O 4 1 ml d-suda çözüldü standart koşullarda nanopartiküller sentezlendi. Amoksisilin ticari formundan ekstraksiyonu ve standart grafiğinin çizilmesi Amoksisilinin ekstraksiyonu ve tayini Qureshi ve arkadaşlarının kullandığı yöntemin modifikasyonu ile yapıldı (Qureshi ve arkadaşları, 1999). 500 mg amoksisilin içeren 5 adet tablet havanda ezildi ve elde edilen toz 50 ml su ile 1,5 saat manyetik karıştırıcıda karıştırıldı. Süre sonunda karışım 13000 rpm de 25 dak santrifüjlendi ve üst fazlar toplanarak ilk önce Whatmann No:1 kağıdından ardından 0,20 µ luk membran filtre ile süzüldü. Standart grafiği için ilk olarak 50 mg/ml lik amoksisilin stoğundan farklı hacimler (0,1-3,0 ml) çekilerek d-su ile 3 ml ye tamamlandı ve kör tüpüne ise 3 ml su konuldu. Bütün tüplere 0,1 M NaOH çözeltisinden 2,5 ml ilave edilerek 80º C deki su banyosunda 15 dakika inkübasyona bırakıldı. Tüplerin oda sıcaklığına soğutulmasının ardından üzerlerine sırasıyla,1 ml 0,1M KIO 3, 0,5 ml 1 M HCl ve 5 ml CCl 4 eklendi. Tüplerde oluşan pembe renkli organik faz ile sulu faz birbirinden ayırma hunisi ile ayrıldı. Organik fazın 200-700 nm arasında dalga boyu 11
taraması yapıldı ve maksimum absorbans verdiği dalga boyu olan 524 nm de spektrofotometrik olarak tayin yapıldı. Albumin nanopartiküllerine amoksisilinin adsorpsiyon yolu ile yüklenmesi 25 mg manyetik albumin nanopartikül ile 2 ml amoksisilin 37 C de çalkalamalı ortamda inkübe edildi ve inkübasyonun ardından 13000 rpm de 45 dak santrifüj edilerek adsorbe olmayan ilaç nanopartiküllerden ayrıldı. Üst fazda amoksisilin tayini yapılıp adsorbe olmayan ilaç miktarı bulundu. Bu değerin başlangıç ilaç miktarından çıkarılmasıyla da adsorbe ilaç miktarı ve sonucun 100 ile çarpılmasıyla aşağıdaki formülden de görüldüğü gibi adsorpsiyon verimi hesaplandı. Manyetik albumin nanopartiküllerine amoksisilin adsorpsiyonu için süre, ortam ph sı ve ilaç konsantrasyonu gibi parametreler incelenerek sonuçlar değerlendirildi. Adsorpsiyon verimi (%) = Başlangıç ilaç miktarı (mg) Adsorbe olmayan ilaç miktarı (mg) Başlangıç ilaç miktarı (mg) 100 a. Optimum Adsorpsiyonun Süresinin Tayini 50 mg/ml amoksisilin manyetik albumin nanopartiküller ile 3, 6, 24 ve 48 saatlik sürelerde inkübe edildi. Sürelerde sonunda yapılan ilaç tayinleri sonuçları ile adsorpsiyon verimleri hesaplandı ve en yüksek verimin olduğu adsorpsiyon süresi optimum kabul edildi. b. Optimum Adsorpsiyon ph sının Belirlenmesi 50 mg/ml konsantrasyondaki ilacın ph değeri NaOH ve HCl çözeltileri kullanarak 3-9 aralığında ayarlandı. 2.6.1 de belirtilen prosedüre uygun olarak manyetik nanopartiküllere 12
optimum sürede ilaç adsorpsiyonu yapıldı ve hesaplanan adsorpsiyon verimleri ile optimum adsorplanma ph sı belirlendi.. c. Optimum İlaç Konsantrasyonunun Saptanması 25, 50, 75, 100 ve 150 mg/ml konsantrasyonda amoksisilin çözeltileri hazırlandı ve diğer optimum koşulları kullanarak nanopartiküller ile adsorpsiyon gerçekleştirildi. Adsorpsiyon verimlerinin hesaplanmasının yanında ilaç yüklü nanopartiküllerin İzmir Yüksek Teknoloji Enstitüsü Fen Fakültesi Kimya Bölümü nde zeta boyut cihazı (Malvern NanoSZ) ile boyut analizi yapıldı. Sonuçlar adsorpsiyon verimleri ve partikül boyutları açısından değerlendirildi. İn Vitro İlaç Salımı Amoksisilin adsorbe edilmiş manyetik nanopartikül süspansiyonu 12000 molekül kütleli maddelere geçirgen gözenek boyutuna sahip diyaliz torbasına konularak 15 ml ph 5.0, 6.0 ve fizyolojik ph değeri olan 7.4 e ayarlı fosfat ile tamponlu tuz çözeltisi (PBS) içeren reaktöre yerleştirildi, aynı zamanda 1 ml serbest ilaç (50 mg/ml) da aynı PBS ortamlarına koyuldu. Reaktörler 200 rpm hızla çalkalayıcı su banyosunda 37 o C de inkübe edildi. Belirli zaman aralıklarında örnekler alınarak amoksisilin tayinleri yapıldı ve nanopartiküllerden amoksisilin salımı belirlendi. Ayrıca salım oranları serbest ilacın salım sonuçları ile karşılaştırıldı. 13
SONUÇ VE TARTIŞMA Albumin Standart Grafiği Bradford yöntemiyle 0-0.2 mg/ml aralığında BSA kullanılarak çizilen standart grafiği kullanılarak albumin miktarları belirlendi. Şekil 9 da verilen protein standart grafiği kullanılarak bilinmeyen örneklerde protein tayinleri yapıldı. A(595 nm) 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 y = 2,067x R² = 0,9913 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 c(mg/ml) Şekil 9: Protein Standart Grafiği Amoksisilin Tayini Amoksisilin tayininde organik fazın oluşan pembe renginin dalga boyu taraması yapıldı (Şekil 10). Maksimum absorbans verdiği 524 nm de spektrofotometrik ölçümü yapılarak standart grafik oluşturuldu. Şekil 11 de görülen standart grafik yardımıyla her bir örnekte amoksisilin miktarları belirlendi. 14
2 Absorbans 1,5 1 0,5 0 400 500 600 700 Dalga boyu Şekil 10: Dalga Boyu Taraması 1 A(524nm) 0,8 0,6 0,4 0,2 0 y = 0,0169x R² = 0,9842 0 10 20 30 40 50 c(mg/ml) Şekil 11: Amoksisilin Standart Grafiği 15
Nanopartikül Hazırlama ve Hazırlanılan Nanopartiküllere İlaç Yükleme Koşullarının Optimizasyonu a. Albumin Konsantrasyonunun Etkisi Farklı miktarlarda albumin kullanılarak hazırlanılan nanopartiküllerde desolvasyon % değerleri her bir albumin oranı için hesaplandı ve örneklerin partikül boyutları zeta potansiyel ile saptandı. Albumin miktarı 100 mg/ml alındığında desolvasyon yüzdesi 91.6 değerine yükselsede nanopartikül boyutlarındaki görülen artış nedeniyle tercih edilmemiştir. 25 mg/ml albumin konsantrasyonunda desolvasyon % değeri 83.4 olarak saptanmıştır. 50 mg/ml albumin konsantrasyonunda ise bu değer 84.5 dir. Desolvasyon % değerinde fazla artış olmaması nedeniyle aşırı albumin kullanımına gerek duyulmamış ve partikül boyutları yaklaşık 120 nm olarak saptanan 25 mg/ml albumin konsantrasyonu sonraki denemeler için tercih edilmiştir. Şekil 12 de 25 mg/ml albumin konsantrasyonu kullanılarak hazırlanılan nanopartikül boyutlarının yarıçapının 61.58 nm olduğu görülmektedir. Şekil 12: 25 mg/ml Albumin Konsantrasyonunda Hazırlanılan Nanopartikül Boyutu 16
b. İnkübasyon Süresinin Etkisi Adsorplama ile etken madde yüklenmesinde etkin olan bir diğer parametre adsorpsiyon süresidir. Etken maddenin hazırlanan manyetik nanopartiküllere adsorpsiyonunda optimum sürenin belirlenmesi amacıyla, hazırlanan nanopartiküller 3 72 saat süre ile amoksisilinle inkübe edildi. İnkübasyon süresine bağlı mg adsorplanan madde miktarı ve adsorpsiyon verimi şekil 13 de görülmektedir. 24 saatlik inkübasyon sonrası yaklaşık %41 adsorpsiyon sağlandığı için optimum inkübasyon süresi 24 saat olarak belirlenmiştir. 24 saatin üzerinde inkübasyonlarda kontaminasyon saptandığından sonuçlar değerlendirilememiştir. Adsorplanan ilaç miktarı (mg) 15 12 9 6 3 0 3 6 9 15 24 50 40 30 20 10 0 t(saat) Adsorpsiyon verimi (%) adsorplanma miktarı adsorplanma verimi Şekil 13: İnkübasyon Süresinin İlaç Yükleme Verimi Üzerine Etkisi c. ph Etkisi Optimum albumin konsantrasyonu kullanılarak hazırlanılan nanopartiküllerde farklı ph ortamlarında amoksisilin adsorpsiyonu gerçekleştirildi. ph 3 ve 4 te nanopartikül yapılarının bozularak ipliksi yapıların oluştuğu, ph 9 da ise jelimsi bir yapının oluştuğu gözlemlendi. Şekil 14 de farklı ph değerlerinde adsorplanan amoksisilin miktarları ve adsorpsiyon verimleri verilmiştir. Şekilden görüldüğü gibi ph 6 ve 7 değerinde adsorpsiyon veriminde fark görülmemektedir. Bu nedenle amoksisilin sulu çözeltisinin ph değeri olan ph 6 optimum ph değeri olarak seçilmiştir. Bu şekilde herhangi bir ph ayarlamasına gereksinim duyulmayacaktır. 17
Adsorplanan ilaç miktarı (mg) 16 12 8 4 60 50 40 30 20 10 Adsorpsiyon verimi (%) 0 0 5 6 7 8 ph adsorplanma miktarı adsorplanma verimi Şekil 14: ph ın İlaç Yükleme Verimi Üzerine Etkisi d. Amoksisilin Konsantrasyonunun Adsorpsiyon Verimi Üzerine Etkisi 25-150 mg/ml aralığında Amoksisilin kullanılarak yapılan deneme sonucunda elde edilen veriler şekil 15 de verilmiştir. 60 Adsorpsiyon Verimi(%) 50 40 30 20 23 44 45 47 50 10 0 25 50 75 100 150 c(mg/ml) Şekil 15: Amoksisilin Konsantrasyonunun Adsorpsiyon Verimi Üzerine Etkisi Amoksisilin konsantrasyonunun optimizasyonunda yapılan denemeler sonucu sentezlenen ilaç içeren nanopartiküllerin zeta potansiyel verileri tablo 1 de özetlenmiştir. Adsorpsiyon verimleri ve boyutlar dikkate alındığında 50 mg/ml ve 75 mg/ml konsantrasyonu 18
kullanıldığında adsorpsiyon verimlerinde fark gözlenmemiş bu nedenle partikül boyutunun artmaması amacıyla 50 mg/ml amoksisilin optimum konsantrasyon olarak seçilmiştir. Tablo 1: Amoksisilin Konsantrasyonunun Adsorpsiyon Verimi ve Partikül Boyutu Üzerine Etkisi İlaç konsantrasyonu (mg/ml) Adsorplanan ilaç miktarı (mg) İlaç adsorplanma verimi (%) Partikül boyutu (nm) 25 4,92 23 136,2 50 36,48 44 192,9 75 41,76 45 200,1 100 72,36 47 223,1 150 119,64 50 258,1 Herbir örnek için ayrıca zeta potansiyel sonuçları Şekil 16 da verilmiştir. Tablo 1 ve Şekil 16 dan görüldüğü gibi 50 mg/ml amoksisilin kullanılarak hazırlanılan ilaç içeren manyetik nanopartikül boyutu yaklaşık 193 nm dir. 19
Şekil 16: 25, 50,75, 100 ve 150 mg/ml Amoksisilin İçeren Manyetik Nanopartiküllerin Zeta Potansiyel Grafikleri 20
DEĞERLENDİRME Osteomiyelit gelişen antibiyotikler ve tedavi yöntemlerine rağmen kronikleşme eğilimi ile önemini koruyan bir hastalıktır. Diğer enfeksiyonlarda olduğu gibi osteomiyelit tedavisinde de en önemli tedavi yöntemi antibiyotikler olmasına rağmen özellikle kombine antibiyotik tedavisinde ilaç atımında güçlükler, normal floranın tahribatı, zıt ilaç reaksiyonları gibi sakıncalar oluşabilmektedir (Bilsel, 1990). Lokal antibiyotik uygulamasında sıklıkla tercih edilen antibiyotik içeren zincir şeklindeki polimerler ise cerrahi müdahale ile hastalıklı bölgeye yerleştirilip tedavi sonunda aynı yöntemle metabolizmadan uzaklaştırmayı gerektirir. İlaç taşıyıcı partiküller olarak nano yapılı mikroküreler kullanılmaktadır. Kontrollü ilaç salınımında mikroküreler, taşınacak maddenin yapı ve aktivitesini değiştirmeden, hedef organ doku ve hücreye taşımasını sağlarlar. Biyobozunur mikrokürelerin kullanımı biyolojik sistemle uyumlu olması, parçalanma ürünlerinin toksik olmaması ve sistemden daha sonra çıkarılmaları gerekmediğinden daha avantajlıdır. Bunun yanında düşük dozda ilaç kullanımına olanak sağlarlar. İlacın fiziksel hedeflendirme yöntemi olan manyetik hedeflendirme ile hedef hücreye gönderilmesi yeni bir hedefleme tekniğidir. Manyetik hedefleme yöntemi ile enjekte edilen dozun en az %60 ını hedef dokuya taşıması, serbest ilacın dolaşımdaki konsantrasyonunun 100 kat azalması, normal doku hücrelerinin hasarının azalması, dokuda kontrollü bir şekilde ilaç bulunmasının sağlanması gibi üstünlükleri bölgesel rahatsızlıkların tedavisinde daha etkin olduğu gösterilmiştir. Yapılan çalışmada osteomiyelit tedavisinde kulanılmak üzere manyetik özellikte albumin nanopartikülleri sentezlenerek nanopartiküllere amoksisilin, adsorpsiyon yolu ile yüklenmiştir. Amoksisilin adsorpsiyonu için süre, ortam ph sı ve ilaç konsantrasyonu gibi parametreler incelenmiştir. Hazırlanılan nanopartiküllere ilaç yükleme koşullarının optimizasyonu gerçekleştirilmiş, örneklerin partikül boyutları zeta potansiyel ile saptanmıştır. 21
TEŞEKKÜR Proje çalışmalarımız sırasında teorik ve laboratuvar desteklerinden dolayı Ege Üniversitesi Fen Fakültesi Biyokimya Bölümü Öğretim Üyesi Doç.Dr.Şenay Şanlıer, Araştırma Görevlisi Güliz Ak ve Habibe Yılmaz a, bize danışmanlık yapan Kimya öğretmenimiz Funda Akdoğan a, Bilim Kurulu Eş Başkanımız Dr. Ayşe Türker e ve her konuda destek olan okul yöneticilerimize, ailelerimize teşekkür ederiz. KAYNAKLAR Öztuna, V., Osteomiyelit Patofizyolojisi ve Tedavi Prensipleri, TOTBİD Dergisi, 4,1-2(2005). McNally M and Nagarajah K., Osteomyelitis, Orthopaedics and Trauma, 24,6(2010). Oto M., Kronik Osteomiyelit te Tanı ve Medikal Cerrahi Tedavi Kombinasyonunun Değeri, Pamukkale Tıp Dergisi, 1,50-58(2008). Wang X., et all., Application of Nanotechnology in Cancer Therapy and Imaging, A Cancer Journal For Clinicals, 58(97)(2008). Zhang L., et all., Nanoparticles in Medicine:Therapeutic Applications and Developments, Clinical Pharmacology and Therapeutics, 83, 761-769(2008). Ak G., Folat-PEG-Doxorubicin türevinin sentezlenerek teknesyumla işaretlenmesi ve kanser görüntüleme ajanı olarak kullanım olanaklarının araştırılması, Ege Üniversitesi Yüksek Lisans tezi, danışman Doç.Dr.Şenay Şanlıer (2010). Vasir J.K. and Labhasetwar V., Targeted drug delivery in cancer therapy, Technology in Cancer Research and Treatment, 4(4), 363-374(2005). Bradford MM, A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein Utilizing the principle of protein-dye binding, Anal Biochem, 72, 248-254 (1976). Langer. K., Balthasar. S., Vogel. V., Dinauer., von Briesen. H., Schubert.D., Optimization of the preparation process for human serum albumin (HSA) nanoparticles, International Journal of Pharmaceutics,, 257, 169-180(2003). Pınarbaşlı, O, Alfa-fenil-N-tert-bütil Nitron (PBN) Yüklü Nanopartiküler Taşıyıcı Sistemlerin Hazırlanması ve İn Vitro Olarak Değerlendirilmesi, Farmasötik Teknoloji Programı Yüksek Lisans Tezi (2010). 22
Chen. D., Tang. Q., Xue. W., Xiang. J., Zhang. L., Wang. X., The preparation and characterization of folate-conjugated human serum albumin magnetic cisplatin nanoparticles, Journal of Biomedical Research,, 24(1), 26-32(2010). QureshiS.Z., et all., Simultaneous spectrophotometric and volumetric determinations of amoxycillin, ampicillin and cloxacillin in drug formulations: reaction mechanism in the base catalysed hydrolysis followed by oxidation with iodate in dilute acid solution, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 21, 473-482(1999). Bilsel N., Osteomiyelit Tedavisinde Antibiyotik Kullanımı, Ankem Derg 4(No 3):414-420 (1990) Widder K.J and Senyei A.E., Magnetic albumin microshere in drug delivery Microsheres and Drug Therapy, Eda.: S.S. Davis, L.Illum, J.G.McVie, E. Tomlinson, Elsevier, Amsterdam, 393-411 (1984). Çokkuş N., Albümin Nanopartiküllerinin İlaç Taşıma ve Görüntüleme Sistemlerindeki Kullanım Çalışmaları, Ege Üniversitesi Yüksek Lisans Tezi, danışman Doç.Dr.Şenay Şanlıer (2010). 23