Elektroforez Vildan Fidancı
Elektroforez electro elektriksel yük phoresis separasyon Elektriksel bir alanda yüklü moleküllerin separasyonu. Yüklü moleküllerin separasyonu ve analizinde kullanılan ucuz, kullanışlı bir tekniktir. - - electrode +electrode
Elektriksel Ortamda Anyon ve Katyonların Hareketi Anod (pozitif elektrod) + - Güç kaynagı Katod (negatif elektrod) Anyon - - - - - - - - Solüsyon + + + + + + + + Katyon Çoğu biyolojik molekül iyonize olabilen gruplar içerdiğinden dolayı elektriksel yük taşırlar ve elektroforetik sistemde taşıdıkları yükün tipine göre katod veya anoda doğru hareket ederler; pozitif iyonlar (katyonlar) katoda doğru, negatif iyonlar (anyonlar) anoda doğru göç ederler.
Elektroforez ile Ayrımı Yapılan Analitler Amino asitler, nukleotidler, iyonlar Genelliklede proteinler ve nukleik asitler Elektroforezde separasyonu yapılacak moleküller amfoterik özellikte olmalıdır. Proteinler iyonize olabilen çok sayıda çözünebilen amino (-NH2) ve karboksil (-COOH) grup içerdikleri ve nükleik asitlerdeki bazlarda pozitif veya negatif yük taşıyabildikleri için, protein ve nükleik asitler çözelti içinde amfolit olarak davranırlar. Na + Na+ O O P O CH 2 O O Sugar Base Na+ Na+ O O P O O Base CH 2 O Sugar OH
ph ve Protein Net Yükü Đzoelektrik nokta (pi), net yükün negatif olduğu ph dır. Asidik çözeltide (ph < pi) protein pozitif yük taşır (proton bağlar) ve katoda doğru göç eder, Alkali çözeltide (ph > pi) negatif yük taşır (proton verir) ve anoda doğru göç eder.
Elektroforezde Göç Hızı - -- Molekülün net elektriksel yüküne, Molekülün yapısı ve büyüklüğüne, Elektriksel alanın gücüne, Destek ortamın özelliğine, Uygulama ısısına bağlıdır.
Elektroforetik Mobilite (U) Alana uygulanan güç başına göç hızıdır. iki denklemden türetilmiştir; 1.Elektrik alanın iyon üzerine oluşturduğu hareket gücü F e = qe : q net yük, E is elektrik alan gücü 2. Buna zıt olarak destek ortamın sürtünme direnci sonucu oluşan hareketi engelleyici güçtür F s = fv : f sürtünme gücü, v hız 3. qe = fv 4. Sonuç olarak, lektroforetik mobilite (U) = v/e = q/f = q/6pηr : η destek ortamın viskozitesi, r molekülün çapı + - q + - - - - + f v F E
Bu formüle göre, elektroforetik mobilite net yük ile doğru ; molekül büyüklüğü ve elektroforetik ortamın viskozitesi ile ters orantılıdır.
5 - + 2 2 5 1 4 3 4 1 (1) Elektrotlar (2) Destek ortam (3) Fitiller (4) Kapak (5) Güç Kaynağı Agaroz veya selüloz asetat gibi bir elektroforetik destek elektrot bölmeleri arasına yerleştirilir. Tanklar istenilen ph da tampon ile doldurulur. Elektroforetik destek ortam tamponla doğrudan veya fitiller aracılığı ile ilişkilendirilir. Her iki tampon tankında platin veya karbon elektrot yer alır ve bu elektrotlar güç kaynağına bağlanmak sureti ile devre tamamlanır. Buharlaşmayı en aza indirmek ve sistemi korumak için tüm sistem bir kapak ile kapatılır. Elektroforetik desteğe uygulanan numune akım uygulandığında göç edecektir.
Güç Kaynağı Elektrotlar arasında elektrik akımı sağlar. Elektrik akımı Isı üretimi Göç hızının artması, Separe edilen moleküllerin buharlaşması, Su kaybı, Đyon konsantrasyonunun artması, Tampon viskozitesinde azalma direnci düşürür Bu problemleri en aza indirmek için: sabit akımlı güç kaynağı kullanılmalıdır.
Tamponlar 50X TAE Buffer Elektrik akımını taşımak Elektroforezin yürütüldüğü ph yı belirlemek Yürütülen molekülün elektriksel yükünü belirlemek Tamponun iyonik gücü Đyonik bulutun kalınlaşması migrasyon oranı elektroforetik zonların daha keskin ayrılması [iyon] iyonik bulut moleküllerin hareketi Barbital tamponlar & Tris-borik asid- EDTA tamponlar ph= ~8.5
Boyalar Nükleik asit ve protein fraksiyonlarını belirlemek ve görsel hale getirilmesinde kullanılan boyaların seçimi aplikasyon tipine ve kişisel seçime bağlıdır. Amino Black Ethidium Bromide Numune tarafından alınan boyanın miktarı ; proteinin tipine, sabitleyici ajanların oluşturduğu denatürasyon derecesine bağlıdır. Nitrotetrazolium Blue Oil Red O Sudan Red 7B Coomassie Brilliant Blue
Type Nominal Wavelength (nm) Serum Proteins in General Separation Amino Black (Naphthol Blue Black) Coomassie Brilliant Blue G-250 (Brilliant Blue G) Coomassie Brilliant Blue R-250 (Brilliant Blue R) Ponceau S 640 595 560 520 Isoenzymes NAD(P)H (NBTH formazan) Nitrotetrazolium Blue (as the formazan) 570 Lipoprotein Zones Fat Red 7B (Sudan Red 7B) Oil Red O Sudan Black B 540 520 600 DNA Fragments Ethidium bromide (fluorescent) 32 P Autoradiography 254(Ex) 590(Em) ---- CSF Proteins Silver nitrate ---- Ex, excitation, Em, emission, NBTH, reduced nitortetrazolium blue
Genel Prosedür Separasyon Destek materyalin fazla tamponu giderilir ve elektroforez tankına yerleştirilir. Destek materyalde fazla miktarda sıvı bulunmamasına ve hava kabarcığı oluşmamasına dikkat edilmelidir. Destek; elektroforez tankına doldurulmuş tampon ile temasta olacak şekilde yerleştirilir.
Numune desteğe uygulanır, - Sabit voltaj ve sabit akım uygulanarak elektroforez işlemi belirlenen zaman süresince yürütülür. +
Daha sonra destek materyal elektroforez ortamından uzaklaştırılarak numune komponentlerinin diffüzyonunu önlemek için hızlıca kurutulur veya fiksatif içine yerleştirilir.
Sonra her bir protein bandının yerini belirlemek ve görünür hale getirmek için boyanır.fazla boya uzaklaştırıldıktan sonra,destek ortam kurutulur veya temizleyici bir ajan içine yerleştirilir.
Saptama & Miktar Tayini Elektroforetik ayırma ve boyama tamamlandıktan sonra, miktar; Toplamın yüzdeleri olarak, Total protein miktarı biliniyorsa konsantrasyon olarak hesaplanır. Dansitometre ile, Bu elektroforez stripi optik bir sistemin önünden geçirilir ve her bir fraksiyonun absorbansı kaydedicinin grafiğinde veya katot ışın tüpünde görüntülenir. Son olarak her pikin altında kalan alan otomatik olarak hesaplanır.
Elektroforez Çeşitleri a. Agaroz Jel Elektroforez b. Selluloz Asetat Elektroforez c. Poliakrilamid Jel Elektroforez d. Isoelektrik Odaklama e. Đki Yönlü Elektroforez Kapiller Elektroforez
Wells. Wells. Agaroz Jel Elektroforez Agarose Gel Agarose Gel -- DNA bands Bands + Safety Lid Cathode - + Buffer Bands Anode Agarose Gel
Agaroz Jel Elektroforez Destek ortam olarak agaroz kullanılır. [agaroz] por büyüklüğü por büyüklüğü sürtünme mobilite voltage mobility serum proteinleri, nükleik asitler, hemoglobin varyantları, laktat dehidrogenaz ve kreatin kinaz izoenzimleri, lipoprotein fraksiyonları ve diğer bazı maddelerin analizlerinde başarı ile kullanılmaktadır. Saflık derecesi yüksek agaroz iyonize olan gruplardan arınmıştır endosmoz görülmez.
Agaroz jel elektroforezin avantajı; Protein için düşük bir affiniteye sahiptir. Göç hızı üzerine etkisinin çok azdır. Kurutmadan sonra tam olarak temizlendiğinden mükemmel bir dansitometrik muayeneye olanak verir
Selüloz Asetat Elektroforez Selülozun hidroksil grupları + asetik anhidrid Selüloz Asetat % 80 hava içerir Tamponla ıslatıldığında sıvı ile dolar. Membran esnek yapı kazanır. 95 kısım metanol + 5 kısım glasiyel asetik asit karışımı Dansitometri için saydam membran Avantajları: Separasyon hızlıdır. Saydam membranlar arşivlenebilir. Dezavantajları; Membranın kullanılmadan önce ıslatılması Densitometri için temizleme aşaması
Poliakrilamid Jel Elektroforez Poliakrilamid jel elektroforezinde 20 yada daha fazla fraksiyon elde edilir. Bu nedenle genetik varyantlar ve izoenzim analizleri olmak üzere, protein ve nükleik asit çalışmalarında tercih edilir. Separasyon; moleküllerin büyüklüğüne ve yüküne bağlıdır.
Ayrılan protein zonlarının diskoid şeklinden dolayı bu metod bazen disk elektroforezi olarak da tanımlanmaktadır. Plaka şeklinde jel tabaka yada tüp şeklindeki elektroforez hücreleri kullanılır. Küçük gözenekli ayırma jeli, tüp şeklindeki elektroforez hücresine dökülür, jelleşme için 30 dakika beklenir. Geniş-gözenekli monomer çözelti + ~3 µl numune jel üzerine ilave edilir.
Elektroforez başladığında, Tüm proteinler geniş-gözenekli jel boyunca hareket eder, ayırma jeline ulaştığında yığılırlar. Bu işlem çözünürlüğü artırır ve proteinler başlangıç noktasında yoğunlaşır. BOS gibi düşük protein içerikli numunelerin önceden konsantre edilmesi gerekmez.
Ortalama % 7.7 poliakrilamid jeldeki ortalama gözenek çapı 5 nm kadardır. Bu durum pek çok serum proteinlerinin engellenmeden göç etmesine olanak verir, Ancak,moleküler çapı büyük proteinlerin (fibrinojen,β 1 - lipoprotein,α 2 -macroglobulin gibi) göçünü az veya çok etkiler. Avantajları: Termostabil, saydam, kuvvetli, kimyasal olarak inerttir. Geniş por büyüklüğü aralığına sahiptir. Yüksüzdür Endosmoz oluşmaz. Dezavantajı: Kanserojeniktir.
SDS-PAGE β-mercaptoethanol: disülfid köprülerini indirger. β-mercaptoethanol & SDS, numune ile 5 dakika kaynatılır. SDS: Kuvvetli deterjan etki proteinleri denatüre eder.
SDS-PAGE SDS proteinlerin yüzeyini kaplar (proteinlerin hidrofobik bölgelerine bağlanır) Tüm proteinler negatif yük taşır sabit bir yük-kütle oranı separasyon moleküler büyüklüğe göre gerçekleşir. Elektroforezde poliakrilamid jel boyunca pozitif kutba göç eder. proteinlerin molekül ağırlığı, proteinlerin saflığının tayininde kullanılır.
PAGE Denatürasyon aşaması yok SDS yadaβ-mercaptoethanol kullanılmıyor Proteinler denatüre edilmiyor. Proteinlerin separasyonu Farklı elektroforetik mobiliteye Jelin elek etkisine göre Kullanımı : Biolojik aktivite çalışmalarında native protein/enzim elde etmek için
Đzoelektrik Odaklanma Proteinler gibi amfoterik maddelerin separasyonu ile ilgili tekniktir. Protein destek ortam üzerinde, pi eşit olan ph ya göç eder Bu ph da elektriksel yük = 0 olur göç durur. Increasing ph A N O D E + + + + + + + + + _ C A T H O D E pi = 5.1 pi = 6.4 pi = 8.6
Proteinler pi değerleri çok dar bir ph aralığı ile sınırlanmış olduğundan oluşan bölgeler son derece keskindir. Bu işlemde yayılmada engellenir, çünkü protein izoelektrik noktasındaki bölgeden ayrıldığı zaman yük kazanır ve elektroforetik güç tarafından tekrar eski yerine döner. Metod: Cam/plastik tabakalar üzerinde horizontal jeller kullanılır, Amfolit jelin içine nüfus edince -> ph gradienti oluşur. Separasyon moleküler ağırlığa göre değil, pi ya göre Yüksek voltaj gerekli (5000V) Uzun zaman periyoduna ihtiyaç duyar (10h)
Đki Yönlü Jel Elektroforez 1. Birinci yön IFE (separasyon pi ya göre ) geniş-gözenekli ortamda gerçekleştirilir. ph gradienti oluşturmak için taşıyıcı amfolit eklenir. 2. Đkinci yön SDS-PAGE (separasyon büyüklüğe göre) Poliakrilamid jel Linear yada gradient 3. Đki Yönlü-PAGE olarakda adlandırılır. Proteomik için esas metoddur.
O Farrell Metodu β-mercaptoethanol (1 st D) & SDS (2 nd D) Đlk yön için çubuk poliakrilamid IEF yöntemi Elektroforez sonunda jel tüpten çıkartılır Đkinci yön SDS-PAGE SDS içeren poliakrilamid gradient jeli ile temasta olacak şekilde yerleştirilir.
Proteinler Coomassie boyaları, gümüş boya, radyografi (izotop işaretli polipeptitlerden yayılanların fotoğraf filmine maruz bırakılması), florografik (sintilatör varlığında trityum işaretli polipeptitlerin röntgen filmlerinin çekilmesi) analizler kullanılarak saptanabilir.
Đkiyönlüelektroforezin avantajları: 1. Saflığın en iyi göstergesidir. 2. Proteinlerin heterojenitesinin tayini yapılabilir. 3. Kompleks protein karışımlarının analizi yapılabilir. 4. Proteinlerin saflaştırılması sağlnır.
Kapiller Elektroforez Termostatik Kapillar Sistem + - Yüksek Voltaj Elektrolit Elektrolit Dedektör Örnek Elektroforetogram Sistem ters çevrilmiş U şeklinde duran ve uçları tampon dolu tüplere batmış durumda iken yüksek gerilim uygulanan bir borudan oluşur. Dış yüzeyi; ya bir sıvı kılıfı yada soğuk hava akımı ile soğutularak ısınma sorunu ortadan tamamen kalkar.
Kapiller Tüp Çok değişik uzunluklarda fakat normali 25-50 cm Küçük çaplı (25-100 µm) ve fused silica kuvartztan yapılmış olup UV ışınlarına geçirgendir. Çok kırılgan olan bu kapillerin kırılmasını önlemek için üzeri polimid tabakası ile kaplanmıştır.
Poliimid tabakasının detektör önüne gelen kısmı ya soyularak yada yakılarak bir pencere açılır. Bu pencere, spektrofotometre küveti görevi görür. Elektroforezle ayrılan moleküller bu pencereden geçerken ışığı absorbe ederler.
Absorbe edilen ışık detektör tarafından saptanır. Bilgisayar sistemi aracılığı ile absorbsiyon pikleri ekrana verilir.
Ooooo! It MOVES
Pulse Field Jel Elektroforez (PFGE) Normal electrophoresis can only separate DNA fragments up to 20 kb. Gels used are always agarose gels PFGE can separate bands several Megabases long (1Mb= million base pairs) including whole chromosomes. Relies on inability of large pieces of DNA to change direction quickly within a gel when the direction of the electric field is changed repetitively. Most PFGE system changes the electric field direction by 90-120 0 at each pulse.
Pulse Field Gel Electrophoresis (PFGE) - 120 0 +
Preparative Gel electrophoresis 20% PEG soln. Extraction by Electrophoresis - + Phenol/ Chloroform purify and Concentrate (70%EtOH) Melt gel At 65 o C Add Agarase and digest. Extraction by Agarose digestion Run Sample on Gel
Protein Elektroforezi Protein elektroforezi, serum proteinlerinin elektriksel ortamda taşıdıkları farklı yüklere göre migrasyonlarıdır.
1.pre-albumin 2.Albumin 1.Albumin 3.alpha 2.alpha 1-Acid-Glycoprotein 4.alpha 3.alpha 1-Antitrrypsin 5.Haptoglobin 4.Haptoglobin 1.alpha2 macroglobulin 2.Hemopexin 3.Transferrin 4.Complement 5.Gamma Serum protein elektroforez fraksiyonları ve bu fraksiyonları oluşturan başlıca proteinler;
Serum Protein Elektroforez Normal Pattern
Serum Protein Elektroforez- Poliklonal Gammapati Poliklonal gammapati genellikle sekonder olarak görülür. Bu hastada (39 yaşında, sarkozdoz lu erkek) Globulin fraksiyonunda, "sarcoid stepping" olarak adlandırılan ardışık artış görülüyor.
Serum Protein Elektroforez- Nefrotik Patern Nefrotik paternde, düşük moleküler ağırlıklı proteinlerin uzun dönem kaybı kaybı, (albumin, IgG gibi) ve yüksek moleküler ağırlıklı proteinlerin (alpha-2-makroglobulin gibi) tutulumu vardır. Bu hastada (39 yaşında SLE lu kadın) günlük total üriner protein kaybı 3700 mg. üzerinde (Normal kayıp 150 mg/gün den az).
Serum Protein Electrophoresis--Cirrhotic Pattern Patient was a 46 year old male with end stage liver disease secondary to chronic alcohol abuse. He died 5 months after this sample was obtained. In the cirrhotic pattern, the distinction between beta and gamma globulin is blurred and is sometimes referred to as the "beta-gamma bridge" pattern.
Serum Protein Electrophoresis- Acute inflammatory pattern This patient was a 42 year old female who presented with a temperature of 40 degrees C and was diagnosed with both pneumonia and pyelonephritis. In the acute inflammatory pattern albumin and gamma globulin are decreased and alpha-2- globulin becomes very prominent. In both the strip and scan note that the intensity of the alpha-2 fraction is greater that the gamma globulin fraction.
Serum Protein Electrophoresis- Alpha 1 anti-trypsin deficiency Alpha-1-anti-trypsin deficiency can be congenital or acquired, typically secondary to liver or pulmonary diseases. Congenital alpha-1-antitrypsin deficiency is most commonly associated with early onset emphysema, pancreatic insufficiency, or cirrhosis.
Serum Protein Electrophoresis- Monoclonal (M) Protein Present The patient was a 72 year old male who presented with lower back pain. Quantitative immunoglobulin measurements showed a large increase in serum IgG, but decreased IgA and IgM. Bone marrow exam revealed a large increase in plasma cells that were frequently aggregated. IFE on this patient's serum showed the M protein was IgG kappa. A diagnosis of multiple myeloma was made.
Serum Protein Elektroforez- Biklonal Gammapati This sample is from a 62 year old male who presented with weight loss and fatigue. He was found to have multiple myeloma. In this disease, biclonal gammopathies are rare, occurring in about 1.7 % of patients. IFE showed the 2 M proteins to be IgG-k and IgA-lambda
24-Hour Urine Protein Electrophoresis Interpretation Chart PatternDescription Electrophoretic Zones Total Protein (mg/d) Albumin Alpha-1 Alpha-2 Beta Gamma Normal <150 +/- +/- +/- Selective glomerular proteinuria mild <1500 ++ + + severe >1500 +++ ++ ++ Nonselective glomerular proteinuria1 >3000 +++ ++ ++ ++ ++ Tubular proteinuria <1500 Trace to + Trace ++ ++ Trace of light chain Mixed glomerular and tubular proteinuria +++ + ++ + + Albuminuria >150 ++ Overflow proteinuria from acute phase response Trace or present ++ ++ Trace Trace Overflow proteinuria with monoclonal spike (spike) or ++ (spike) or ++ 1Lookslike serum protein electrophoretogram. + = mildly elevated ++ = moderately elevated +++ = markedly elevated +/- = may or may not bepresent
Sık Karşılaşılan Problemler 1-Numune uygulamasında devamsızlık; aplikatörün kirliliği veya deforme olması sonucu olabilir. 2-Örneklerin jel boyunca birbirlerine eşit olmayan hızlarda göç etmeleri ya eşit olmayan bir elektriksel alana yol açan kirli eletrotlardan yada jelin her tarafının eşit olmamasından kaynaklanabilir. 3-Protein zonlarının çarpık oluşması, aplikatör ucunun bükülmesinden, örnek aplikasyonu sırasında hava kabarcığı oluşmasından, örneğin fazla miktarda uygulanmasından, elektroforez öncesi veya sırasında destek ortamın aşırı kurumasından kaynaklanabilir. Selüloz asetat filminelektroforez sırasında veya daha önceden aşırı kurutulması da bükülmüş zonlara neden olur.
4-Uygulanan numunede kırılmalar şeklindeki diğer düzensizlikler; muhtemelen selüloz asetat filmin aşırı ıslatılmasına veya agaroz jele bağlıdır. Numune uygulanan kısım solgun görülebilir. 5-Bazı artefaktlar; kolaylıkla tanımlanabilen, olağan dışı bantlara neden olur. Hemolizli örnekler, beta-globulin bandının yoğunlaşmasına (serbest hemoglobinin göç ettiği bölge) veya hemoglobin-haptoglobulin kompleksine bağlı olarak alfa-2 ve beta-globulinlerin arasında olmaması gereken bir bant oluşmasına neden olur.
Başlangıç noktasında bant oluşması fibrinojene bağlı olabilir ve anormal bir bant olarak rapor edilmeden önce örneğin serum olduğundan emin olunmalıdır. Đki parçalı alfa-1,alfa-2 veya beta-globulin bantlarının oluşması nadir değildir ve hatalı olarak kabul edilmemelidir. Bazen Bis-albuminemide iki parçalı albumin bandı oluşabilir, fakat büyük ölçüde yaygınlaşmış albumin bandı, albumine bağlı ilaçların kullanımına bağlı olabilir.
Elektroendozmoz/Endozmoz Destek ortamın, su ile etkileşimi - hidroksil iyonların absorbsiyonu negatif iyonlarla yüklenmesine neden olur. Destekteki negatif yük solüsyondaki pozitif iyonları çeker Stern potential Böylece yüzeydeki negatif yüklü bölge mesafesi negatif iyonların sayısı zeta (ζ) potensiyel negatif iyonların sayısı = pozitif iyonların sayısı
Elektroendozmoz/Endozmoz Böyle bir sisteme akım uygulandığı zaman destekteki negatif yükler sabit kalırken çözeltideki iyon bulutu zıt polaritedeki elektroda doğru hareket eder. Đyonların yüksek oranda hidrate olması solventinde hareketine neden olur. Sabit iyonların beraberinde solventi sürüklemesi endosmosis
Elektroendozmoz/Endozmoz Suyun tek yönlü hareketine neden olur. Çözeltide, bu akışın tersi yönünde hareket eden makromoleküller harekesiz kalabilir, hatta yetersiz yüke sahiplerse ters kutba doğru geriye doğru hareket edebilirler. Selluloz asetat & agaroz jel gibi destek ortamlarda endozmoz güçlüdür. Gama globulinler uygulama noktasının gerisine doğru sürüklenirler. Endozmoz olayını azaltmak için; Destek ortamdaki yüklü grupları azaltmak Sukroz yada sorbitol ilavesi ->osmolalite artışı
Hemoglobin Elektroforezi (ph 8.5) Rutin analizlerde sellüloz asetat membranı kullanılarak ph 8.5 de uygulanan Hb elektroforezi oldukça kolay, duyarlı ve hızlı bir yöntemdir. Genellikle sık görülen varyantların tanımlanmasında kullanılır.
Prensip Alkali ph' da hemoglobin molekülü negatif yüklüdür ve elektriksel ortamda anoda(+) doğru göç eder. Hb'ler molekül başına düşen yük nedeniyle Hb A ya göre Hb S 2x, Hb C 4x daha fazla yük taşır. Böylece anoda doğru Hb S ve Hb C, Hb A'dan çok daha yavaş hareket eder. Buna ters olarak ; Hb A'dan daha hızlı anoda doğru hareket eden Hb H, I ve J ise ayrıca negatif yükler taşırlar. Selüloz asetat genel olarak kullanılmaktadır. Alkali ortamda sellüloz asetat kağıdı üzerine uygulanan kan örnekleme, elektriksel güç uygulanarak basit ve seri bir şekilde hemoglobin tiplendirmesi yapılır. Agaroz kullanılarak da benzer sonuçlar sağlanır.
Tam kan, hemolizat ya da filtre kağıdında toplanmış kan örnekleri kullanılabilir. Plazma proteinlerinin bulaşması sonucu oluşan ek bantların önlenmesi için hemolizat kullanımı önerilir. Örnek alımında, açlık ve sıvı kısıtlaması gerekmez. Heparinli örnek -4 C'de 1 hafta ve EDTA veya ACD li örnek 3 hafta saklanabilir. Hb H veya Hb Köln gibi unstable Hb'ler düşünülüyorsa elektroforez 24 saatte yapılmalıdır.
- C A 2 S F A Barts H + Hb varyantları - A 2 S A + Sickle Cell Anemi - taşıyıcı - A 2 S F A + Sickle Cell Anemi - A 2 A + Normal - A 2 A + Anemi - A Barts + α-talassemi - A 2 F A + β-talassemi
Lipoprotein Elektroforezi LP lerin major elemanları elektroforetik olarak, taşıdıkları yük, dansite ve destek ortamla olan etkileşimlerine göre göç ederler. Selluloz asetat, VLDL ile birlikte göç ettiğinden dolayı, şilomikronların tesbitinde yetersizdir ve tavsiye edilmez. LPE de agaroz jel prosedürü tavsiye edilir. Agaroz jel 90' Barbital tamponda fikse edildikten sonra kurutulur, Fat Red 7B, Sudan Black B ile boyanır.
LPE de Fat Red 7B, Sudan Black B gibi lipit boyaları kullanılır. Bu lipit boyaları primer olarak trigliserit ve kolesterol esterlerinin ester bağlarını boyar. Beklenen numunelerde ester bağları yıkılacağından hatalı sonuçlar alınabilir, pre-beta fraksiyonunun göç oranı artar. Fat Red 7B, Sudan Black B boyalarının trigliserit ve kolesterol esterlerine affinitesi kolesterol ve fosfolipitlerden daha fazladır.
Bu boyalarla boyamadan sonra görünür hale gelen bantlar, total plasma lipitlerinin gerçek kantitatif değerini vermez. Bu nedenle LP bantlarının % sinin, total plasma lipit değerlerine göre, her fraksiyondaki total lipit içeriğini kantitatif olarak hesaplanması tavsiye edilmez.
Agaroz jel LPE de HDL, alfa-1 globulin fraksiyonunda; LDL, alfa-2 globulin fraksiyonunda, VLDL, beta-2 globulin fraksiyonunda göç eder, şilomikronlar ise orjinde kalır.